Xét nghiệm miễn dịch giáo trình dành cho cử nhân xét nghiệm y học dự phòng

TR NG Đ I H C Y T CÔNG C NG TRUNG TÂM XÉT NGHI M H P XÉT NGHI M MI N D CH GIÁO TRÌNH DÀNH CHO C NHÂN XÉT NGHI M Y H C D U H HÀ N I - 2016 PHÒNG Ch biên TS Đặng Vũ Phương Linh Tham gia biên so n PGS TS Lê Th Minh Hương TS Nguyễn Thanh Bình TS Nguyễn Triệu Vân TS Phạm Việt Hùng Th ký biên so n BS Đặng Minh Điềm H P CN Phan Th Quỳnh H U L I NÓI Đ U Năm 2016, để ph c v nhu cầu đào tào cán b bậc đại h c chun ngành Xét nghiệm Y h c dự phịng, mơn h c “Xét nghiệm Miễn d ch” bắt đầu đư c đưa vào gi ng dạy Trư ng Đại h c Y tế Cơng c ng Vì m t môn h c r t cần thiết cho công việc xét nghiệm Y h c dự phòng tương lai c a m t cán b y tế, th y cần thiết ph i biên soạn giáo trình nhằm h tr cho trình h c tập c a sinh viên Giáo trình “Xét nghiệm Miễn d ch” m t tài liệu đầy đ cập nhật n i H P dung kiến th c, kỹ thuật xét nghiệm tiến tiến chuyên ngành Miễn d ch h c giới Việt Nam Trong q trình biên soạn, chúng tơi cố gắng thể tính b n, tính đại, tính khoa h c tính hệ thống c a chương trình mơn h c Trong th i gian biên soạn có hạn, hẳn khơng tránh khỏi cịn tồn m t U số sai sót khơng mong muốn Chúng tơi r t mong muốn nhận đư c thông tin ph n hồi quý báu c a quý bạn đ c để giáo trình hồn thiện lần tái b n tới Xin trân tr ng c m ơn! H Thay mặt nhóm tác gi Ch biên TS Đặng Vũ Ph ng Linh M CL C BÀI C CH C A ĐÁP NG MI N D CH 1 Giới thiệu Các quan c a hệ miễn d ch 3 Các tế bào ch yếu c a hệ thống miễn d ch Miễn d ch tự nhiên 12 Miễn d ch thu đư c 15 Cytokine 21 BÀI MI N D CH CH NG VI SINH V T 28 Miễn d ch bẩm sinh chống vi sinh vật 28 Đáp ng miễn d ch thu đư c 29 BÀI DUNG TH H P MI N D CH VÀ B NH T MI N 38 Dung th miễn d ch 38 Bệnh tự miễn .41 BÀI SUY GI M MI N D CH 49 Suy gi m miễn d ch bẩm sinh 49 Suy gi m miễn d ch mắc ph i 51 U BÀI MI N D CH CH NG UNG TH 57 Oncogene - gene c chế ung thư tác nhân gây ung thư .57 Đáp ng miễn d ch chống ung thư 57 Kh tế bào ung thư tránh né đáp ng miễn d ch 58 Liệu pháp miễn d ch phòng chống ung thư 4.1 Liệu pháp miễn d ch ch đ ng chống lại khối u 59 H BÀI MI N D CH GHÉP 63 Gene mã hóa ph c hệ MHC ngư i 63 C u trúc c a kháng nguyên MHC 65 Ch c c a hệ thống HLA 66 M t số kỹ thuật xác đ nh HLA 67 Miễn d ch ghép 69 c chế miễn d ch ghép 72 BÀI NGUYÊN LÝ VÀ NG D NG C A M T S XÉT NGHI M MI N D CH C B N TRONG CH N ĐOÁN B NH TRUY N NHI M 75 Ph n ng kết t a 75 Ph n ng ngưng kết 75 Ph n ng kết h p bổ thể 76 Ph n ng trung hòa 77 Ph n ng miễn d ch huỳnh quang 77 Ph n ng ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) .78 Ph n ng miễn d ch phóng xạ (Radioimmunoassay RIA) .78 Kỹ thuật sắc ký miễn d ch .78 Nhận đ nh kết qu .78 BÀI NGUYÊN LÝ VÀ NG D NG C A M T S XÉT NGHI M MI N D CH C B N TRONG CH N ĐỐN B NH KHƠNG TRUY N NHI M 81 M t số xét nghiệm miễn d ch ng d ng chẩn đoán d ng tự miễn 81 Kh o sát bổ thể 84 Kh o sát lympho bào 85 Đánh giá tế bào trung tính tế bào mono .86 S n xu t kháng huyết dùng cho phịng thí nghiệm miễn d ch lâm sàng.88 Kỹ thuật Sinh h c phân tử miễn d ch lâm sàng 88 H P H U BÀI C CH C A ĐÁP NG MI N D CH M C TIÊU BÀI H C Sau kết thúc học, sinh viên/học viên có thể: Trình bày đư c quan c a hệ miễn d ch tế bào tham gia đáp ng miễn d ch Trình bày đư c đáp ng miễn d ch tự nhiên đáp ng miễn d ch thu đư c (đáp ng miễn d ch d ch thể đáp ng miễn d ch qua trung gian tế bào) Trình bày đư c vai trò c a cytokine đáp ng miễn d ch N I DUNG BÀI H C Gi i thi u Miễn d ch tên g i tiếng Anh “Immunity”, có nguồn gốc từ tiếng Latinh “immunitas” có nghĩa miễn trừ cáo bu c pháp luật dành cho ngh sĩ quốc h i th i gian đương ch c Trước đây, miễn d ch đư c hiểu không mắc bệnh ch yếu bệnh nhiễm trùng Hiện hệ miễn d ch đư c hiểu r ng t t c tế bào phân tử hóa h c tạo thành hệ thống b o vệ thể chống lại ch t lạ xâm nhập Những ch t lạ bao gồm vi sinh vật gây bệnh c m t số ch t lạ không gây bệnh Và đáp ng miễn d ch đư c đ nh nghĩa ph n ng ch t lạ, bao gồm c vi khuẩn đại phân tử protein, polysaccharide, không kể ph n ng sinh lý hay bệnh lý Thucydides, m t ngư i Hy Lạp Athens, sống kỷ th V trước Công nguyên đươc coi ngư i đề cập đến tính miễn d ch chống lại bệnh nhiễm trùng mà lúc đư c g i “bệnh d ch” Tuy nhiên, chế c a hệ miễn d ch ghi nhớ đư c ngư i Trung Quốc ng d ng từ r t lâu ngư i dân có tập t c cho ngư i dân hít ch t b t làm từ da c a ngư i b đậu mùa khỏi để phòng ngừa bệnh Miễn d ch h c đại ngành khoa h c gi i thích tư ng dựa ch ng thực nghiệm Bằng ch ng l ch sử ngành miễn d ch thành cơng c a bác sĩ ngư i Anh Edward Jenner việc tiêm ch ng phòng bệnh đậu mùa Jenner nhận th y ngư i vắt sữa bò m t hồi ph c sau b bệnh đậu mùa bị khơng bao gi mắc bệnh nữa.Do đó, ơng l y d ch từ vết thương c a ngư i b đậu bò tiêm cho m t đ a trẻ tuổi sau cho đ a trẻ tiếp xúc trực tiếp với nguồn bệnh trẻ khơng b bệnh Ơng g i cách b o vệ c a “vaccination - tiêm ch ng” (chữ vaccination bắt nguồn từ tiếng Latinh “vacca” nghĩa bị cái) Từ biện pháp tiêm ch ng để ngăn ngừa bệnh truyền nhiễm đư c ng d ng r ng rãi phương pháp phòng ngừa hiệu qu nh t bệnh truyền nhiễm Sự đề kháng chống lại vi sinh vật xâm nhập vào thể ph n ng c a hệ thống miễn d ch bẩm sinh hệ miễn d ch thu đư c Hệ miễn d ch bẩm sinh (còn g i miễn d ch tự nhiên) bao gồm chế đề kháng có sẵn thể sẵn sàng đáp ng r t nhanh vi sinh vật xâm nhập ph n ng theo m t H P U H chế giống hệt với loại vi sinh vật với m t loại vi sinh vật xâm nhập nhiều lần Các thành phần c a miễn d ch bẩm sinh bao gồm: (1) hàng rào vật lý hoá h c da, niêm mạc, ch t kháng khuẩn đư c tiết bề mặt này; (2) tế bào thực bào (tế bào trung tính, đại thực bào) tế bào NK (tế bào diệt tự nhiên); (3) protein máu, bao gồm thành phần c a hệ thống bổ thể ch t trung gian khác c a ph n ng viêm; (4) protein g i cytokine có vai trị điều hoà phối h p