Thực hành xét nghiệm miễn dịch

TR NG Đ I H C Y T CÔNG C NG TRUNG TÂM XÉT NGHI M H P TH C HÀNH XÉT NGHI M MI N D CH GIÁO TRÌNH DÀNH CHO C NHÂN XÉT NGHI M Y H C D U H HÀ N I - 2016 PHÒNG Ch biên TS Đặng Vũ Ph ơng Linh Tham gia biên so n PGS.TS Lê Thị Minh H ơng TS Nguyễn Thanh Bình TS Nguyễn Triệu Vân TS Phạm Việt Hùng Th ký biên so n H P BS Đặng Minh Điềm CN Phan Thị Quỳnh H U L I NÓI Đ U Năm 2016, để ph c v nhu cầu đào tào cán bậc đại học, chuyên ngành Xét nghiệm Y học dự phịng, mơn học “Xét nghiệm Miễn dịch” bắt đầu đ ợc đ a vào giảng dạy Tr ờng Đại học Y tế Cơng cộng Vì mơn học cần thiết cho công việc xét nghiệm y học dự phòng t ơng lai c a cán y tế, thấy cần thiết phải biên soạn cu n giáo trình nhằm hỗ trợ cho q trình thực hành phịng thí nghiệm c a sinh viên Giáo trình “Thực hành Xét nghiệm Miễn dịch” tài liệu đầy đ cập nhật H P nội dung kiến thức, nh kỹ thuật xét nghiệm tiến tiến chuyên ngành Miễn dịch học giới Việt Nam Trong q trình biên soạn, chúng tơi c gắng thể tính bản, tính đại, tính khoa học tính hệ th ng c a ch ơng trình thực hành mơn học Trong thời gian biên soạn có hạn, hẳn khơng tránh kh i cịn tồn s U sai sót khơng mong mu n Chúng mong mu n nhận đ ợc thông tin phản hồi quý báu c a quý bạn đọc để cu n giáo trình hồn thiện lần tái tới Xin trân trọng cảm ơn! H Thay m t nhóm tác gi Ch biên TS Đ ng Vũ Ph ng Linh M CL C BÀI K THU T SERODIA 1 Nguyên tắc Các býớc tiến hành BÀI K THU T TÁCH VÀ Đ M T BÀO Kỹ thuật tách tế bào bạch cầu Ficoll Kỹ thuật đếm tế bào bạch cầu kính hiển vi quang học BÀI K THU T ELISA PHÁT HI N S CÓ M T C A KHÁNG NGUYÊN H P Nguyên lý Thiết bị cần thiết Các loại ELISA 10 Thực hành kỹ thuật ELISA phát kháng nguyên HBsAg 11 BÀI K THU T XÉT NGHI M MI N D CH NG D NG TRONG CH N ĐOÁN KÝ SINH TRÙNG 14 U Nguyên tắc 14 D ng c hóa chất 14 H Quy trình kỹ thuật 15 Biện luận kết 15 BÀI K THU T ELISA PHÁT HI N S CÓ M T C A KHÁNG TH 17 Nguyên lý c a kỹ thuật ELISA gián tiếp 17 Chuẩn bị 18 BÀI K THU T T BÀO DÒNG CH Y 21 Cấu tạo máy tế bào dòng chảy 21 Cơ chế nhuộm kháng nguyên bề mặt tế bào trình thu nhận tín hiệu 21 Quy trình kỹ thuật nhuộm tế bào lympho CD4 22 BÀI K THU T ELISA Đ NH L NG KHÁNG TH TRÊN M T S B NH TRUY N NHI M 25 Nguyên lý 25 Chuẩn bị 25 BÀI PH NG PHÁP Đ M B O CH T L NG TRONG XÉT NGHI M MI N D CH 28 Đảm bảo chất l ợng giai đoạn xét nghiệm 28 Kiểm soát chất l ợng 28 Quy trình kiểm sốt chất l ợng nội 29 Các nguyên nhân gây lỗi 32 Ngoại kiểm 32 H P BÀI Đ C THÊM 1: K THU T L Y MÁU, B O QU N VÀ X LÝ B NH PH M 34 Kỹ thuật lấy máu 34 Quy cách bảo quản bệnh phẩm (bệnh phẩm máu): 35 Đóng gói, bảo quản vận chuyển mẫu 36 Thực hành lấy máu tĩnh mạch tách huyết 37 U BÀI Đ C THÊM 2: K THU T TEST NHANH 40 Kỹ thuật Miễn dịch sắc ký 40 Kỹ thuật Miễn dịch gắn ENZYME (Kỹ thuật ELISA – Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) 41 H BÀI Đ C THÊM 3: K THU T NGÝNG K T 43 Nguyên lý 43 Ng ng kết ch động – Phản đứng định nhóm hồng cầu ABO 43 Phản ứng ng ng kết hồng cầu xác định cúm 44 Phản ứng ức chế ng ng kết hồng cầu (Hemagglutin Inhibition Test) 45 BÀI Đ C THÊM 4: K THU T HĨA MƠ MI N D CH 49 Nguyên lý 49 Chỉ định 50 Chuẩn bị 50 Các b ớc tiến hành 51 BÀI Đ C THÊM 5: XÉT NGHI M MI N D CH NG D NG TRONG 54 L A CH N VÀ THEO DÕI GHÉP 54 Xét nghiệm định typ HLA (HLA typing) 54 Xét nghiệm đọ chéo lympho (Lympho cross match) 55 H P H U BÀI K THU T SERODIA M C TIÊU BÀI H C Sau học xong này, sinh viên có khả năng: Trình bày đ ợc nguyên lý c a kỹ thuật SERODIA ứng d ng chẩn đoán s bệnh truyền nhiễm Trình bày tiến hành đ ợc b ớc kỹ thuật Phân tích nhận định kết N I DUNG K thu t TPHA ch n đoán giang mai Nguyên tắc TPHA kỹ thuật ng ng kết hồng cầu gián tiếp nhạy cảm đặc hiệu để phát kháng thể kháng Treponema pallidum Hồng cầu hạt gel đ ợc gắn kháng nguyên thành phần c a Treponema pallidum gây bệnh (ch ng Nichol’s) Phản ứng ng ng kết hồng cầu xảy huyết ng ời bệnh có chứa kháng thể kháng Treponema pallidum gắn với hồng cầu hạt gel tạo nên phản ứng ng ng kết nhìn thấy đ ợc mắt th ờng Các býớc tiến hành 2.1 Hóa ch t:  Bộ hoá chất bao gồm - TPHA Test cell (chứa HC có gắn kháng nguyên) - TPHA Control cell (chứa HC không gắn kháng nguyên) - Diluent (dung dịch pha loãng) - Positive control (chứng d ơng, hiệu giá 1:2560) - Negative control (chứng âm) Các lọ sinh phẩm hoá chất lưu giữ nhiệt độ từ 2-8oC Các hóa chất nên lắc trộn thật kỹ trước sử dụng  Các d ng c cần thiết chuẩn bị: - Micropipette loại - Đĩa vi l ợng có giếng đáy trịn 2.2 B nh ph m - Huyết không nhiễm khuẩn, không bị tan huyết - Mẫu huyết tách có thể giữ 24 nhiệt độ 2-80C, mu n trữ lâu bảo quản nhiệt độ -200C 2.3 K thu t đ nh tính - Mỗi thử nghiệm cần dùng t i thiểu giếng - Thêm 190l dung dịch pha loãng vào giếng s H P U H Thêm 10l huyết vào giếng s 1, trộn pipette Chuyển 25l hỗn dịch từ giếng s sang giếng s giếng s Thêm 75l control cell vào giếng s trộn Thêm 75l Test cell vào giếng s trộn Đậy nắp phiến nhựa nhiệt độ phòng từ 45-60 phút qua đêm, tránh ánh sáng - Đọc kết 2.4 K thu t bán đ nh l ng - Mỗi mẫu cần sử d ng nhât giếng - Thêm 190l dung dịch pha loãng vào giếng s - Thêm 25l dung dịch pha loãng vào giếng s đến giếng s - Thêm 10l huyết vào giếng 1, trộn pipette - Pipet 25l hỗn dịch từ giếng s sang giếng s 2, - Trộn hỗn dịch giếng s pipet 25l sang giếng s - Lặp lại thao tác pha loãng nh với giếng từ s đến giếng s - Thêm 75l control cell vào giếng s trộn - Thêm 75l Test cell vào giếng s đến giếng s trộn - Đậy nắp phiến nhựa nhiệt độ phòng từ 45-60 phút qua đêm, tránh ánh sáng Trong tr ờng hợp có ng ng kết hai giếng test cell control cell cần làm lại với mẫu huyết control cell ng nghiệm, có kết ng ng kết không đặc hiệu huyết bệnh nhân có chứa nhiều loại kháng thể có khả phản ứng chéo nên kiểm tra lại kỹ thuật khác 2.5 Nh n đ nh k t qu - Chứng âm khơng có ng ng kết giếng test cells control cells - Chứng d ơng ng ng kết giếng Test cells - Kết mẫu thử: (4+) D ơng tính mạnh, ng ng kết tạo thành vòng hồng cầu tròn đầy đáy giếng (3+) D ơng tính, ng ng kết tạo thành vòng hồng cầu nh đáy giếng (2+) D ơng tính, ng ng kết tạo thành vịng hồng cầu trịn đều, có viền hồng cầu xung quang vịng ng ng kết (1+) D ơng tính yếu, ng ng kết tạo thành bánh vịng cầu nh hơn, có viền hồng cầu xung quang vòng ng ng kết lắng sát đáy giếng (+/-) Không xác định, hồng cầu lắng sát đáy giếng, tạo vòng sáng rõ trung tâm (-) Âm tính, hồng cầu lắng sát đáy giếng, tạo nút hồng cầu trung tâm đáy giếng - H P U H H P U H TÀI LI U THAM KH O Nguyễn Phúc Nh Hà, Một s kỹ thuật chẩn đốn bệnh khơng truyền nhiễm Bộ Y Tế, 2014, “H