Xác định adn mã vạch giống bạch đàn lai up99 và up95 (eucalyptus urophylla x eucalyptus pellita) phục vụ giám định giống cây

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: XÁC ĐỊNH ADN MÃ VẠCH GIỐNG BẠCH ĐÀN LAI UP99 UP95 (Eucalyptus urophylla X Eucalyptus pellita) PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH GIỐNG CÂY Giảng viên hướng dẫn : TS Bùi Thị Mai Hương Sinh viên thực : Phạm Thị Kim Yến Lớp : K64 – CNSH Hà Nội, 2023 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp trang bị kiến thức cho em suốt trình học tập Nhân dịp này, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô TS Bùi Thị Mai Hương người trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ đóng góp ý kiến quý báu để em hồn thành khóa luận Trong q trình thực khóa luận, em học nhiều điều rút nhiều học kinh nghiệm q báu Vì kiến thức thân cịn hạn chế, q trình thực đề tài khơng tránh khỏi sai sót, em kính mong nhận ý kiến đóng góp q báu thầy Tơi xin chân thành cảm ơn! i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC VIẾT TẮT vi ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .3 1.Giới thiệu chung bạch đàn lai UP99 UP95 .3 1.1Nguồn gốc đặc điểm ưu việt dòng bạch đàn lai UP99 UP 95 .3 1.2Đặc điểm dòng bố mẹ dòng UP99 UP95 1.2.1Phân loại 1.2.2 Đặc điểm 2.Tổng quan ADN mã vạch .8 2.1Giới thiệu ADN mã vạch (ADN barcode) 2.2Một số locus sử dụng làm thị mã vạch ADN thực vật 2.2.1 Trình tự gen nhân 2.2.2 Vùng gen mã hóa Ribosome 10 2.2.3Trình tự gen lục lạp 10 2.3Những nghiên cứu ứng dụng ADN mã vạch giám định loài 13 2.3.1 Trên giới 13 2.4 Tổng quan phương pháp xử lí liệu nghiên cứu ADN mã vạch giám định loài 16 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 1.Mục tiêu nghiên cứu .17 1.1Mục tiêu tổng quát 17 1.2Mục tiêu cụ thể .17 2.Nội dung nghiên cứu .17 2.1Xác định số trình tự ADN mã vạch cho dịng bạch đàn lai UP99 UP95 17 2.2.Địa điểm 17 2.3.Đối tượng, vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 17 ii 2.3.1 Đối tượng nghiên cứu .17 2.3.2 Vật liệu nghiên cứu 18 2.3.3 Hóa chất sử dụng nghiên cứu dụng cụ thí nghiệm 18 2.4 Phương pháp nghiên cứu xác định ADN mã vạch 21 2.4.1 Tách chiết ADN tổng số 21 2.4.2 Phương pháp nhân gen đích kỹ thuật PCR 22 2.4.3 Tinh sản phẩm PCR 26 2.5 Phương pháp đọc trình tự ADN 26 2.6Xử lý số liệu 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 1.Kết tách chiết ADN tổng số số từ Bạch đàn lai UP99 UP95 .28 2.Kết nhân ADN mã vạch kỹ thuật PCR 28 3.Kết xác định phân tích trình tự nucleotide đoạn ADN mã vạch 30 3.1 Trình tự đoạn gen rcbL 30 3.2 Trình tự đoạn gen matK 33 3.3 Trình tự đoạn gen trnH-psbA .36 3.4 Trình tự đoạn gen ITS 39 3.5 Trình tự đoạn gen ITS2 41 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 1KẾT LUẬN .45 2.KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 iii DANH MỤC BẢNG Bảng1.1 Phân loại khoa học Bạch Đàn lai .4 Bảng 2.1 Kí hiệu mẫu Bạch đàn lai UP99 18 Bảng 2.2 Kí hiệu mẫu Bạch đàn lai UP95 18 Bảng 2.3 Thành phần đệm tách A (100µl) 18 Bảng 2.4 Thành phần đệm tách B (100µl) 19 Bảng 2.5 Thành phần đệm TE (100µl) .19 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR 23 Bảng 2.7 Trình tự thông tin cặp mồi sử dụng 24 Bảng 2.8 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 25 Bảng 3.1 Một số lồi có trình tự đoạn rbcL tương đồng với giống Bạch đàn lai UP99 NCBI 31 Bảng 3.2 Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai UP99, UP95 với loài khác đoạn rbcL 33 Bảng 3.3 Một số lồi có trình tự đoạn matK tương đồng với giống Bạch đàn lai UP99 NCBI 34 Bảng 3.4 Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai UP 99,UP95 .36 Bảng 3.5 Một số lồi có trình tự