BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG H P THỰC HÀNH U XÉT NGHIỆM DINH DƯỠNG VÀ AN TOÀN THỰC PHẨM H Hà Nội, 2015 BAN BIÊN SOẠN Chủ biên: PGS TS Nguyễn Xuân Ninh ThS Lưu Quốc Toản Thư ký biên soạn: ThS Lê Thị Thu Hà PGS TS Nguyễn Thanh Hà Nhóm tác giả: H P PGS TS Nguyễn Xuân Ninh PGS TS Lê Thị Hồng Hảo TS Đặng Thế Hưng U TS Nguyễn Thu Hương ThS Bùi Mai Hương ThS Lưu Quốc Toản H MỤC LỤC BÀI 1: THỰC HÀNH LẤY MẪU, BẢO QUẢN MẪU THỰC PHẨM BÀI 2: XÉT NGHIỆM SINH HOÁ CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH DINH DƯỠNG VÀ CHUYỂN HOÁ .10 BÀI 3: XÉT NGHIỆM VI CHẤT CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH DINH DƯỠNG VÀ CHUYỂN HOÁ .20 BÀI 4: XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ NĂNG LƯỢNG CỦA THỨC ĂN 28 BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN, LIPID, CARBOHYDRATE TRONG THỰC PHẨM 36 H P BÀI 6: PHÂN TÍCH VI CHẤT DINH DƯỠNG, ĐỢ ẨM VÀ HÀM LƯỢNG TRO TOÀN PHẦN CỦA THỰC PHẨM 48 BÀI 7: KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIỂU KHÍ 60 BÀI 8: ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI TRONG THỰC PHẨM BẰNG U PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT 69 BÀI 9: PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM 79 H BÀI 10: PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CLOSTRIDIUM PERFRIGENS 87 BÀI 11: ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCI CĨ PHẢN ỨNG DƯƠNG TÍNH VỚI COAGULASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG THẠCH BAIRD-PARKER 101 BÀI 12: XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ BÀO TỬ NẤM MEN, MỐC TRONG THỰC PHẨM .114 BÀI 13: XÁC ĐỊNH HÀN THE VÀ PHẨM MẦU TRONG THỰC PHẨM (PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ BÁN ĐỊNH LƯỢNG) 124 BÀI 14: KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM TÌM TRỨNG GIUN SÁN TRONG RAU QUẢ VÀ NƯỚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NỔI 140 BÀI 15: XÉT NGHIỆM HÀM LƯỢNG CHÌ TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ 150 BÀI 1: THỰC HÀNH LẤY MẪU, BẢO QUẢN MẪU THỰC PHẨM Mục tiêu: Sau học xong học này, sinh viên có khả năng: Thực hiện được quy trình lấy mẫu thịt lợn để xét nghiệm ô nhiễm Salmonella spp Thực hiện được quy trình lấy mẫu rau để xét nghiệm tồn dư hóa chất bảo vệ thực vật Thực hiện được quy trình lấy mẫu sữa để xét nghiệm hàm lượng protein sữa I LẤY MẪU THỊT H P 1.1 Dụng cụ Cân Dao, kéo, khoan Túi đựng mẫu Găng tay U Khẩu trang Bút viết kính Đá lạnh H Thùng đựng mẫu 1.2 Tiến hành lấy mẫu Chuẩn bị người lấy mẫu Cán bộ thực hiện lấy mẫu cần rửa tay và găng tay, mặc đồ bảo hộ lao động theo quy định Đổi găng tay mới tiến hành lấy mẫu tiếp theo Chuẩn bị dụng cụ Các dụng cụ sử dụng (dao, túi đựng mẫu, kẹp, kéo) để lấy mẫu thịt lợn xét nghiệm Salmonella spp cần đảm bảo vô trùng