Xác định một số trình tự adn mã vạch và nhân giống cây râu mèo (orthosiphon aristatus (blume ) miq ) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi, hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Văn Việt Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa công bố hình thức Luận văn sử dụng thơng tin, số liệu từ báo nguồn tài liệu tác giả khác có trích dẫn thích nguồn gốc đầy đủ Nếu có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Học viên Chu Sỹ Cường ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp trang bị kiến thức cho suốt trình học tập Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Việt tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu đề tài hồn chỉnh Luận văn Thạc sĩ Tôi xin cảm ơn thầy cô cán Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp sát cánh hỗ trợ động viên vật chất tinh thần suốt trình học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 06 năm 2020 Học viên Chu Sỹ Cường iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Râu mèo 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật học Râu mèo 1.1.3 Đặc điểm sinh thái Râu mèo 1.1.4 Giá trị dược liệu, công dụng 1.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào 1.2.1 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.2.2 Các bước tiến hành phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật 1.3 Thành tựu nuôi cấy mô tế bào dược liệu Cây Râu mèo 10 1.3.1.Nghiên cứu nước 11 1.3.2 Thế giới 13 1.4 Tổng quan mã vạch ADN 15 1.4.1 Giới thiệu mã vạch ADN (DNA barcode) 15 1.4.2 Một số mã vạch ADN thường sử dụng 18 1.4.3 Tình hình nghiên cứu mã vạch ADN thực vật 23 Chương MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Mục tiêu tổng quát 28 2.2 Mục tiêu cụ thể 28 2.3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 28 2.3.1 Đối tượng nghiên cứu 28 iv 2.3.2 Hóa chất 28 2.3.3 Dụng cụ - máy móc 29 2.4 Nội dung phương pháp nghiên cứu 30 2.4.1 Nội dung nghiên cứu 30 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu 30 2.4.3 Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá 36 2.4.4 Phương pháp theo dõi 37 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 37 2.5 Địa điểm thời gian bố trí thí nghiệm 37 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Xác định số trình tự ADN mã vạch Râu mèo 38 3.1.1 Kết tách chiết ADN tổng số 38 3.1.2 Kết nhân đoạn ADN mã vạch 39 3.1.3 Phân tích trình tự đoạn mã vạch ADN với đoạn mồi khác 43 3.1.4 So sánh hiệu giám định loài ba trình tự ADN mã vạch ITS, psbA - trnH,và rbcL 53 3.2 Kết nhân giống Râu mèo kỹ thuật nuôi cấy in vitro 54 3.2.1 Kết tạo mẫu in vitro Râu mèo 54 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh chồi 57 3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chất lượng Râu mèo 61 3.2.5 Nghiên chứu ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng 64 KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ BIỂU v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Các chữ viết tắt Nghĩa tiếng anh Nghĩa tiếng việt -NAA -Naphthalene Acetic Acid -Naphthalene Acetic Acid ADN Axit deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic ATP Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat BAP 6-Bezyl amino purine 6-Bezyl amino purine BME ß-mereaptoethanol ß-mereaptoethanol BOLD Barcode of Life Data Systems Cơ sở liệu mã vạch ADN Bp Base pair Cặp base CBOL Consortium for the Barcode of Life Hiệp hội mã vạch sống CITES Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna Flora