Nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu adn mã vạch cho loài khổ sâm (croton tonkinensis gagnep) đến từ việt nam phục vụ giám định loài

LỜI CẢM ƠN Sau thời gian nghiên cứu, với tinh thần nghiêm túc, tích cực đến đề tài khóa luận đƣợc hồn thành Có đƣợc kết trƣớc hết chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện CNSH Lâm Nghiệp cho phép tạo điều kiện thuận lợi để thuận lợi thực thành cơng đề tài khóa luận Trong q trình thực đề tài khóa luận, ngồi nỗ lực thân tơi cịn nhận đƣợc hƣớng dẫn tâm, bảo truyền đạt kiến thức thầy giáo cô giáo Trƣờng Đại học Lâm nghiệp, cán Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp suốt trình học tập nghiên cứu Nhân dịp tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo hƣớng dẫn PGS.TS Bùi Văn Thắng Th.S Nguy n Thị Huyền thầy cô Bộ môn Công ghệ Gen Di truyền phân tử, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn gia đình ngƣời thân bạn bè động viên tạo điều kiện tốt cho tơi q trình học tập nghiên cứu Mặc dù cố gắng để hồn thành đề tài khóa luận song thời gian có hạn, kinh nghiệm thân cịn hạn chế nên đề tài nghiên khóa luận khơng thể tránh khỏi thiếu sót Tơi mong nhận đƣợc lời nhận xét, đóng góp ý kiến Thầy, Cơ giáo để báo cáo đề tài khóa luận đƣợc hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội ngày… tháng… năm 2019 Sinh viên i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Khổ sâm 1.1.1 Giới thiệu Khổ sâm 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Đặc điểm sinh thái phân bố 1.1.4 Giá trị Khổ Sâm cho 1.2 Tổng quan ADN mã vạch 1.2.1 Lịch sử phát triển ADN mã vạch (DNA barcode) 1.2.2 Khái niệm ADN mã vạch 1.2.2 Ứng dụng lợi ích ADN mã vạch 1.2.3 Các đặc điểm ADN mã vạch 1.3 Một số mã vạch ADN đƣợc sử dụng phổ biến tình hình nghiên cứu 1.3.1 Mã vạch ADN động vật 1.3.2 Mã vạch thực vật 1.3.1 Hiện trạng mã vạch thực vật 14 1.4 Những nghiên cứu ứng dụng ADN mã vạch giám định loài 15 1.4.1 Trên giới 15 1.4.2 Ở Việt Nam 17 CHƢƠNG 2.MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 21 ii 2.2 Nội dung nghiên cứu 21 2.3 Địa điểm nghiên cứu 21 2.4 Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 21 2.4.1 Vật liệu nghiên cứu 21 2.4.2 Hóa chất 22 2.4.3 Các thiết bị dùng nghiên cứu 23 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.5.1 Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số 23 2.5.2 Phƣơng pháp PCR với mồi đặc hiệu 24 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Kết tách ADN tổng số 28 3.2 Kết PCR nhân gen với mồi đặc hiệu 29 3.2.1 Kết PCR nhân gen trnL- trnF 29 3.2.2 Kết PCR nhân gen rpoB 30 3.3 Kết giải trình tự nucleotit đoạn gen rpoB gen trnL-trnF 30 3.3.1 Kết giải trình tự phân tích đoạn gen rpoB 30 3.3.2 Kết giải trình tự đoạn gen trnL-trnF 