đoạn trnH-psbA tương đồng với giống 37 Bảng 3.6 Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai UP99 UP95 với loài khác đoạn trnH-psbA 38 Bảng 3.7 Một số lồi có trình tự đoạn ITS tương đồng với giống Bạch đàn lai UP99 NCBI 40 Bảng 3.8 Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai UP99 UP95 với loài khác đoạn ITS 41 Bảng 3.9 Một số lồi có trình tự đoạn ITS tương đồng với giống Bạch đàn lai UP99 NCBI 42 Bảng 3.10 Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai UP99 UP95 với loài khác đoạn ITS2 44 iv DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Rừng trồng bạch đàn Urophylla năm tuổi tỉnh Phú Thọ, Việt Nam .5 Hình 1.2: Hình thái Bạch đàn E.pellita Hình 3.1 : Ảnh điện di sản phẩm ADN tổng số tách từ mẫu dòng Bạch đàn lai UP99 UP95 28 Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu UP99 với mồi đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITSc (M: Marker) 29 Hình 3.3 Ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu UP95 với mồi đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 (M: Marker) 29 Hình 3.4 Trình tự ADN đoạn gen rbcL giống Bạch đàn lai UP99 .30 Hình 3.5 Trình tự ADN đoạn gen rbcL giống Bạch đàn lai UP95 .30 Hình 3.7 Trình tự ADN đoạn gen matK giống Bạch đàn lai UP99 .33 Hình 3.8 Trình tự ADN đoạn gen matK giống Bạch đàn lai UP95 34 Hình 3.9 Cây quan hệ di truyền dựa đoạn gen matK giống Bạch đàn lai UP99, UP95 35 Hình 3.10 Trình tự ADN đoạn gen trnH-psbA giống Bạch đàn lai UP99 36 Hình 3.11 Trình tự ADN đoạn gen trnH-psbA giống Bạch đàn lai UP95 37 Hình 3.12 Cây quan hệ di truyền dựa đoạn gen trnH-psbA UP99 UP95 với số loài ngân hàng gen quốc tế 38 Hình 3.13 Trình tự ADN đoạn gen ITS giống Bạch đàn lai UP99 .39 Hình 3.14 Trình tự ADN đoạn gen ITS giống Bạch đàn lai UP95 .39 Hình 3.15 Cây quan hệ di truyền dựa đoạn gen ITS UP 99 UP 95 với số loài Ngân hàng gen Quốc tế 40 Hình 3.16 Trình tự ADN đoạn gen ITS2 giống Bạch đàn lai UP99 .42 Hình 3.17 Trình tự ADN đoạn gen ITS2 giống Bạch đàn lai UP95 .42 Hình 3.18 Cây quan hệ di truyền dựa đoạn gen ITS2 Bạch đàn lai UP99, UP95 với số loài Ngân hàng gen Quốc tế 43 v DANH MỤC VIẾT TẮT Các chữ viết tắt ATP bp Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat Base pair Cặp base cpADN Chloroplast ADN Bộ gen lục lạp CTAB Cetyl trimethylammonium bromide Cetyl trimethylammonium bromide CBOL Consortium for the Barcode of Life Consortium for the Barcode of Life ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate Deoxyribonucleotid triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit ethylenediamine tetraacetic FPrimer Foward-Primer Mồi xuôi IGS Intergenic Spacer Vùng liên gen ITS Internal Transcribed Spacer Vùng ADN nằm gen NAD(P Nicotinamide adenine )H dinucleotide phosphate Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ sinh học PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase RFLP Restriction fragment length polymorphism Phân tích đa hình trình tự ADN RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome Reverse primer Mồi ngược TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA tRNA Transfer RNA ARN vận chuyển RPrimer UV Untraviolet Tia cực tím V/p v/p Vịng / phút vi ĐẶT VẤN ĐỀ Bạch đàn nói chung hay gọi khuynh diệp (bạc hà), chi thực vật có hoa Eucalyptus trong trong họ Sim (Myrtaceae) Hiện giới có 700 lồi bạch đàn, hầu hết có địa Australia Ngoài ra, số loài tìm thấy New Guinea, Indonesia lồi vùng viễn bắc Philippines Đài Loan Các loài bạch đàn trồng vùng nhiệt đới cận nhiệt đới gồm châu Mỹ, châu Âu, châu Phi, vùng Địa Trung Hải, Trung Đông, Trung Quốc, bán đảo Ấn Độ Việt Nam Bạch đàn lồi gỗ có giá trị kinh