ớng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Hóa sinh” 3 Abul Abbas, Andrew Lichtman, Shiv Pilai, 2007, Cellular and Molecular Immunology H P U H BÀI K THU T TÁCH VÀ Đ M T BÀO BÀI Đ C THÊM 3: K THU T NG NG K T M C TIÊU BÀI H C Sau học xong này, sinh viên có khả năng: Trình bày đ ợc ngun lý c a phản ứng ng ng kết Thực đọc kết phản ứng ng ng kết Trình bày đ ợc cách nhận định kết quả, nguyên nhân c a phản ứng d ơng tính/âm tính giả cách phịng tránh H P N I DUNG Nguyên lý Phản ứng ng ng kết phản ứng liên kết tiểu thể (kích th ớc nh ) thành cấu trúc lớn, quan sát đ ợc mắt th ờng Các tiểu thể tế bào nh tế bào hồng cầu, bạch cầu, hạt trơ nhân tạo có mang KN cách tự nhiên KN đ ợc gắn vào bệnh lý nhân tạo Vì kích th ớc tiểu thể lớn nên phản ứng ng ng kết nhạy gấp nhiều lần phản ứng t a Kháng thể đ ợc sử d ng th ờng IgM với 10 paratop nên gây đ ợc ng ng kết mạnh nhiều so với loại KT khác Ng ng kết ch động – Phản đứng định nhóm hồng cầu ABO Trên màng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu có protein có tính kháng ngun Các kháng nguyên nhóm hồng cầu sản phẩm protein màng hồng cầu mà trình tổng hợp protein đ ợc mã hoá gen nằm nhiễm sắc thể, gen tập hợp thành hệ th ng Sự ph i hợp gen c a hay nhiều hệ th ng (kiểu gen) tạo tính trạng (kiểu hình) nhóm máu Kháng ngun nhóm máu kích thích thể thiếu tạo kháng thể, phần lớn kháng thể tự nhiên IgM Kháng thể tự nhiên kháng kháng nguyên nhóm máu bao gồm kháng thể kháng A, kháng B Kháng thể miễn dịch th ờng xuất sau kích thích miễn dịch ví d nh mang thai nhiều lần truyền máu bao gồm kháng thể kháng Rh, kháng Kel, kháng Duffy Những kháng thể th ờng IgG, hoạt động nhiệt độ 370C không gây ng ng kết trực tiếp phải phát kỹ thuật ng ng kết gián tiếp 2.1 D ng c , hóa ch t v t t tiêu hao - Lam kính - Bút viết kinh - Dao chích máu - Bơng thấm - Que th y tinh U H 43 Bộ kit định l ợng nhóm máu ABO + Huyết mẫu ch ng A (Anti A) + Huyết mẫu ch ng B (Anti B) + Huyết mẫu ch ng AB (Anti AB) 2.2 Quy trình th c hi n Dùng huyết mẫu chứa kháng thể đặc hiệu biết để định loại kháng nguyên nhóm máu c a hồng cầu dựa vào phản ứng ng ng kết Chọn ba vị trí ngang hàng lam kính cách khoảng 3cm - Nh vào vị trí hai giọt huyết mẫu loại theo trình tự: vị trí ch ng A, vị trí ch ng B, vị trí ch ng AB (sử d ng pipet gắn sẵn lọ huyết mẫu) - Dùng pipet Pasteur nh thêm vào bên cạnh ba vị trí vị trí giọt dịch treo hồng cầu cần định nhóm - Dùng que thuỷ tinh trộn huyết mẫu với hồng cầu cần định nhóm để có vịng trịn đ ờng kính từ - 3cm, lắc nhẹ liên t c vòng - phút - Đọc kết sau phút Phản ứng ng ng kết hồng cầu xác định cúm Phản ứng ng ng kết hồng cầu ph ơng pháp cổ điển để phát có mặt c a virus cúm chí cịn định l ợng nồng độ virus cúm gây ng ng kết (titering virus cúm) dựa nguyên lý virus cúm bám vào phân tử bề mặt hồng cầu Bằng cách pha loãng nồng độ virus cúm nồng độ định đĩa 96 giếng thêm vào l ợng tế bào hồng cầu định, ta định l ợng cách t ơng đ i nồng độ virus cúm mẫu thử 3.1 D ng c , hóa ch t v t t tiêu hao: - T an toàn sinh học - Máy ly tâm ph kiện thích hợp - Kính hiển vi ng falcon 15ml - Pippeteman - Đầu côn - PBS - Tế bào hồng cầu gà - Đĩa 96 giếng tròn 3.2 Chu n b hồng c u: - Lấy 4ml hồng cầu gà vào ng falcon 15ml thêm PBS cho đầy - Ly tâm ng 10 phút, 800rpm