Tiến hành Ghi nhãn mẫu lên túi đựng mẫu Chọn ngẫu nhiên mẫu thịt ở pha lọc của quầy hàng bán thịt lợn tại chợ Lấy mẫu tại nhiều điểm để đảm bảo tính đại diện của mẫu bằng cách cắt tại các mặt cắt khác của miếng thịt, mỗi vị trí lấy khoảng 20 g, lấy từ – vị trí Gộp các phần thịt vừa cắt được thành một mẫu và cho vào túi đựng mẫu Ghi hồ sơ lấy mẫu Ngày lấy mẫu Thông tin quầy hàng thịt lợn đã lấy mẫu (tên, địa chỉ, số điện thoại) Mã số mẫu Loại mẫu Khối lượng mẫu Mục đích lấy mẫu Phương pháp lấy mẫu H P Nhiệt độ bảo quản Thông tin người thực hiện lấy mẫu 1.3 Bảo quản mẫu Nhiệt độ bảo quản mẫu phù hợp là từ 1-5o C để tránh việc tăng sinh của vi sinh vật nếu có ô nhiễm mẫu U Gửi mẫu tới phòng kiểm nghiệm sau lấy Quá trình vận chuyển và bảo quản mẫu từ thực địa tới phòng thí nghiệm cần đảm bảo không để mẫu đã đóng gói bị đông lại túi đá lạnh Mẫu bị đơng lại H có khả tiêu diệt mầm bệnh Không đặt túi đá lạnh trực tiếp lên mẫu Cần gói chặt mẫu để tránh mẫu bị xê dịch bao bì đựng mẫu không được buộc chặt tránh làm hỏng hoặc nén chặt mẫu trình vận chuyển II LẤY MẪU RAU 2.1 Dụng cụ Cân Dao, kéo, kẹp Túi đựng mẫu Găng tay Khẩu trang Bút viết kính Đá lạnh Thùng đựng mẫu 2.2 Tiến hành lấy mẫu Chuẩn bị người lấy mẫu Cán bộ thực hiện lấy mẫu cần rửa tay và găng tay, mặc đồ bảo hộ lao động theo quy định Đổi găng tay mới tiến hành lấy mẫu tiếp theo Chuẩn bị dụng cụ Các dụng cụ sử dụng (dao, túi đựng mẫu, kẹp, kéo) để lấy mẫu rau xét nghiệm dư lượng thuốc bảo vệ thực vật Tiến hành H P Quy trình lấy mẫu rau dưới được mô tả để thực hiện lấy mẫu rau tại ruộng sản xuất, dựa TCVN 9016:2011 o Bước 1: Ghi nhãn lên túi đựng mẫu o Bước 2: Xác định vị trí lấy mẫu tại ruộng o Bước 3: Tiến hành thu thập mẫu rau Sử dụng dao/kéo cắt các thân rau U Mỗi điểm lấy một mẫu đơn từ một hay nhiều cho đủ khối lượng hoặc số lượng mẫu đơn tối thiểu Cây được lấy mẫu phải sinh trưởng bình thường, khơng dị dạng, không bị sâu bệnh gây hại cách bờ tối thiểu H m, bỏ hàng Sử dụng găng tay bằng nilon loại dùng một lần, lấy mẫu nhẹ nhàng bằng tay, không làm dập nát rau Mỗi mẫu đơn được đựng riêng một túi Quả được lấy đều ở phần thân và nhánh không lấy quả ngọn, quả gốc; ngắt cuống quả bằng tay nếu quả nhỏ hoặc dùng dụng cụ lấy mẫu, thu lấy từng quả Trong trường hợp lấy mẫu rau ăn lá, cắt loại bỏ phần gốc, già, gốc hoặc cắt lấy phần thân ngọn ăn được Đối với rau ăn củ, nhổ nhẹ nhàng từng củ lên khỏi mặt đất hoặc phải đào bới, lật đất thu cắt lấy từng củ Trong trường hợp rau quả được lấy bị vấy bùn bẩn và ướt, nên sử dụng giấy mềm sạch lau chùi thật nhẹ nhàng đến sạch khô Ghi hồ sơ lấy mẫu Ngày lấy mẫu Địa chỉ lấy mẫu Mã số mẫu Loại mẫu Khối lượng mẫu Mục đích lấy mẫu Phương pháp lấy mẫu Nhiệt độ bảo quản Thông tin người thực hiện lấy mẫu 2.3 Bảo quản mẫu Nhiệt độ bảo quản