(Luận văn) nghiên cứu xác định một số đoạn adn mã vạch và nhân giống lan phi điệp tím hòa bình (dendrobium anosmun lindley) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP -LUẬN VĂN THẠC SỸ KH OA HỌC LÂM NGHIỆP ĐỖ QUỲNH LIÊN lu NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐOẠN ADN MÃ VẠCH an va VÀ NHÂN GIỐNG LAN PHI ĐIỆP TÍM HỊA BÌNH n (Dendrobium anosmun Lindley) BẰNG KỸ THUẬT tn to p ie gh NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO oa nl w CHUYÊN NGHÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC d MÃ NGÀNH: 8420201 nf va an lu LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC z at nh oi lm ul NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: z TS BÙI THỊ MAI HƯƠNG @ m co l gm PGS.TS NGUYỄN VĂN VIỆT an Lu Hà Nội, 2020 n va ac th si i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan, cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Nếu nội dung nghiên cứu trùng lặp với cơng trình nghiên cứu cơng bố, tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm tuân thủ kết luận đánh giá luận văn hội đồng khoa học lu an Hà nội, ngày… tháng… Năm 2020 n va Người cam đoan p ie gh tn to ( Tác giả ký ghi rõ họ tên) oa nl w d Đỗ Quỳnh Liên nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp trang bị kiến thức cho tơi suốt q trình học tập Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Việt TS Bùi Thị Mai Hương tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình làm luận văn Thạc sĩ Tôi xin cảm ơn cán Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp Trường Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn lu an Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp n va sát cánh hỗ trợ động viên vật chất tinh thần tn to trình học tập nghiên cứu p ie gh Xin chân thành cảm ơn! w Hà Nội, ngày tháng năm 2020 d oa nl Học viên nf va an lu lm ul z at nh oi Đỗ Quỳnh Liên z m co l gm @ an Lu n va ac th si iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii BẢNH DANH MỤC VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH x ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU lu an 1.1 Giới thiệu chung Phi điệp tím Hịa Bình n va 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại tn to 1.1.2 Đặc điểm thực vật học Phi điệp tím Hịa Bình 1.1.4 Giá trị sử dụng p ie gh 1.1.3 Một số điều kiện sinh thái w 1.2 Tổng quan ADN mã vạch oa nl 1.2.1 Giới thiệu ADN mã vạch (DNA barcode) d 1.2.2 Một số locus sử dụng làm thị mã vạch ADN thực vật 10 lu nf va an 1.2.3.Những nghiên cứu ứng dụng ADN mã vạch giám định loài 13 1.3 Tổng quan nuôi cấy mô - tế bào 16 lm ul 1.3.1 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật 16 z at nh oi 1.3.2 Các bước tiến hành phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật.17 1.3.3 Thành tựu nuôi mô chi Dendrobium 19 z Chương 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP gm @ NGHIÊN CỨU 23 l 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 23 m co 2.1.1 Mục tiêu tổng quát 23 an Lu 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 23 2.2 Nội dung nghiên cứu 23 n va ac th si iv 2.2.1 Xác định số trình tự ADN mã vạch 23 2.2.2 Nhân giống Phi điệp tím Hịa Bình kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào 23 2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 