tế cao làm gỗ xây dựng, làm nguyên liệu chế biến bột giấy ván ép công nghiệp, tinh dầu bạch đàn điều trị đau đầu, nhức xương y học… Trong gần 20 năm qua, loài bạch đàn đóng vai trị quan trọng rừng trồng độ cao 800 m Việt Nam, nơi chúng trồng để sản xuất bột giấy cột xây dựng Tổng diện tích trồng bạch đàn Việt Nam năm 2001 348 000 ha, chiếm khoảng 30% tổng diện tích trồng nước (MARD 2002) Và gần đây, số giống bạch đàn lai có suất cao chọn gây trồng thành công số nước Brazil, Congo, Trung Quốc, Ấn Độ, Philippin, Indonesia, Zambia… Bạch đàn lai UP99 UP95 tạo từ hai loài Bạch đàn E.urophylla E.pellita giống Bạch đàn lai cơng nhận giống có giá trị kinh tế cao trồng rừng sản xuất Do đó, việc nghiên cứu xác định đoạn mã vạch ADN cho giống Bạch đàn lai UP 99, UP 95 phục vụ giám định dòng vấn đề cần thiết cấp bách cho việc định danh phát triển vùng trồng để đưa giống lai UP99, UP95 vào sản xuất đại trà Việt Nam Xác định đoạn mã vạch ADN phương pháp định danh, sử dụng đoạn ADN chuẩn ngắn nằm hệ gen sinh vật nghiên cứu để phục vụ giám định loài Phương pháp mang lại hiệu cao thời gian ngắn, góp phần khơng nhỏ vào định danh bảo tồn loài thực vật giới Phương pháp xác định đoạn mã vạch ADN công cụ hữu hiệu bổ trợ cho phương pháp phân loại dựa vào hình thái Một số lồi Bạch đàn định danh thành công mã vạch ITS matK, rbcL, psbA-matK, trnG-psbK Với lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “ XÁC ĐỊNH ADN MÃ VẠCH GIỐNG BẠCH ĐÀN LAI UP99 UP95 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH GIỐNG CÂY” Trong nghiên cứu này, tiến hành lựa chọn năm đoạn trình tự ADN để sử dụng làm mã vạch ADN là: matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 Trong số đó, đoạn rbcL, trnH-psbA matK đoạn ADN nằm hệ gen lục lạp, đoạn ITS ITS2 nằm hệ gen nhân Các đoạn trình tự có tính đặc trưng cao cho lồi, đem lại kết khả quan nhằm phân loại, giám định xác định mối quan hệ di truyền, đồng thời nhận biết biến đổi cá thể dịng Từ góp phần nâng cao hiệu bảo tồn, phát triển nhận biết xác dịng khác lồi Bạch đàn lai Việt Nam .CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1.1 Giới thiệu chung bạch đàn lai UP99 UP95 1.1 Nguồn gốc đặc điểm ưu việt dòng bạch đàn lai UP99 UP 95 - Nguồn gốc: UP99 UP95 hai dòng Bạch đàn lai Eucalyptus urophylla Eucalyptus pellita; U kí hiệu urophylla, P kí hiệu pellita, số 99 95 biểu thị cho đầu dòng sử dụng để làm giống lai Trong mục trồng trọt báo Khuyến Nông Việt Nam Bạch đàn UP99 UP95 trồng ngồi thực tế trường cho kết đáng mong đợi Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn định công nhận giống Bạch đàn lai UP 99 UP95 phù hợp với nhiều vùng sinh thái nước - Những đặc điểm vượt trội UP99 UP95 công nhận bao gồm: o Khả chống chịu sâu bệnh tốt o Năng suất cao đạt 25-30m3/ha/năm o Cây sinh trưởng tốt cho thân to, thẳng trịn đều; cành nhánh nhỏ; mấu mắt o Bộ rễ ăn sâu, chiều cao cành lớn o Gia tăng lợi nhuận cho người trồng rừng [1] Với nhiều đặc tính trội trên, UP99 UP95 lựa chọn để tiến hành nghiên cứu nhân nhanh vùng trồng hai dòng Việt Nam để cung cấp gỗ nước xuất Tuy nhiên, đặc điểm hình thái hai dịng UP99 UP95 có đặc điểm giống khó phân biệt quan sát hình thái, dễ bị nhầm lẫn Vì vậy, để góp phần vào việc phân loại giống Bạch đàn lai lựa chọn phương pháp định danh ADN barcode cho hai dòng UP99 UP95 1.2 Đặc điểm dòng bố mẹ dòng UP99 UP95 1.2.1 Phân loại Bạch đàn Eucalyptus urophylla Eucalyptus pellita có vị trí phân loại sau: Bảng 3.4 Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai UP 99,UP95 với loài khác đoạn matK UP99_E.urophy lla x E.pellita UP95_E.urophy lla x E.pellita Syzygium paniculatu m E.urophyll a E.pellit a