mẫu phù hợp là từ 10-15o C Gửi mẫu tới phòng kiểm nghiệm càng nhanh càng tốt sau lấy H P Đối với kiểm nghiệm dư lượng thuốc BVTV rau, mẫu rau có thể được chuyên chở bằng xe thường, không nhất thiết phải bảo quản lạnh III LẤY MẪU SỮA 3.1 Dụng cụ Ống đong U Túi/lọ đựng mẫu Găng tay Khẩu trang Bút viết kính Đá lạnh H Thùng đựng mẫu 3.2 Tiến hành lấy mẫu Chuẩn bị người lấy mẫu Cán bộ thực hiện lấy mẫu cần rửa tay và găng tay, mặc đồ bảo hộ lao động theo quy định Đổi găng tay mới tiến hành lấy mẫu tiếp theo Chuẩn bị dụng cụ Các dụng cụ sử dụng (ống đong, lọ đựng mẫu) để lấy mẫu sữa cần đảm bảo vô trùng Tiến hành Việc lấy mẫu phải được thực hiện cho thu được mẫu đại diện của sản phẩm Nếu việc lấy mẫu để phân tích vi sinh vật, lý hoá kiểm tra cảm quan được thực hiện riêng rẽ, mẫu để kiểm tra vi sinh phải được lấy trước bằng kỹ thuật vô trùng sử dụng dụng cụ, vật chứa đã khử trùng Chú ý để đảm bảo rằng, mẫu được lấy để kiểm tra mùi, dùng dụng cụ lấy mẫu hoặc ống lấy mẫu không làm ảnh hưởng đến mùi của mẫu Phương pháp lấy mẫu cụ thể khới lượng hoặc thể tích của sản phẩm được lấy phụ thuộc vào bản chất của sản phẩm mục đích của việc lấy mẫu Nếu sản phẩm chứa hạt thơ, có thể phải tăng cỡ mẫu tối thiểu Ngay sau lấy mẫu xong, đậy vật chứa mẫu Đối với trường hợp vật chứa sản phẩm bán lẻ, mẫu bao gồm một hoặc nhiều vật chứa chưa mở H P Nếu cần, lấy thêm một mẫu để kiểm tra nhiệt đợ śt q trình vận chủn đến phòng thử nghiệm o Bước 1: Ghi nhãn mẫu lên lọ đựng mẫu o Bước 2: Khuấy đều sữa dụng cụ đựng cho đồng nhất Trong quá trình khuấy trộn cần tránh việc tạo bọt, lượng bọt nhiều làm thay đởi U tính chất vật lý cảm quan của sản phẩm được lấy mẫu o Bước 3: Lấy mẫu sang dụng cụ đựng mẫu một lượng theo yêu cầu o Bước 4: Bảo quản mẫu và vận chuyển về phòng thí nghiệm H Ghi hồ sơ lấy mẫu Ngày lấy mẫu Thông tin sở Mã số mẫu Loại mẫu Khối lượng mẫu Mục đích lấy mẫu Phương pháp lấy mẫu Nhiệt độ bảo quản Thông tin người thực hiện lấy mẫu 3.3 Bảo quản mẫu Chất bảo quản được bổ sung vào mẫu trường hợp: Hướng dẫn của phòng thử nghiệm Bản chất của chất bảo quản không ảnh hưởng đến phép phân tích phép thử về cấu trúc mùi; Tuân thủ các hướng dẫn an toàn đối với chất bảo quản được sử dụng Nhiệt độ bảo quản mẫu phù hợp là từ 1-50C để tránh việc tăng sinh của vi sinh vật nếu có ô nhiễm mẫu Gửi mẫu tới phòng kiểm nghiệm sau lấy Thời gian gửi mẫu đến phòng thử nghiệm phải ngắn tớt, tớt nhất vịng 24 h Nếu có yêu cầu, mẫu phải được gửi theo chỉ dẫn của phòng thử nghiệm H P U H BIÊN BẢN LẤY MẪU Số /BB- Hôm nay, …… giờ, ngày… tháng… năm…… Tên sở :……………………………………………………… Địa chỉ:………………………………………………………………………… Điện thoại/Fax:………………………………………………………………… Người đại diện hợp pháp của sở:………………………………………… Sản phẩm được lấy mẫu: ………………………………………………………… ………………………………………………………… Nguồn gốc sản phẩm được lấy mẫu:…………………… Địa chỉ sản phẩm được tiêu thụ:…………………………………………… H P Mục đích lấy mẫu: Kiểm tra ô nhiễm vi sinh vật □, kiểm tra nhiễm hóa chất □, kiểm tra chất tồn dư □ Số lượng mẫu: 10 Phương pháp lấy mẫu: …………………………………………………………… …………………………………………………… …… 11 Nhiệt độ của mẫu tại thời điểm thu thập mẫu:………………… U 12 Nhiệt độ bảo quản mẫu: …………………… Biên bản này được lập thành 02 bản: 01 bản quan lấy mẫu giữ; 01 bản H chủ sở hoặc người đại diện giữ Đại diện sở được lấy mẫu Người lấy mẫu (Ký, ghi rõ họ tên) (Ký, ghi rõ họ tên) Tiến hành Chuẩn bị mẫu nước: Ghi mã mẫu nước xét nghiệm vào sổ xét nghiệm mẫu số 03 và đổ mẫu nước vào cớc thủy tinh hình trụ Cho 0,5g ḿi CuSO4 (hoặc AlSO4 hoặc MgSO4) vào cốc đựng mẫu nước, khuấy đều Để lắng 45 phút, sau đó bỏ nước giữ lại cặn Phương pháp tiến hành Bước Chuyển cặn (khoảng 100ml) vào tuýp loại 50 ml, thăng bằng ớng, ly tâm 1.500 vịng/phút phút Đổ dung dịch bên Thêm ml dung dịch HCl 3% Bước Khuấy đều hỡn hợp ly tâm 1.000 vịng/phút phút H P Bước Đổ dung dịch nổi ở đi, thêm NaNO3 bão hoà vào tuýp đến vạch 40 ml, dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều, ly tâm 1.000 vòng/phút phút Bước Lấy tuýp ra, nhỏ dung dịch NaNO3 bão hòa cho đầy tuýp đến mặt nước vồng lên miệng tuýp U Bước Đặt lam kính lên miệng tuýp, sau 20 phút nhấc lam kính Tiếp tục đặt lam thứ hai lên miệng tuýp, thời gian 10 phút H Bước Nhỏ một giọt glycerin 50% phủ lên giọt dung dịch lam kính, đậy kính Bước Soi kính hiển vi phát hiện trứng giun sán ở vật kính 10X, quan sát chi tiết ở vật kính 40X Đánh giá kết quả xét nghiệm Kết quả được báo cáo ở dạng: định tính và định lượng o Kết quả định tính: mẫu dương tính (+) hoặc âm tính (-) o Kết quả định lượng: biểu thị bằng số lượng trứng/mẫu nước Đảm bảo chất lượng xét nghiệm Mỗi mẫu lấy nhất tiêu bản Tiêu bản đạt yêu cầu là tiêu bản đủ lượng nước lam (khơng có bọt khí, khơng khơ, hoặc q nhiều nước) Không để tiêu bản khô quá làm 142 trứng biến dạng khó nhận biết, nếu nhiều nước làm trứng tràn ngồi kính Đánh giá thao tác kỹ thuật Các bước tiến hành TT Đánh giá Đạt Không đạt Chuẩn bị dụng cụ xét nghiệm Chuẩn bị đúng các loại hóa chất xét nghiệm Làm lắng cặn mẫu nước xét nghiệm Chuyển cặn và ly tâm đúng quy trình Lấy tuýp ra, nhỏ dung dịch NaNO3 bão hòa H P cho đầy tuýp đến mặt nước vồng lên miệng tuýp Đặt lam kính lên miệng tuýp nhấc lam kính đúng kỹ thuật không trào miệng tuýp U Nhỏ một giọt glycerin 50% phủ lên giọt dung dịch lam kính, đậy kính không tạo bọt sán KHV Ghi kết quả vào phiếu XN hoặc sổ xét nghiệm 10 H Soi kính hiển vi phát hiện trứng giun Sử lý dụng cụ an toàn vệ sinh 143 II KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM TÌM TRỨNG GIUN SÁN TRONG RAU, QUẢ BẰNG PHƯƠNG PHÁP NỔI Nguyên tắc Sử dụng dung dịch Tween 20 và máy