nhiệt độ phòng - Hút b phần dịch không làm ảnh h ởng đến tế bào máu phía d ới - Thêm 12ml PBS vào ng falcon, trộn đảo ng ng ợc xuôi để rửa tế bào máu, không vortex - Ly tâm nhiệt độ phòng phút với t c độ 800rpm - Rửa thêm hai lần - H P U H 44 Hút b dịch không làm ảnh h ởng đến tế bào máu Thêm PBS cho đ để đ ợc dung dịch 10% nồng độ hồng cầu Dung dịch đ ợc sử d ng vòng tuần đ ợc bảo quản nhiệt độ 4°C - Pha thành dung dịch cu i 0,5% hồng cầu PBS 3.3 Pha lỗng nồng đ virus thí nghi m ng ng k t hồng c u: - Đĩa 96 giếng đ ợc sử d ng thí nghiệm đĩa phù hợp với phản ứng ng ng kết hồng cầu đĩa giếng - Pipet 50μl PBS vào giếng - Trong giếng đầu tiên, thêm 50 μl mẫu virus - Dùng pipet trộn giếng thứ lấy 50μl dung dịch chuyển sang giếng thứ hai bên phải c a nó, lặp lại q trình trộn giếng cu i pipet b 50μl dung dịch c a giếng cu i - Thêm 50ml dung dịch hồng cầu 0,5% vào giếng, trộn nhẹ nhàng vòng 30 -60 phút nhiệt độ phòng Kết âm tính chấm đ xuất đáy giếng, d ơng tính tạo thành mạng l ới màu hồng giếng - Chuẩn độ virus dung dịch đ ợc pha loãng cao mà cho kết d ơng tính Phản ứng ức chế ng ng kết hồng cầu (Hemagglutin Inhibition Test) 4.1 Nguyên lý: Một s vi sinh vật có gen mã hóa protein làm ng ng kết tế bào hồng cầu c a s lồi Ví d , virus cúm có protein v gọi hemagglutinin, HA, gắn với hồng cầu, gây hình thành mạng l ới hồng cầu hay gọi ng ng kết hồng cầu Phản ứng ng ng kết hồng cầu đ ợc sử d ng chẩn đoán nghiên cứu nhiều loại virus cúm nh Orthomyxoviruses, paramyxoviruses, abrovirusestogaviruses (bao gồm rubella), flaviviruses, bunyaviruses Các virus đ ợc nuôi cấy môi tr ờng đặc hiệu cho virus đ ợc thử nghiệm với phản ứng ng ng kết hồng cầu Tuy nhiên, diện c a kháng thể đặc hiệu kháng virus huyết ngăn cản phản ứng ng ng kết hồng cầu xảy ra, t ợng đ ợc gọi phản ứng ức chế ng ng kết hồng cầu HAI Titer: Độ pha loãng cao c a kháng thể ức chế ng ng kết hồng cầu đ ợc gọi HAI titer c a huyết - Nếu huyết khơng có kháng thể kháng virus cúm, t ợng ng ng kết hồng cầu đ ợc nhìn thấy mắt th ờng giếng thử nghiệm - Ng ợc lại, có kháng thể kháng virus t ợng ng ng kết hồng cầu không quan sát đ ợc giếng với l ợng kháng thể đ để ức chế ng ng kết hồng cầu, nhiên giếng mà kháng thể đ ợc hòa tan với thành nồng độ cực nh , l ợng khơng đ để ức chế tồn phản ứng ng ng kết trình xảy quan sát đ ợc mắt th ờng Kết c a thử nghiệm HAI bị ảnh h ởng có mặt c a s chất ức chế không đặc hiệu c a virus nh ng ng kết hồng cầu tự nhiên, - H P U H 45 s phịng thí nghiệm nhân viên xử lý huyết tr ớc làm thí nghiệm để tránh kết d ơng tính âm tính giả phát sinh 4.2 D ng c , hóa ch t v t t tiêu hao - Hồng cầu c a loài phù hợp (hồng cầu gà, ngỗng ) đ ợc chứa ng có dung dịch Alseve heparin - Dung dịch pha lỗng hồng cầu (có thể pha lỗng dung dịch đệm Bovine albumin verolnal) pH phù hợp - Dung dịch để loại b s thành phần gây ng ng kết hồng cầu không đặc hiệu từ huyết - Dung dịch có chứa virus kháng nguyên chuẩn (vd: virus cúm) biết chuẩn HA để xác định HA c a ch ng virus 4.3 Quy trình th c hi n - Dung dịch virus dung dịch xác định đ ợc HA c a kháng nguyên dung dịch virus (ví d : virus cúm) - Chuẩn bị dung dịch pha loãng hai lần c a huyết bệnh nhân cần đ ợc pha lỗng: pha lỗng từ 1:4 đến 1:1024 - Cho l ợng gi ng c a virus vào giếng thử