23 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 23 2.3.2 Hóa chất 24 2.4 Phương pháp nghiên cứu xác đinh ADN mã vạch 26 2.4.1.Tách chiết DNA tổng số 26 2.4.2 Phương pháp nhân gen đích kỹ thuật PCR 28 2.4.3.Tinh sản phẩm PCR 29 lu an 2.4.4 Phương pháp đọc trình tự 30 n va 2.4.5 Xử lý số liệu 30 cấy mô tế bào 30 2.5.1 Phương pháp khử trùng tạo mẫu nuôi cấy khởi động 30 p ie gh tn to 2.5 Phương pháp nhân giống Phi điệp tím Hịa Bình kỹ thuật ni w 2.5.2 Phương pháp nhân nhanh thể chồi 31 oa nl 2.5.3 Phương pháp nhân nhanh chồi 32 d 2.5.4 Phương pháp nghiên cứu rễ - tạo hoàn chỉnh 34 lu nf va an 2.5.5 Phương pháp huấn luyện 35 2.5.6 Điều kiện thí nghiệm 36 lm ul 2.5.7.Chỉ tiêu theo dõi, đánhgiá 36 z at nh oi Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Kết xác định số đoạn ADN mã vạch 37 z 3.1.1 Kết tách chiết ADN tổng số 37 gm @ 3.1.2 Kết nhân vùng gen nghiên cứu kỹ thuật PCR 37 l 3.1.3 Phân tích kết 38 m co 3.2 Kết nhân giống Phi điệp tím Hịa Bình ni cấy mơ tế bào 52 an Lu 3.2.1 Phương pháp khử trùng tạo mẫu nuôi cấy khởi động 52 3.2.2 Phương pháp nhân nhanh thể chồi 55 n va ac th si v 3.2.3 Phương pháp nhân nhanh chồi 57 3.2.4 Phương pháp nghiên cứu rễ - tạo hoàn chỉnh 63 3.2.5 Phương pháp huấn luyện 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si vi BẢNH DANH MỤC VIẾT TẮT Chữ viết tắt ADN Deoxyribonucleic Acid IBA Indol Butyric Acid MS Murashige Skoog(1962) NAA a- Naphthalen acetic acid CTTN Công thức thí nghiệm ĐHST Điều hịa sinh trưởng BAP -benzynlaminopurin Knops ĐC Đối chứng TB Trung Bình TG Thời gian lu TT an n va ie gh tn to p 10 Knops Medium CTAB Cetyl trimethylammonium bromide d oa lu Phản ứng chuỗi polymerase PCR nf va an 13 nl 12 w 11 Giải nghĩa EDTA axit ethylenediamine tetraacetic 15 IAA 16 WPM 17 GA3 18 NCBI 19 bp Cặp base 20 ITS Vùng AND nằm gen lm ul 14 Indol- acetic acid z at nh oi Woody plant medium z Gibberellin A3 @ m co l sinh học gm Trung tâm quốc gia thông tin công nghệ an Lu n va ac th si vii TT Chữ viết tắt Giải nghĩa 21 IAE Tris-Acetate-EAIA 22 EBA Đệm tách A 23 EBB Đệm tách B 24 SOS Sodium Đoecyl Sulphate 25 UV Tia cực tím 26 ddNTP Dideoxy nucleotide lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Vị trí phân loại chi Dendrobium Bảng 2.1 Thành phần đệm tách A (100ml) 24 Bảng 2.2 Thành phần đệm tách B (100ml) 24 Bảng 2.3 Thành phần đệm TE (100ml) 25 Bảng 2.4 Trình tự thơng tin cặp mồi sử dụng 28 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 28 Bảng 2.6 Ảnh hưởng hóa chất thời gian khử trùng đến tạo mẫu khả nảy mầm 31 lu an Bảng 2.7 Ảnh hưởng nồng độ chất ĐHST đến khả nhân nhanh n va thể chồi 32 tn to Bảng 2.8 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi 32 gh Bảng 2.9 Ảnh hưởng nồng độ BAP NAA đến nhân nhanh chồi 33 p ie Bảng 2.10 Ảnh hưởng nồng độ BAP, Kinetin NAA đến nhân nhanh w chồi 34 oa nl Bảng 2.11 Ảnh hưởng nồng độ IBA NAA tới khả rễ 35 d Bảng 2.12 Ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chất lượng lu nf va an 36 Bảng 3.1 Bảng so sánh khoảng cách di truyền Phi điệp tím Hịa Bình lm ul với loài Lan khác ngân hàng gen quốc tế NCBI đoạn trình tự z at nh oi trnH-psbA 40 Bảng 3.2 Bảng so sánh khoảng cách di truyền Phi điệp tím Hịa Bình z với lồi Lan khác đoạn trình tự rbcL 45 gm @ Bảng 3.3 Bảng so sánh khoảng cách di truyền Phi điệp tím Hịa Bình l với lồi Lan khác đoạn trình tự ycf 49 m co Bảng 3.4 Bảng so sánh khả phân biệt Các đoạn trình tự ycf, trnH- an Lu psbA rbcL 52 Bảng 3.5 Ảnh hưởng hóa chất thời gian khử trùng đến tạo mẫu n va ac th si ix nảy mầm 53 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nồng độ chất ĐHST đến khả nhân nhanh thể chồi (sau tuần nuôi cấy) 55 Bảng 3.7 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả nhân nhanh chồi (sau tuần nuôi cấy) 57 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nồng độ BAP NAA đến khả nhân nhanh chồi (sau tuần nuôi cấy) 59 Bảng 3.9 Ảnh hưởng nồng độ BAP, Kinetin NAA đến nhân nhanh chồi (sau tuần nuôi cấy 61 lu an Bảng 3.10 Ảnh hưởng nồng độ IBA NAA tới khả rễ (sau n va tuần nuôi cấy) 63 tn to Bảng 3.11 Ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chất lượng p ie gh (sau tuần ngôi) 65 d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si 60 lu an n va nhân nhanh chồi Kết bảng 3.8 biểu đồ 3.4 cho thấy tất cơng thức thí p ie gh tn to Hình 3.14 Ảnh hưởng nồng độ BAP NAA đến khả w nghiệm có bổ sung chất điều hịa sinh trưởng, tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi đạt oa nl giá trị cao (66,8 đến 86,7%), cơng thức thí nghiệm NC4 (bổ sung 0,8 d mg/L BAP, 0,2 mg/L NAA) cho kết tốt nhất, với tỷ lệ mẫu tạo cụm chồi lu nf va an đạt 86,7%, số chồi TB/mẫu đạt 9,4 chồi, chất lượng chồi tốt, mập, đồng đều, màu xanh đậm Kết tương ứng với công bố Nguyễn Văn Việt lm ul (2016) nhân nhanh Hồng thảo vơi mơi trường MS bổ sung 0,5 mg/L z at nh oi BAP 0,3 mg/L NAA, cho kết 90% mẫu tạo cụm chồi, số chồi trung bình/mẫu đạt 9,6 chồi Kết phân tích thống kê cho thấy khác biệt rõ rệt z khả nhân nhanh chồi cơng thức thí nghiệm (Sig < 0,05) @ gm *Ảnh hưởng nồng độ BAP, Kinetin NAA đến nhân nhanh chồi l Xác định ảnh hưởng tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng đến khả m co nhân nhanh chồi, thí nghiệm bố trí với mơi trường khống cứu trình bày bảng 3.9 an Lu MS bổ sung BAP, Kinetin NAA có nồng độ khác Kết nghiên n va ac th si 61 Bảng 3.9 Ảnh hưởng nồng độ BAP, Kinetin NAA đến nhân nhanh chồi (sau tuần nuôi cấy) Chất ĐHST( mg/L) CT Số chồi TB/mẫu Chất lượng chồi Kinetin NAA ĐC 0 40,3 3,0 + NN1 0,8 0,1 0,2 88,3 9,6 ++ NN2 0,8 0,3 0,2 91,7 10,1 +++ NN3 0,8 0,5 0,2 96,8 13,7 +++ NN4 0,8 0,7 0,2 89,0 12,4 +++ NN5 0,8 0,9 0,2 86,3 9,6 ++ NN6 0,8 1,1 0,2 84,5 8,9 ++ 0,8 1,5 0,2 81,7 8,2 ++ lu BAP gh TN Tỷ lệ tạo cụm chồi (%) an n va tn to p ie NN7 0,0001 0,0001 w Sig oa nl Ghi chú: +: Chồi mảnh, yếu, xanh; ++: Chồi thấp, gầy, yếu, xanh d +++:Chồi cao, mập, xanh đậm nf va an lu z at nh oi lm ul z l gm @ co … m Hình 3.15 Ảnh hưởng nồng độ BAP, Kinetin NAA đến an Lu nhân nhanh chồi n va ac th si 62 Kết bảng 3.9 biểu đồ 3.5 cho thấy, bổ sung đồng thời BAP, NAA Kinetin vào môi trường nuôi cấy, công thức thí nghiệm cho tỷ lệ tạo cụm chồi cao Với giá trị tỷ lệ tạo cụm chồi đạt 81,7% đến 96,8%, số chồi trung bình/mẫu đạt từ 8,2 đến 13,3 Đặc biệt công thức NN3 đạt giá trị cao nhất, tỷ lệ tạo cụm chồi, số chồi trung bình mẫu 96,8% 13,3 chồi/cụm (Hình 3.11 a,3.11b, 3.11c) Kết tương ứng với kết nhân giống lan Hồng thảo vơi (Tỷ lệ tạo cụm chồi 96,7%, 12,3 chồi/cụm) tác giả Nguyễn văn Việt (2017) Theo công bố Vũ Kim Dung cộng (2016) nhân nhanh lan Hoàng thảo ý thảo ba mầu lu an cho kết 96,67% tạo cụm chồi, số chồi tạo 9,53 chồi/cụm Như vậy, có n va thể chọn mơi trường nhân nhanh Phi Điệp tím Hồ Bình mơi trường dinh tn to dưỡng MS bổ sung 0,8 mg/L BAP, 0,5 mg/L Kinetin 0,2 mg/L gh NAA Kết phân tích thống kê cho thấy khác biệt rõ rệt cơng p ie thức thí nghiệm hệ số nhân chồi (Sig < 0,05) d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z b gm @ a c l m giai đoạn ni cấy co Hình 3.16 Hình ảnh lan Phi điệp tím Hịa Bình qua an Lu a) Cụm chồi NN2; b) Cụm chồi NN3; c) Cụm chồi NN4 n va ac th si 63 3.2.4 Phương pháp nghiên cứu rễ - tạo hoàn chỉnh Ra rễ tạo hoàn chỉnh in vitro khâu quan trọng trước cho ngồi huấn luyện Thí nghiệm tiến hành với việc cấy chuyển chồi lan đủ tiêu chuẩn (chồi đạt - 4cm, mập, xanh) vào môi trường khoáng MS bổ sung (0,1 đến 0,4mg/L) IBA, (0,2 đến 0,4mg/L) NAA, 20g/L sucrose, 6,5g/L agar, 100g/L khoai tây nghiền, 100ml/L nước dừa Kết thí nghiệm trình bày bảng 3.10 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nồng độ IBA NAA tới khả rễ (sau tuần nuôi cấy) lu va n Số rễ Chiều dài ĐHST(mg/L) chồi TB/cây TB/rễ IBA NAA rễ(%) (rễ) (cm) 0 34,3 2,1 1,6 3,4 0,2 - 67,3 3,2 2,3 7,4 - 72,0 3,3 2,5 8,3 81,0 3,1 2,4 7,4 71,3 3,3 2,2 7,3 83,3 3,4 2,8 9,5 Chỉ số rễ gh tn to Tỷ lệ an an CTTN Chất p ie ĐC RR2 oa nl w RR1 RR3 0,4 RR4 - 0,2 RR5 - 0,3 RR6 - 0,4 79,5 3,2 2,7 8,6 RR7 0,1 0,2 86,7 3,4 2,9 9,9 RR8 0.2 0,3 94,3 3,5 3,0 10,5 RR9 0,3 0,4 90,3 3,6 2,7 9,7 0,0023 0,0001 d 0,3 lu - nf va z at nh oi lm ul z m co l gm @ 0,0001 an Lu Sig n va ac th si 64 Hình 3.17 Ảnh hưởng nồng độ IBA NAA tới khả rễ lu an Kết bảng 3.10 biểu đồ 3.6 cho thấy, cơng thức thí nghiệm n va bổ sung chất điều hoà sinh trưởng thực vật (IBA NAA) cho tỷ lệ tn to rễ thấp Môi trường bổ sung 0,2 đến 0,4 mg/L IBA, tỷ lệ rễ đạt 67,3 đến gh 81% số rễ đạt 7,4 đến 8,3 Với công thức môi trường bổ sung 0,2 p ie đến 0,4 mg/L NAA, tỷ lệ rễ số rễ cao 83,3% w 9,5% Các công thức môi trường bổ sung phối hợp hai chất ĐHST (0,1 đến oa nl 0,3) mg/L IBA (0,2 đến 0,4mg/L) NAA, cho kết cao so với bổ d sung hai chất trên, cụ thể công thức RR8, với môi trường dinh lu nf va an dưỡng MS bổ sung 0,2 mg/L IBA 0,3 mg/L NAA cho kết cao tỷ lệ chồi rễ số rễ 94,3% 10,5 (Hình 3.12a, lm ul 3.12b) Kết đạt tương tự tác giả Vũ Kim Dung z at nh oi cộng (2016) dùng môi trường khoáng MS bổ sung NAA 0,3 mg/L, IBA 0,2 mg/L nghiên cứu rễ lan Hoàng thảo ý thảo ba mầu, tỷ lệ rễ z đạt 93,33% Tác giả Nguyễn Văn Việt (2017) nghiên cứu mơi trường rễ gm @ lan Hồng thảo kèn mơi trường khống Knops bổ sung l NAA 0,3 mg/L, IBA 0,1 mg/L cho tỷ lệ chồi rễ cao đạt 100%, số rễ m co TB/cây 4,8 chiều dài TB/rễ đạt 3,6 cm, số rễ 17,3 Kết phân tích an Lu thống kê cho thấy, nồng độ chất điều hoà sinh trưởng thực vật khác ảnh hưởng rõ rệt tới khả rễ Phi điệp tím Hồ Bình (Sig < 0,05) n va ac th si 65 a) Cây lan hoàn chỉnh RR8 b) Cây lan hồn chỉnh Hình 3.18 Hình ảnh lan Phi điệp tím Hịa Bình qua lu an giai đoạn nuôi cấy n va 3.2.5 Phương pháp huấn luyện ngơi tn to Khi có chiều cao lớn 4,5 cm, có khoảng rễ, cứng cáp, gh tiến hành đem bình huấn luyện điều kiện ánh sáng tán xạ Thí nghiệm p ie này, được bố trí với cơng thức khác thời gian, sau huấn luyện