Xác định một số trình tự adn mã vạch của loài đinh mật (fernandoa brilletii) tại tỉnh thái nguyên

Công nghệ sinh học & Giống trồng XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH T ự ADN MÃ VẠCH CỦA LỒI ĐINH MẬT (Fernandoa brilletii ) TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN Hà Bích Hồng1, Nguyễn Thế Hưởng1, Vũ Phạm Thảo Vy2, Vũ Văn Thông3 'Trường Đại học Lâm nghiệp 2Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên 3Công ty TNHH Phát triển nơng nghiệp Vy Anh https://doi.Org/10.55250/jo.vnuf.2022.4.030-039 TĨM TẮT Đinh mật {Fernandoa brilletii (Dop) Steen) lồi đặc hữu có giá trị kinh tế cao Việt Nam Đây lồi có nguy tuyệt chủng cao ngồi tự nhiên đến chưa có nghiên cứu đánh giá đầy đủ nhằm bảo tồn phát triển loài Do đó, nghiên cứu phục vụ cơng tác đánh giá đa dạng di truyền cần thiết đế kiến nghị đưa biện pháp bảo tồn nguồn gen loài Đinh mật nước nói chung địa bàn tỉnh Thái Nguyên nói riêng Hiện nay, ADN mã vạch sử dụng thị phân tử có độ xác cao việc định danh loài đánh giá đa dạng di truyền Ở thực vật, trình tự ADN sử dụng làm mã vạch giám định hay phân loại thường trình tự nucleotide thuộc hệ gen lục lạp hệ gen nhân, bao gôm vùng mã hóa vùng khơng mã hóa Trong nghiên cứu này, ba thị ADN mã vạch matK, trnH-psbA ITS sử dụng để nghiên cứu bước đầu ADN mã vạch cho loài Đinh mật phân bố tinh Thái Nguyên Hiệu nhân PCR giải trình tự nucleotide ba thị ADN mã vạch loài Đinh mật đạt 100% Trong đó, trình tự nucleotide đoạn gen matK tmỉl-psbA tất mẫu Đinh mật huyện tinh Thái Nguyên có tương đồng tuyệt đối Trong 848 nucleotide vùng gen ITS xác định hai vị trí nucleotide sai khác mẫu Đinh mật nghiên cứu Các trình tự matK, tmỉì-psbA ITS lồi Đinh mật đăng ký thành công Ngân hàng gen Quốc té (GenBank) với mã số ON603621, ON603622, ỌN614190, ON614191 Cở sở liệu ADN mã vạch giới Ngân hàng gen Quôc tê chưa công bô trình tự ADN mã vạch lồi Đinh mật Do đó, nghiên cứu nghiên cứu đâu tiên vê xác định trình tự ADN mã vạch cho lồi gơ q đặc hữu này, góp phân làm phong phú thêm sở liệu ADN mã vạch cho hệ thống ADN mã vạch thực vật Từ khóa: ADN mã vạch, Đinh mật, ITS, matK, trnĩí-psbA l ĐẶT VẤN ĐÈ Đinh mật (Fernandoa brilletiỉ (Dop) Steen) loài đặc hữu Việt Nam có giá trị kinh tế cao, thân gỗ dùng xây dựng, đóng đồ dùng nội thất cao cấp có vân gỗ đẹp chất lượng gỗ vơ tốt Cây gỗ lớn, cao 25 - 30 m, đường kính tới 50 - 100 cm v ỏ mầu xám tro bong mảng, có nhiều lớp mỏng, lóp nâu vàng Phân cành thấp Cành non hoi vuông cạnh phủ lông nâu vàng Lá kép lông chim lần lẻ mọc đối, dài 40 - 45 cm Lá chét hình trái xoan hay trứng trái xoan, đầu có mũi nhọn, gần trịn, dài 10 - 13 cm, rộng - cm, mặt có lơng mịn tuyến nhỏ gốc, gân bên rõ mặt dưới, gân nhỏ gần song song Cuống chét ngắn Hoa tự xim viên chuỳ đầu cành Hoa to, thưa, lưỡng tính, khơng Đài hình chng, tràng hợp