nghiệm đĩa 96 giếng, t ơng đ ơng với đơn vị HA (tùy thuộc vào virus) trừ huyết giếng chuẩn - Đĩa thử đ ợc nhiệt độ phòng 60 phút (thời gian ph thuộc vào loại virus khác nhau) - Thêm l ợng hồng cầu gi ng vào giếng thử 4°C 30 phút - Đọc kết 4.4 Cách đ c k t qu Nồng độ pha lỗng cao ức chế đ ợc Các pha loãng cao c a huyết (Ab) ngăn chặn Hemagglutin đ ợc gọi hiệu giá HAI c a huyết Một chắn mịn lởm chởm c a tế bào nút bất th ờng cho thấy ng ng kết Quan sát chuyển động c a nút c a tế bào màu đ nghiêng giúp làm sáng t điểm kết thúc H P U H 4.5 Đ m b o ch t l ng - Mẫu huyết d ơng tính biết tr ớc - Mẫu huyết âm tính biết tr ớc 46 - Mẫu huyết tế bào mà khơng có kháng ngun t ơng ứng (để kiểm tra độ ng ng kết không đặc hiệu) Titrate ng ợc kết c a phản ứng ng ng kết (để đảm bảo đơn vị HA đ ợc thực hiện) H P U H 47 TÀI LI U THAM KH O: www.virapur.com WHO, 2013, Laboratory Procedures, Serological detection of avian influenza A(H7N9) virus infections by modified horse red blood cells haemagglutinationinhibition assay Abul Abbas, Andrew Lichtman, Shiv Pilai, 2007, Cellular and Molecular Immunology H P U H 48 BÀI Đ C THÊM 4: K THU T HĨA MƠ MI N D CH M C TIÊU BÀI H C Sau học xong này, sinh viên có khả năng: Trình bày ngun lý kỹ thuật hóa mơ miễn dịch Trình bày b ớc tiến hành kỹ thuật hóa mơ miễn dịch Nắm vững đọc kết Biết phân biệt sai sót q trình tiến hành kỹ thuật H P N I DUNG Nguyên lý Hóa mơ miễn dịch (Immunohistochemical - IHC) ph ơng pháp xét nghiệm kết hợp kỹ thuật giải phẫu học, miễn dịch học sinh hóa để xác định có mặt hay khơng có mặt c a kháng nguyên diện mô (bào t ơng, màng tế bào, nhân tế bào) Vì kháng ngun khơng thể quan sát hình thái đ ợc nên ta phải xác định có mặt c a mơ phản ứng miễn dịch sinh hóa thơng qua chất đánh dấu (chất thị) Có hai loại chất đánh dấu chất huỳnh quang enzyme Tùy theo loại chất đánh dấu mà có phản ứng t ơng sử d ng kính hiển vi thích hợp để quan sát Hóa mơ miễn dịch đ ợc sử d ng chẩn đoán bệnh Kỹ thuật sử d ng để phát kh i u c thể để xác định bệnh ung th lành tính ác tính Nó cịn xác định giai đoạn c a ung th , xác định loại tế bào nguồn g c c a bệnh di để tìm điểm phát sinh nguyên phát c a kh i u Do chẩn đoán giải phẫu bệnh dựa hình thái tế bào cấu trúc mô học c a tế bào Các u có nguồn g c th ợng bì th ờng xếp thành mảng, u có nguồn g c trung bì th ờng xếp rời rạc… Có nhiều loại u có nguồn g c khác nh ng có biểu hình thái gi ng nh u tế bào sáng có nguồn g c trung bì (sarcom tế bào sáng), th ợng bì (carcinoma tế bào sáng) mơ lympho (lympho tế bào sáng)… Do nhà bệnh học cần phải nhờ đến công c khác ngồi hình thái học để xác định nguồn g c tế bào u Đó dùng kỹ thuật hóa mơ miễn dịch để xác định kháng ngun đặc hiệu diện tế bào u Trong khuôn khổ viết này, chúng tơi trình bầy phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch sở bệnh phầm mảnh sinh thiết tủy xương Nhuộm hóa mơ miễn dịch mảnh sinh thiết t y x ơng ph ơng pháp nhuộm sử d ng kháng thể biết để xác định kháng nguyên có tổ chức t y x ơng Đây kỹ thuật kết hợp phản U H 49 ứng miễn dịch hóa chất để làm rõ kháng nguyên diện tế bào (bào t ơng, màng tế bào, nhân tế bào) Chỉ định - Nghi ngờ u lympho xâm lấn t y x ơng; - Nghi ngờ K di t y x ơng; - Nghi ngờ tăng sinh bất th ờng dòng tế bào t y x ơng Chuẩn