hoạt đ ng c a tế bào hệ miễn d ch bẩm sinh Ngư c lại với hệ miễn d ch bẩm sinh, đáp ng miễn d ch đư c kích thích b i tiếp xúc với vi sinh vật tạo cư ng đ tăng dần Nếu tiếp xúc đư c lặp lặp lại, đáp ng đư c g i đáp ng miễn d ch thu đư c Tính ch t đặc biệt c a đáp ng miễn d ch thu đư c tính đặc hiệu phân tử kh “ghi nhớ” phân tử xâm nhập tr lại có kh tạo m t đáp ng mạnh nhiều so với lần xâm nhập Khác với miễn d ch bẩm sinh thư ng ph n ng lại với vi sinh vật, miễn d ch thu đư c có kh nhận diện ph n ng lại với nhiều vật lạ bao gồm c vi sinh vật kháng nguyên không ph i vi sinh vật Ngoài ra, miễn d ch thu đư c cịn có kh phân biệt đặc hiệu khác r t nhỏ kháng nguyên lạ cịn đư c g i miễn d ch đặc hiệu Các thành phần c a đáp ng miễn d ch bẩm sinh thu đư c thư ng xen lẫn với m t chế đề kháng chung c a thể thông qua nhiều loại tế bào phân tử Miễn d ch bẩm sinh giúp thể khỏi t n công c a m t số vi sinh vật Tuy nhiên nhiều vi sinh vật gây bệnh có kh vư t qua hàng rào miễn d ch nên loại trừ chúng cần đến m t chế đề kháng mạnh nhiều, miễn d ch thu đư c Miễn d ch bẩm sinh có kh kích thích đáp ng miễn d ch thu đư c nh hư ng đến b n ch t c a miễn d ch thu đư c ngư c lại đáp ng miễn d ch thu đư c có kh tăng cư ng hoạt đ ng kháng khuẩn c a miễn d ch bẩm sinh Về mặt di truyền h c, miễn d ch bẩm sinh thu c hệ thống đề kháng cổ nh t c a thể ch , miễn d ch thu đư c có đư c nh q trình tiến hố đ ng vật khơng xương sống, s c đề kháng c a thể ch chống lại vi sinh ch yếu đư c đ m trách b i miễn d ch bẩm sinh cịn lồi đ ng vật có xương sống hệ miễn d ch bao gồm c tự nhiên thu đư c Có hai kiểu đáp ng miễn d ch thu đư c, đáp ng thể d ch đáp ng qua trung gian tế bào C hai kiểu có tham gia c a r t nhiều thành phần c a hệ thống miễn d ch với m c đích loại trừ vi sinh vật khỏi thể Miễn d ch d ch thể đư c thực qua trung gian c a phân tử máu d ch niêm mạc có tên kháng thể, đư c s n xu t b i tế bào lympho B Kháng thể có kh nhận diện kháng nguyên, trung hịa đ c tính vi sinh vật tác đ ng lên vi sinh vật để loại trừ qua nhiều chế hiệu qu khác Miễn d ch d ch thể chế đề kháng ch yếu chống lại vi sinh vật ngoại bào đ c tố c a chúng với tuýp kháng thể khác có chế loại bỏ kháng nguyên khác bao gồm hoạt đ ng thực bào, kích thích tế bào lympho s n xu t ch t trung gian c a ph n ng viêm Miễn d ch qua trung gian tế bào (còn g i miễn d ch tế bào) kiểu đáp H P U H ng đư c thực qua trung gian c a tế bào lympho T đáp ng chống lại vi sinh vật n i bào virus m t số vi khuẩn có kh sống nhân lên đại thực bào m t số tế bào vật ch Miễn d ch b o vệ chống lại m t vi sinh vật đư c tạo nh kích thích c a vi sinh vật nh truyền kháng thể tế bào lympho đặc hiệu từ bên ngồi Cách th c tạo kháng thể qua kích thích trực tiếp với vật lạ đư c g i miễn d ch ch đ ng cá thể tiếp xúc với vật lạ đóng vai trị ch đ ng việc đáp ng với kháng nguyên Những cá thể tế bào lympho chưa đư c tiếp xúc với m t kháng nguyên đư c g i “nguyên vẹn” (naive) Còn cá thể đư c tiếp xúc với m t kháng nguyên vi sinh vật sau đư c b o vệ chống lại lần tiếp xúc đư c g i miễn nhiễm (immune) Truyền huyết tế bào lympho từ m t cá thể khác đư c gây miễn d ch giúp cho thể có miễn d ch chống lại vi sinh vật, đư c g i truyền miễn d ch th đ ng Gây miễn d ch th đ ng m t phương pháp hữu ích để cung c p s c đề kháng nhanh, không ph i ch miễn d ch ch đ ng xu t Ví d : truyền kháng thể từ mẹ sang th i kỳ bào thai giúp cho đ a trẻ chống lại nhiễm trùng th i kỳ ch đ i miễn d ch ch đ ng c a trẻ hình thành Phương pháp miễn d ch th đ ng đư c sử d ng để chống lại đ c tố vi khuẩn gây chết ngư i (ví d đ c tố uốn ván) cách truyền kháng thể từ đ ng vật đư c gây miễn d ch b i vi sinh vật Ngồi truyền tế bào phân tử có tính ch t b o vệ đư c sử d ng để có miễn d ch t c g i miễn d ch vay mư n Các c quan c a h mi n d ch H P U H Hình 1.1 Các quan hệ miễn dịch 2.1 Các mô lympho Mô lympho đư c phân loại thành quan lympho trung ương (hay quan lympho sơ c p) - nơi mà tế bào lympho lần thể th thể kháng nguyên trư ng thành mặt ch c quan lympho ngoại biên (hay quan lympho th c p) - nơi x y đáp ng c a tế bào lympho với kháng nguyên lạ Cơ quan lympho trung ương c a đ ng vật có vú bao gồm tuỷ xương (nơi s n xu t toàn b tế bào lympho) tuyến c (nơi tế bào lympho T trư ng thành đạt đến giai đoạn phát triển ch c đầy đ ) Cơ quan mô lympho ngoại biên bao gồm hạch bạch huyết, lách, hệ thống miễn d ch da hệ thống miễn d ch niêm mạc Ngồi ra, ngư i ta cịn tìm th y m t số tế bào lympho mô liên kết t t c quan trừ hệ thần kinh trung ương 2.1.1 Tuỷ xương ngư i trư ng thành, tuỷ xương nơi s n sinh t t c tế bào máu lưu đ ng kể c tế bào lympho non Trong trình phát triển bào thai, s n xu t tế bào máu, g i trình tạo máu, xu t đ o máu c a túi phôi nhu mô cạnh đ ng mạch ch sau gan lách Ch c đư c chuyển giao cho tuỷ xương đặc biệt xương dẹt tuổi dậy thì ch c tạo máu ch yếu x y xương c, đốt sống, xương chậu xương sư n T t c tế bào máu xu t phát từ m t loại tế bào g i tế bào mầm, tế bào phân hố để tạo nhiều dịng tế bào máu khác (bao gồm dòng tuỷ, dòng đại ngun hồng cầu, dịng hạt, dịng lympho) (Hình 1.2) Tế bào mầm khơng có d u n c a tế bào lympho biệt hố thay vào protein màng có tên CD34 kháng nguyên- c a tế bào mầm (Sca- 1) Những d u n dùng để nhận diện làm giàu tế bào mầm từ h n d ch tuỷ xương để dùng cho ghép tuỷ Sự tăng sinh trư ng thành c a tế bào máu tiền thân tuỷ xương đư c kích thích b i cytokine Các cytokine tạo máu đư c s n xu t b i tế bào đệm đại thực bào tuỷ xương tạo nên m t môi trư ng tạo máu thuận l i 2.1.2 Tuyến c Tuyến c nơi trư ng thành c a tế bào lympho T Tuyến c đư c hình thành trình lõm vào c a ngoại bì (ectoderm) th i kỳ bào thai để tạo nên cổ ngực Trong m t dịng chu t tr i lơng đặc biệt, m t đ t biến gene làm cho chúng m t kh biệt hoá tế bào lympho biểu