Công ước buôn bán quốc tế loài nguy cấp 10 cpDNA Chloroplast DNA Bộ gen lục lạp 11 CT Công thức Cetyl trimethylammonium bromide Cetyl trimethylammonium bromide 12 CTAB 13 ĐC 14 dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate Deoxyribonucleotid triphosphate 15 EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid axit ethylenediamine tetraacetic 16 IBA Indole -3 -Butyric Acid Indole -3 -Butyric Acid Đối chứng vi TT Các chữ viết tắt 17 IGS intergenic Vùng liên kết gen 18 Kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base 19 KIN Kinetin (6 -furfurol amino Kinetin (6 -furfurol amino purine) purine) 10 MS Murashige & Skoog, 1962 Murashige & Skoog, 1962 21 mtDNA Mitochondrial DNA DNA ty thể 22 NAD(P) H Nicontinamide adenine dinucleotide phosphate Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ sinh học 23 NCBI National Center for Trung tâm thông tin Công Biotechnology Information nghệ sinh học Hoa Kỳ 24 ORF Open Reading Frame khung đọc mở 25 PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase 26 RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic 27 rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome 29 SDS Sodium dodecyl sulphate Sodium dodecyl sulphate 30 Ta 31 TAE Tris – Acetic acide – EDTA Tris – Acetic acide – EDTA 32 tRNA Transfer RNA ARN vận chuyển 33 UV Untraviolet Tia cực tím Nghĩa tiếng anh Nghĩa tiếng việt Nhiệt độ gắn mồi vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự thơng tin cặp mồi đặc hiệu 29 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 32 Bảng 2.3 Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR 33 Bảng 3.1 Bảng so sánh kết giám định loài Râu mèo đoạn trình tự ITS, psbA - trnH rbcL 53 Bảng 3.2 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu tái sinh chồi 55 Bảng 3.3 Ảnh hưởng chất ĐHST đến khả nhân nhanh chồi 58 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ 60 Bảng 3.5 Ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến khả sống 62 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thành phần ruột bầu đến khả sống 65 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái Râu mèo Hình 3.1 Kết điện di ADN tổng số mẫu Râu mèo 38 Hình 3.2 Kết nhân đoạn gen ITS từ mẫu Râu mèo dùng mồi ITS_F ITS_R 40 Hình 3.3 Kết nhân đoạn gen psbA-trnH từ mẫu Râu mèo thu dùng mồi psbA-trnH_F psbA-trnH_R 41 Hình 3.4 Kết nhân đoạn gen rbcL từ mẫu Râu mèo thu dùng mồi rbcL_F rbcL_R 42 Hình 3.5 Trình tự nucleotide đoạn mã vạch ITS mẫu Râu mèo 44 Hình 3.6 So sánh trình tự ITS Râu mèo (query) với loài Râu mèo (FJ593403.1) ngân hàng gen NCBI (sbjct) 46 Hình 3.7 Cây quan hệ di truyền lồi Râu mèo với 06 lồi có trình tự ITS tương đồng ngân hàng gen quốc tế NCBI 47 Hình 3.8 Trình tự nucleotide đoạn mã vạch psbA – trnH mẫu Râu mèo 47 Hình 3.9 So sánh trình tự psbA – trnH Râu mèo (query) với loài Râu mèo (LC456393.1) ngân hàng gen NCBI (sbjct) 49 Hình 3.10 Cây quan hệ di truyền lồi Râu mèo với 06 lồi có trình tự psbA - trnH tương đồng ngân hàng gen quốc tế NCBI 49 Hình 3.11 Trình tự nucleotide đoạn mã vạch rbcL mẫu Râu mèo 50 Hình 3.12 So sánh trình tự rbcL Râu mèo (query) với loài Râu mèo (LC456392.1) ngân hàng gen NCBI (sbjct) 52 Hình 3.13 Cây quan hệ di truyền lồi Râu mèo với 06 lồi có trình tự rbcL tương đồng ngân hàng gen quốc tế NCBI 53 Hình 3.14 Mẫu nảy chồi CT4 sau tuần 56 ix Hình 3.15 Cụm chồi Râu mèo (A) bình chồi Râu mèo (B) môi trường RM2 59 Hình 3.16 Rễ Râu mèo cơng thức R2 (0,3 mg/l NAA) 61 Hình 3.17 Cây Râu