E.grandi s UP99_E.urophylla x E.pellita UP95_E.urophylla E.pellita x 0,0000 Syzygium paniculatum 0,0196 0,0196 E.urophylla 0,0000 0,0000 0,0196 E.pellita 0,0055 0,0055 0,0196 0,0055 E.grandis 0,0055 0,0055 0,0196 0,0055 0,0000 Từ phân loại dựa số liệu trình tự đoạn gen matK kết hợp với khoảng cách di truyền hệ số tương đồng giống Bạch đàn lai UP99 UP95 với loài khác ta thấy: giống Bạch đàn lai UP99 có trình tự gen giống 100% với đoạn gen UP95, E.urophylla với khoảng cách di truyền 0,0000 có quan hệ xa với loài E.grandis E.pellita với khoảng cách di truyền 0,0055 (hệ số tương đồng 99,45%) Tuy nhiên, giống Bạch đàn lai UP99 có quan hệ xa với lồi Syzygium paniculatum với khoảng cách di truyền 0,0196 (hệ số tương đồng 98,07%) Như vậy, trình tự đoạn gen matK chưa xác định khác giống Bạch đàn lai UP99 UP95 3.3 Trình tự đoạn gen trnH-psbA Kết xác định trình tự nucleotide đoạn gen trnH-psbA cho thấy mẫu UP99.1; UP99.2; UP99.3 có kích thước 626bp mẫu UP95.1; UP95.2; UP95.3 có kích thước 626bp thể hình 3.10 3.11: CGCGCATGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTGATCCACTTGGCTACATCCGCCCCCACTACTA CTAATATTCTTTTTTTTCTTTTTAAATGGATTAAAAAGAAAAAAAAGAATATTCCATTTTTAAT GAAATAAAAAAAAGAAATTCATAATGGAAAATATTTCATTCGATTGTTAATTTTTAACATTTTT CTATACTTAATTATGAGTAACATTTTTCTATCTTAATTATGAGATAGAAGAAGCAGAAAATTAT AACCTTTCTATTTTATTTGATAAAAAAAAACTAGAAGATAATAATCTCACAAAGCCTTACAAAG GGTTGAAAAGAATGTATATAAATTCATATCTAAGGAAAAAAGTATGATAAGCAATCATAAAGCA ATCCCTAAGACTAGAATACTTTTTCTTATGTTGAAGTAAAGAAAAACTTATGTAAAGAAAAGAG CACTAAATAAAGGAACAATAACCAATTTCTTTTTCTATCAAGAGTGTTGGTTATTGCTCCTTTC CAATCAAAAACTCGGCTAGACTTATACTAAGACCAAAGTCTTATCCATTTGTAGATGGAACTTC GACAGCAGCTAGGTCTAGAGGGAAGTTATGAGCATTACGTTCATGCATAAC 36 Hình 3.10 Trình tự ADN đoạn gen trnH-psbA giống Bạch đàn lai UP99 CGCGCATGGTGGATTCACAATCCACTGCCTTGATCCACTTGGCTACATCCGCCCCCACTAC TACTAATATTCTTTTTTTTCTTTTTAATCCATTTAAAAAGAAAAAAAAGAATATTCCATTTT TAATGAAATAAAAAAAAGAAATTCATAATGGAAAATATTTCATTCGATTGTTAATTTTTAAC ATTTTTCTATACTTAATTATGAGTAACATTTTTCTATCTTAATTATGAGATAGAAGAAGCAG AAAATTATAACCTTTCTATTTTATTTGATAAAAAAAAACTAGAAGATAATAATCTCACAAAG CCTTACAAAGGGTTGAAAAGAATGTATATAAATTCATATCTAAGGAAAAAAGTATGATAAGC AATCATAAAGCAATCCCTAAGACTAGAATACTTTTTCTTATGTTGAAGTAAAGAAAAACTTA TGTAAAGAAAAGAGCACTAAATAAAGGAACAATAACCAATTTCTTTTTCTATCAAGAGTGTT GGTTATTGCTCCTTTCCAATCAAAAACTCGGCTAGACTTATACTAAGACCAAAGTCTTATCC ATTTGTAGATGGAACTTCGACAGCAGCTAGGTCTAGAGGGAAGTTATGAGCATTACGTTCAT GCATAAC Hình 3.11 Trình tự ADN đoạn gen trnH-psbA giống Bạch đàn lai UP95 Các trình tự sau so sánh với trình tự ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tương đồng với đoạn gen trnH-psbA dịng Bạch đàn lai UP99 cách sử dụng công cụ BLASTn Một số lồi có trình tự gen tương đồng dùng so sánh với giống Bạch đàn lai UP99 trình bày bảng 3.5: Bảng 3.5 Một số lồi có trình tự đoạn trnH-psbA tương đồng với giống Bạch đàn lai UP99 NCBI T Tên loài Mã số T Hệ số tương đồng Eucalyptus urophylla EF507887.1 100% Eucalyptus grandis EF507887.1 99,41% UP 95_ E.urophyla x E.pellita UP95 100% Syzygium aromaticum MH070008.1 85,05% Sau xây dựng phát sinh chủng loại tìm mối quan hệ giống Bạch đàn lai nghiên cứu với loài khác bảng 3.5 khoảng cách di truyền chúng thể hình 3.12 37 Hình 3.12 Cây quan hệ di truyền dựa đoạn gen trnH-psbA UP99 UP95 với số loài ngân hàng gen quốc tế Bằng phần mềm mega X nhận khoảng cách di truyền dịng Bạch đàn lai UP99 với lồi khác sau: Bảng 3.6 Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai UP99 UP95 với loài khác đoạn trnH-psbA UP 99_ E.urophyla x E.pellita UP 95_ E.urophyla x E.pellita Syzygium aromaticum UP 99_E.urophyla x E.pellita UP 95_ E.urophyla x E.pellita 0,0000 Syzygium aromaticum 