mơ tế bào cần thiết để hình thành tuyến c nang tạo lơng dịng chu t khơng có tế bào lympho T khơng có lơng ngư i, trẻ có h i ch ng Di George khơng có tế bào lympho T đ t biến gene cần thiết cho hình thành tuyến c Tế bào lympho tuyến c tế bào lympho T giai đoạn phát triển khác Hầu hết tế bào lympho T non vào vỏ tuyến c qua hệ thống mạch máu, tế bào lympho T trư ng thành khỏi tuyến c để vào máu mô lympho ngoại biên 2.1.3 Hạch bạch huyết hệ thống mạch bạch huyết (mạch bạch huyết) Hạch bạch huyết quan nhỏ dạng hạt c a mô lympho đư c tìm th y d c theo hệ thống mạch bạch huyết khắp thể M t hạch bạch huyết có H P U H vùng vỏ bên vùng tuỷ bên Mạch bạch huyết th m qua vùng vỏ để vào vùng tuỷ r i hạch qua mạch bạch huyết vùng rốn hạch Bên tiểu mao mạch c a lớp vỏ đám tế bào lympho tập trung dày đặc đư c g i nang Nang trung tâm mầm đư c g i nang sơ c p, cịn nang có trung tâm mầm đư c g i nang th c p Vùng vỏ xung quanh nang đư c tổ ch c thành kho ng không gian ch a tế bào lympho, tế bào hình thực bào đơn nhân Tế bào lympho tế bào trình diện kháng nguyên kho ng không gian thư ng nằm cạnh không tạo nên cầu nối liên bào điều cần thiết để tế bào lympho di chuyển lưu thông máu, hệ mạch bạch huyết mô Các loại tế bào lympho khác đư c bố trí vùng riêng biệt hạch bạch huyết Sự chia tách mặt gi i phẫu c a loại tế bào lympho hạch bạch huyết trình ph thu c vào cytokine Tế bào lympho T B nguyên vẹn đư c đưa vào hạch qua mạch máu Sự phân cách mặt gi i phẫu c a tế bào lympho T B nhằm đ m b o cho m i tế bào đư c tiếp xúc trực tiếp với tế bào trình diện kháng ngun thích h p Sau đư c kháng nguyên kích thích, tế bào lympho T B m t ngăn cách mặt gi i phẫu di chuyển phía Tế bào lympho T hoạt hố cuối khỏi hạch để vào tuần hoàn, tế bào lympho B tiến vào trung tâm mầm vùng tuỷ, từ chúng tiết kháng thể Kháng nguyên đư c vận chuyển đến hạch ch yếu qua hệ thống mạch bạch huyết Hệ mạch bạch huyết đ m trách ch c thu thập vận chuyển kháng nguyên từ nơi xâm nhập đến hạch bạch huyết Da, biểu mô quan có nhu mơ ch a r t nhiều mao mạch bạch huyết nơi để h p th vận chuyển d ch gian bào (thoát từ bào tương) khỏi nơi D ch gian bào đư c h p th vào đư c g i bạch huyết, di chuyển dần qua mao mạch lớn để cuối đổ vào m t mạch bạch huyết lớn nh t g i ống ngực Bạch huyết từ ống ngực đư c đổ vào tĩnh mạch ch để tr lại hệ tuần hồn M i ngày có nhiều lít bạch huyết đư c đổ vào hệ tuần hồn, tắc hệ mạch bạch huyết nhanh chóng dẫn đến phù mô Vi sinh vật thư ng xâm nhập vào thể qua da, đư ng tiêu hố hơ h p T t c mô đư c bao ph b i m t lớp biểu mô ch a nhiều tế bào hình Tế bào hình bắt giữ kháng nguyên vi sinh vật di chuyển vào mạch bạch huyết Các hạch bạch huyết đư c bố trí d c theo hệ mạch bạch huyết hoạt đ ng quan l c mẫu vật bạch huyết trước bạch huyết đổ vào hệ tuần hoàn Khi bạch huyết vào m t hạch bạch huyết qua hệ thống mạch bạch huyết, th m vào vùng đệm c a hạch Các tế bào hình mang kháng nguyên vào vùng tế bào lympho T lại vùng Các kháng ngun hồ tan đến theo bạch mạch đư c tế bào hình đại thực bào diện vùng đệm c a hạch thu thập Kết qu kháng nguyên đư c tập trung với đậm đ cao hạch đ để trình diện cho tế bào lympho T đặc hiệu 2.1.4 Lách Lách v trí ch yếu c a đáp ng miễn d ch kháng nguyên đến từ máu Kháng nguyên tế bào lympho vào lách qua xoang mạch máu Khi H P U H 2.2 Ph n ng ngưng kết trực tiếp Vi sinh vật sống hay chết có kh ngưng kết với kháng thể Với vi sinh vật sống, thực ph n ng m t phiến kính Các tế bào hồng cầu, tinh trùng có kh ngưng kết với kháng thể tương ng M t số xét nghiệm ph n ng Widal sử d ng vi sinh vật chết ống nghiệm để xác đ nh hiệu giá kháng thể huyết chẩn đoán thương hàn 2.3 Ph n ng ngưng kết gián tiếp Kháng nguyên kháng thể ngưng kết có diện c a m t yếu tố th Ví d : Ph n ng Coombs Ngư i mẹ Rh- mang thai Rh+ (kháng nguyên D) Lúc sinh con, hồng cầu Rh+ l t vào máu ngư i mẹ khích thích tạo thành kháng thể anti-D Kháng thể anti-D l t qua lần mang thai sau ngư i th hai mang kháng nguyên D Ph n ng kháng thể anti-D kháng nguyên D phá h y hồng cầu gây nên ch ng tan máu trẻ sơ sinh Để phòng ngừa tư ng này, ngư i ta tiêm vào ngư i mẹ trước sinh th nh t m t lư ng nhỏ anti-D để phá h y hồng cầu Rh+ c a l t vào hệ tuần hồn c a mẹ q trình chuyển đẻ 2.4 Ph n ng ngưng kết th đ ng Kháng nguyên hòa tan đư c h p ph lên bề mặt mư n hạt latex hồng cầu cừu Những hạt ngưng kết với kháng thể nh diện c a kháng nguyên dính vào bề mặt chúng Để phát kháng nguyên, ngư i ta gắn kháng thể lên mư n Khi kháng thể gặp kháng nguyên đặc hiệu, quan sát đư c tư ng ngưng Đây ph n ng ngưng kết th đ ng ngư c Ph n ng ngưng kết th đ ng nhạy ph n ng ngưng kết trực tiếp nh hình thể tương đối lớn c a hạt mang kháng nguyên đ đặc hiệu cao tinh chế đư c kháng nguyên kháng thể trước gắn lên mư n Loại ph n ng đư c dùng chẩn đoán nhiều bệnh nhiễm trùng d ch hạch, Whitmore, viêm màng não m 2.5 Ph n ng ngăn ngưng kết hồng cầu M t số virus có kh ngưng kết hồng cầu c a m t số đ ng vật ph n ng b c chế b i kháng huyết c a virus Ph n ng ngăn ngưng kết hồng cầu đư c sử d ng để chẩn đoán nhiều ch ng bệnh virus cúm, quai b , sốt xu t huyết, đậu mùa.v.v Ph n ng k t h p bổ th 3.1 Nguyên lý: Kháng thể gắn đặc hiệu với kháng nguyên có kh hoạt hóa bổ thể từ gây ly gi i tế bào vi khuẩn m t số tế bào đ ng vật khác 3.2 Ph n ng kết h p bổ thể Ph n ng kết h p bổ thể đư c thực cách ghép hệ thống ph n ng: - Trong hệ thống 1, kháng nguyên đư c cho tác d ng với kháng thể Nếu kháng nguyên kháng thể ph n ng đặc hiệu t t c lư ng bổ thể kết h p vào ph c h p kháng nguyên - kháng thể (KN-KT) - Hệ thống th hai đư c sử d ng để nhận mặt bổ thể tự (không kết h p) Thêm vào hệ thống th nh t hồng cầu cừu huyết kháng hồng cầu H P U H 76 cừu (hệ thống tan máu) Lúc bổ thể kết h p vào ph c h p KN-KT c a hệ thống khơng cịn bổ thể để ly gi i hồng cầu cừu kết h p với KT Nếu hệ thống 1, kháng nguyên kháng thể khơng ph n ng đặc hiệu với bổ thể tự đư c hoạt hóa làm tan hồng cầu cừu Ph n ng kết h p bổ thể đư c sử d ng để chẩn đoán bệnh giang mai, nhiễm virus đ nh tính kháng nguyên/kháng thể Ph n ng trung hòa 4.1 Nguyên lý: Kháng thể đặc hiệu có kh trung hồ đ c tố, đ c lực c a vi sinh vật, làm m t m t tính ch t c a vi sinh vật s n phẩm c a chúng 4.2 Ph n ng trung hòa đ c tố Đ c tố đư c sử d ng ph n ng trung hòa thư ng ngoại đ c tố Nếu sử d ng đ c tố liều gây chết kết h p với kháng thể đặc hiệu tương ng tiêm vào cho đ ng vật nhạy c m vật khơng b nguy hiểm Nếu thay cho m t lư ng đ c tố biết vào m t lư ng kháng đ c tố để trung hòa, ngư i ta cho lư ng đ c tố làm hai lần vào lư ng kháng đ c tố h n h p khơng trung hịa đ ng vật thí nghiệm Đó tư ng Danysz Ngư i ta cho lúc cho nửa lư ng đ c tố vào kháng đ c tố đ c tố kết h p với nhiều kháng đ c tố số lư ng phân tử kháng đ c tố tự cịn lại khơng đ để trung hòa lư ng đ c tố lại 4.3 Ph n ng trung hòa virus M t số loại virus có kh phá h y tế bào, nhiên cho kháng thể đặc hiệu với virus vào đồng th i với virus tư ng phá h y tế bào không x y Ph n ng đư c sử d ng để xác đ nh hàm lư ng kháng thể huyết đ nh type virus Mặt khác đ nh lư ng kháng thể c a virus huyết cách tr n h n h p kháng huyết tiêm h n h p vào m t nhóm đ ng vật nhạy c m Nếu đ ng vật thử nghiệm không cho th y triệu ch ng bệnh ph n ng cho kết qu đ nh tính c a kháng thể trung hịa 4.4 Ph n ng trung hòa enzyme Nhiều enzyme c a vi khuẩn có tính ch t sinh kháng tốt kích thích tạo thành kháng thể streptolysin O, streptokinase c a liên cầu với kháng thể tương ng kháng streptolysin O (antistreptolysin O - ASO), kháng streptokinase (anti streptokinase - ASK) Dựa nguyên tắc ph n ng trung hịa, ta đ nh lư ng kháng thể kháng streptolysin O (ASO), kháng streptokinase (ASK) có huyết c a bệnh nhân để chẩn đoán nhiễm liên cầu Ph n ng ASO đư c sử d ng chẩn đoán bệnh th p tim viêm cầu thận c p sau nhiễm liên cầu nhóm A Ph n ng mi n d ch huỳnh quang 5.1.Nguyên lý Kháng thể đặc hiệu gắn với thuốc nhu m huỳnh quang Fluorescein, Rhodamin v trí Fc c a kháng thể mà khơng phá h y tính ch t đặc hiệu c a kháng thể Kháng thể có kh gắn đặc hiệu với kháng nguyên tương ng quan sát đư c kính hiển vi huỳnh quang 5.2 Phương pháp trực tiếp H P U H 77 Kháng thể kết h p với thuốc nhu m huỳnh quang cho tác d ng với kháng nguyên Ví d chẩn đoán vi khuẩn t sau - gi nuôi c y nước pepton kiềm, dung d ch đư c phết lên phiến kính nhu m với kháng kháng thể đặc hiệu liên h p Fluorescein Nếu mẫu dương tính, ta quan sát vi khuẩn t phát huỳnh quang xanh l c kính hiển vi huỳnh quang 5.3 Phương pháp gián tiếp Kháng thể đư c cho tác d ng trực tiếp với kháng nguyên cho kết h p với kháng globulin ngư i liên h p với Fluorescein Trước hết cho kháng nguyên cố đ nh lên tiêu b n cho tác d ng với huyết bệnh nhân, rửa để loại bỏ kháng thể thừa sau nhỏ m t gi t globulin ngư i gắn Fluorescein quan sát kính hiển vi huỳnh quang Phương pháp đư c sử d ng để chẩn đoán bệnh giang mai (ph n ng FTA - Abs), bệnh tự miễn Ph n ng ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) Kỹ thuật sử d ng kháng thể kháng nguyên cố đ nh vào giếng ELISA polystyren Nếu kháng nguyên/kháng thể đặc hiệu tương ng đư c cho vào (ví d từ huyết bệnh nhân), kháng nguyên kết h p đặc hiệu với kháng thể, ph c h p gắn với enzyme đư c cho vào, ph c h p đặc hiệu với kháng nguyên kháng thể huyết thanh, nh enzyme gắn với kháng thể tác đ ng lên ch t đặc hiệu Cơ ch t b enzyme th y phân thành ch t tạo màu đư c đo máy đo quang ELSIA, tỷ lệ với nồng đ c a kháng thể kháng nguyên dung d ch thử nghiệm Enzyme đư c sử d ng photphatase kiễm peroxydase Thử nghiệm cho kết qu khách quan r t nhạy Thử nghiệm miễn d ch liên kết enzyme đư c áp dựng để chẩn đoán vi khuẩn giang mai, Brucella, Salmonella , vi khuẩn t virus virus viêm gan, virus s i, virus HIV Ph n ng mi n d ch phóng x (Radioimmunoassay RIA) Ph n ng RIA sử d ng đồng v phóng xạ Thymidin H3, Cacbon 14, Iode 125 đánh d u kháng nguyên kháng thể để theo dõi ph n ng kết h p kháng ngun kháng thể Sau đó, v trí c a kháng nguyên (hoặc kháng thể) đánh d u đồng v phóng xạ đư c phát phương pháp ch p nh thông thư ng Phương pháp đồng v phóng xạ khơng khu trú v trí kết h p m t cách xác mà làm tăng đ nhạy c m ph n ng lên hàng nghìn lần Kỹ thu t sắc ký mi n d ch Ph c h p kháng kháng thể (KKT) gắn ch t màu đư c phân bố b n gi y sắc ký Kháng nguyên (KN) đặc hiệu (có thể kháng nguyên vi sinh vật) đư c gắn cố đ nh “vạch ph n ng” Khi nhỏ huyết cần xác đ nh kháng thể (KT) lên b n sắc ký, KT đặc hiệu (nếu có) huyết kết h p với KKT gắn màu, ph c h p miễn d ch KT-KKT gắn màu di chuyển gi y sắc ký b giữ lại “vạch ph n ng” KT kết h p với KN vi sinh vật, kết qu “vạch ph n ng” màu Ngư c lại, huyết khơng có KT đặc hiệu, “vạch ph n ng” KN giữ đư c KKT gắn màu, khơng màu vạch ph n ng Nh n đ nh k t qu H P U H 78 9.1 Kết qu đ nh tính: Kết qu đ nh tính cho biết mẫu xét nghiệm có hay khơng có kháng thể kháng nguyên Thông thư ng kết qu ph n ng đư c ký hiệu m c đ dương tính (+, + +, + + +) , khơng rõ dương tính hay âm tính (+/-), âm tính (-) 9.2 Kết qu đ nh lư ng Chẩn đoán gián tiếp bệnh nhiễm trùng qua việc xác đ nh kháng thể huyết đư c g i chẩn đoán huyết h c Kết qu đ nh lư ng chẩn đoán huyết cho biết hiệu giá kháng thể Thông thư ng kháng thể ngư i bệnh đư c pha loãng dần theo c p sô Đậm đ huyết th p nh t cho kết qu dương tính đậm đ hiệu giá Các ph n ng đ nh lư ng cần thiết để theo dõi đ ng lực kháng thể c a huyết kép thư ng l y cách ngày Đ ng lực kháng thể đại lư ng đặc trưng cho m c đ thay đổi hiệu giá kháng thể theo th i gian Đối với bệnh virus hiệu giá kháng thể thư ng tăng lên lần 9.3 Ranh giới hiệu giá Là ranh giới hiệu