gốc, màu trắng hay trắng vàng tạo thành mơi Nhị có nhị dài, bầu Quả nang hình trụ dài khoảng 40 cm, rộng cm, đầu nhọn, v ỏ hoá gỗ chín tách Hạt dẹt nhẵn bóng, có cánh màu trắng, xếp thành hàng ô Cây mọc 30 chậm, mùa hoa tháng - 1 Mọc rải rác rừng kín rộng thường xanh tỉnh miền Bắc Hiện nay, ADN mã vạch chứng minh thị phân tử có độ xác cao ừong việc định danh lồi đánh giá đa dạng di truyền Đặc điểm quan ừọng ADN mã vạch phải phổ biến đặc hiệu biến dị dễ dàng sử dụng Ở thực vật, đoạn ADN m ã vạch đoạn ADN nằm hệ gen nhân (28S rDNA, IT S ) (Baharum, 2012; Chen, 2010; Schoch et al., 2012) hệ gen lục lạp (matK, rbcL, trn\A psbA , rpo, trnL-trnĩ, ycf ) (Yu et al., 2011; Hollingsvvorth, 2011) Ba mã vạch ADN (rbcL, matK, trnH-psbA) sử dụng để đánh giá đa dạng loài rừng mưa nhiệt đới Queensland, ú c kết luận ADN mã vạch trợ giúp đáng kể đánh giá đa dạng sinh học xác định quần thể chúng phân biệt tất lồi phương pháp hình thái (Costion et al., 2011) ADN mã vạch sử dụng để giải vấn đề bảo tồn đa dạng sinh học theo TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2022 Công nghệ sinh học & Giống trồng hai cách sau: (1) Là phương tiện giám sát đa dạng sinh học xác nhanh chóng trước sau hành động bảo tồn, (2) Cung cấp liệu để hỗ trợ việc ước tính đa dạng phát sinh lồi để thiết lập ưu tiên bảo tồn (Krishnamurthy & Francis, 2012) Đinh mật lồi có nguy tuyệt chủng cao tự nhiên đến chưa đưa vào sách Đỏ Việt Nam Nghị định 06/2019 quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý, thực thi công ước buôn bán quốc tế loài động vật, thực vật hoang dã nguy cấp Tại Thái Nguyên, Đinh mật lại ít, phân bố rải rác vườn rừng, diện tích rừng tự nhiên huyện Võ Nhai, Đồng Hỷ, Định Hóa, Phú Lương Đại Từ Do đó, nghiên cứu phục vụ cơng tác định danh đánh giá đa dạng di truyền cần thiết để kiến nghị đưa biện pháp bảo tồn nguồn gen loài Đinh mật nước nói chung địa bàn tỉnh Thái Nguyên nói riêng Cho đến nay, chưa có nghiên cứu phân tích ADN lồi Đinh mật, ngân hàng gen quốc tế có số trình tự ADN mã vạch số lồi chi Fernandoa như: F coccỉnea, F macrantha, F bracteata, F serrata, F magnị/ìca, F adolfi-friderỉcỉ Hình Cây Đinh mật Vũ Chấn, huyện Vỗ Nhai, tỉnh Thái Nguyên PH Ư Ơ N G PH Á P N G H IÊN cứu huyện tỉnh Thái Nguyên Các mẫu kí 2.1 Lựa chọn mẫu cách lấy mẫu hiệu Bảng Lá 15 Đinh mật thu thập từ 05 Bảng L Địa điểm thòi gian thu thập mẫu Đỉnh mật Thái Nguyên Ký hiệu Thịi gian Toa STT Địa điểm thu nhận mẫu mẫu thu mẫu Kỉnh độ Vĩ độ DH01 Định Hóa - Thái Nguyên 4/2022 565781 2432139 DH 02 Định Hóa - Thái Nguyên 4/2022 2432146 565781 DH 03 Định Hóa - Thái Nguyên 565789 4/2022 2432158 DHY01 Đồng Hỷ - Thái Nguyên 4/2022 2415195 0587737 DHY 02 Đồng Hỷ - Thái Nguyên 4/2022 2415707 0588155 DHY 03 Đồng Hỷ - Thái Nguyên 0587542 4/2022 2415106 PL01 Phú Lương - Thái Nguyên 2410434 0579768 4/2022 PL 02 