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt AFLP Bp Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Amplified Fragments Length Polymorphism Đa hình độ dài đoạn khếch đại Base pair Cặp bazơ nitơ DNA sợi đôi đƣợc tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc cDNA Complementary DNA DNA Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleic Axit (DNA) EDTA Ethylene diamine tetraa acid cetic Etylen diamin tetraxetic Axit Internal transcribed space Vùng gen ITS matK maturase Gen matK mRNA Messenger RNA ARN thông tin NADP Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Coenzym đƣợc sử dụng phản ứng đồng hóa Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase ITS matK PCR RAPD RADNom Amplification of Đa hình DNA nhân ngẫu Polymorphic DNA nhiên RNA Ribonucleic acid Ribonucleic Axit rRNA RNA ribosome riboxom RNA SSR Simple Sequence Repeats Đa hình đoạn lặp lại đơn giản Phản ứng chuỗi polimer hóa NCBI Polymerase Center for Biotechnology Information TAE Tris- Acetic- EDTA UV Untraviolet Tia cực tím iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần đệm chiết ADN tổng số 22 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR 24 Bảng 2.3 Chu trình phản ứng PCR nhân gen trnL-trnF 25 Bảng 2.4 Chu trình phản ứng PCR nhân gen rpoB 25 Bảng 2.5 Trình tự thơng tin cặp mồi 25 Bàng 3.1 Mức độ tƣơng đồng trình tự gen rpoB phân lập đƣợc từ Khơ sâm so sánh với trình tự Ngân hàng gen NCBI 32 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Khổ sâm cho (nguồn: thaythuocvietnam.vn) Hình 3.1: Kết điện di ADN tổng số tách chiết từ mẫu Khổ sâm 28 Hình 3.2: Kết điện di sản phẩm PCR nhân gen trnL-trnF 29 Hình 3.3: Kết PCR nhân gen rpoB 30 Hình 3.4 Blast trình tự đoạn gen rpoB phân lập đƣợc từ Khổ sâm với lồi có trình tự gen cơng bố Ngân hàng gen NCBI 31 Hình 3.5 So sánh trình tự gen rpoB phân lập đƣợc từ Khổ sâm với trình tự cơng bố Ngân hàng gen quốc tế NCBI 33 Hình 3.6: Cây phát sinh dựa trình tự gen rpoB 33 Hình 3.7 Blast trình tự đoạn gen trnL-trnF phân lập đƣợc từ Khổ sâm với lồi có trình tự gen công bố Ngân hàng gen NCBI 34 Hình 3.8 So sánh trình tự gen trnL-trnF phân lập đƣợc từ Khổ sâm với trình tự cơng bố Ngân hàng gen quốc tế NCBI 35 Hình 3.9 Cây phát sinh dựa đoạn gen trnL-trnF 36 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Khổ sâm hay giân gian đƣợc gọi Khổ sâm, Cù đèn Co chạy đón (dân tộc Thái) Đây loại thực vật họ Thầu dầu Khổ sâm phân bố nƣớc châu Á nhƣ: Hàn Quốc, Trung Quốc, Ấn Độ vùng Thái Bình Dƣơng; Việt Nam Sa Pa địa phƣơng có lồi nhiều Từ cổ xƣa ngƣời dân thƣờng dùng Khổ sâm (tƣơi phơi khô) sắc lấy nƣớc uống để trị ung nhọt, kiết lị, bệnh đƣờng tiêu hóa nhƣ đầy bụng, kiết lị, viêm loét dày, v.v Đặc biệt phải thu hoạch vào lúc hoa tốt