BỘ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BOUNTHAVY PHENGSAVATDY KHẢO SÁT KHẢ NÀNG VI NANG HOÁ NẮM MEN Saccharomyces boulardii BẰNG NGUYÊN LIỆU CARRAGEENAN KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÃ NỘI 2023 BỘ YTẾ TRƯỜ[.]
BỘ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BOUNTHAVY PHENGSAVATDY KHẢO SÁT KHẢ NÀNG VI NANG HOÁ NẮM MEN Saccharomyces boulardii BẰNG NGUYÊN LIỆU CARRAGEENAN KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÃ NỘI - 2023 BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BOUNTHAVY PHENGSAVATDY MÃ SINH VIÊN: 1801545 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG VI NANG HOÁ NÁM MEN Saccharomyces boulardỉi BẰNG NGUYÊN LIỆU CARRAGEENAN KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ Người hướng dẫn: PGS TS Đàm Thanh Xuân TS Nguyễn Đức Thiện Nơi thực Bộ• mơn Cơng” nghệ ” • sinh học • Dược • Khoa Cơng nghệ sinh học HÀ NỘI - 2023 LỜI CÃM ƠN Khóa luận thực hồn thành Bộ môn Công nghệ sinh học Dược - Khoa Công nghệ sinh học Trong suốt thời gian thực khóa luận, em nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ thầy cơ, bạn bè gia đình Với tất kính trọng lịng biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Đàm Thanh Xuân TS Nguyễn Đức Thiện, người thầy ln tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ em từ ngày em hồn thành khố luận Em xin gửi lời cảm ơn tới công ty TNHH Sản xuất Thương mại Hoàng Yến cung cấp nguyên liệu carrageenan cho em sử dụng suốt q trình thực • • khố luận • Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Khắc Tiệp Ths Lê Ngọc Khánh, hai người thầy giúp đỡ, hỗ trợ cho em lời khuyên bổ ích suốt q trình làm khố luận Em cảm ơn chị Phạm Thị Thanh Huyền, chị Nguyễn Thị Kim Chi - kỹ thuật viên; chị Trần Thị Minh Thu, chị Đỗ Thị Huyền Thương - học viên cao học khoá 27; bạn Nguyễn Thị Thu Trang, Khổng Thị Ngọc Anh, Vũ Thành Lập, Nguyễn Thị Lan Anh, Thân Đắc Hùng, Mai Phương Thu, Bùi Thị Phương Thanh Bùi Thị Mai Nhung - sinh viên nghiên cứu khoá 73, em khoá 74 nghiên cứu môn Công nghệ sinh học Dược đà đồng hành sẻ chia, giúp đỡ em thời gian làm khoá luận Hơn nữa, em xin cảm ơn thầy cô giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ mơn Vật lý, Bộ mơn Hố sinh, Bộ mơn Vi sinh Sinh học, Bộ môn Công nghiệp Dược, Bộ mơn Dược lý Bộ mơn Kỹ thuật hố dược - chiết xuất tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu tồn thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho em thời gian học tập trường Cuối cùng, em xin bày tỏ cảm ơn chân thành tới gia đình, ngưịi thân bạn bè đà động viên, ủng hộ em trình học tập sống Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Bounthavy PHENGSAVATDY MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẬT VẤN ĐÈ CHƯƠNG 1: TỒNG QUAN 1.1 Tổng quan carrageenan 1.1.1 Nguồn gốc, cấu trúc phân loại 1.1.2 Tính chất vật lý 1.1.3 Tính chất tạo gel 1.1.4 Cơ chế tạo gel 1.2 Tổng quan vi nang 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Cấu tạo vi nang 1.2.3 Các phương pháp tạo vi nang 1.3 Tồng quan probiotics 1.3.1 Khái niệm probiotics 1.3.2 Các vi sinh vật probiotics phổ biến 1.3.3 Đặc tính probiotics 10 1.3.4 Một số phương pháp đánh giá đặc tính probiotics 10 1.4 Tổng quan loài Saccharomyces boulardii 11 1.5 Tình hình nghiên cứu sử dụng carrageenan nưóc giói 12 CHƯƠNG 2: ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ .14 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 14 2.1.1 Chủng vi sinh vật 14 2.1.2 Nguyên liệu 14 2.1.3 Hoá chất 14 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 14 2.1.5 Môi trường sử dụng nghiên cún 15 2.1.6 Dung dịch sử dụng nghiên cứu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1 