rung siêu âm để rửa chất bề mặt rau, củ quả, bao gồm cả trứng giun sán Sau đó pha loãng các mẫu bằng NaNO3, trứng giun sán có tỷ trọng nhẹ các chất có thành phần của đất nên nổi lên Thu mẫu trứng giun sán vào lam kính, đếm kiểm tra chất lượng trứng giun sán dưới kính hiển vi Phương pháp này dùng để phát hiện và đếm số lượng trứng giun sán mẫu rau, củ, quả Đánh giá chất lượng trứng giun sán có mẫu rau, củ, quả H P Chuẩn bị phương tiện Thiết bị: Máy ly tâm có tuýp ly tâm cỡ lớn 50ml, tốc độ tối đa 6,000 vòng/phút Kính hiển vi quang học thị kính 10X, vật kính 10X 40X Cân kỹ thuật (D=0,1) U Cân thăng bằng Đồng hồ hẹn giờ Dụng cụ H Tuýp ly tâm cỡ lớn, dung tích 50ml Giá dựng tuýp ly tâm Que thủy tinh hoặc đũa tre dài ít nhất 20 cm Giá để lam Lam kính 75mm x 25 mm Lá kính 22 mm x 22mm Pipet nhỏ giọt Cớc thuỷ tinh có mỏ 100ml Bình thủy tinh lít Đèn cờn Túi nilon dựng mẫu loại 200g có dán nhãn Bút viết kính 144 Kéo, dao gọt vỏ Kẹp khơng mấu Giấy vệ sinh Hóa chất Dung dịch ḿi NaNO3 bão hịa Dung dịch NaOH 0,5% Dung dịch glycerin 50% Dung dịch Tween 20 0,5% Cồn 950 Cách pha chế H P Dung dịch nước ḿi NaN03 bão hịa (d = 1,15-1,20) o NaN03 :350g o Nước cất: 1000ml o Cho muối vào nước đun sôi có nổi lớp váng mỏng bề mặt, để ng̣i đở vào bình thủy tinh hình trụ Dung dịch Na0H 0,5% U o NaOH: 5g o Nước cất vừa đủ: 1.000 ml H Dung dich glyxerin 50% o Glyxerin: 50 ml o Nước cất vừa đủ: 100 ml Dung dịch Tween-20 0,5 % o Tween 20: 5ml o Nước cất vừa đủ 1.000 ml Lấy mẫu xử lý mẫu: Loại mẫu: loại rau, củ, quả (xà lách, muống, mùi, tía tơ, kinh giới, húng, rau răm, táo, củ đậu, dưa chuột…) Địa điểm: ruộng rau, chợ bán rau Lượng rau: mỗi loại rau khoảng 500g 145 Bảo quản túi nilon có dán nhãn, ghi rõ địa điểm, thời gian lấy mẫu rau, buộc lại bằng chun vịng Bảo quản mẫu ở nhiệt đợ 80C - 250C túi nilon kín miệng, xét nghiệm thời gian nhanh nhất, tùy từng loại mẫu – cụ thể điều kiện thời gian không nên ghi tùy từng loại mẫu Các bước tiến hành Chuẩn bị mẫu: Cân mẫu: o Mẫu rau cân 100g cho mỗi loại o Mẫu củ quả: gọt/nạo lớp vỏ bên lấy đủ 100g Cho mẫu đã cân vào cớc thủy tinh 1.000 ml có chứa 500ml Tween 20 H P 0,5% Mỗi mẫu một cốc có ghi đúng mã số mẫu Ngâm qua đêm ở nhiệt đợ phịng Đặt cớc chứa mẫu vào máy rung siêu âm có chứa nước sạch mức nước ở máy cao mức dung dịch có cốc, đặt máy tại mức số phút U Dùng kẹp gắp rau ngoài, để lắng dung dịch cịn lại qua đêm ở nhiệt đợ phịng H Phương pháp tiến hành Bước Chuyển cặn (khoảng 100ml) vào tuýp loại 50 ml, thăng bằng ống, ly tâm 1.500 vòng/phút phút Đổ dung dịch bên Thêm ml dung dịch HCl 3% Bước Khuấy đều hỗn hợp ly tâm 1.000 vòng/phút phút Bước Đổ dung dịch nổi ở đi, thêm NaNO3 bão hoà vào tuýp đến vạch 40 ml, dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều, ly tâm 1.000 vòng/phút phút Bước Lấy