w đem trồng giá thể hỗn hợp dương xỉ xơ dừa qua oa nl xử lý Kết nghiên cứu trình bày bảng 3.11 d Bảng 3.11 Ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chất lu Số mẫu TG huấn luyện( ngày) Đặc điểm + 91 54,05 TG1 92 79,14 ++ TG2 91 10 98,03 +++ TG3 91 14 97,70 +++ gm @ Sig z ĐC lm ul Tỷ lệ sống(%) z at nh oi CTTN nf va an lượng (sau tuần ngôi) 0,0025 l co Ghi chú: +) Cây nhỏ, thân yếu, rễ bám giá thể kém; ++) Cây cao, xanh m đậm, cứng cáp, rễ bám giá thể tốt; +++) Cây to, khỏe, xanh đậm, rễ an Lu bám giá thể tốt xuất rễ mới, tăng chiều cao n va ac th si 66 Hình 3.19 Ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến lu tỷ lệ sống chất lượng an Kết thu (Bảng 3.11và biểu đồ 3.7), cho thấy tỷ lệ sống có sai va n khác rõ rệt công thức đối chứng (Không huấn luyện) với cơng thức cịn tn to lại có trải qua huấn luyện khả thích ứng với mơi trường tự ie gh nhiên tốt Thời gian huấn luyện 10 ngày, tỷ lệ sống trồng giá p thể đạt 98,03% (Hình 3.13) Kết phân tích thống kê cho thấy, Sig < 0,05, d oa nl w chứng tỏ có khác biệt rõ rệt tỷ lệ sống công thức thí nghiệm nf va an lu z at nh oi lm ul z b.TG huấn luyện 10 ngày l gm @ a TG huấn luyện ngày giai đoạn lan huấn luyện m co Hình 3.20 Hình ảnh lan Phi điệp tím Hịa Bình an Lu n va ac th si 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận a) Đối với xây dựng sở liệu ADN mã vạch Phi điệp tím Hịa Bình Đã tách chiết ADN tổng số 03/03 mẫu lồi Phi điệp tím Hịa Bình (Dendrobium anosmun) Đã nhân thành cơng gen ycf, trnH-psbA rbcL kỹ thuật PCR từ ADN tổng số mẫu thu Đã xác định trình tự đoạn gen ycf, trnH-psbA rbcL lu an 4.Đã xây dựng phát sinh chủng loại Phi điệp tím Hịa n va Bình (Dendrobium anosmun) với dòng Phi điệp khác ngân hàng gen tn to quốc tế gh Đoạn ycf có khả phân biệt cao so với đoạn trnH-psbA p ie rbcL so sánh loài Dendrobium anosmunvới lồi Dendrobium tosaense w Kết phân tích đoạn gen ycf phù hợp với kết hình thái cho thấy lồi oa nl Dendrobium anosmun có quan hệ gần với loài Dendrobium tosaense Mặc dù d cách tốt sử dụng đồng thời đoạn trình tự để xác định lu nf va an xác lồi cần định danh b) Đối với nhân giống lan Phi điệp tím Hịa Bình (Dendrobium anosmun) lm ul kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào z at nh oi Xác đinh công thức khử trùng mẫu dung dịch HgCl2 0,1% 10 phút đạt tỷ lệ 94,6%, tỷ lệ tạo thể chồi 9,3% z Xác định công thức nhân nhanh chồi mơi trường khống @ MS bổ sung 0,8 mg/L BAP, 0,2mg/L NAA, 0,5mg/L Kinetin, 30g/L sucrose, gm m co 96,8% hệ số nhân chồi đạt 13,7 lần; l 6,5g/L agar, 100g/L khoai tây nghiền, 100ml/L nước dừa Tỷ lệ tạo cụm chồi an Lu Xác định công thức rễ - tạo hồn chỉnh mơi trường khống MS bổ sung 0,2mg/L IBA 0,3mg/L NAA, 100mg/L khoai tây n va ac th si 68 nghiền, 20 g/L sucrose, 6,5 g/L agar Đạt tỷ lệ rễ 93,3%, số rễ trung bình 3,5 rễ/cây, chiều dài rễ trung bình 3,0cm, số rễ 10,5 Xác định công thức huấn luyện 10 ngày ánh sáng tán xạ, sau đưa trồng giá thể, tỷ lệ sống đạt 98,03% sau tuần theo dõi Kiến nghị - Sử dụng đoạn gen ycf, trnH-psbA rbcL vào việc giám định loài Phi điệp Việt Nam, đồng thời Đưa trình tự đoạn gen ycf, trnHpsbA rbcL lên ngân hàng Gen Quốc tế để phục vụ nghiên cứu sau này, tiến hành nghiên cứu với mồi khác để tìm dấu hiệu xác định loài khác lu an nhằm phân