0579011 Phú Lương - Thái Nguyên 4/2022 2408229 PL 03 0579392 Phú Lương - Thái Nguyên 2410841 4/2022 10 VN01 Võ Nhai - Thái Nguyên 2420007 0604997 4/2022 0604979 11 VN 02 Vố Nhai - Thái Nguyên 4/2022 2419938 0605034 12 VN 03 Vố Nhai - Thái Nguyên 2419964 4/2022 568815 13 DT01 Đại Từ - Thái Nguyên 4/2022 2377435 14 DT 02 568216 Đại Từ - Thái Nguyên 4/2022 2375015 572578 DT 03 2374222 15 Đại Từ - Thái Nguyên 4/2022 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2022 31 ^ ô n ^ n g h ^ s m h h o c ^ & ^ G iố n g c ^ ữ n ^ ^ ^ Yêu cầu mẫu cách bảo quản: cắt bánh tẻ, xanh không bị sâu bệnh Sau bảo quản mẫu tủi nilon có chứa hạt hút ẩm silica gel, vận chuyển phịng thí nghiệm ngày Các mẫu bảo quản tủ lạnh -20°c sử dụng để tách chiết ADN tổng số 2.2 Phương pháp tách chiết ADN tổng số ADN tổng số tách chiết từ mẫu Đinh mật theo hướng dẫn sử dụng kit tách chiết ADN thực vật “DNA mini kit Qiagen” hãng Qiagen, CHLB Đức Các mẫu ADN tổng số sau tách chiết đánh giá nồng độ độ tinh máy đo quang phổ hấp phụ ScanDrop (Analytik Jena, Germany) bảo quản nhiệt độ -20°c 2.3 Phương pháp khuyếch đại PCR xác định trình tự nucleotide Gen Kí hiệu mồi maữC_F Phản ứng PCR thực máy Biometra Tadvanced PCR Systems 96S (Germany) vói thành phần bao gồm: lOpl PCR master mix 2X, lq l mồi xuôi (lOpM ) 1(0.1 mồi ngược (10(iM), l(ol ADN khuôn (50 ng), bổ sung H 2O deion tới 20pl Chưoug trình nhiệt độ phản ứng PCR sau: biến tính 95°c phút; 35 chu kì lặp lại ba bước 95°c - giây, l°c - 60°c (tùy mồi) - 30 giây, 72°c - phút; kết thúc tổng hợp 72°c ừong phút; bảo quản sản phẩm PCR 4°c Tên mồi, trình tự nucleotide mồi ADN mã vạch nhiệt độ gắn mồi mồi sử dụng nghiên cứu thể Bảng Sản phẩm PCR điện di ưên gel agarose 1,0% có bổ sung thuốc nhuộm axit nucleic (Redsafe) Sau điện di, gel agarose soi đèn UY chụp ảnh Bảng Đanh sách trình tự nucleotide cặp mồi Kích Ta Trình tự mồi (5’ - 3’) thước (°C) ACCCAGTCCATCTGGAAATCTGGTTC matK trnìỉpsbẢ ITS matK_R CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG trnĩiĩ psbAR ITS_F CGCGCATGGTGGATTCACAATCC GTTATGCATGAACGTAATGCTC ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG ITS_R TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC Những sản phẩm PCR sau khuếch đại thành công tinh sử dụng kit Priíication Kit hãng InTRON - Hàn Quốc Sau tinh sạch, sản phẩm PCR gửi cho phịng thí nghiệm l st Base Malaysia để giải trình tự nucleotide theo hai chiều xi ngược Trình tự nucleotide đoạn ADN xác định máy giải trình tự tự động dựa nguyên lý Sanger, sử dụng Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing 2.4 Phương pháp phân tích liệu ADN mã vạch Các trình tự nucleotide phân tích xử lý phần mềm tin sinh BioEdit 7.2.5 (Hall, 1999), Mega7 (Kumar et al., 2016), công cụ NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 32 52 850 D1 460 60 900 Tham khảo