tuýp ra, nhỏ dung dịch NaNO3 bão hòa cho đầy tuýp đến mặt nước vồng lên miệng tuýp Bước Đặt lam kính lên miệng tuýp, sau 20 phút nhấc lam kính Tiếp tục đặt lam thứ hai lên miệng tuýp, thời gian 10 phút 146 Bước Nhỏ một giọt glycerin 50% phủ lên giọt dung dịch lam kính, đậy kính Bước Soi kính hiển vi phát hiện trứng giun sán ở vật kính 10X, quan sát chi tiết ở vật kính 40X Đánh giá kết quả Kết quả được báo cáo ở dạng: định tính và định lượng o Kết quả định tính: mẫu dương tính (+) hoặc âm tính (-) o Kết quả định lượng: biểu thị bằng số lượng trứng/100 g rau Trường hợp mẫu rau không đủ 100g cân sớ mẫu thực tế tính sớ lượng trứng/100 g rau theo công thức sau: Số trứng thực tế tìm được x 100 Số trứng/100gam rau H P = Số gam thực tế Báo cáo thử nghiệm phải chỉ ra: o Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; o Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; U o Phương pháp thử đã sử dụng viện dẫn tiêu chuẩn này; o Tất cả chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn này, với chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả; H Đảm bảo chất lượng an tồn xét nghiệm: Mỡi lấy nhất tiêu bản Tiêu bản đạt yêu cầu là tiêu bản đủ lượng nước lam (khơng có bọt khí, khơng khơ, hoặc q nhiều nước) Khơng để tiêu bản khơ quá làm trứng biến dạng khó nhận biết, nếu nhiều nước làm trứng tràn kính Trứng giun sán có khả lan truyền qua tiếp xúc, có thể gây nhiễm cho người xét nghiệm, cần ý mặc bảo hộ lao động, găng tay tránh cho trứng tiếp xúc trực tiếp với người xét nghiệm Vệ sinh tay sạch bằng xà phòng để tránh lây nhiễm giun, sán Đánh giá thao tác kỹ thuật 147 Các bước tiến hành TT Đánh giá Đạt Không đạt Chuẩn bị dụng cụ xét nghiệm Chuẩn bị đúng các loại hóa chất xét nghiệm Làm lắng cặn mẫu xét nghiệm đủ thời gian Chuyển cặn và ly tâm đúng quy trình Lấy tuýp ra, nhỏ dung dịch NaNO3 bão hòa cho đầy tuýp đến mặt nước vồng H P lên miệng tuýp Đặt lam kính lên miệng tuýp nhấc lam kính đúng kỹ thuật không trào miệng tuýp Nhỏ một giọt glycerin 50% phủ lên giọt dung dịch lam kính, đậy kính khơng U tạo bọt Soi kính hiển vi phát hiện trứng giun sán KHV nghiệm 10 H Ghi kết quả vào phiếu XN hoặc sở xét Sử lý dụng cụ an tồn vệ sinh 148 TÀI LIỆU THAM KHẢO World Health Organization (1994) "Bench aids for the diagnosis of intestinal parasites" World Health Organization (1991) “Basic laboratory methods in medical parasitology” (ISBN 92 15 44104) Kỹ thuật xét nghiệm chuyên ngành ký sinh trùng côn trùng, Tài liệu giảng dạy Kỹ thuật viên trung học xét nghiệm, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương, 2000 H P U H 149 BÀI 15: XÉT NGHIỆM HÀM LƯỢNG CHÌ TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ Mục tiêu Sau học xong học này, sinh viên có khả năng: Trình bày được nguyên lý thử nghiệm định lượng hàm