loại cách xác cụ thể Nhân mã vạch n va ADN khác đối tượng Phi điệp tím tn to - Có thêm thời gian điều kiện để tiếp tục hoàn thiện nội dung gh quy trình nhân giống Phi điệp tím Hịa Bình (Dendrobium anosmun) p ie như: Nghiên cứu mơi trường thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh chồi giai w đoạn rễ, nghiên cứu chế độ huấn luyện lan từ ống nghiệm oa nl vườn ươm, giá thể trồng, chế độ chăm sóc ngồi vườn ươm để quy trình d nghiên cứu hồn thiện kỹ thuật ni cấy mơ tế bào để lu nf va an đưa vào sản xuất z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan (2013) Nhân giống in vitro loài Lan địa Dendrobium nobile Lindley Tạp chí khoa học phát triển, (11): 917-925 Nguyễn Thị Lý Anh, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị Lý Sơn, Nguyễn Quang Thạch, Từ Bích Thủy (2014) Nhân giống in vitro lan Dendrobium officinle Kimura et Migo (Thạch Hơc Thiết Bì) Tạp chí khoa học phát triển (12): 1274-1282 lu Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Quỳnh Nga, Trần Ngọc Lân, Nguyễn Thị an n va Thu, Ninh Thị Phíp, Đồn Thị Thanh Nhàn, Lê Thị Thu Hiền, tn to Nguyễn Nhật Linh (2018), “Đặc điểm hình thái mã vạch DNA p ie gh loài Bảy hoa Paris vietnamensis (Takht.) H.Li” Tạp chí Vũ Kim Dung, Bùi văn Thắng, Nguyễn Văn Việt (2016) Nhân giống w Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2018, 16(4):282-289 oa nl Lan Hoàng Thảo Ý thảo ba màu (Dendrobium gratiosissimun d Reichenb.f), tạp chí khoa học cơng nghệ số -2016 lu Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015), “Xác định mã vach cho Trà nf va an hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis)”, Tạp chí Nơng Nghiệp lm ul PTNT, số 5/2015, trang 123 -124 Lê Thanh Hương, Nguyễn Nhật Linh, Bùi Mạnh Minh, Hà Hồng Hạnh, z at nh oi Huỳnh Thị Thu Huệ, Nông Văn Hải, Hà Văn Huân, Lê Thị Thu Hiền z (2017), “Ứng dụng mã vạch DNA hỗ trợ định danh loại loài số Nguyễn Thu Hường (2016) Nghiên cứu nhân giống in vitrolan Hoàng l gm @ mẫu sâm thuộc chi nhân Sâm” Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, số 15 an Lu sinh học ứng dụng, Đại học Thái Nguyên m co Thảo phi điệp tím(Dendrobium anosmum Lindley) Luận văn thạc sỹ n va ac th si 70 Nguyễn Thị Lài, Vũ Mạnh Hải, Phạm Hương Sơn, Tống Xuân Trung (2018) Nghiên cứu nhân giống Lan Hoàng Thảo Nghệ Tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe), tạp chí khoa học cơng nghệ 60(5) 5.2018 Nguyễn Quang Thạch (2000) Giáo trình sinh lý thực vật Nxb Nơng nghiệp Hà Nội 10 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2000) Bài giảng môn học Công nghệ sinh học thực vật Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội lu an 11 Nguyễn Đức Thành (2017).Tìm hiểu kỹ thuật nhân giống chăm sóc lan n va phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindley) Khóa luận tốt nghiệp tn to Đại học Lâm Nghiệp p ie gh 12 Nguyễn Quỳnh Trang, Vũ Thị Huệ, Khuất Thị Hải Ninh, Nguyễn Thị Thơ (2013) Nhân giống in vitro lan Phi điệp tím (Dendrobium Nguyễn Văn Uyển (1993) Ni cấy mơ thực vật phục vụ công tác oa nl 13 w anosum) Tạp chí khoa học cơng nghệ Lâm nghiệp, 3(1): 16-21 d giống trồng Nxb Nông nghiệp, 23-44 lu nf va an 14 Nguyễn Văn Việt (2017).Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro nhân giống lan Hồng thảo kèn (Dendrobium lituiflorum Lindley) Tạp chí lm ul Khoa học & Công nghệ Lâm nghiệp, 4/2017: 39-45 z at nh oi TÀI LIỆU TIẾNG ANH 15.Baharum S.N (2012) Application of 16s rDNA DNA cytochrome b z ribosomal markers in studies of lineage DNA fish populations @ structure of aquatic species Molecular biology reports, 39 (5):5225- l gm 5232 m co 16.Balaraju K, Agastian P, Preetamraj J.P, Arokiyaraj S, Ignaciumthu S an Lu (2008) Micropropagation of Vitex agnuscatus (Verbenaceae) Avaluable medicinal plant In vitroCellular & Developmental Biology n va ac th si 71 - Plant, 44(5): 436-411 17.Brown B, Emberson R.M, and Paterson A.M (1999) Mitochondrial COI DNA II provide useful markers for Wiseana (Lepidoptera: Hepialidae) species identification”, Bulletin of Entomological Research, 89 (04): 287-293 18.Casiraghi M, Labra M, Ferri E, Galimberti A, and Mattia D.F (2010) DNA barcoding: theoretical aspects DNA practical applications Brief Bioinform,11(4):440-453 19.Chase M.W, Robyn S Cowan , Peter M Hollingsworth , Cassio van den lu an Berg , Santiago Madriñán , Gitte Petersen , Ole Seberg , Tina n va Jørgsensen , Kenneth M Cameron6 , Mark Carine , Niklas Pedersen , tn to Terry A.J Hedderson , Ferozah Conrad , Gerardo A Salazar, James p ie gh E Richardson , Michelle L Hollingsworth , Timothy G Barraclough, Laura Kelly & Mike Wilkinson (2007) A proposal for a st and ardised protocol to barcode all DNA plants Taxon, 56 (2): 295-299 w oa nl 20.Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, Shi L, Zhu Y, Ma X, Gao T, Pang d X, Luo K, Li Y, Li X, Jia X, Lin Y, Leon C (2010) Validation of the lu nf va an ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species PloS one, (1): e8613 lm ul 21.Chen SY, Zhao R, Xu L, Feng QJ, Wang B, Kang TQ(2016), “DNA z at nh oi barcoding of Mongolian Medicinal Plant Scutellaria Scordifolia” Zhong Yao cao (Journal of chinese medicinal materials) , 39(7):1483- z @ 22.Chiou, S.-J., Yen J.-H., Fang C.-L., Chen H.-L., DNA Lin T.Y (2007) gm l Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with m co specific primers Planta medica, 73 (13):1421-1426 an Lu 23.Fazekas A.J, Burgess K.S, Kesanakurti P.R, Graham S.W, Newmaster S.G, Husband B.C, Percy D.M, Hajibabaei M, Barrett S.C (2008) n va ac th si 72 Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well.PLoS One, (7): e2802 24 Hebert, P.D., Cywinska A., and Ball S.L (2003) Biological identifications through DNA barcodes.Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 270 (1512): 313-321 25 Hebert P.D, Ratnasingham S and De Waard J.R (2003).Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit divergences among closely related species Proceedings of the Royal Society of London B Biological Sciences, 270 (1): 96-99 lu an 26 Hollingsworth, P.M (2011) Refining the DNA barcode for DNA plants n va Proceedings of the National Academy of Sciences, 108 (49):19451- tn to 19452 p ie gh 27 Hollingsworth M.L, and Clark A., et al (2009) Selecting barcoding loci for plants: evaluation of seven candidate loci with species-level sampling in three divergent groups of land plants Molecular Ecology w oa nl Resources, (2): 439-457 d 28 Lee H-L, Yi D-K, Kim J-S, Kim K-J (2007) Development of plant DNA lu nf va an barcoding markers from the variable noncoding regions of chloroplast genome The Second International Barcode of Life Conference lm ul Academia Sinica, Taipei, Taiwan September 18–20, 2007 z at nh oi 29 Logacheva, M., Penin A., Samigullin T., Vallejo-Roman C., DNA Antonov A (2007) Phylogeny of flowering plants by the chloroplast z genome sequences: in search of a “lucky gene” Biochemistry gm @ (Moscow), 72 (12): 1324-1330 l 30 Park SU, Kim YK, Lee SY (2009), Improvedin vitro plant regeneration an Lu Medicial Plants Research, 3(1): 031-034 m co DNA micropropagation of Rehmannia glutinosa L Journal of 31 Pereira AM, Amui SF, Bertoni BW, Moraes RM, Franca SC (2003) n va ac th si 73 Micropropagation of Anemopaegma arvense: Conservation of an endangered madicinal plant Plant Med, 69(6): 571-573 32 Peter M Hollingsworth, Laura L Forrest, John L Spouge, Mehrdad Hajibabaei, Sujeevan Ratnasingham,et al (2009) A DNA barcode for land plants.Proceedings of the National Academy of Sciences, 106 (31): 12794-12797 33 Scharaschklin T., Doyle J.A.( 2005) Phylogeny and historical biogeography of Anaxagorea (Annonaceae) using morphology and noncoding chloroplast sequence data Syst Bot 30: 712–735 lu an 34 Schoch C.L, Seifert K.A, et al (2012) Nuclear ribosomal internal n va transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker tn to for Fungi Proceedings of the National Academy of Sciences, 109 gh (16): 6241- 6246 p ie 35 Shigematsu N, Asano R, Shimosaka M, Okazaki M (2001) Effect of administration with the extract of Gymnema sylvestre R Br leaves on w oa nl lipid metabolism in rats Biol Pharm Bull,24(6):713-717 d 36 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., lu nf va an Thierry V., Gérard C., Christian B., and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA lm ul barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3): 14 z at nh oi 37 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates z the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle l Resources 9: 1086-1091 gm @ ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology m co 38 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy 39 an Lu in a new perspective” Current science, 99: 1530 – 1540 Wang DY., Wang Q.,Wang YL., Xiang XG., Huang LQ., Jin n va ac th si 74 XH(2017), “Evaluation of DNA bacorde in Codonpsis (Campanulaceae) and in some large angiosperm plant genera” Plos one 12(2): e0170286: 1-14 40 Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R (2010) “DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots” BMC Plant Biology 10: 205 41 Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary lu an and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade” n va Genetics, 174: 1407-1420 tn to 42 Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010), “Use of ITS2 region as p ie gh theuniversal DNA barcode for plants and animals” PLoS ONE, 5: 13102 43 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y w oa nl (2010) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding d technique” Journal of Medicinal Plants Research, 4(24): 2706-2709 nf va an lu WEBSITE lm ul 44 http://www.barcodinglife.org/ z at nh oi 45 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi z m co l gm @ an Lu n va ac th si