bị 3.1 Ph ng ti n – Hóa ch t 3.1.1 Ph ơng tiện: - Kính hiển vi quang học; - Máy cắt tiêu bản; - Bàn sấy 37oC; - Lam kính chuyên d ng POLYSINED SNIDE; - Bể nhuộm tiêu dung tích 100ml: 07 chiếc; - Bể nhuộm tiêu dung tích 200ml: 07 chiếc; - Lị vi sóng: 01 chiếc; - Giá cài tiêu vừa bể nhuộm 200ml: 01 chiếc; - Giá gỗ cài tiêu bản: 02 chiếc; - Pipette man 0.2 -10 l: 01 chiếc; - Pipette man 100l: 01 chiếc; - ng nghiệm vô trùng 2ml: 10 ng (tùy s maker cần sử d ng) - Khay Inox 30 x 50 cm: 02 chiếc; - Gạc thấm n ớc: 03 chiếc; - Bút chì: 01 chiếc; - Lamen 22 x 24 22 x 22 3.1.2 Hóa chất: - Toluen 1,2,3: để sẵn bể nhuộm 100ml; - Cồn Etylic 80o, cồn tuyệt đ i 1,2 để sẵn bể nhuộm 100ml; - Dung dịch đệm TBS (pH = 7,6); - Dung dịch đệm Citrat Buffer (pH = 7,0); - Dung dịch Hydroclorit (oxy già) 3%; - Dung dịch Anti Dako Diluent; - Kháng thể (Anti Human  Tùy Marker); - Kháng thể (Envision + HRP  REF: K5007); - Bộ định màu DAB + Chomogen (REF: K5007); - Dung dịch Hematoxylin 5% 100ml; - Boom Canada: Lấy c c nh , để t 60oC 3.2 Pha hóa ch t: 3.2.1 Dung dịch TBS (pH = 7.6) Dung dịch Tris HCL (1) H P U H 50 Tris 60.55 gram 30.27 gram Axit HCL 35 ml 17.5 ml N ớc cất 1000 ml 500ml Tổng sản phẩm 1035 ml 517.5 ml Dung dịch NaCl (2) Natriumchlorid (NaCl) 90 gram 45 gram N ớc cất 1000 ml 500 ml Tổng sản phẩm 1000 ml 500 ml  Dung dịch TBS gồm: 100 ml (1) + 100 ml (2) + 800ml n ớc cất = 1000 ml chuẩn độ để đạt pH = 7,6 3.2.2 Dung dịch Citrat buffer pH = 7.0 Dung dịch (A): Acid acitric 21.01 gram 10.51 gram N ớc cất 1000 ml 500ml Tổng sản phẩm 1000 ml 500 ml Dung dịch (B), pH= 6.0 Tri-Natriumcitrat-Dihydrat 29.41 gram 14.71 gram N ớc cất 1000 ml 500ml Tổng sản phẩm 1000 ml 500 ml  Citrat buffer gồm: 2ml (A) + 98ml (B) + 900ml n ớc cất (Tổng = 1000 ml) 2.3.3 Dung dịch kháng thể 1: Là kết hợp c a Anti Diluent (100µl/1 tiêu bản) với kháng thể biết (Anti Human) theo tỷ lệ khuyến cáo c a nhà sản xuất tùy maker sử d ng 3.3 B nh ph m: L c nến mảnh sinh thiết t y x ơng Các b ớc tiến hành 4.1 Chu n b tiêu b n - Đúc khuôn parafin mảnh sinh thiết t y x ơng đ ợc xử lý, làm nguội bảo quản điều kiện 2-8oC - Cắt tiêu m ng 0,2 m, dán lam kính chun d ng - Sấy khơ tiêu t ấm 37oC thời gian 12 4.2 Ti n hành nhu m: Thực theo b ớc sau điều kiện tiêu ẩm - Ngâm tiêu dung dịch Toluen (15 phút), cồn 80o (5 phút) cồn tuyệt đ i (10 phút) - Rửa d ới n ớc chảy nhẹ: phút - Tráng tiêu qua dung dịch TBS (pH = 7,6) vài giây  Cho vào đệm Citrate buffer (pH = 7.0) đun lò vi sóng: 15 phút (ở chế độ M.Hight) - Để nguội tự nhiên nhiệt độ phòng đến ≤ 40oC - Rửa dd TBS (pH = 7,6): lần (lần đầu tráng qua, lần lần phút) - Ngâm dung dịch Oxy già 3% (Hydrogen peoxide): phút H P U H 51 - Tráng qua n ớc cất lần (dùng bình bóp) - Cho qua dung dịch TBS (pH = 7,6): lần - Lấy tiêu giá kháng thể 1(100 - 200l/lam): 30 phút - Rửa dung dịch TBS (pH = 7,6): lần, lau khô xung quanh mảnh - Ph kháng thể (Envision + HRP): 30 phút - Rửa dung dịch TBS (pH = 7,6): lần, lau khô xung quanh mảnh - Ph dung dịch DAB (Tỷ lệ: 1ml buffer + 10 l chomogen): 510 giây, kết thúc phút - Rửa qua n ớc cất bình bóp cài vào giá bể nhuộm có sẵn n ớc cất lần - Nhuộm Hematoxylin: phút - Tráng cồn tuyệt đ i, ngâm tiêu Toluen  gắn lamen, để khô nhận định kết 4.3 Nh n đ nh k t qu Việc nhận