lượng chì thực phẩm Thực hiện được quy trình thử nghiệm định lượng hàm lượng chì thực phẩm Đọc và hiểu đúng kết quả thử nghiệm định lượng hàm lượng chì thực phẩm H P Nguyên lý Muối stronti sunfat phản ứng với chì được giải phóng từ quá trình phân hủy mẫu thực phẩm và tạo thành các ḿi kết tủa Lượng ḿi sunfat hịa tan dư được gạn ra, muối PbSO4 kết tủa và được chuyển thành các muối cacbonat Muối cacbonat được hòa tan axit và được xác định bằng quang phổ hấp U thụ nguyên tử ở bước sóng 217,0 nm hoặc 283,3 nm Chuẩn bị Thiết bị, dụng cụ H Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử bước sóng 217,0 nm hoặc 283,3 nm Tủ hút chân không Máy nghiền mẫu Bếp vô hóa mẫu Bể siêu âm Cân phân tích Bình định mức 100 ml, 1000 ml, 2000 ml Cốc chịu nhiệt 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml Pipet Bình Kjeldahl Găng tay chịu nhiệt 150 Khẩu trang Kính bảo hộ Hóa chất, sinh phẩm Dung dịch stronti, 2% Hỗn hợp ba axit (axit sulfuric, axit nitric, axit pecloric) Axit nitric (HNO3), M Dung dịch chì ch̉n o Dung dịch gớc, 000 μg /ml o Dung dịch làm việc Axit nitric (HNO3), 10 % H P Amoni cacbonat [(NH4)2CO3] Axit sulfuric (H2SO4), 0,5M Axit pecloric (HClO4), 70 % Tiến hành Quy trình dưới được xây dựng để xác định hàm lượng chì U thực phẩm, với giới hạn phát hiện ≥ µg chì Quy trình được thực hiện dựa TCVN 7602: 2007 Vô hóa mẫu H Cân lượng mẫu thử chuyển vào cốc chịu nhiệt 500 ml, bên có một số bi thủy tinh (Đảm bảo lượng mẫu thực phẩm sau vô hóa đạt < 10 g chất khô) Thêm ml dung dịch stronti % Thêm 15 ml hỗn hợp ba axit cho mỗi gam chất khô dự kiến và để yên ít nhất giờ Đun mẫu thử tủ hút hoặc với hệ thớng ớng hút chân khơng bằng vịi nước cho đến bình chỉ cịn lại axit sulfuric muối vô Thực hiện tương tự các thao tác với mẫu trắng Tách chì Lượng mẫu sau vô hóa được để nguội bớt vài phút Bổ sung 15 ml nước cất tách ion 151 Chuyển hỗn dịch thu được sang ống nghiệm thủy tinh chị nhiệt 50 ml, có thắt đáy và lắc đều Để hỗn dịch thu được nguội Ly tâm hỗn dịch ở 3500 vòng/phút x 10 phút Tách bỏ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần kết tủa Rửa lại cốc đựng mẫu sau vô hóa bằng cách thêm 20 ml nước cất và ml axit sulfuric 0,5 M vào cốc và đun nóng Khi nước cốc còn nóng, rửa và đổ toàn bộ hỗ dịch sang ống nghiệm 50 ml đựng chất kết tủa ở Khuấy trộ đều hỗ dịch ống nghiệm và ly tâm một lần nữa H P Gạn bỏ toàn bộ dung dịch ở phía của ống nghiệm sau ly tâm Trộn chất kết tủa còn lại ống nghiệm với 25 ml dung dịch amoni cacbonat bão hòa (khoảng 20 %) khuấy cho đến tất cả phần kết tủa được phân tán hết Để yên hỗ dịch thu được giờ Ly tâm hỗn dịch gạn bỏ phần chất lỏng phía trên, giữa lại phần kết tủa U Lặp lại bước hòa tan tủa ống nghiệm bằng amoni cacbonat thêm nhất hai lần nữa H Sau gạn bỏ phần nước ở phái trên, lật úp