Khảo sát số thông số trình tạo vi nang từ carrageenan 16 2.2.2 Đánh giá số đặc tính vi nang carrageenan chứa s bouỉardii 16 2.3 Phuong pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn nhiệt ẩm 16 2.3.2 Phuong pháp tạo vi nang phương pháp tách pha đông tụ 16 2.3.3 Phương pháp đo kích thước vi nang hình thành 17 2.3.4 Phương pháp đông khô 17 2.3.5 Phương pháp đánh giá chất bên cấu tạo bên vi nang 17 2.3.6 Phương pháp đánh giá độ rã vi nang điều kiện pH mô dịch dày, ruột non đại tràng 18 2.3.7 Phương pháp nuôi cấy s boulardỉi thu sinh khối 18 2.3.8 Phương pháp tạo vi nang tươi chứa s bouỉardiỉ 19 2.3.9 Phương pháp phá hạt để xác định số lượng s bouỉardỉỉ vi nang tươi carrageenan 19 2.3.10 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng vsv vi nang 19 2.3.11 Phương pháp làm tiêu giọt ép để soi vsv 20 CHƯƠNG 3: THỤC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Khảo sát số thơng số q trình tạo vi nang từ carrageenan 21 3.1.1 Khảo sát nồng độ dung dịch carrageenan, KC1 CaCh để tạo vi nang 21 \ r 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng kích cỡ đâu nhở giọt đên kích thước vi nang hình thành 25 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng khoảng cách nhở giọt đến thể chất vi nang 27 3.1.4 Khảo sát chất hạt vi nang carrageenan đông khô 29 3.1.5 Khảo sát độ rã vi nang carrageenan đông khô điều kiện pH mô dịch dày, ruột non đại tràng .31 3.2 Đánh giá số đặc tính vi nang carrageenan chứa s boulardii 32 3.2.1 Đánh giá thê chât bên câu tạo bên vi nang carrageenan chứa boulardiỉ 32 3.2.2 Đánh giá khả giải phóng s bouỉardỉỉ vi nang carrageenan đông khô điều kiện pH mô dịch dày, ruột non đại tràng 35 r £ 3.2.3 Đánh giá số lượng s bouỉardiỉ vi nang tươi carrageenan 37 CHƯƠNG 4: KẾT LƯẬN VÀ ĐÈ XƯẤT .38 4.1 Kết luận 38 4.2 Đề xuất DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 38 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AIDS: : Hội chứng suy giảm miên dịch người (Acquired Immunodeficiency Syndrome) B longum, B bifidum : Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum B megaterium : Bacillus megaterỉum CFU : Số đon vị khuẩn lạc (Colony - Forming Units) cP : Đon vị độ nhớt Centipoise cs : Cộng DĐVN V : Dược điển Việt Nam V FAO : Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization of the United Nations) g GRAS : Đơn vị đo khối lượng (gam) : Nhóm cơng nhận an tồn (Generally Recognized As Safe) H pylori : Helicobacter pylori HĨV : Virus gây suy giảm hệ miễn dịch người (Human Immunodeficiency Virus) ISAPP : Hiệp hội khoa học quốc tế Probiotics Prebiotics (International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics) K-, 1-, Ấ-carrageenan : Loại kappa-, iota-, lambda-carrageenan kl/tt : Khối lượng/thể tích L acidophilus, L casei : Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus easel M : Nồng độ mol MPa : Đơn vị độ nhớt (Mega pascal) MT1,MT2 : Môi trường 1, Môi trường s boulardỉi : Saccharomyces boulardiỉ SD : Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) SGJ : Dịch dày mô phong (Simulated Gastric Juice) SU : Dịch ruột mô phong (Simulated Intestinal Juice) TCCS : Tiêu chuẩn sở TCNSX : Tiêu chuẩn nhà sản xuất TKHH : Tinh khiết hóa học vsv : Vi sinh vật WHO : Tổ chức Y tế giới (World Heald Organization) DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hố học carrageenan Hình 1.2 Cấu trúc hố học loại carrageenan Hình 1.3 Sự hình thành gel kết họp cấu trúc xoắn ốc hạ nhiệt độ dung dịch carrageenan nóng Hình 1.4 Cơ chế tạo gel K-carrageenan có mặt ion kali Hình 1.5 Cơ chế tạo gel 1-carrageenan có mặt ion canxi Hình 1.6 Ba cấu tạo vi nang thường gặp Hình 1.7 