Kress and Erickson, 2007 Sang et al., 1997 W en and Zimmer, 1996 Cây quan hệ di truyền xây dựng dựa phương pháp Maximum likelihood, với số lần lặp 1000 KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết ADN tổng số Sử dụng kit tách chiết ADN thực vật Qiagen-Đức để tách chiết ADN tổng số từ 15 mẫu Đinh mật Kết tách chiết ADN tổng số đo ứên máy Scandrop với nồng độ thấp (dao động từ 14,99 đến 29,25 ng/pl) độ tinh tương đối tốt (tỉ số A260/A280 đạt từ 1,57 -1 ,8 ) Chi tiết hàm lượng ADN tổng số độ tinh mẫu thể bảng Với kết tách chiết ADN tổng số chứng tiến hành thử nghiệm nồng độ ADN khuôn phù hợp cho phản ứng PCR thơng TAP CHÍ KHOA HOC VÀ CƠNG NGHÊ• LÂM NGHIỆP SĨ - 2022 • • • Cơng nghệ sinh học & Giống trồng qua cặp mồi matK_FỈR tất mẫu ADN tổng số xuất sản phẩm PCR đặc hiệu với kích thước khoảng 850 bp nồng độ ADN tổng số 30 ng đến 50 ng phản ứng PCR Đoạn gen nhân thể gel agarose 1,0% băng rõ, sắc nét khơng có sản phẩm phụ Từ kết thử nghiệm PCR này, khẳng định tách chiết ADN tổng số từ mẫu Đinh mật sử dụng kit tách chiết ADN thực vật Qiagen-Đức Bảng Hàm lượng độ tỉnh 15 mẫu ADN tổng số tách chiết từ loài Đỉnh mật Địa điểm lấy mẫu STT Độ tinh Hàm lượng ADN Mẩu 10 11 12 13 14 15 Định Hóa Đồng Hỷ Phú Lương Võ Nhai Đại Từ ĐH1 ĐH2 ĐH3 ĐHY1 ĐHY2 ĐHY3 PL1 PL2 PL3 VN1 VN2 VN3 ĐT1 ĐT2 ĐT3 3.2 Kết nhân gen vối đoạn ADN mã vạch kĩ thuật PC R 15 mẫu ADN tổng số tách chiết từ 15 Đinh mật sử dụng làm khuôn để nhân đoạn gen matK, tm ĩỉ-psbA , ITS kỳ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu Bảng Gen matK trình tự gen nằm lục lạp nhân cách dễ dàng nhiều lồi thực vật Trình tự gen matK sử dụng rộng rãi để xây dựng mối quan hệ hệ sinh thái lồi có liên quan chặt chẽ để định danh loài thực vật Cặp mồi sử dụng matK_R để nhân đoạn gen matK Kết kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose 1% cho thấy gen m atK khuếch đại thành công tất mẫu Đinh mật nghiên cứu, băng thu sáng với kích thước tương tự khoảng 850 bp (khi so sánh với thang ADN chuẩn 100 bp), khơng có băng phụ xuất tất mẫu nghiên cứu (Hình 2A) Vùng xen trnĩỉ-psbA vùng biến đổi gen lục lạp 1,77 1,65 1,59 1,57 1,65 1,78 1,57 1,76 1,83 1,83 1,74 1,78 1,73 1,71 1,61 24,52 27,50 21,30 17,11 20,50 22,03 14,99 18,90 27,50 29,25 19,50 22,68 27,15 22,76 22,12 lồi hạt kín Nó cơng cụ phổ biến để nghiên cứu di truyền quần thể thực vật phát sinh cấp loài đề xuất phù hợp cho nghiên cứu mã vạch DNA Cặp mồi trnH_F psbA _R thiết kế để nhân đoạn gen trnH-psbA nhiều đối tượng thực vật khác Ket kiểm tra sản phẩm nhân đoạn gen trnH-psbA phương pháp điện di gel agarose 1,0% cho thấy đoạn gen tm R -p sb A khuếch đại thành công tất 15 mẫu Đinh mật nghiên cứu Hình 2B kết điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnR-psbA 15 mẫu Đinh mật tỉnh Thái Nguyên, băng ADN nhân đặc hiệu với băng nhất, sáng rõ Sản