mèo hồn chỉnh mơi trường R1, R2, R3 R4 61 Hình 3.18 Cây Râu mèo trồng bầu sau ngày công thức T0 (A) T3 (B) 64 Hình 3.19 Cây Râu mèo trồng (A) sau tháng trồng (B) công thức RB1 66 Hình 3.20 Cây Râu mèo trồng (A) sau trồng tháng (B) công thức RB3 66 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam quốc gia nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật phong phú đa dạng Nhiều loài thực vật tự nhiên người biết đến với nhiều giá trị sử dụng kinh tế, y học, nghiên cứu,…Trong khơng thể khơng nhắc đến nhóm thực vật có tác dụng dược lý, sử dụng phổ biến nhiều thuốc dân gian y học đại Tuy nhiên, tình trạng khai thác mức khai khác rừng bừa bãi làm số loài thuốc quý ngày khan hiếm, có Râu mèo Râu mèo biết đến vị thuốc làm tăng lượng nước tiểu thúc đẩy tiết urê, chlorua acid uric, có tác dụng tốt chứng rối loạn đường tiêu hóa, bệnh thấp khớp, đau lưng, đau nhức khớp xương Ngồi ra, Râu mèo cịn có tác dụng tốt bệnh xung huyết gan bệnh đường ruột Hiệu tác dụng kết hợp glycosid với muối kiềm, chất giống tanin dầu thơm saponin Hiện nhu cầu người nguồn dược liệu ngày tăng, nhiên loài tự nhiên bị giảm số lượng chất lượng khai thác mức, điều kiện ngày bất lợi môi trường tự nhiên, nên việc nghiên cứu nhân giống bảo tồn cần thiết, cấp bách việc lưu giữ nguồn gen quý Mã vạch ADN đoạn ADN ngắn, nằm hệ gen (nhân, lục lạp ty thể) đặc trưng lồi sinh vật Do việc xác định lồi mã vạch ADN có độ xác cao Phương pháp trở thành công cụ hữu hiệu cho nhà khoa học việc phân loại, đánh giá đa dạng di truyền quan hệ di truyền lồi Cây Râu mèo nhân giống phương pháp, gieo hạt giâm hom, biện pháp nhân giống có ưu điểm 72 26 Chiou, S.-J., Yen J.-H., Fang C.-L., Chen H.-L., ADN Lin T.Y (2007) Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers Planta medica, 73 (13): 1421-1426 27 Dorothy P, Sudarshana1 M.S, Nissar A.R ADN Girish H.V (2016) In vitro Cytological Studies of Leaf Callus Cultures of Orthosiphon aristatus (Blume) Miq Journal of British Biotechnology, 13(4): 1-6 28 Fazekas A.J, Burgess K.S, Kesanakurti P.R, Graham S.W, Newmaster S.G, HusbADN B.C, Percy D.M, Hajibabaei M, Barrett S.C (2008) Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well PLoS One, (7): e2802 29 Ford C S, Ayres K L., Toomey N., Haider N., Van Alphen Stahl J., Kelly L J, Wikström N (2009) Selection of cADNidate coding DNA barcoding regions for use on lADN plants Botanical Journal of the Linnean Society 159: 1–11 30 Gao T.Y.H., Song J., Mori S.A., Pe Tronelli PROTEASE Et Al (2009), Indentyficiation of medicinal plants in the family fabaceae using a potential DNA barcode ITS2 Journal of Ethnopharmacology, 130, pp.116-121 31 Hamilton M.B (1999) Four primer pairs for the aplification of chloroplast intergenic religions with intraspecific varation Molecular Ecology, 8: 513-525 32 Hebert, P.D., Cywinska A., ADN Ball S.L (2003) Biological identifications through DNA barcodes Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 270 (1512): 313-321 33 Hebert, P.D., Penton E.H., Burns J.M., Janzen D.H., ADN Hallwachs W (2004) Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101 (41): 14812-14817 73 34 Hebert P.D, Ratnasingham S ADN De Waard J.R (2003) Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit divergences among closely related species Proceedings of the Royal Society of London B Biological Sciences, 270 (1): 96-99 35 Hilu K.W.L.H (1997) The matk gene: secuence variation ADN amplification in plant systematic American journal