ống ly tâm lên khăn giấy và để hết nước Thêm ml axit nitric M, kh́y mạnh để đ̉i khí CO2 hoặc sử dụng bể siêu âm từ phút đến phút, để yên 30 phút ly tâm nếu vẫn chất kết tủa Các bước được thực hiện tương tự ống mẫu chuẩn Chuẩn độ máy quang phổ hấp thụ nguyên tử Khởi động máy và cài đặt các điều kiện cần thiết, sử dụng ngọn lửa oxi hóa không khí axetylen và bước sóng cợng hưởng 217,0 nm hoặc 283,3 nm 152 Xác định độ hấp thụ của dung dịch thử dung dịch trắng nhất chuẩn dải làm việc tối ưu (10% đến 80% T) trước và sau đọc mẫu Rửa đầu đốt bằng axit nitric M kiểm tra điểm “0” giữa lần đọc Ghi nhận kết quả đo Đánh giá kết quả Xác định hàm lượng chì từ đường chuẩn của độ hấp thụ A dựa theo nồng đợ chì (µg/ml) có mẫu ch̉n đo được Hàm lượng chì mẫu thực phẩm (X) được tính bằng microgam gam, theo công thức sau: X H P m1 v m2 Trong đó: o m1 : là hàm lượng chì từ đường chuẩn tương ứng với đợ hấp thụ A, tính bằng µg/ml; U o v: thể tích dung dịch axit nitric M đã sử dụng, tính bằng mililít o m2: khới lượng phần mẫu thử, tính bằng gam Theo QCVN 8-2:2011 quy định giới hạn ô nhiễm chì các sản H phẩm thực phẩm sau: Giới hạn Tên sản phẩm mg/kg mg/L Sữa sản phẩm sữa 0,02 Thịt trâu, bò, lợn, cừu, gia cầm 0,1 Phụ phẩm của trâu, bò, lợn, gia cầm 0,5 Dầu mỡ động vật 0,1 Bơ thực vật, dầu thực vật 0,1 Rau họ thập tự (cải) 0,3 Hành 0,1 153 Giới hạn Tên sản phẩm mg/kg mg/L Rau ăn quả 0,1 Rau ăn lá 0,3 Rau họ đậu 0,2 Rau ăn củ và ăn rễ 0,1 Nấm 0,3 Ngũ cốc 0,2 Các loại trái nhiệt đới, ăn được vỏ 0,1 Các loại trái nhiệt đới, không ăn được vỏ 0,1 H P Quả mọng quả nhỏ khác 0,2 Quả có múi 0,1 Nhóm quả táo 0,1 Nhóm quả có hạt 0,1 Mứt (mứt quả) thạch U Các loại rau, quả khô Các loại rau, quả đóng hộp Nước ép rau, quả (mg/l) Chè sản phẩm chè Cà phê H 1,0 2,0 1,0 0,05 2,0 2,0 Cacao sản phẩm cacao (gồm sôcôla) 2,0 Gia vị (trừ bột cà ri) 2,0 Bột cà ri 2,0 Nước chấm (mg/l) 2,0 Muối ăn 2,0 Đường 2,0 Mật ong 2,0 Dấm (mg/l) 0,5 Cơ thịt cá kiếm 154 Giới hạn Tên sản phẩm mg/kg mg/L Cơ thịt cá 0,3 Giáp xác (trừ phần thịt nâu của ghẹ, đầu ngực của tơm hùm lồi giáp xác lớn) 0,5 Nhuyễn thể hai mảnh vỏ 1,5 Nhuyễn thể chân đầu (khơng nợi tạng) 1,0 Nước khống thiên nhiên (mg/l) 0,01 Nước uống đóng chai (mg/l) 0,01 Rượu vang (mg/l) 0,2 H P Thức ăn công thức cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ (ăn liền) 0,02 Thực phẩm chức 3,0 (Trích nguồn QCVN 8-2:2011/BYT) U H 155 TÀI LIỆU THAM KHẢO TCVN 7602:2007 Thực phẩm – Xác định hàm lượng chì bằng phương pháp quan phổ hấp thụ nguyên tử QCVN 8-2: 2011/BYT Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm kim loại nặng thực phẩm AOAC 935.50 Lead Suitability of methods and precautions AOAC 934.07 Lead in food General Dithizone Method AOAC 972.25 Lead in Food Atomic absorption spectrophotometric method H P U H 156