0,1106 0,1106 E urophylla 0,0000 0,0000 38 0,1106 E E urophylla grandis E.grandis 0,0086 0,0086 0,0966 0,0086 Từ phân loại dựa số liệu trình tự đoạn gen trnH-psbA kết hợp với hệ số tương đồng giống Bạch đàn lai UP99 UP95 với loài khác ta thấy: giống Bạch đàn lai UP99 gần gũi với giống UP95, với loài E urophylla (khoảng cách di truyền 0,0000), tương đồng 100% Với đoạn gen lồi E grandis có quan hệ xa UP99 với hệ số tương đồng 99,41% (khoảng cách di truyền 0,0086), nhiên UP99 có quan hệ xa với loài Syzygium aromaticum với hệ số tương đồng 85,05% (khoảng cách di truyền 0,1106) Như vậy, trình tự đoạn gen trnH-psbA chưa xác định khác giống Bạch đàn lai UP99 UP95 3.4 Trình tự đoạn gen ITS Kết xác định trình tự nucleotide đoạn gen ITS cho thấy mẫu UP99.1; UP99.2; UP99.3 có kích thước 563bp mẫu UP95.1; UP95.2; UP95.3 có kích thước 534bp thể hình 3.13 hình 3.14: CCGACGTCCCTCTCGACGCGGAGGATCGGGGCTCGGGCACCTCAGGGCGCTCGGCCTTTGTCC TCGGCGGCGCAACGAACCCCGGCGCGGAATGCGCCAAGGAACTTTAACAAGAGTGCGATGCTCC CGCCGCCCCATACACGGTGCGCGCGCGGGATGCCATGCAATCTCATATTAGTCATAACGACTCT CGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAACTGCGATACTTGGTGTGA ATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAACCTTTGGTCGAG GGCACGTTTGCCTGGGTGTCACACATGGCGTTGCCCCTAATCCCCTCCGCCCTCTGAACGGGGC GAGCGGGACTCGGGCGCGTACGATGGCCTCCCGCGACGACCACGTCCCGGTTGGCCCAAAATCG AGCGTCGGAGCGATCAGCACCACGACATTCGGTGGTTGATTAGACCCCAATGATCAATGTCGCG CGTGCCGCTCATCGCACGCTCCGCGAATCTGCTCCTTACCAACGCGACCCCA Hình 3.13 Trình tự ADN đoạn gen ITS giống Bạch đàn lai UP99 CCGACGTCCCTCTCGACGCGGAGGATCGGGGCTCGGGCACCTCAGGGCGCTCGGCCTTTGTCC TCGGCGGCGCAACGAACCCCGGCGCGGAATGCGCCAAGGAACTTTAACAAGAGTGCGATGCTCC CGCCGCCCCATACACGGTGCGCGCGCGGGATGCCATGCAATCTCATATTAGTCATAACGACTCT CGGCATCGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAACTGCGATACTTGGTGTGA ATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAACCTTTGGTCGAG GGCACGTTTGCCTGGGTGTCACACATGGCGTTGCCCCTAATCCCCTCCGCCCTCTGAACGGGGC GAGCGGGACTCGGGCGCGTACGATGGCCTCCCGCGACGACCACGTCCCGGTTGGCCCAAAATCG AGCGTCGGAGCGATCAGCACCACGACATTCGGTGGTTGATTAGACCCCAATGATCAATGTCGCG CGTGCCGCTCATCGCACGCTCCGCGAATCTGCTCCTTACCAACGCGACCCCA 39 Hình 3.14 Trình tự ADN đoạn gen ITS giống Bạch đàn lai UP95 Các trình tự sau so sánh với trình tự Ngân hàng gen Quốc tế (NCBI) để tìm khác biệt cấp độ lồi Một số lồi có trình tự gen tương đồng dùng so sánh với giống Bạch đàn lai UP99 trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7 Một số lồi có trình tự đoạn ITS tương đồng với giống Bạch đàn lai UP99 NCBI T T Tên loài Mã số Eucalyptus urophylla Eucalyptus grandis Eucalyptus pellita UP 95_ E.urophyla x E.pellita Syzygium paniculatum HM596068.1 AF058475.1 KT631261.1 UP95 KM064993.1 Hệ số tương đồng 99,04% 98,13% 98,31% 99,81% 90,67% Sau xây dựng phát sinh chủng loại tìm mối quan hệ giống Bạch đàn lai, nghiên cứu với loài khác bảng 3.7 khoảng cách di truyền chúng thể hình 3.15 40 Hình 3.15 Cây quan hệ di truyền dựa đoạn gen ITS UP 99 UP 95 với số loài Ngân hàng gen Quốc tế Bằng phần mềm mega X nhận khoảng cách di truyền dòng Bạch đàn lai UP99, UP95 với loài khác sau: Bảng 3.8 Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai UP99 UP95 với loài khác đoạn ITS UP 99_ E.urophyla x E.pellita UP 95_ E.urophyla x E.pellita Syzygium aromaticum E E urophylla grandis UP 99_E.urophyla x E.pellita UP 95_ E.urophyla x E.pellita 0,0018 Syzygium aromaticum 0,0981 0,1004 E urophylla 0,0075 0,0094 0,1003 E.pellita 0.0171 0,0190 0,1091 0,0075 E.grandis 0,0133 0,0153 0,1077 0,0075 0,0095 Từ phân loại dựa số liệu trình tự đoạn gen ITS kết hợp với khoảng cách di truyền hệ số tương đồng giống Bạch đàn lai UP99, UP95 với loài khác ta thấy: giống Bạch đàn lai UP99 có trình tự gen tương đồng 99,81% với đoạn gen loài UP95 với khoảng cách di truyền 0,0018; tương đồng 99,04% với đoạn gen loài E urophylla với khoảng cách di truyền 0,0075, tương đồng 98,31% với đoạn gen loài E.pellita với khoảng cách di truyền 0,0171, tương đồng 98,13% với đoạn gen loài E grandis với khoảng cách di truyền 0.0133 có quan hệ xa với loài Syzygium aromaticum với hệ số tương đồng 90,67% (khoảng cách di truyền 0,0981) Như vậy, trình tự đoạn gen ITS có khác trình tự nucleotide giống Bạch đàn lai UP99 UP95, sử dụng trình tự đoạn gen ITS để phục vụ cho giám định giống Bạch đàn lai UP99 UP95 41 3.5 Trình tự đoạn gen ITS2 Kết xác định trình tự nucleotide đoạn gen ITS2 cho thấy mẫu UP99.1; UP99.2; UP99.3 có kích thước 214bp mẫu UP95.1; UP95.2; UP95.3 có kích thước 374bp thể hình 3.16 hình 3.17: CACATGGCGTTGCCCCTAATCCCCTCCGCCCTCTGAACGGGGCGAGCGGGACTCGGGCGCG TACGATGGCCTCCCGCGACGACCACGTCCCGGTTGGCCCAAAATCGAGCGTCGGAGCGATCA GCACCACGACATTCGGTGGTTGATTAGACCCCAATGATCAATGTCGCGCGTGCCGCTCATCG CACGCTCCGCGAATCTGCTCCTTACCAAC Hình 3.16 Trình tự ADN đoạn gen ITS2 giống Bạch đàn lai UP99 TGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCG CCCGAAACCTTTGGTCGAGGGCACGTTTGCCTGGGTGTCACACATGGCGTTGCCCCCAATCCC CTCCGCCCTTTCAACGGGGCGAGCGGGACTCGGGCGCGTACGATGGCCTCCCGCGACGACCAC GTCCCGGTTGGCCCAAAATCGAGCGTCGGAGCGATCAGCACCACGACATTCGGTGGTTGATTA GACCCCAATGATCAATGTCGCGCGTGCCGCTCATCGCACGCTCCGCGAATCTGCTCCTTACCA ACGCGACCCCAGGTCAAGCGGGGCTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA 42 Hình 3.17 Trình tự ADN đoạn gen ITS2 giống Bạch đàn lai UP95 Các trình tự sau so sánh với trình tự ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tương đồng với đoạn gen ITS2 dòng Bạch đàn lai UP99 cách sử dụng công cụ BLASTn Một số lồi có trình tự gen tương đồng dùng so sánh với giống Bạch đàn lai UP99 trình bày bảng 3.9 Bảng 3.9 Một số lồi có trình tự đoạn ITS tương đồng với giống Bạch đàn lai UP99 NCBI STT Tên loài Mã số Hệ số tương đồng Eucalyptus urophylla AF390492.1 98,29% Eucalyptus grandis HM596050.1 98,29% Eucalyptus pellita KT631261.1 96,57% UP 95_ E.urophyla x E.pellita UP95 98,86% Syzygium paniculatum AY187204.2 86,78% Sau xây dựng phát sinh chủng loại tìm mối quan hệ giống Bạch đàn lai, nghiên cứu với loài khác bảng 3.9 khoảng cách di truyền chúng thể hình 3.18 43 Hình 3.18 Cây quan hệ di truyền dựa đoạn gen ITS2 Bạch đàn lai UP99, UP95 với số loài Ngân hàng gen Quốc tế Bằng phần mềm mega X nhận khoảng cách di truyền dòng Bạch đàn lai UP99, UP95 với loài khác sau: 44 Bảng 3.10 Khoảng cách di truyền giống Bạch đàn lai UP99 UP95 với loài khác đoạn ITS2 UP 99_ E.urophyla x E.pellita UP 95_ E.urophyla x E.pellita Syzygium paniculatum E E urophylla grandis UP 99_E.urophyla x E.pellita UP 95_ E.urophyla x E.pellita 0,0016 Syzygium paniculatum 0,1477 0,1488 E urophylla 0,1740 0,0234 0,1711 E.pellita 0,0356 0,0297 0,1711 0,0175 E.grandis 0,0235 0,0116 0,1655 0,0234 0,0175 Từ phân loại dựa số liệu trình tự đoạn gen ITS2 kết hợp với khoảng cách di truyền hệ số tương đồng giống Bạch đàn lai UP99, UP95 với lồi khác ta thấy: giống Bạch đàn lai UP99 có trình tự gen tương đồng 98,86%với đoạn gen lồi UP95 với khoảng cách di truyền 0,0016; tương đồng 98,29% với đoạn gen loài E urophylla với khoảng cách di truyền 0,1740; tương đồng 98,29% với đoạn gen loài E.pellita với khoảng cách di truyền 0,0356; tương đồng 96,57% với đoạn gen loài E grandis với khoảng cách di truyền 0,0235 có quan hệ xa với loài Syzygium aromaticum với hệ số tương đồng 86,.78% (khoảng cách di truyền 0,1477) Như vậy, trình tự đoạn gen ITS2 có khác trình tự nucleotide giống Bạch đàn lai UP99 UP95, sử