Cịn y học đại theo nhà khoa học, Khổ sâm có tác dụng nhiệt tiêu độc, sát khuẩn, v.v nên có hiệu tốt với ngƣời bị bệnh đƣờng tiêu hóa, đặc biệt viêm hang vị, nhi m khuẩn Đi sâu nghiên cứu, nhà khoa học tìm thành phần hoá học Khổ sâm gồm số hoạt chất Flavonoid, alcaloid, tanin, polyphenol, v.v Sử dụng Khổ sâm viêm hang vị giúp ngƣời bệnh giảm triệu chứng khó tiêu, ổn định tiêu hóa Hiện nay, có nhiều nghiên cứu hoạt tính sinh học loài Khổ sâm nghiên cứu nói tác dụng kháng ung thƣ chiết xuất từ Khổ sâm Vì loại thuốc có giá trị nên cần thiết xây dựng ADN mã vạch cho loài nhằm cung cấp sở khoa học phân tử để định danh loài phục vụ cho việc bảo tồn phát triển loài Khổ sâm ADN mã vạch (DNA barcode) phƣơng pháp định danh giám định loài dựa trình tự ADN ngắn vùng chuẩn hóa ADN hệ gen (Hebert cs, 2003) Ở thực vật, việc nghiên cứu truy tìm vùng ADN hệ gen thích hợp đƣợc chứng minh khó khăn so với động vật nhiều Tuy nhiên, qua nghiên cứu thấy có vài vùng gen hệ gen lục lạp nhƣ rbcL, matK, v.v hay vùng đệm chép (internal transcribed spacer – ITS) đƣợc sử dụng việc xác định đoạn mã vạch ADN thực vật phục vụ cho mục đích khác Xuất phát từ lý tiến hành đề tài “Nghiên cứu xây dựng sở liệu ADN mã vạch cho loài Khổ sâm (Croton tonkinensis Gagnep) đến từ Việt Nam phục vụ giám định lồi” nhằm góp phần cung cấp thơng tin sở liệu cho việc xác định xác loài cấp độ phân tử CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Khổ sâm 1.1.1 Giới thiệu Khổ sâm Khổ Sâm loại dƣợc liệu quý nhiều thuốc chữa trị y học đông y Tác dụng Khổ sâm chữa đƣợc nhiều bệnh, có nhiều lồi bệnh khó chữa mà đến y học đại chƣa điều trị đƣợc Có loại Khổ sâm là: lồi Khổ sâm cho r loài Khổ sâm cho Trong nghiên cứu này, chúng tơi phân tích trình tự ADN mã vạch cho loài Khổ sâm cho Đặc điểm nhận dạng Khổ sâm cho lá: Tên tiếng Việt: Khổ sâm cho lá, Khổ sâm, Cù đèn, Co chạy đón (dân tộc Thái) croton du Tonkien, croton du Nord Vietnam (Pháp) Cây Khô sâm cho có tên khoa học Croton tonkinensis Gagnep thuộc Sapindales, họ thầu dầu Euphorbiaceae, chi Brucea, loài B tonkinensis Hình 1.1: Croton tonkinemsis (nguồn: thaythuocvietnam.vn) 1.1.2 Đặc điểm hình thái Cây Khổ sâm nhỏ cao khoảng 1- 1,5 m, mọc cách so le có tụ họp 3- nhƣ kiểu mọc vòng, hai mặt có nhiều lơng hình khiên óng ánh nhƣ nhót, phủ dầy mặt dƣới; phiến hình giáo dài - cm, rộng 1-3cm, chóp nhọn dài hình thành mũi nhọn mép khun Khi phơi khơ mặt dƣới có màu trắng bạc, mặt có màu nâu đen Cụm hoa mọc kẽ hay đầu cành, hoa có màu trắng hoa lƣỡng tính đơn tính Hoa đực có đài 12 nhị, hóa có đài vòi nhụy Quả gồm mảnh vỏ màu đỏ có long trắng Hạt hình trứng, có mỏ, màu nâu Mùa hoa quả: tháng - 1.1.3 Đặc điểm sinh thái phân bố Đặc điểm sinh thái: Cây đƣợc trồng khắp nơi vƣờn gia đình vƣờn thuốc chủ yếu tỉnh phía bắc Việt Nam Thƣờng trồng cách deo hạt hay trồng cành vào mùa xuân Cây ƣa sang ƣa đất tốt, tái sinh chồi tốt tái sinh hạt Phân bố: Khổ sâm mọc hầu hết tỉnh phía Bắc Việt Nam nhƣ Tuyên Quang Vĩnh Phúc Phú Thọ, Hà Nội Nghệ An, Thanh Hóa 1.1.4 Giá trị Khổ Sâm cho Bộ phận đƣợc dùng làm thuốc lá; có hợp chất flavoniod, alkaloid, tamin, polyphenol Khổ sâm vị đắng tính hàn quy kinh: Tâm Phế Thận Đại tràng có tác dụng: nhiệt táo thấp khu phong sát trùng lợi niệu chủ trị chứng hoàng đản tả lỵ bạch đới tiểu tiện khó ngứa ngồi da phong hủi thƣờng dùng làm thuốc bổ đắng thuốc lợi niệu thuốc dùng Theo y học đại Khổ sâm có tác dụng: - Chống rối loạn nhịp tim (do matrin kurarinon) làm tăng lƣu lƣợng máu động mạch vành chống thiếu máu tim làm hạ lipid máu chống xơ vữa động mạch - Chống phóng xạ phòng trị đƣợc chứng bạch cầu giảm - Làm giảm hen suy n loại bỏ đờm Lợi niệu chống viêm chống oxy hóa chống dị ứng (do nhóm quinolon) làm giảm đau - Kháng khuẩn: ức chế trực khuẩn lỵ liên cầu khuẩn B tụ cầu vàng loại nấm da - Chống ung thƣ hoạt động mi n dịch polysaccharid (SFPW1) có Khổ sâm - Hiện có số cơng trình nghiên cứu phát có mặt nhiều ent- kauran Ditecpenoit – loại chất có tác dụng chống ung thƣ chống viêm từ Khổ sâm có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học đáng quan tâm 1.2 Tổng quan ADN mã vạch 1.2.1 Lịch sử phát triển ADN mã vạch (DNA barcode) Mã vạch sản phẩm tiêu dùng dải mã nhỏ nhƣng giúp truy xuất thông tin sản phẩm vƣới độ xác gần nhƣ tuyệt đối Trong khoa học, sống tồn khái niệm tƣơng tự - mã vạch ADN đƣợc xây dựng từ vật chất sống ADN Khái niệm mã vạch ADN đƣợc biết đến rộng rãi từ năm đầu kỉ 21, nhà khoa học Canada trình bày nghiên cứu sử dụng đoạn gen dà 648 nucleotid từ gen ti thể - gọi Cod1 – để dám định 260 loài chim đề xuất dùng nhƣ “mã vạch” để lƣu trữ, chuẩn hóa thơng tin lồi động vật Việc sử dụng ADN nghiên cứu định lồi khơng phải ý tƣởng mới, loài ngƣời biết đến ADN từ năm 1953 Đột phá mã vạch ADN nằm tính chuẩn hóa đồng Nghĩa với lồi sinh vật bất kì, cần giải mã vạch đoạn gen Co1 (hoặc số lƣợng gen tít xác định trƣớc), so sánh với thƣ viện ADN có xác định danh tính lồi xác định lồi 1.2.2 Khái niệm ADN mã vạch ADN mã vạch trình tự nucleotide chuỗi ADN ngắn gen biết có vùng bị thay đổi (rất ổn định) có vùng d thay đổi q tình tiến hóa Dựa vào mức độ thay đổi trình tự ADN để đánh giá sai khác di truyền sinh vật (Nguy n Đức Lƣợng, 2002) 2.5.3 Phương pháp điện di Nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc nucleic acid đại phân tử tích điện âm đồng khắp bề mặt nên chịu tác động dòng điện chiều dung dịch đệm dẫn điện chúng di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng Tốc độ di chuyển phân tử ADN dòng điện phụ thuộc vào khối lƣợng kích thƣớc, cấu trúc chúng Các phân tử có khối lƣợng kích thƣớc nhỏ di chuyển nhanh cực dƣơng Do dó dựa vào vị trí phân đoạn ADN thu đƣợc gel sau điện di xác định nhƣ so sánh đƣợc kích thƣớc chúng với thang ADN chuẩn (ADN marker) • Pha gel 1% nhƣ sau: cân 1,0g agarose cho vào bình chứa (nếu pha gel 1,5% cân 1,5g), bổ sung đệm TAE 1X đến đạt thể tích 100 ml, cho vào lị vi sóng đun đến gel tan hồn tồn Để nguội đến 600C bổ sung µl Redsafe 20000x • Đúc gel: Cho gel vào khn cho gel ngập lƣợc khoảng 3mm đợi đến gel nguội hoàn toàn đặt gel vào bể điện di • Tra ADN: - Nếu ADN tổng số lấy 5µl ADN trộn với 1µl Loading dye 6X, mix tra vào giếng - Nếu ADN sản phẩm PCR lấy µl tra vào giếng • Sau chạy điện di xong lấy gel quan sát dƣới đèn UV chụp ảnh nhận xét kết 2.5.4 Phương pháp tinh sản phẩm PCR giải trình tự Những sản phẩm PCR sau đƣợc khuếch đại thành công đƣợc tinh kit Purification KIT hãng Norgen, Canada sản xuất Các bƣớc tinh nhƣ sau: Bƣớc 1: Thêm tỉ lệ thể tích 1:5 Binding solution vào ống chứa sản phẩm PCR ( thể tích sản phẩm PCR cần thể tích Binding solution) sau trộn 26 Bƣớc 2: Chuyển tối đa 750µl dung dịch thu đƣợc từ bƣớc 1sang cột lọc collection tube Ly tâm với 10000 vòng/ phút 30 giây Loại bỏ dung dịch lọc qua cột Lƣu ý: Nếu dung dịch thu đƣợc từ bƣớc nhiều 750µl lặp lại bƣớc hết dịch Bƣớc 3: Thêm 500µl Washing solution vào cột lọc, ly tâm 10000 vòng/ phút phút Bỏ dịch lọc qua cột Bƣớc 4: Lặp lại bƣớc 3, ly tâm 12000 vịng/ phút phút để loại bỏ hồn tồn dịch Bƣớc 5: Lắp cột vào ống 1,5 ml Thêm 50µl Elution buffer vào trung tâm màng cột collection tube để nhiệt độ phịng phút sau ly tâm vòng phút 12000 vòng/ phút Sản phẩm PCR đƣợc tinh đƣa xác định trình tự nucleotid phịng thí nghiệm 1st BASE DNA, Malaysia Trình tự nucleotide đƣợc đọc máy ABI PRISM®3730xl ADN Anakyzer (ABI, Foster City, CA, USA) 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tách ADN tổng số ADN tổng số đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp CTAB Sahai Maroof cs (1984) nhƣ mô tả mục 2.5.1 chứng tỏ quy trình có hiệu để tách chiết DNA tổng số từ Khổ sâm DNA tổng số sau tách chiết đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 1% Kết đƣợc thể hình 3.1 qq KS1 KS2 KS3 Hình 3.1: Kết điện di ADN tổng số tách chiết từ mẫu Khổ sâm Ghi chú: Giếng từ đến Kí hiệu KS1, KS2, KS3 Chất lƣợng ADN tổng số (độ độ nguyên vẹn) sau tách chiết từ mẫu nghiên cứu có ảnh hƣởng nhiều đến kết phân tích ADN kĩ thuật sinh học phân tử đặc biệt phản ứng PCR Kết thu đƣợc hình 3.1 cho thấy băng ADN tổng số có kích thƣớc lớn băng sáng gọn bị gãy đứt chứng tỏ hàm lƣợng ADN mẫu cao (khơng lẫn protein polysaccharide), bên cạnh băng có độ sáng tƣơng đƣơng chứng tỏ mẫu có nồng độ tƣơng đối đồng