định kết hình thái đ ợc khẳng định hai tiêu chí: âm tính d ơng tính Âm tính: Trên kính hiển vi huỳnh quang, quan sát thấy nhân c a tế bào bắt màu xanh tím c a Hematoxylin, nguyên sinh chất khơng có biểu Dương tính: Nếu có diện kháng nguyên tế bào, phức hợp kháng nguyên  kháng thể  DAB Chromogen cho màu vàng nâu nguyên sinh chất c a tế bào, nhân c a tế bào bắt màu xanh tím c a Hematoxylin 4.4 Sai sót x trí - Để lam khơ q trình nhuộm; - Thực khơng đầy đ theo quy trình kỹ thuật; - Xử lý mảnh sinh thiết không t t; - Thời gian nhuộm b ớc không phù hợp; - Kỹ c a ng ời thực kỹ thuật ch a ổn định H P U H TÀI LI U THAM KH O Nguyễn Thế Khánh, Phạm Tử D ơng (2005); Xét nghiệm sử d ng lâm sàng; Nhà xuất Y học 52 Kỹ thuật xét nghiệm Huyết học Truyền máu ứng d ng lâm sàng (2010); Nhà xuất Y học Huyết học dịch, 1997 H P U H BÀI Đ C THÊM 5: XÉT NGHI M MI N D CH NG D NG TRONG L A CH N VÀ THEO DÕI GHÉP 53 M C TIÊU BÀI H C Sau học xong này, sinh viên có khả năng: Trình bày đ ợc tên s xét nghiệm miễn dịch việc lựa chọn ng ời cho phù hợp để ghép Trình bày đ ợc tên giá trị c a s xét nghiệm miễn dịch việc theo dõi sau ghép Thực quy trình xét nghiệm miễn dịch để lựa chọn ng ời cho phù hợp theo dõi sau ghép H P N I DUNG Xét nghiệm định typ HLA (HLA typing) 1.1 Khái ni m: Là xác định kiểu hình kháng nguyên bạch cầu (HLA) c a ng ời HLA có vai trị quan trọng ghép tạng ghép tế bào g c Trong ghép, khác biệt HLA ng ời cho ng ời nhận nguồn g c c a phản ứng thải ghép ghép ch ng ch (trong tr ờng hợp ghép tế bào g c) Các locus HLA quan trọng hay đ ợc xét nghiệm thuộc lớp I là: HLA-A, HLA-B, HLA-C; thuộc lớp II là: HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP 1.2 Ch đ nh xét nghi m đ nh typ HLA 1.2.1 Ghép tạng (ví d ghép gan, ghép thận, ghép tim, ghép phổi, ghép t y ) - Chỉ định xét nghiệm cho ng ời cho ng ời nhận - Chỉ cần xác định locus HLA HLA-A, HLA-B, HLA-DR - Chỉ cần làm với kỹ thuật xác định độ phân giải thấp trung bình đ - Việc định xét nghiệm tiến hành d ới hình thức: định cho cặp ng ời cho ng ời nhận c thể; định xét nghiệm cho ng ời bệnh có nhu cầu ghép (m c đích quản lý danh sách ng ời bệnh chờ ghép) ng ời tình nguyện hiến tạng (m c đích quản lý danh sách ng ời cho) 1.2.2 Ghép tế bào g c tạo máu - Chỉ định xét nghiệm HLA cho ghép tế bào g c tạo máu đồng lồi, khơng định xét nghiệm HLA với ghép tế bào g c tạo máu tự thân - Chỉ định xét nghiệm cho ng ời cho ng ời nhận - Cần xác định locus HLA HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DQ Một s trung tâm ghép yêu cầu xác định HLA-DP - Yêu cầu phải xác định HLA kỹ thuật có độ phân giải cao - Việc định xét nghiệm d ới hình thức: xét nghiệm cho ng ời nhận (ng ời bệnh) ng ời cho tiềm năng; xét nghiệm cho ng ời bệnh (để làm sở tìm kiếm ng ời cho phù hợp), ng ời đăng ký cho tế bào g c tạo máu (để lập U H 54 ngân hàng tế bào g c tạo máu), xét nghiệm cho mẫu máu cu ng r n thu thập (để lập ngân hàng tế bào g c máu cu ng r n) 1.3 L y m u đ xét nghi m HLA: Lấy 2ml máu ngoại vi, ch ng đông EDTA 1.4 Nh n đ nh k t qu xét nghi m HLA Kết phân tích HLA dùng để so sánh mức độ phù hợp kháng nguyên HLA ng ời cho ng ời nhận Về nguyên tắc ng ời cho ng ời nhận có nhiều điểm gi ng kết ghép t t, hạn chế đ ợc tình trạng thải ghép ghép ch ng ch Trong ghép tạng, có