dụng trình tự đoạn gen ITS2 để phục vụ cho giám định giống Bạch đàn lai UP99 UP95 45 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN - Đã tách chiết tinh 06 mẫu bánh tẻ lấy từ 03 Bạch đàn lai UP99 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) UP95 (Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita) - Nhân gen thành công đoạn gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 kỹ thuật PCR - So sánh trình tự nucleotide đoạn mã vạch ADN (matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2) bạch đàn lai UP99 UP95 với trình tự nucleotide đoạn mã vạch tương ứng số dòng bạch đàn ngân hàng gen quốc tế NCBI - Xác định trình tự đoạn gen ITS, ITS2 có khác biệt giống Bạch đàn lai UP99 UP95 Do đó, sử dụng trình tự đoạn gen ITS ITS2 để phục vụ cho giám định giống Bạch đàn lai UP99 UP95 Tuy nhiên, sử dụng thị matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 tốt làm mã vạch ADN để giám định giống bạch đàn lai UP99 UP95 Việt Nam KIẾN NGHỊ - Nghiên cứu ứng dụng mã vạch ADN để xây dựng sở liệu ADN barcode cho loài thực vật Việt Nam - Sử dụng gen matK, rbcL, trnH-psbA, ITS ITS2 vào việc giám định loài Bạch đàn lai Việt Nam, đồng thời tiến hành nghiên cứu với mồi khác để tìm dấu hiệu xác định lồi nhằm phân loại cách xác cụ thể 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Báo Nông Nghiệp Việt Nam -Triển vọng trồng rừng gỗ lớn từ bạch đàn lai Hà Bích Hồng, Nguyễn Thế Hưởng, Vũ Phạm Thảo Vy, Vũ Văn Thông (2022) báo cáo tổng kết đề tài “XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ ADN MÃ VẠCH CỦA LỒI ĐINH MẬT (Fernandoa brilletii) TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN” TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ – 2022 Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015), “Xác định mã vạch cho Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis)”, Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, số 5/2015, trang 123 – 124 Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Lê Cơng Mạnh (2019) Khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu xác định ADN mã vạch cho loài lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata ” Lê Thanh Hương, Nguyễn Nhật Linh, Bùi Mạnh Minh, Hà Hồng Hạnh, Huỳnh Thị Thu Huệ, Nông Văn Hải, Hà Văn Huân, Lê Thị Thu Hiền (2017), Ứng dụng mã vạch ADN hỗ trợ định danh loại loài số mẫu sâm thuộc chi nhân Sâm Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, số 15 Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Quỳnh Nga, Trần Ngọc Lân, Nguyễn Thị Thu, Ninh Thị Phíp, Đoàn Thị Thanh Nhàn, Lê Thị Thu Hiền, Nguyễn Nhật Linh (2018), “Đặc điểm hình thái mã vạch ADN loài Bảy hoa Paris vietnamensis (Takht.) H.Li” Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 16(4):282-289 Nguyễn Thị Hồng Gấm, Vũ Thị Lan Anh, Kim Thị Huế, Phạm Thị Kim Yến, Nguyễn Đức Nam, Bùi Thị Mai Hương, Nguyễn Hồng Nhung , Đỗ Tiến Phát (2023) báo cáo tổng kết đề tài “XÁC ĐỊNH ADN MÃ VẠCH CHO LOÀI ĐÀN HƯƠNG TRẮNG (Santalum album L.) PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH LỒI” TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ – 2023 47 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Atlas of Living Australia Global Biodiversity Information Facility 10 Bailey C D C.T.G Harri S A Hughes C E (2003), "Characterization of angiosperm nrADN polymorphism, paralogy, and pseudogenes”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 29, pp.435-455 11 Chippendale, George M "Eucalyptus pellita" Australian Biological Resources Study, Department of the Environment and Energy, Canberra 12 Euclid: Centre for Australian National Biodiversity 13 