giá kháng thể bình thư ng hiệu giá bệnh lý Liên cầu thư ng cư trú hầu hết m i ngư i nên huyết c a hầu hết m i ngư i có kháng thể kháng streptolysin O (ASO) Vì ngư i ta xem 1/200 (200 đơn v /ml), hiệu giá ranh giới Chỉ huyết có 400 đơn v /ml tr lên bệnh lý 9.4 Kết qu dương tính gi Dương tính gi kỹ thuật chưa tốt trạng thái sinh lý c a ngư i bệnh Trong huyết h c cổ điển chẩn đoán giang mai với kháng nguyên lipoit th y nhiều kết qu dương tính gi (sốt rét, m t số bệnh ký sinh trùng khác ) Trong thực tế ngư i ta thực nhiều ph n ng huyết h c khác m t lúc để kiểm tra dương tính gi Ví d Kolmer, Kaln, VDRL nh t dùng kháng nguyên đặc hiệu để tránh dương tính gi , ví d TPI, FTA-Abs 9.5 Kết qu âm tính gi Có nhiều ngun nhân dẫn đến tư ng âm tính gi như: thành phần tham gia ph n ng không đư c chuẩn đ , lư ng kháng thể nhiều so với kháng nguyên ngư c lại, kháng thể mẫu kháng nguyên mẫu b hỏng Để khắc ph c tư ng dương tính gi , âm tính gi ph i chuẩn đ thành phần tham gia ph n ng, đ m b o điều kiện c a ph n ng (dung d ch đệm, nhiệt đ , th i gian ) ph i ln có ch ng dương, ch ng âm H P U H 79 TÀI LI U THAM KH O Abul Abbas, Andrew Lichtman, Shiv Pilai, 2007, Cellular and Molecular Immunology Vũ Triệu An c ng (1981) Những kỹ thuật dùng miễn d ch h c Tập I, Nhà xu t b n Y h c Vũ Triệu An c ng (1982) Những kỹ thuật dùng miễn d ch h c Tập II, Nhà xu t b n Y h c H P U H 80 BÀI NGUYÊN LÝ VÀ NG D NG C A M T S XÉT NGHI M MI N D CH C B N TRONG CH N ĐỐN B NH KHƠNG TRUY N NHI M M C TIÊU BÀI H C Sau kết thúc học, sinh viên/học viên có thể: Trình bày đư c nguyên lý c a kỹ thuật miễn d ch ng d ng chẩn đoán theo dõi điều tr d ng tự miễn Trình bày đư c guyên lý c a kỹ thuật miễn d ch ng d ng chẩn đoán theo dõi điều tr bệnh liên quan đến bổ thể Trình bày đư c nguyên lý c a kỹ thuật miễn d ch kh o sát lympho bào Trình bày đư c nguyên lý ng d ng c a kỹ thuật miễn d ch điều tr lâm sàng H P N I DUNG BÀI H C M t s xét nghi m mi n d ch ng d ng ch n đoán d ng t mi n 1.1 Xét nghiệm miễn d ch ng d ng chẩn đoán d ng Thử nghiệm bì (test bì) thư ng xét nghiệm b n ng d ng chẩn đoán d ng viêm mũi d ng vì: (1) m t ph n ng typ I qua trung gian c a IgE; (2) giúp phát kháng nguyên liên quan Xét nghiệm lẩy da (prick test) xét nghiệm thư ng đư c sử d ng d ng ch t đem thử đư c đưa vào da nh m t đầu kim đưa xuyên qua m t gi t ch t mặt da lẩy da lên Ch t đư c thử nghiệm ph i tinh khiết có hoạt tính tốt, thử nghiệm cho kết qu tốt Mặc dù có sẵn nhiều chế phẩm tương đối tinh khiết c a n c ong, ph n hoa, b b i, lông thú m t số kháng nguyên thực phẩm tr ng, cá, loại hạt vỏ c ng có nhân Tuy nhiên, m t số bệnh nhân atopy thư ng cho thử nghiệm lẩy da dương tính với nhiều kháng ngun, có m t loại kháng nguyên gây triệu ch ng lâm sàng Thử nghiệm kích thích (provocation test) thử nghiệm kích thích niêm mạc mũi niêm mạc phế qu n kháng nguyên ng d ng quan tr ng c a xét nghiệm miễn d ch d ng đ nh lư ng IgE Vì lư ng IgE bình thư ng huyết th p (120- 480 ng/ml) Lư ng IgE thư ng đư c tính IU (Đơn v quốc tế, IU = 2,4 ng IgE) Trước đ nh lư ng IgE thư ng đư c thực phương pháp “kỹ thuật h p th miễn d ch phóng xạ gi y” (paper radioimmunosorbent technique, PRIST) Kỹ thuật h p th d ng phóng xạ (radioallergosorbent technique, RAST) cho phép đ nh lư ng đư c kháng thể IgE đặc hiệu kháng nguyên Kháng nguyên đư c gắn lên t m đĩa nhỏ gi y lên hạt khơng hồ tan; sau cho huyết thử vào kháng thể IgE đặc hiệu đư c giữ lại sau rửa Kháng thể IgE đặc hiệu đư c phát kháng thể th c p có đánh d u phóng xạ U H 81 Hiện theo hướng dẫn nh t c a B Y tế, IgE đư c đ nh lư ng phương pháp ELISA đ nh lư ng máy xét nghiệm tự đ ng Máy xét nghiệm Cobas e411, e170… Khảo sát phức hợp miễn dịch: R t nhiều ch ng cho th y ph c h p miễn d ch tham gia vào chế bệnh sinh c a tổn thương mô nhiều bệnh c a ngư i Việc tham gia gây triệu ch ng lâm sàng c a ph c h p miễn d ch thư ng đư c đánh giá hai cách: cách th nh t phân tích hình nh tổn thương mơ để tìm ch ng c a lắng đ ng ph c h p miễn d ch, cách tìm ph c h p miễn d ch huyết d ch thể Có nhiều phương pháp phát ph c h p miễn d ch lưu đ ng Nguyên lý c a phương pháp phát immunoglobulin có ph c h p mà không cần ý b n ch t c a kháng nguyên Những xét nghiệm ph thu c vào th thể bổ thể không phát đư c ph c h p có mang kháng thể thu c loại khơng cố đ nh hoạt hóa bổ thể Những thử nghiệm th thể Fc không phát đư c ph c h p ch a immunoglobulin không ph i IgG Theo báo cáo c a cơng trình h p tác c a Tổ ch c Y tế giới, ngư i ta th y rõ có m t số xét nghiệm (đặc biệt xét nghiệm liên kết C1q, thử nghiệm conglutinin, thử nghiệm c chế yếu tố th p đơn dòng, xét nghiệm dùng tế bào Raji) giúp phân biệt đư c huyết bình thư ng Kết qu dương tính c a xét nghiệm ch ng tỏ có diện c a ph c h p miễn d ch lưu đ ng máu bệnh nhân 1.2 Xét nghiệm miễn d ch ng d ng chẩn đoán tự miễn 1.2.1 Miễn d ch huỳnh quang gián tiếp Đây kỹ thuật thư ng đư c dùng để phát nhiều loại tự kháng thể huyết Ngư i ta thư ng dùng mô đ ng vật để làm ch t kháng nguyên diện chung c mô ngư i lẫn mô đ ng vật Vật phẩm mô đư c cho đông lạnh sau l y khỏi thể đư c cắt lạnh – 2000C Huyết bệnh nhân đư c với ch t (mô) 30 phút Kháng thể không gắn vào mô đư c rửa sạch, sau cho kháng thể c p hai có gắn huỳnh quang đặc hiệu với immunoglobulin c a huyết bệnh nhân, đư c phát kính hiển vi huỳnh quang M i tự kháng thể đư c xác đ nh m t kiểu bắt màu huỳnh quang đặc biệt m t ch t đặc biệt Kết qu đ nh lư ng đư c tính tỉ lệ hiệu giá (ví d 1/4, 1/8, 1/32,…) IU (đơn v quốc tế) Việc phân tích kết qu c a xét nghiệm miễn d ch huỳnh quang gián tiếp ph thu c vào lớp kháng thể, hiệu giá c a chúng, tuổi giới tính c a bệnh nhân Ngư i già, nh t ph nữ thư ng có s n xu t tự kháng thể mà khơng xu t triệu ch ng lâm sàng c a bệnh tự miễn Ngư c lại, hiệu giá tự kháng thể cao