Những đặc điểm cho thấy phƣơng pháp chiết sử dụng nghiên cứu phù hợp với đối tƣợng Khổ sâm ADN tổng số có độ tinh cao đáp ứng đƣợc yêu cầu phục vụ cho thí nghiệm 28 3.2 Kết PCR nhân gen với mồi đặc hiệu Sau tách đƣợc ADN tổng số, mẫu ADN đƣợc dùng làm khuôn để nhân đoạn gen trnL-trnF, rpoB kĩ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu có trình tự nucleotide nhƣ mô tả bảng 2.5 Sau thực phản ứng PCR thu đƣợc kết nhƣ sau: 3.2.1 Kết PCR nhân gen trnL- trnF Thành phần điều kiện phản ứng PCR đƣợc mô tả phần phƣơng pháp (mục 2.5.3, bảng 2.2 2.3), sản phẩm PCR mẫu đƣợc tiến hành điện di gel agarose 1,5% Kết điện di đƣợc thể hình 3.2: KS KS KS3 1000bp Hình 3.2: Kết điện di sản phẩm PCR nhân gen trnL-trnF Ghi chú: M marker 1000 bp, giếng từ 1,2,3 tương ứng với mẫu Khổ sâm nghiên cứu Kết PCR gen trnL-trnF cho thấy đoạn gen nhân đƣợc có kích thƣớc khoảng 1100 bp Tất mẫu nghiên cứu xuất băng đặc hiệu khơng có băng phụ độ sáng tƣơng đƣơng chứng tỏ nồng độ ADN thu đƣợc sau phản ứng PCR tƣơng đối đồng Sản phẩm PCR mang giải trình tự gen trực tiếp 29 3.2.2 Kết PCR nhân gen rpoB M 500bp Hình 3.3: Kết PCR nhân gen rpoB Ghi chú: M marker 1000 bp, giếng từ 1,2,3 tương ứng với mẫu Khổ sâm nghiên cứu Kết nhân gen rpoB kĩ thuật PCR với mồi đặc hiệu cho thấy mẫu xuất băng có kích thƣớc khoảng 500 bp so với với thang marker 1000 bp Các băng thu đƣợc sáng, gọn sử dụng cho thí nghiệm giải trình tự gen trực tiếp 3.3 Kết giải trình tự nucleotit đoạn gen rpoB gen trnL-trnF 3.3.1 Kết giải trình tự phân tích đoạn gen rpoB Kết giải trình tự đoạn gen rpoB phân lập từ mẫu Khổ sâm (KS1, KS2 KS3) máy tự động, cho thấy đoạn gen rpoB thu đƣợc từ mẫu sử dụng nghiên cứu có kích thƣớc 517 bp có độ tƣơng đồng100% Kết trình tự gen rpoB Khổ sâm nghiên cứu nhƣ sau: TTTAAGTGCATTGTTGGAACTGGATTGGAACGCCAAGTGGCTCTAGATTCCGG AGTTCCTGCTATAGCCGAACACGAGGGAAAGATAATTTATACCGATATTGACA AAATCATTTTATCGGGTAATGGAGATACTCTACACATTCCATTAGTTATATAT CAACGTTCCAACAAAAATACTTGTATGCATCAAAAAACCCAGGTTCAGCGGGG TAAATGCATTAAAAAGGGACAAGTTTTAGCGGATGGTGCCGCTACAGTTGGTG GCGAACTCGCCTTGGGCAAAAACGTATTAGTGGCTTATATGCCGTGGGAGGGT TACAATTTTGAGGATGCGGTACTCATTAGCGAACGTCTGGTATATGAAGATAT TTATACTTCTTTTCACATACGGAAATATGAAATTCAGACTCATGTGACAAGCC AAGGACCTGAAAAGATCACTAACAAAATACCGCATCTAGAAACTCATTTACTC CGAAATTTAGACAAAAGTGGAATTGTGATGCTGGGATCAA 30 Từ tƣơng đồng trình tự, chúng tơi nhận thấy khơng có khác cấp độ cá thể loài Khổ sâm Do chúng tơi lấy trình tự đại diện cho loài để tiếp tục phân tích So sánh khác biệt cấp độ lồi theo đoạn gen rpoB Khổ sâm nghiên cứu với trình tự cơng bố Ngân hàng gen quốc tế cho thấy gen rpoB phân lập từ Khổ sâm có độ tƣơng đồng cao với loài thuộc chi Croton từ 98 63% đến 99,02% với lồi thuộc chi khác thấp (Hình 3.4) Hình 3.4 Blast trình tự đoạn