Fazekewmaster S.G Hollingsworth P M (2010),"Stopping the stutter: Improvements in sequence quality from regions with mononucleotide repeat can increase the usefulness of non-coding regions for DNA barcoding", Taxon, 59, pp 694 – 697 14 Hebert PD, Ratnasingham S, De Waard JR (2003b) Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit divergences among closely related species Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 270 (Suppl 1): S96-S99 15 Hills, R 2019 Eucalyptus urophylla The IUCN Red List of Threatened Species 2019 16 Invasive Species Compendium Centre for Agriculture and Bioscience International 17 Invasive Species Compendium Centre for Agriculture and Bioscience International 18 Jaakola L S.M Haggman H (2010), "Novel approaches based on ADN barcoding and high-resolution melting of amplicons for authenticity analyses of berry species", Food Chemistry, 123, pp 494-500 19 Ken Fern (2014)."Eucalyptus pellita F.muell Myrtaceae" Useful tropical plant database 20 Ken Fern (2014) "Eucalyptus urophylla S.T.Blake Myrtaceae" Useful Tropical Plants Database Retrieved October 2018 48 21 Mark Y Stoeckle, Catherine C Gamble, Rohan Kirpekar, Grace Young, Selena Ahmed & Damon P Little (2011) Commercial Teas Highlight Plant ADN Barcode Identification Successes and Obstacles Sci Rep 1, 42; DOI:10.1038/srep00042 22 Nerea Larranaga José L Hormaza (2015) “ADN barcoding of perennial fruit tree species of agronomic interest in the genus Annona (Annonaceae)”, Frontiers in Plant Science 23 Ogden R M.H.N Cowan R S Chua L Groves M Et Al (2008), "SNPbased method for the genetic identification of ramin Gonystylus spp Timber and products :applied research meeting CITES enforcement needs", Endangered Species Research, 9, pp 255-261 24 Ogden R, McGough HN, Cowan RS, Chua L, Groves M, et al (2008) SNP-based method for the genetic identification of ramin Gonystylus spp timber and products: applied research meeting CITES enforcement needs Endangered Species Research 9: 255–261 25 PRASAD R KESANAKURTI, ARON J FAZEKAS, KEVIN S BURGESS, DIANA M PERCY, STEVEN G NEWMASTER, SEAN W GRAHAM, SPENCER C H BARRETT, MEHRDAD HAJIBABAEI– and BRIAN C HUSBAND- Spatial patterns of plant diversity below-ground as revealed by ADN barcoding 26 Shih-Chieh lee, Chia-Hsiang Wang, Cheng-En Yen, Chieh Chang (2016) ADN barcode and identification of the varieties and provenances of Taiwan’s domestic and imported made teas using ribosomal internal transcribed spacer sequences Journal of food and drug analysis 25.pp260-274 27 Srirama R S.U Sreejayan N Ravikanth G Gurumurthy Br Et AL (2010), "Assessing species admixtures in raw drug trade of Phyllantthus, ahepatoprotactive plant using molecular tools", Journal of Ethnopharmacology, 130, pp 208-215 28 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant ADN barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3): 14 49 29 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “ADN barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources 9: 1086-1091 30 Vijayan K and Tsou C H (2010), “ADN barcoding in plants: taxonomy in a new perspective” Current science, 99: 1530 – 1540 31 Von Mueller, Ferdinand (1864) Fragmenta phytographiae Australiae Melbourne: Victorian Government Printer pp 159–160 Retrieved 28 November 2019 32 Wrigley, John; Fagg, Murray (2010) Eucalypts: A Celebration Allen & Unwin trang 84, 157, 217 33 Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade” Genetics, 174: 1407-1420 WEB SITE https://en.wikipedia.org/wiki/Eucalyptus_urophylla https://en.wikipedia.org/wiki/Eucalyptus_pellita https://alchetron.com/Eucalyptus-pellita 50