ngư i trẻ thư ng liên quan đến bệnh tự miễn tiềm ẩn xu t sau 1.2.2 Ngưng kết Kỹ thuật ngưng kết dung để phát yếu tố th p (m t kháng thể IgM ph n ng với IgG đóng vai trị kháng ngun) Ngư i ta sử d ng hạt latex gắn với IgG ngư i hạt ngưng kết gặp yếu tố th p Đây m t xét nghiệm H P U H 82 thư ng sử d ng để sàng l c yếu tố th p, nhiên chúng thư ng cho ph n ng dương tính gi , đó, huyết dương tính sau ph i làm lại với xét nghiệm Waaler- Rose Trong ph n ng Waaler- Rose, kháng thể IgG thỏ (có đ nh kháng nguyên chung với IgG ngư i) đư c dùng để gắn lên hồng cầu cừu M t liều ngưng kết c a kháng thể đư c đem với hồng cầu cừu hồng cầu th “đã mẫn c m” đư c dùng để phát yếu tố th p ch t có kh làm ngưng kết hồng cầu cừu mẫn c m, ch không làm ngưng kết hồng cầu nguyên b n Hồng cầu không mẫn c m đư c dùng để phát kháng thể tự nhiên hồng cầu cừu Kết qu c a ph n ng Waaler- Rose đư c tính IU/ml tính thành tỉ số hiệu giá Yếu tố th p thư ng đư c sử d ng để theo dõi tiên lư ng c a bệnh 1.2.3 Điện di miễn d ch ngư c dòng (countercurrent electro- phoresis) Phương pháp đư c dùng để phát kháng thể nhiều loại kháng nguyên nhân chiết xu t nước muối kháng nguyên bào tương mà ta g i chung “kháng nguyên nhân chiết xu t (ENA)” Tuyến c c a bê thỏ đư c dùng làm nguồn cung c p phần lớn kháng nguyên nhân, kháng nguyên Ro/SSA kháng nguyên bào tương đư c tách chiết từ lách ngư i Huyết c a m i cá thể thư ng ch a kháng thể chống lại nhiều kháng nguyên; tính đặc hiệu kháng thể thư ng th y m t nhóm nhỏ bệnh, mà kháng thể có tính chẩn đốn bệnh Trong xét nghiệm này, ngư i ta điện di kháng nguyên kháng Với pH thích h p, kháng ngun có tính acid di chuyển nhanh chóng phía anode cịn kháng thể chạy phía cathode Nếu huyết bệnh nhân có ch a kháng thể thích h p tạo thành m t đư ng t a l ch a kháng nguyên kháng thể 1.2.4 Phương pháp miễn d ch phóng xạ (RIA) miễn d ch enzym (ELISA) Đây phương pháp r t nhậy dùng để phát tự kháng thể với nồng đ th p Bệnh nhân b nghi ng mắc SLE thư ng đư c đ nh làm xét nghiệm đ nh tính kháng thể chống DNA chu i kép Kháng thể thư ng đư c phát cách dùng 14C- DNA, 125I- DNA DNA đánh d u phóng xạ trước cách cho 14C- thymidine vào môi trư ng c y để vi khuẩn tiêu th M t ch t l y từ n c rắn có tên α- bungarotoxin có kh liên kết r t mạnh với th thể c a Acetylcholine d ch chiết xu t l y từ vân ngư i Ch t đư c sử d ng để làm xét nghiệm tìm kháng thể chống th thể acetylcholine (AChR) Alpha- bungarotoxin tinh khiết đư c đánh d u iod phóng xạ cho kết h p với ch t chiết xu t từ ngư i Kháng thể AChR ph n ng với ch t làm t a kháng huyết kháng Ig ngư i Đây m t xét nghiệm r t nhậy; kho ng 90% bệnh nhân c nặng cho kết qu dương tính làm xét nghiệm 1.2.5 Hóa mơ miễn d ch Kh o sát phương pháp hóa mơ miễn d ch (immunohistochemical) mẫu sinh thiết l y từ mơ bình thư ng bệnh lý đư c sử d ng xét nghiệm lắng đ ng immunoglobulin, bổ thể, đơi có c kháng nguyên H P U H 83 Các mẫu sinh thiết để dùng cho xét nghiệm kỹ thuật miễn d ch huỳnh quang không đư c cố đ nh, ph i đư c chuyển cho phịng thí nghiệm nhiệt đ lạnh Sau đó, chúng đư c làm đông lạnh đ t ng t cắt mỏng; lát cắt đư c rửa nước muối để gi m đ nhu m bẩn c a trước cho với kháng huyết có c ng h p (conjugate) thích h p M t mẫu song song đư c nhu m với hematoxylin eosin để xem hình nh hình thái h c Kỹ thuật thư ng đư c dùng cho mẫu sinh thiết thận, da t y xương thư ng đư c sử d ng chẩn đoán Kh o sát bổ th Các phương pháp dùng để kh o sát bổ thể huyết đư c chia làm hai; kỹ thuật đo hoạt tính ch c gây tan máu, kỹ thuật nhận diện b n ch t kháng nguyên c a m i thành phần bổ thể 2.1 Đánh giá ch c Kỹ thuật gây tan máu kỹ thuật đư c dùng phổ biến nh t phịng thí nghiệm thư ng quy Chỉ số thư ng đư c đánh giá CH50 (bổ thể gây tan máu toàn phần) Kỹ thuật tính lư ng huyết cần thiết (t c lư ng bổ thể cần thiết) để gây ly gi i 50% số lư ng hồng cầu mẫn c m Huyết bệnh nhân đư c đ nh hiệu giá dựa theo m t huyết chuẩn Đây m t xét nghiệm đư c đ nh bệnh nhân nghi ng b thiếu h t di truyền m t thành phần bổ thể đó, bệnh nhân thư ng b nhiễm trùng lặp lặp lại bệnh nhân thành viên c a m t gia đình b SLE hay h i ch ng giống SLE (SLE – like) 2.2 Xét nghiệm thành phần bổ thể Xét nghiệm phần bổ thể đư c sử d ng nhiều nh t đ nh lư ng C3 C4 phương pháp hóa miễn d ch Tuy nhiên, thành phần thay đổi tăng mạnh viêm, ngư i ta thư ng đ nh lư ng thêm m t số protein khác vào th i điểm đ nh lư ng bổ thể Bổ thể đư c chia thành ba nhóm theo vai trò c a chúng bao gồm: (1) thành phần sớm c a đư ng cổ điển (C1, C4 C2 ); (2) thành phần sớm c a đư ng không cổ điển (Yếu tố B, D P); (3) thành phần mu n chung cho c hai đư ng (C3 đến C9 ) Khi lư ng C3 C4 th p yếu tố B bình thư ng hoạt hóa x y theo đư ng cổ điển; c C3, C4 yếu tố B th p có lẽ đư ng khơng cổ điển đư c hoạt hóa theo lối vịng cung ph n hồi (feedback loop) hoạt hóa đồng th i Nếu lư ng C4 bình thư ng cịn C3 yếu tố B th p có nghĩa đư ng không cổ điển đư c hoạt hóa Việc đo C3 C4 nhiều lần giúp ích cho việc theo dõi bệnh nhân b mắc m t số dạng bệnh viêm cầu thận, SLE viêm mạch 2.3 Phát s n phẩm phân cắt c a C3 Xét nghiệm thư ng đư c sử d ng trư ng h p bệnh nhân b sốc n i đ c tố, t c thể có kh hoạt hóa C3 theo đư ng khơng cổ điển Đ di chuyển điện di c a C3 s n phẩm phân cắt c a (ví d C3dg) khác Đối với mẫu huyết tương l y từ bệnh nhân có phân cắt C3 in vivo s n phẩm phân cắt phát đư c huyết tương chống đông EDTA, trong mẫu huyết tương bình thư ng phát C3 cịn ngun vẹn H P U H 84 2.4 Yếu tố viêm thận C3 (C3NeF) Yếu tố viêm thận C3 m t tự kháng thể chống C3 hoạt hóa Tự kháng thể làm bền vững enzym C3 convertase c a đư ng không cổ điển cho phép phân cắt C3 tiếp t c x y Trên bệnh nhân mắc bệnh thận nhiễm trùng tái tái lại có m c C3 th p khơng gi i thích đư c, ngư i ta thư ng đ nh làm xét nghiệm