of Botany 84: 830-839 36 Hollingsworth M.L, ADN Clark A., et al (2009) Selecting barcoding loci for plants: evaluation of seven cADNidate loci with specieslevel sampling in three divergent groups of lADN plants Molecular Ecology Resources, (2): 439-457 37 Hollingsworth, P.M (2011) Refining the DNA barcode for ADN plants Proceedings of the National Academy of Sciences, 108 (49):1945119452 38 Hollingsworth, P.M., Graham S.W ADN Little D.P (2011) Choosing ADN using a plant DNA barcode PloS one, (5): e19254 39 K Grover et al (2002) Medicinal plants of India with anti-diabetic potential Journal of Ethnopharmacology, 81: 81-100 40 Kapoor L.D (1990) HADN book of Ayurvedic Medicinal Plants Boca Raton, F.L, CRC Press: 200-201 41 Kress, J.W., K.J , Zimmer, E.A., Weight, L.A & Janzen, D,H (2005), Use of DNA barcodes to identyfy flowering plants, Proc Natl Acad Sci USA, 102: 8369-8374 42 Lee H, Yi D, Kim J ADN Kim K (2007) Development of plant DNA barcoding markers from the variable noncoding regions of chloroplast genome in Abstract presented at the second international barcode of life conference Academia Sinica, Taipei, Taiwan 43 Logacheva, M., Penin A., Samigullin T., Vallejo-Roman C., ADN Antonov A (2007) Phylogeny of flowering plants by the chloroplast genome 74 sequences: in search of a “lucky gene” Biochemistry (Moscow), 72 (12): 1324-1330 44 Peter M Hollingsworth, Laura L Forrest, John L Spouge, Mehrdad Hajibabaei, Sujeevan Ratnasingham, et al (2009) A DNA barcode for lADN plants Proceedings of the National Academy of Sciences, 106 (31): 12794-12797 45 Ren B.Q.X.X.R., Chen Z.D (2010) Species identification of Alnus using nrDNA ADN cpDNA genetics makers Mol.Eco.Res 10: 594-605 46 Reshi N.A, Sudarshana M.S ADN Rajashekar N (2013) Callus Induction ADN Plantlet Regeneration in Orthosiphon aristatus (Blume) Miq A Potent Medicinal Herb Journal of Pharmacy ADN Biological Sciences Volume 6, Issue (May – Jun): 52-55 47 Reshi N.A ADN Sudarshana M.S (2015) In vitro micropropagation of Orthosiphon aristatus (Blume) Miq Academic Journals Vol.9: 962-967 48 Schoch C.L, Seifert K.A, et al (2012) Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi Proceedings of the National Academy of Sciences, 109 (16): 6241- 6246 49 Shaw J.L.E.B., Schiling E.E., Small R.L.(2007) Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms: the tortoise ADN the hare III Amer Jour.Bota 94: 275-288 50 Shigematsu N, Asano R, Shimosaka M, Okazaki M (2001) Effect of administration with the extract of Gymnema sylvestre R Br leaves on lipid metabolism in rats Biol Pharm Bull, 24(6): 713-717 51 Srimara R.S.U, Sreejayn, et al (2010) Assesing species admixtures in raw drug trade of phyllanthus, a hepatoprotective plant using molecular tools Journal of Eth 130: 208-215 52 Van den Berg C., Higgins W E., Dressler R L., Whitten W M., Soto Arenas M A., Culham A., Chase M W (2000), “A phylogenetic 75 analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (ITS) of ribosomal DNA”, Lindleyana 15: 96114 53 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, (Hydrocotyle Molecular Ecology Resources 9: 1086-1091 54 Vijayan K ADN Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, 99: 1530 – 1540 55 Wai-Leng L, Lai-Keng C (2003) Establishment of Orthosiphon stamineus cell sespension culture for cell growth Jounal of Plant cell, Tissue ADN Organ Culture, 78: 101-106 56 Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R (2010) “DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology 10: 205 57 Yao H, Song J, Liu C, Luo K, Han J (2010) Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants ADN animals PLoS ONE, 5: 13102 58 Yong H L, Jinlan R, Shilin C, Jingyuan S, Kun L, Dong L ADN Hui Y (2010) Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique Journal of Medicinal Plants Research, (24): 2706 - 2709 59 Yu J, Xue J.H ADN Zhou S.L (2011) New universal matK primers for DNA barcoding angiosperms Journal of Systematics ADN Evolution, 49 (3): 176-181 WEBSITE 60 http://www.barcodinglife.org/ 61 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi PHỤ BIỂU Phụ biểu 01 Tỷ lệ mẫu sạch, mẫu nhiễm ở cơng thức thí nghiệm khác CT * Mausach Crosstabulation Mausach maunhiem Count CT1 % within CT CT % within CT 49 91 46.2% 53.8% 100.0% 32 60 92 34.8% 65.2% 100.0% 86 92 6.5% 93.5% 100.0% 92 95 3.2% 96.8% 100.0% 90 93 3.2% 96.8% 100.0% 86 377 463 18.6% 81.4% 100.0% Count CT3 % within CT Count CT4 % within CT Count CT5 % within CT Count Total % within CT Total 42 Count CT2 mausach Phụ biểu 02 Kết quả kiểm tra tỷ lệ mẫu Chi-Square Tests Value df Asymp Sig (2-sided) Pearson Chi-Square 99.996a 000 Likelihood Ratio 102.478 000 83.847 000 Linear-by-Linear Association N of Valid Cases 463 a cells (0.0%) have expected count less than The minimum expected count is 16.90 Phụ biểu 03 Tỷ lệ mẫu bật chồi cơng thức thí nghiệm với thời gian khác CT1 CT2 CT CT3 CT4 CT5 Total CT * Maubatchoi Crosstabulation Maubatchoi khongbatchoi batchoi Count 49 42 % within CT 53.8% 46.2% Count 40 52 % within CT 43.5% 56.5% Count 31 61 % within CT 33.7% 66.3% Count 89 % within CT 6.3% 93.7% Count 21 72 % within CT 22.6% 77.4% Count 147 316 % within CT 31.7% 68.3% Total 91 100.0% 92 100.0% 92 100.0% 95 100.0% 93 100.0% 463 100.0% Phụ biểu 04 Kết quả kiểm tra tỷ lệ mẫu bật chồi Chi-Square Tests Value df Asymp Sig (2-sided) Pearson Chi-Square 58.474a 000 Likelihood Ratio 65.449 000 Linear-by-Linear Association 42.437 000 N of Valid Cases 463 a cells (0.0%) have expected count less than The minimum expected count is 28.89 Phụ biểu 05 Tỷ lệ chời hữu hiệu ở cơng thức thí nghiệm khác CT * Choihuuhieu Crosstabulation Choihuuhieu Khonghuuhieu RM1 RM2 RM3 RM4 RM5 CT RM6 RM7 RM8 RM9 DC Count % within CT Count % within CT Count % within CT Count % within CT Count % within CT Count % within CT Count % within CT Count % within CT Count % within CT Count % within CT Count Total % within CT Total Choihuuhieu 363 485 848 42.8% 57.2% 100.0% 296 881 1177 23.3% 76.7% 100.0% 325 566 891 36.5% 63.5% 100.0% 307 393 700 43.9% 56.1% 100.0% 304 413 717 42.4% 57.6% 100.0% 366 569 935 39.1% 60.9% 100.0% 317 495 812 39.0% 61.0% 100.0% 224 243 467 48.0% 52.0% 100.0% 180 239 419 43.0% 57.0% 100.0% 63 38 101 62.4% 37.6% 100.0% 2745 4322 7067 38.8% 61.2% 100.0% Phụ biểu 06 Kết quả kiểm tra tỷ lệ chồi hữu hiệu Chi-Square Tests Value df Asymp Sig (2-sided) Pearson Chi-Square 154.798a 000 Likelihood Ratio 159.185 000 43.424 000 Linear-by-Linear Association N of Valid Cases 7067 a cells (0.0%) have expected count less than The minimum expected count is 39.23 Phụ biểu 07 Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng chất ĐHST đến số chồi TB/mẫu nhanh ANOVA Hesonhannhanh Sum of df Mean Squares Between Groups Within Groups Total F Sig Square 302.060 314 20 302.373 29 33.562 2138.172 016 000 Phụ biểu 08 Tỷ lệ rễ cơng thức thí nghiệm với nồng độ NAA khác CT * Tylerare Crosstabulation