nhiều thu c ch ng thải ghép t t, chí khơng phù hợp HLA ghép đ ợc Tuy nhiên ghép tế bào g c đồng loại từ máu dây r n, yêu cầu phù hợp HLA t i thiểu phải 4/6 allen (HLA-A, HLA-B, HLA-DR), ghép tế bào g c đồng loại từ ng ời cho không huyết th ng, yêu cầu phù hợp phải t i thiểu 5/6 (là HLA-A, HLA-B, HLA-DR ) 9/10 (là HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, DQ) Xét nghiệm đọ chéo lympho (Lympho cross match) 2.1 Khái ni m Là xét nghiệm nhằm phát xem liệu huyết ng ời nhận có sẵn kháng thể đặc hiệu ch ng lại HLA c a ng ời cho hay khơng Xét nghiệm có ý nghĩa phát tiên l ợng khả thải ghép t i cấp sau ghép, giúp tránh đ ợc phản ứng thải ghép t i cấp Xét nghiệm đọ chéo lympho đ ợc thực cách huyết ng ời nhận với tế bào lympho T lympho B c a ng ời cho sau phát đánh giá mức độ phản ứng kháng thể đặc hiệu có huyết ng ời nhận với HLA có bề mặt tế bào lympho ng ời cho 2.2 Ch đ nh xét nghi m đ chéo lympho - Khi tìm đ ợc cặp ng ời cho ng ời nhận cho ghép tạng (gan, thận, tim, t y…) Xét nghiệm đ ợc làm gần với ngày ghép t t nhiêu, đặc biệt ng ời nhận đ ợc truyền máu nhiều lần ng ời nhận nữ nạo phá thai chửa đẻ nhiều lần - Chỉ cần định làm xét nghiệm với ng ời nhận, nhiên mẫu phải lấy ng ời cho ng ời nhận 2.3 L y m u đ xét nghi m đ chéo lympho - Ng ời cho: Lấy ml máu ngoại vi có ch ng đông EDTA - Ng ời nhận: Lấy ml máu không ch ng đông H P U H 2.4 Nh n đ nh k t qu xét nghi m đ chéo lympho - Phản ứng dương tính khi: huyết ng ời nhận có kháng thể ch ng HLA ng ời cho, tr ờng hợp không ghép đ ợc, ghép xảy thải ghép t i cấp 55 - Phản ứng âm tính khi: huyết ng ời nhận khơng có kháng thể ch ng HLA ng ời cho, tiến hành ghép, khơng xảy thải ghép t i cấp Ngồi hai xét nghiệm trên, ghép theo dõi sau ghép, ng ời ta tiến hành xét nghiệm miễn dịch khác nh : xác định nhóm máu hệ ABO xác định trạng thái tiền mẫn cảm Kỹ thuật xác định nhóm máu hệ ABO đ ợc học phần kỹ thuật huyết học nhóm máu Sau đây, viết cung cấp thêm s thông tin trạng thái tiền mẫn cảm 2.5 Xác đ nh tr ng thái ti n m n c m Trong s tr ờng hợp, máu c a ng ời nhận ghép có sẵn s kháng thể kháng HLA Tình trạng có sẵn kháng thể kháng HLA huyết ng ời nhận tr ớc ghép đ ợc gọi trạng thái tiền mẫn cảm Ngun nhân hình thành kháng thể đ ợc truyền máu nhiều lần, ph nữ mang thai nhiều lần, đ ợc ghép tạng/mô tr ớc Các kháng thể nhân t tham gia phản ứng thải ghép, nhiều s chúng đặc hiệu với kháng nguyên HLA c a ng ời cho Có thể xét nghiệm sàng lọc (xác định có mặt) định danh (xác định c thể) kháng thể kháng HLA huyết ng ời nhận kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch Tên gọi "xét nghiệm PRA" xuất phát từ ph ơng pháp kỹ thuật đ ợc sử d ng để sàng lọc kháng thể kháng HLA: trộn huyết ng ời nhận ghép lần l ợt với loại tế bào lympho tập hợp (panel) nhiều loại tế bào lympho khác (mỗi loại lấy từ ng ời cho, với kháng nguyên HLA đ ợc xác định tr ớc đó), sau quan sát mức độ phản ứng c a huyết ng ời nhận với loại tế bào lympho panel H P U H TÀI LI U THAM KH O Nguyễn Thế Khánh, Phạm Tử D ơng (2005); Xét nghiệm sử d ng lâm sàng; Nhà xuất Y học 56 Kỹ thuật xét nghiệm Huyết học Truyền máu ứng d ng lâm sàng (2010); Nhà xuất Y học AABB Technical Manual, 17th, 2011 Jelalu Kemal, 2014, Laboratory Manual and Review on Clinical Pathology H P U H 57