C3NeF Yếu tố đư c phát cách cho huyết bệnh nhân với huyết bình thư ng; yếu tố viêm thận C3 c a bệnh nhân phân cắt C3 huyết bình thư ng đ nh lư ng C3c h n h p Kh o sát lympho bào Ngư i ta thư ng có ba kiểm xét nghiệm đánh giá tế bào: (1) đếm số lư ng loại tế bào; (2) thử nghiệm in vivo; (3) đánh giá ch c c a loại tế bào 3.1 Đếm số lư ng tế bào lympho Đếm số lư ng tế bào lympho tiểu quần thể lympho T lympho B đư c sử d ng r t nhiều bệnh thiếu h t miễn d ch tăng sinh lympho Xét nghiệm ngày đư c áp d ng cho bệnh nhân nhiễm HIV để đánh giá m c đ suy gi m miễn d ch tiên lư ng bệnh Trong xét nghiệm này, ngư i ta đếm tế bào trực tiếp từ máu tồn phần tế bào lympho tách Việc tách tế bào lympho từ máu toàn phần đư c thực cách pipet máu chống đông heparin lên lớp Ficoll có tỉ tr ng thích h p Sau ly tâm, hồng cầu bạch cầu múi chìm vào lớp Ficoll để lại tồn b tế bào lympho m t vài monocyte bề mặt c a lớp Ficoll Máu toàn phần hay tế bào lympho khiết đư c với kháng thể đặc hiệu gắn huỳnh quang với marker bề mặt (CD) Các tế bào dương tính đếm đư c kính hiển vi máy đếm tế bào dòng ch y Tế bào lympho bào nhu m qua m t chùm tia laser tia sáng phát từ ch t đánh d u tế bào đư c m t c m biến tiếp nhận Các tín hiệu điện tử thu đư c giúp để phân tích tiểu quần thể tế bào 3.2 Ph n ng da mẫn mu n (in vivo) Có hai loại ph n ng da in vivo đư c dùng để phát lympho bào T mẫn c m đặc hiệu, là: thử nghiệm n i bì, dùng kháng nguyên tiêm vào lớp n i bì, thử nghiệm áp: áp kháng nguyên lên da để h p th qua da Thử nghiệm n i bì phổ biến nh t ph n ng tuberculin (Mantoux), dẫn xu t protein tinh khiết (PPD) c a tuberculin m t ch t chiết xu t từ Mycobacterium hominis Ph n ng đư c đ c sau 48 gi dương tính với ch tiêm đỏ c ng không ng a hay đau Ph n ng có cư ng đ tối đa sau 72 gi nhạt dần sau nhiều ngày Hình nh phân biệt dễ dàng với ph n ng Arthus, ph n ng xu t sau tiêm 12 – 24 gi , có phù đơi ng a Trên 75% quần thể ngư i lớn cho kết qu dương tính ph n ng tuberculin Nếu ph n ng x y mạnh có nghĩa có nhiễm trùng mycobacterium hoạt đ ng thể kết qu r t có ích cho chẩn đoán trư ng h p nghi ng mắc lao; cịn ph n ng âm tính nói lên thể trước chưa tiếp xúc với vi khuẩn lao hệ miễn d ch tế bào b suy gi m H P U H 85 Ph n ng bì cho biết rằng, trước bệnh nhân đư c mẫn c m với kháng nguyên đư c thử Để tránh kh ph n ng âm tính chưa tiếp xúc, xét nghiệm tình trạng suy gi m miễn d ch ngư i ta dùng m t panel kháng nguyên thư ng gặp để thử Panel thư ng bao gồm PPD, Candida albicans, streptokinase- streptodornase, quai b trichophyton; 95% ngư i lớn bình thư ng đáp ng với nh t m t kháng nguyên này, trẻ em chưa tiêm phịng chưa tiếp xúc với kháng ngun nói mơi trư ng B i ch ng thiều h t tế bào lympho T tiên phát thư ng thể vào tuổi trẻ em nên dùng thêm thử nghiệm DNCB (dinitro- choloro- benzene) để đánh giá Bệnh nhân đư c cho mẫn c m với DNCB cách bôi lên da 10 ngày sau cho thử thách lại với DNCB đư c hịa lỗng nhiều lần Với ngư i bình thư ng ph n ng dương tính xu t vòng 48 gi với đỏ c ng da Thử nghiệm áp thử nghiệm thư ng đư c sử d ng cần xác đ nh kháng nguyên gây viêm da tiếp xúc M t số kháng nguyên dễ dàng h p th bơi lên da, số khác h p th đư c cho lên gi y cellulose dán vào da Sự lựa ch n kháng nguyên ph thu c vào tiền sử tiếp xúc, nhiều bệnh nhân nhạy c m lúc với nhiều kháng nguyên Th i gian để ph n ng dương tính xu t ph thu c vào m c đ h p th thay đổi thư ng đư c đ c sau 2-4 ngày 3.3 Các thử nghiệm ch c Các thử nghiệm ch c in vitro miễn d ch tế bào thư ng tiến hành triệu ch ng lâm sàng cho th y có kh có b t thư ng c a miễn d ch tế bào, thư ng đư c sử d ng nghi ng bệnh nhân thiếu h t miễn d ch theo dõi điều tr liệu pháp miễn d ch Khi tế bào lympho đư c cho tiếp xúc với m t ch t kích thích đó, m t số tế bào lympho nhỏ đáp ng cách chuyển dạng thành nguyên bào th i gian vài ngày Đáp ng tăng sinh sau kích thích đo đư c kỹ thuật cho thâm nhập thymidine có đánh d u phóng xạ vào DNA c a tế bào lympho c chế di t n bạch cầu (leukocyte migration inhibition, LMI) m t thử nghiệm dễ thực không đư c dùng làm xét nghiệm thư ng quy Lympho T s n xu t lymphokin đư c tiếp xúc với kháng nguyên mà chúng đư c mẫn c m trước M t lymphokin gây c chế di chuyển c a m t số tế bào trung tính, ch t đư c g i yếu tố c chế di t n bạch cầu đ nh lư ng đư c m t số kỹ thuật thư ng quy Đánh giá t bào trung tính t bào mono 4.1 Đếm số lư ng tế bào trung tính tế bào mono: Số lư ng tuyệt đối c a tế bào máu tính dễ dàng từ cơng th c máu 4.2 Tạo “cửa sổ da” Kh tập trung tế bào trung tính tế bào mono ổ viêm ph thu c vào s n xu t ch t thu hút có tính hóa hướng đ ng tế bào kh tế bào di chuyển nơi có yếu tố thu hút Xét nghiệm đư c thực cách tạo m t ch trầy da tối thiểu (thư ng cẳng tay), sau đánh gái tốc đ tế bào đến xu t nơi trầy da cách thu thập tế bào m t t m lam kính nhỏ đặt lên ch trầy da Để cho việc thu H P U H 86 thập tế bào viêm đư c chắn ngư i ta thư ng bơi lên ch trầy m t ch t hóa hướng đ ng (với số lư ng đ nh sẵn) 4.3 Thử nghiệm ch c in vitro Tế bào trung tính tách đư c từ máu toàn phần dùng phương pháp li tâm gradient tỉ tr ng mơ t tách lympho, sau đư c làm cho khiết cách cho ly gi i toàn b hồng cầu b lẫn vào Tế bào mono thu hoạch đư c lớp giao diện (interface) với lympho bào tách riêng cách cho bám dính lên bề mặt th y tinh ch t dẻo rửa tế bào lympho (Tế bào mono tế bào bám dính, khác với tế bào lympho.) Hóa hướng đ ng di chuyển có m c đích c a tế bào phía ch t thu hút mà thư ng casein m t peptid tổng h p f- Met- Leu- Phe Kh tạo tính hóa hướng đ ng c a huyết bệnh nhân kh o sát đư c cách huyết tươi với n i đ c tố Các tế bào cần thử nghiệm đư c tách từ kích thích hóa hướng đ ng m t màng siêu l c (có l r t nhỏ) Sau , màng l c đư c l y ra, cố đ nh nhu m Kho ng cách tế bào di chuyển đư c qua màng l c hướng