Tylerare khongrare rare Count 73 18 R0 R1 CT % within CT R3 R4 Total 91 80.2% 19.8% 100.0% 34 66 100 35.5% 65.5% 100.0% 88 91 % within CT 3.3% 96.7% 100.0% Count % within CT Count 12 13.2% 36 79 86.8% 54 91 100.0% 90 % within CT 40.0% 60.0% 100.0% 165 298 463 35.6% 64.4% 100.0% Count % within CT Count R2 Total Count % within CT Phụ biểu 09 Kết quả kiểm tra tỷ lệ rễ Chi-Square Tests Value Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases 142.348a 158.736 46.687 Asymp Sig (2-sided) df 4 000 000 000 463 a cells (0.0%) have expected count less than The minimum expected count is 32.07 Phụ biểu 10 Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng nồng độ NAA đến số rễ TB/ chồi ANOVA SoreTB Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df Mean Square 21.117 488 10 21.605 14 F 5.279 108.226 Sig .000 049 Phụ biểu 11 Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng nờng độ NAA đến chiều dài rễ TB ANOVA ChieudaireTB Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df Mean Square 20.204 1.153 10 21.357 14 F 5.051 43.795 115 Sig .000 Phụ biểu 12 Tỷ lệ số sống sau huấn luyện ở thời gian khác CT * tylecaysong Crosstabulation tylecaysong Socaychet socaysong Count 48 43 T0 % within CT CT % within CT 47.3% 100.0% 44 49 93 47.3% 52.7% 100.0% 84 91 7.7% 92.3% 100.0% 90 91 1.1% 98.9% 100.0% 100 266 366 27.3% 72.7% 100.0% Count T2 % within CT Count T3 % within CT Count Total % within CT 91 52.7% Count T1 Total Phụ biểu 13 Kết quả kiểm tra tỷ lệ số sống sau huấn luyện ở thời gian khác Chi-Square Tests Value df Asymp Sig (2-sided) Pearson Chi-Square 97.511a 000 Likelihood Ratio 114.372 000 86.799 000 Linear-by-Linear Association N of Valid Cases 366 a cells (0.0%) have expected count less than The minimum expected count is 24.86 Phụ biểu 14 Tỷ lệ số sống sau bầu ngày CT * tylecaysong Crosstabulation tylecaysong Socaychet socaysong 60 31 Count T0 % within CT CT % within CT 34.1% 100.0% 38 55 93 40.9% 59.1% 100.0% 10 81 91 11.0% 89.0% 100.0% 88 91 3.3% 96.7% 100.0% 111 255 366 30.3% 69.7% 100.0% Count T2 % within CT Count T3 % within CT Count Total % within CT 91 65.9% Count T1 Total Phụ biểu 15 Kết quả kiểm tra tỷ lệ sống sau ngày bầu Chi-Square Tests Value df Asymp Sig (2-sided) Pearson Chi-Square 107.057a 000 Likelihood Ratio 117.222 000 Linear-by-Linear Association 101.958 000 N of Valid Cases 366 a cells (0.0%) have expected count less than The minimum expected count is 27.60 Phụ biểu 16 Tỷ lệ số sống ở công thức thành phần ruột bầu khác RB2 RB2 CT RB3 RB4 RB5 Total CT * tylecaysong Crosstabulation tylecaysong Socaychet socaysong Count 38 53 % within CT Total 91 41.8% 58.2% 100.0% 21 70 91 % within CT 23.1% 76.9% 100.0% Count % within CT 2.2% 90 97.8% 92 100.0% Count % within CT Count % within CT Count 17 18.5% 27 29.3% 105 75 81.5% 65 70.7% 353 92 100.0% 92 100.0% 458 % within CT 22.9% 77.1% 100.0% Count Phụ biểu 17 Kết quả kiểm tra tỷ lệ số sống ở cơng thức thí nghiệm thành phần ruột bầu khác Chi-Square Tests 43.865a 52.477 4 Asymp Sig (2sided) 000 000 4.396 036 Value Pearson Chi-Square Likelihood Ratio Linear-by-Linear Association N of Valid Cases df 458 a cells (0.0%) have expected count less than The minimum expected count is 20.86 Phụ biểu 18 Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng thành phần ruột bầu đến độ vượt chiều cao TB ANOVA ChieucaocayTB Sum of Squares Between Groups Within Groups Total Mean Square df 47.743 813 10 48.556 14 F 11.936 146.750 081 Sig .000