phẩm PCR nhân đoạn gen tm U -psbA tinh xác định trình tự nucleotide Trong tế bào, rDNA xếp đơn vị lặp lại ngẫu nhiên bao gồm ADN mã hóa ribosome 18S, 5, 8S, 28S xen trình tự khơng mã hóa IT S ì, ITS2 (intemal transcribed spacers) nằm hai bên sườn vùng 5,8S Vùng IT S (bao gồm ITSỈ /752) vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích TAP CHÍ KHOA HOC VÀ CƠNG NGHÊ• LÂM NGHIẼP SỐ - 2022 • • • 33 Công nghệ sinh học & Giống trồng họp để phân biệt loài gần gũi K ết nhân đoạn gen IT S 15 m ẫu Đ inh m ật tỉnh Thái N guyên thể hình 2C Đoạn gen IT S khuếch đại thành công tất mẫu Đinh mật Các mẫu xuất băng ADN sáng rõ nét, kích thước khoảng 800 bp phù hợp với kích thước lý thuyết đoạn gen IT S dự kiến nhân A Hình Kết nhân 03 đoạn trình tự ADN mã vạch 15 mẫu Đinh mật Thái Nguyên (A); Trình tự matK, (B): Trình tự trnH-psbA, (C): Trình tự ITS Giếng 1-3: mẫu DH 01-DH 03; Giếng 46: DHY 01- DHY 03; Giếng 7-9: PL 01 - PL 03; Giếng 10-12: V N - V N 03; Giểng 13-15: DT 01- DT 03; M: Thang đo (marker) A D N 100 bp 3.3 Phân tích trình tư tự nucleotide đoạn gen xác định * nucỉeotide đoan • ADN mã vạch công ty l st BASE - Malaysia Các sản phẩm PCR tinh 3.3.1 Phân tích trình tự nucleotide đoạn gen kit PCR Puriíícation Kit InTRON - Hàn matK Quốc theo hướng dẫn nhà sản xuất trình Femandoa adỉi-íriderici (MN370400.1) Pemandoa magnìíìca (JX517318.1) Femandoa serrata (LC129167.1) DH01 MatK Fernandoa bracteata (LC129162.1) Dolíchandrone spathacea (LC129151.1) QDŨ10 Hình Cây quan hệ di truyền loài Đinh mật Thái Nguyên với 04 lồi chi Fernandoa dựa trình tự nucleotỉde matK Sau xác định trình tự nucleotide giống 100% tất mẫu Đinh mật phương pháp tự động xử lý trình tự băng nghiên cứu đăng ký lên GenBank với phần mềm BioEdit, thu đoạn gen mã số ON603621 Trên Ngân hàng gen Quốc tế matK với kích thước 839 bp với đỉnh peak chưa cơng bố trình tự nucleotide lồi Đinh rõ ràng Trình tự nucleotide đoạn gen matK mật nên cơng bố lồi 34 TAP CHÍ KHOA HOC VÀ CƠNG NGHÊ• LÂM NGHIÊP SỐ - 2022 • • • Cơng nghệ sinh học & Giống cày trồng Trên Ngân hàng gen Quốc tế có 04 trình tự nucleotide đoạn gen m atK lồi thuộc chi Femandoa, là: F bracteata (LC129162.1), F serrata (LC129167.1), F adolfi-jriderỉcỉ (MN370400.1), F magnifica ỢX517318.1) Cây quan hệ di truyền loài Đinh mật Thái Nguyên với 04 loài thuộc chi Fem andoa đuợc thể ừên Hình Mau DH 01 đại diện cho tất 15 mẫu Đinh mật nghiên cứu có mức độ tương đồng 100% với loài F bracteata (LC129162.1), ba lồi cịn lại chi Fernandoa nhóm thành nhóm tương đối gần với lồi Đinh mật nghiên cứu Loài Dolichandrone spathacea loài thuộc họ Bignoniaceae với loài Đinh mật sử dụng lồi ngồi nhóm (outgroup) để thể mối quan hệ di truyền gần loài chi Fernandoa 3.3.2 Phân tích trình tự nucleotide đoạn gen trnH-psbA Trình tự nucleotide đoạn gen trriR-psbA tương đồng 100% mẫu Đinh