đến kích thích đo đư c kính hiển vi quang h c Thực bào ch c “ăn” vật lạ c a m t tế bào Kh ăn xác đ nh đư c cách tế bào thực bào với hạt trơ hạt latex, vi khuẩn Các hạt hay vi khuẩn bên tế bào thực bào th y đư c kính hiển vi Chúng ta khuếch đại kh thực bào để dễ quan sát cách cho opsonin hóa hạt trước với huyết bình thư ng cho vào mơi trư ng có tế bào thực bào Hoạt tính enzym n i bào (intracellular enzyme activity) đánh giá đư c thử nghiệm giết vi khuẩn (bacterial killing) kh khử thuốc nhu m (dye reduction) M t thử nghiệm kh diệt khuẩn n i bào chuẩn bao gồm bạch cầu với vi khuẩn sống t cầu vàng chẳng hạn Sau , tế bào đư c ly tâm loại bỏ vi sinh vật ngoại bào Vi khuẩn đư c ăn vào, chưa b giết chết, đư c đánh giá cách cho ly gi i tế bào nước c t gi i phóng vi khuẩn bên ra; vi khuẩn đư c nuôi c y thạch dinh dưỡng để xem tỉ lệ vi khuẩn sống Nếu kh thực bào bình thư ng số lư ng vi khuẩn sống ph n ánh m c đ giết n i bào Thử nghiệm nitroblue tetrazolium (NBT) giúp đánh giá kh “ăn” c a thực bào khử thuốc nhu m NBT từ màu vàng sang để chuyển sang màu xanh Các tế bào phân lập đư c cho vào dung d ch ch a NBT Sau , tế bào đư c đem rửa chiết xu t NBT đư c ăn vào bên tế bào đo m c đ khử quang phổ kế M t cách khác tế bào đư c quan sát kính hiển vi đếm số lư ng bạch cầu múi có ch a tinh thể xanh Các tế bào thực bào khử NBT chúng đư c hoạt hóa Số lư ng tế bào hoạt hóa máu ngoại biên bình thư ng r t thay đổi; có ngư i cho số lư ng tế bào hoạt hóa tăng cao có nhiễm trùng vi khuẩn, điều tranh cãi Trong xét nghiệm c i tiến từ thử nghiệm có tên “thử nghiệm NBT hoạt hóa”, ngư i ta cho “mồi” tế bào trước cách cho chúng tiếp xúc với m t lư ng nh t đ nh n i đ c tố trước cho tiếp xúc NBT Thử nghiệm có ưu điểm H P U H 87 khơng ph thu c vào hoạt hóa tế bào trung tính in vivo xem m t xét nghiệm sàng l c dễ làm dùng r ng rãi Khi làm thử nghiệm phát lân quang (chemiluminescence): tế bào trung tính (c a ngư i bình thư ng) phát m t chùm tia sáng có đ dài sóng lớn đư c kích thích b i hạt đư c opsonin hóa Thử nghiệm giúp phát kh opsonin hóa c a huyết m t cách đáng tin cậy, kết qu thu đư c dùng tế bào trung tính c a ngư i bệnh thay đổi đòi hỏi ph i làm thêm xét nghiệm khác M t ưu điểm c a kỹ thuật đánh giá huyết bệnh nhân với vi sinh vật mà bệnh nhân nhiễm Kỹ thuật iode hóa protein cho phép đánh giá tính ngun vẹn c a chế giết myeloperoxidase – hydrogene peroxide Enzym phát đư c nh tính ch t c a chuyển iodua kali 125I thành iodua ion gắn vào protein n i bào Tỉ lệ “125I tự do/125I gắn protein” cho phép đánh giá kh s n xu t enzym c a tế bào trung tính S n xu t kháng huy t dùng cho phịng thí nghi m mi n d ch lâm sàng Kháng huyết đư c sử d ng thử nghiệm thư ng đư c s n xu t đ ng vật cách tiêm kháng nguyên cần thiết vào thể đ ng vật Trong năm vừa qua ngư i ta tạo đư c m t bước tiến quan tr ng s n xu t kháng thể huyết s n xu t kháng thể đơn dòng, t c kháng thể đư c s n xu t b i m t dòng tế bào, phân tử kháng thể đư c s n xu t hoàn toàn giống c vùng thay đổi vùng đ nh c a chúng Những kháng thể đơn dòng ph n ng với m t đ nh kháng nguyên kháng nguyên Khi đư c tiêm kháng nguyên nh t đ nh vào thể qua đư ng máu, chúng đư c đưa tới lách tế bào lympho B hoạt hóa biệt hóa thành tế bào ch c Chúng ta biết h n d ch tế bào lách c a vật đư c gây mẫn c m, có ch a nhiều tế bào lympho B ch u trách nhiệm s n xu t nhiều kháng thể chống nhiều epitope khác kháng nguyên đưa vào Những tế bào lympho B đư c cho “lai” với m t dịng tế bào u t y khơng s n xu t kháng thể để tạo nên m t tế bào lai mang kh b t tử c a tương bào ác tính Các tế bào lai sau đư c tách ch n dịng Việc ni c y quy mơ lớn giúp cung c p số lư ng đáng kể kháng thể tinh khiết cho ph n ng với đ xác cao Kỹ thu t Sinh h c phân t mi n d ch lâm sàng Những tiến b sinh h c phân tử năm qua m nhiều ng d ng quan tr ng chẩn đoán điều tr bệnh miễn d ch 6.1 ng d ng chẩn đoán Kỹ thuật khuyếch đại DNA cung c p cho m t phương tiện chẩn đoán trước sinh (prenatal diagnosis) xác bệnh di truyền Kỹ thuật giúp chẩn đoán giai đoạn tiền lâm sàng bệnh nhiễm sắc thể có th i kỹ kh i bệnh mu n, bệnh ph nữ liên quan giới tính, kể c thiếu h t miễn d ch di truyền Ngư i ta ghi nhận thử nghiệm gene đư c sử d ng ngày nhiều cho việc chẩn đoán bệnh Việc phát tư ng tái xếp (rearrangement) c a gene immunoglobulin c a gene th thể tế bào lympho T H P U H 88 (TCR gene) cung c p cho m t công c để phân tích nguồn gốc c a tế bào lympho ác tính khơng mang d u n kinh điển c a tế bào lympho B tế bào lympho T, tìm nguồn gốc c a tế bào ung thư bệnh bạch cầu tế bào dạng tóc (hairy cell leukemia), tăng sinh d i nguyên bào bệnh bạch cầu t y mạn giúp phân biệt bệnh tăng sinh lympho đa dòng đơn dòng ng d ng điều tr Kỹ thuật DNA tái tổ h p mang lại nhiều tiến b điều tr thông qua việc tổng h p h p ch t sinh h c liệu pháp gene Các enzym endonuclease giới hạn (restriction endonuclease) enzym tách từ vi khuẩn có kh cắt s i DNA v trí liên quan đến m t trình tự nucleotid nh t đ nh Những gene sau đư c gắn vào m t plasmid làm vật truyền sau cho nhân lên thành clôn Phương pháp đư c ng d ng s n xu t nhiều loại hormone (ví d insulin), thuốc điều hịa miễn d ch (ví d interferon) s n xu t vaccine (ví d vaccine viêm gan B) Hiện nhà nghiên c u cố gắng để tìm vaccine có hiệu qu khác nhằm chống lại bệnh nhiễm trùng phổ biến giới sốt rét HIV M t m c đích c a cơng nghệ gene thay đư c gene b khiếm khuyết thể ngư i Liệu pháp gene nhiều tranh cãi rối loạn miễn d ch thiếu h t adenosine deaminase purine nucleoside phosphorylase đư c nghiên c u ng cử viên tiềm cho việc sử d ng liệu pháp để điều tr 6.2 H P U H 89 TÀI LI U THAM KH O Abul Abbas, Andrew Lichtman, Shiv Pilai, 2007, Cellular and Molecular Immunology Vũ Triệu An, Homberg J.C 2001 Miễn d ch h c Nhà xu t b n Y h c H P U H 90