Hình ảnh bouỉardỉi quan sát kính hiển vi thường kính hiển vi điện tử quét 11 Hình 3.1 Hình ảnh vi nang hình thành từ carrageenan 1,0; 1,2; 1,5 2,0% với nồng độ dung dịch đông tụ KC1 CaCỈ2 (2; 10%) 22 Hình 3.2 Các vi nang hình thành từ carrageenan 1,2%; sử dụng kích cỡ đầunhở giọt Dl, D2, D3 với nồng độ 3% dung dịch đông tụ KC1 CaCh 26 Hình 3.3 Các vi nang hình thành từ carrageenan 1,2% với KC1 3% CaCỈ2 3%; sử dụng khoảng cách nhỏ giọt 3; 10 cm 28 Hình 3.4 Vi nang đơng khơ hình thành từ carrageenan 1,2% với (a) KC1 3% (b) CaCl2 3% 29 Hình 3.5 Vi nang đơng khơ hình thành từ carrageenan 1,2% với (a) KC1 3% (b) CaCỈ2 3% kính lúp soi (độ phóng đại 16X) 30 Hình 3.6 Vi nang chứa sinh khối s bouỉardii hình thành từ carrageenan 1,2% với KC1 3%: (a) mẫu tươi; (b) mẫu đông khô 33 Hình 3.7 Vi nang chứa sinh khối s boulardỉi (carrageenan 1,2% - KC1 3%) 34 Hình 3.8 Kết thử độ rã qua pH đường tiêu hố mơ vi nang đơng khơ chứa s bouỉardiỉ theo công thức carrageenan 1,2% - KC1 3% 35 Hình 3.9 Hình ảnh tế bào s boulardiỉ sau pH 7,4 kính hiến vi quang học (độ phóng đại lOOx) 36 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Hoá chất sử dụng 14 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 2.3 Các dụng cụ sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 3.1 Kết khảo sát nồng độ dung dịch carrageenan, KC1 CaCỈ2 để tạo vi nang 21 Bảng 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng kích cỡ đầu nhở giọt đến kích thước vi nang carrageenan 1,2% (n=20) 25 Bảng 3.3 Độ rã vi nang đông khô carrageenan 1,2% với dung dịch KC1 3% CaCh 3% điều kiện pH mơ đường tiêu hố 31 Bảng 3.4 Số lượng boulardỉỉ vi nang tươi carrageenan 1,2% - KC1 3% 37 ĐẶT VÁN ĐỀ Carrageenan polysacarit tự nhiên quan trọng mặt thương mại, chiết xuất từ loài rong đỏ đà sử dụng rộng rãi ngành công nghiệp thực phẩm [1] Tại vùng biển Việt Nam có 800 loài rong biển thuộc tất ngành rong đỏ công bổ giới, số có gần 40 lồi rong đỏ chứa carrageenan với hàm lượng cao [20] Trong thập kỷ qua, nhờ tính chất hóa lý hấp dẫn carrageenan tính chất tạo gel nồng độ thấp, gel bền, ổn định, [61]; tính thân thiện với mơi trường, tính tương thích sinh học độc tính thấp [68], carrageenan phát triển thành phương tiện vật liệu sinh học đa để phân phối thuốc [45] Trong đó, carrageenan sử dụng vật liệu bao bọc q trình vi nang hố [29] Nấm men Saccharomyces boulardii vi sinh vật (VSV) probiotics tìm thấy hệ vsv đường ruột người [36] Khi đưa vào với số lượng đủ lớn đem lại nhiều lợi ích cho người như: ức chế tác nhân gây bệnh ruột, bất hoạt độc tố vsv, tác dụng đến niêm mạc ruột, điều chỉnh hệ vsv bình thường, điều hoà hệ thống miễn dịch, [52] Tuy nhiên, nấm men qua đường tiêu hố bị tác động bất lợi yếu tố pH dịch vị, enzym tiêu hố đó, không phát huy hết tác dụng điều trị [8] Để giải vấn đề trên, công nghệ vi nang hóa nấm men Saccharomyces bouỉardiỉ nhờ hệ gel carrageenan phương pháp đơn giản phổ biến sản xuất chế phẩm probiotics, giúp bảo vệ nấm men khỏi tác động bất lợi di chuyển đường tiêu hóa [48] Hạt vi nang tạo thành cần có hình dạng cầu đều, bề mặt đồng nhất, có đồng kích thước phải chứa đủ lượng tế bào nấm men cần thiết Đồng thời, vi nang phải bảo vệ nấm men pH dày mô phỏng, cần có khả giải phóng nấm men pH ruột mô để phát huy tác dụng hệ tiêu hố [34] Tính đến thời gian tại, số nghiên cứu tạo vi nang probiotics sử dụng carrageenan tiến hành giới [42], [67], [68] Tiếp nối nghiên cứu đó, đề tài: “Khảo sát khả vi nang hoá nấm men Saccharomyces boulardii nguyên liệu carrageenan” thực với mục tiêu: Khảo sát số thông số trình tạo vi nang tù’ carrageenan Đánh giá số đặc tính vi nang carrageenan chứa nấm men Saccharomyces boulardii