mật nghiên cứu đăng ký lên GenBank với mã số ON603622 Trình tự nucleotide đoạn gen trnH-psbA tất 15 mẫu Đinh mật nghiên cứu có chiều dài 399 bp Trên Ngân hàng gen Quốc tế chưa cơng bố trình tự nucleotide lồi Đinh mật (Fernandoa brilletỉí) sở liệu ADN Việt Nam (VNDNABANK) công bố trình tự trríH-psbA lồi Thượng Tiến, Hịa Bình với kích thước 394 bp (Hà Văn Huân, 2015) So sánh trình tự trnHp sb A mẫu Đinh mật Thái Nguyên với trình tự mẫu Đinh mật Hịa Bình cho thấy tương đồng 100% Cây quan hệ di truyền loài Đinh mật Thái Nguyên với số loài chi Fem andoa công bổ Ngân hàng gen Quốc tế thể Hình Trong đó, mẫu Đinh mật Thái Nguyên mà đại diện mẫu DH 01 tương đồng 100% với loài F brỉlletỉi có mã số BF0003 Ngân hàng ADN Việt Nam hai nhóm chung với ba lồi thuộc chi Fernandoa có Ngân hàng gen Quốc tế Kết cho thấy mẫu Đinh mật Thái Ngun lồi F brỉlỉetỉỉ so sánh với sở liệu ADN Việt Nam P e rn a n d o a m acran th a ( K U 203489.1) L P e rn a n d o a sp (K U 203491.1) F e rn a n d o a c o c c in e a (KU203488.1) DHO-Ị Trn H B P B 0 tm H ( V N D N A B a n tỷ D o lic h a n d ro n e ^ sath acea (O K63Ũ 72 71) Q10 H Hình Cây quan hệ di truyền loài Đinh mật Thái Nguyên với lồi thuộc chi Fernandoa dưa trình tư nucỉeotỉde trnH-psbA IT S phân thành hai nhóm trình tự với 3.3.3 Phân tích trình tựnucleotide đoạn ITS Trình tự nucleotide đoạn ITS mẫu mã số GenBank tương ứng O N 614190 Đinh mật có chiều dài 848 bp có số vị trí O N 614191 Hai trình tự ITS khác hai vị nucleotide sai khác mẫu Đinh mật Cụ trí nucleotide vị trí nucleotide số 150 245 thể, sai khác trình tự nucleotide đoạn (Hình 5) Cụ thể trình tự có mã số ON614190 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2022 35 Công nghệ sinh học & Giống trồng bao gồm mẫu Đinh mật Định Hóa, Phú Lương, Đồng Hỷ Võ Nhai (đại diện mẫu DH 01), cịn trình tự có mã số ON614191 bao gồm mẫu Đinh mật Đại Từ (đại diện mẫu DT 03) Mối quan hệ di truyền mẫu Đinh mật Thái Nguyên với số loài thuộc chi Fernandoa dựa trình tự IT S thể Hình Trong đó, mẫu DH 01 DT 03 có khoảng cách di truyền nhỏ (0,007) nằm nhóm với lồi chi 20 10 DB01 IT S (« ) (« ) Fem andoa có Ngân hàng gen Các mẫu Đinh mật nghiên cứu có quan hệ tương đối gần với loài Fernandoa coccỉnea (KU203434.1) Lồi Fernandoa macrantha (KU203435.1) vầFernandoa sp (KU203433.1) nhóm thành nhóm có quan hệ gần với nhóm lồi Đinh mật nghiên cứu Loài Dolỉchandrone spathacea loài thuộc họ Bignoniaceae với loài Đinh mật sử dụng lồi ngồi nhóm (outgroup) 30 4« .1 so , 1, 70 60 ■I 60 .1 C nC T A ^ 'rTICH T fCCT£XXiC )TATTGẰTATOCTTMMrfCAŨgX^MTCOCGCCTOACCTGOGGTCGCGCTCOGA Dnuìnrs 100 90 130 120 110 HGKIQQKỈtPi^ M O I IT S (£ » ) D T03~ITS £ « » ) 170 M IT S (« ) Đ fra jE T S (« ) 14 .I 180 160 190 200 210 220 230 240 350 3« 370 380 390 400 ) f l ,fI |, | l l i l7 I l7 I l AOỈACAGCAC(KK»GTr(y«7rrrCA«XACCAlCTO