gen rpoB phân lập đƣợc từ Khổ sâm với lồi có trình tự gen cơng bố Ngân hàng gen NCBI Sau xử lý trình tự phần mềm Bioedit đối chiếu với thông tin ngân hàng gen NCBI, so sánh MUSCLE, chọn trình tự có độ tƣơng đồng cao để so sánh Mã số đƣợc thể dƣới bảng sau: 31 Bàng 3.1 Mức độ tƣơng đồng trình tự gen rpoB phân lập đƣợc từ Khô sâm so sánh với trình tự Ngân hàng gen NCBI STT Tên loài Mã số Ngân hàng NCBI Mức độ tƣơng đồng (%) Croton tiglium NC_040113.1 99,02% Croton tiglium MH394334.1 99,02% Croton texensis KT458340.1 98,63 % Jatropha curcas FJ695500.1 96,66% Vernicia fordii KY628420.1 95,31% Kết so sánh trình tự nucleotit thu đƣợc nhƣ hình 3.5 32 Hình 3.5 So sánh trình tự gen rpoB phân lập đƣợc từ Khổ sâm với trình tự cơng bố Ngân hàng gen quốc tế NCBI Từ kết so sánh trên, sử dụng phƣơng pháp Neighbor-joing MUSCLE để xây dựng quan hệ di truyền loài Khổ sâm nghiên cứu lồi có độ tƣơng đồng cao với gen rpoB vừa nhận đƣợc Kết phát sinh thu đƣợc nhƣ sau: Hình 3.6: Cây phát sinh dựa trình tự gen rpoB Từ phát sinh ta thấy loài Khổ sâm (Croton tonkinensis) nghiên cứu đƣợc phân nằm nhóm với lồi thuộc chi Croton (Croton tiglium, Croton texensis) 3.3.2 Kết giải trình tự đoạn gen trnL-trnF Phân tích kết giải trình tự đoạn gen trnL-trnF phân lập từ mẫu Khổ Sâm (KS1, KS2 KS3) máy tự động cho thấy đoạn gen trnL-trnF có kích thƣớc 890 bp so sanh trình tƣ mẫu nghiên cứu có độ tƣơng đồng tuyệt đối 100% Kết xử lý trình tự phần mềm Bioedit nhƣ sau: CGCTACGGACTTAATTGGATTGAGCCTTGGTATGGAAACTTACTAAGTGATAACTTTCAAAT TCAGTGAAACCCTGGAATTAAAAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCTGTTTTCCAAAAACAA ATAAAGGTTCAAAAAGACAGAATAATAAAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTG TTCTAACAAATGGAGTTGACTGCGTTGCATTAGTAAAGTAAAGAAATCTTTCCGTTAAAACT CCAGAAAGGATAAAGTAAAGGATAACTCTATATTCATACGTATTCGTATTGAAATACTATCT CAAATGATTAATTATTAATTAATAGGGCCCGAATCAAGATTTTTTTATCTTTCTATGAAAAA 33 TGAAATAAAAAAAAATTGTTTTGAATCGATTCCAAGTTCAAGAACGGATTGAATTTGAATTG ATCAAATCATTCACTCCATAGTCTGATAGATAACCGATTAATCGGACAAGAATAAAGATAGA GTCCCGTTCTACATGTCAATATCGACAACAAGGAAATTTATAGTAAGAGGAAAATCCGTCGA CTTTCAAAATCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCCCCAAAAAAAGAAAAAAAGAAAAAAAGG GTTCGCTCGAATCCCTAATTTTTTTATCCTATTCTATTTTCTCTTTTTGTTAACGGTTCCAA TTTCGTTATCTTTCTGATTCATTCGATTCTTTCACAAACATATCCAGACTGAATTTCTTTTC ACAAGTCTTGTCATAGATGTGATAGATATGATACACATACAAATAAATAAACATCTTTGAGC AAAACAAAAGCGTGGAATCCCCATTGAAAATTGGAATGATTAACAATCCAAACCATTATTCA AACTAAAAATTACAAAGTCGTA Từ tƣơng đồng trình tự, chúng tơi nhận thấy khơng có khác cấp độ cá thể loài Khổ sâm Do tơi lấy trình tự đại diện cho lồi để tiếp tục phân tích Blast trình tự đoạn gen trnL-trnF phân lập đƣợc từ Khổ sâm nghiên cứu với trình tự cơng bố Ngân hàng gen quốc tế NCBI cho thấy có mức độ tƣơng đồng cao khoảng 97% đến 98% (Hình 3.7) Hình 3.7 Blast trình tự đoạn gen trnL-trnF phân lập đƣợc từ Khổ sâm với loài có trình tự gen cơng bố Ngân hàng gen NCBI Dựa vào kết so sánh sơ nhƣ xây dựng quan hệ loài Khổ sâm nghiên cứu với loài với mã số gen đƣợc công bố ngân hàng gen NCBI, kết nhƣ hình 3.8 34 Hình 3.8 So sánh trình tự gen trnL-trnF phân lập đƣợc từ Khổ sâm với trình tự cơng bố Ngân hàng gen quốc tế NCBI 35 Từ kết so sánh trình tự nucleotide đoạn gen trnL-trnF mẫu Khổ sâm với loài nhƣ sử dụng phƣơng pháp Neighbor-joing xây dựng đƣợc quan hệ di truyền thể hình 3.9 dƣới đây: Hình 3.9 Cây phát sinh dựa đoạn gen trnL-trnF Từ phát sinh ta thấy loài Khổ sâm (Croton tonkinensis) nghiên cứu đƣợc phân nằm nhóm với loài Croton kongensis 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1) Đã tách chiết đƣợc ADN tổng số mẫu Khổ sâm nhân thành công đoạn gen rpoB trnL-trnF; đoạn gen rpoB có kích thƣớc 517 bp đoạn gen trnL-trnF có kích thƣớc 890 bp So sánh trình tự đoạn gen rpoB trnLtrnF mẫu nghiên cứu có mức độ tƣơng đồng 100% 2) Đoạn gen rpoB phân lập từ Khổ sâm (Croton tonkinensis) có mức độ tƣơng đồng cao (từ 98 63% đến 99,02%) so với trình tự gen rpoB lồi thuộc chi Croton cơng bố Ngân hàng gen Quốc tế NCBI 3) So sánh đoạn gen trnL-trnF phân lập từ Khổ sâm (Croton tonkinensis) có mức độ tƣơng đồng cao (từ 97% đến 98%) so với trình tự gen trnL-trnF lồi thuộc chi Croton công bố Ngân hàng gen Quốc tế NCBI 4) Đã xây dựng đƣợc phát sinh lồi Khổ sâm dựa đoạn trình tự gen rpoB trnL-trnF với trình tự gen cơng bố NCBI; cho thấy loài Khổ sâm nghiên cứu nằm nhánh với loài Croton tiglium, Croton texensis Croton kongensis Kiến nghị - Tiếp tục giải trình tự đoạn gen matK, rbcL, psbA-trnH đối tƣợng nghiên cứu để đánh giá mức độ hiệu gen việc giám định loài truy xuất nguồn gốc - Nghiên cứu ứng dụng mã vạch ADN gen rpoB trnL-trnF để định danh loài Khổ sâm (Croton tonkinensis) 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tiếng Việt Trƣơng Quốc Ánh (19 tháng 10 năm 2014) “Mã vạch ADN (DNA bacrcode) hƣớng nghiên cứu ứng dụng Việt Nam” Viện khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam Nguy n Văn Đạt, Trần Thị Phƣơng Anh (2013) Bƣớc đầu nghiên cứu xây dựng khóa khóa định loại họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Việt Nam Hội Nghị khoa học toàn quốc Sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 5: 44-51 Lê Thị Thu Huyền Hugo Be Boer Vincent Manzanilla Hà Văn Huân Nông Văn Hải (2016) “ Giải mã hệ gen thực vật loài thuộc chi nhân sâm ( PANAX L.) Hà Văn Huân (13 tháng 12 năm 2015) “ Nghiên cứu ứng dụng thị phân tử ADN ( mã vạch ADN ) phân tích đa dạng di truyền giám định sinh vật Việt Nam” Hà Văn Huân Nguy n Văn Phong (2015) “ Xác định mã vạch cho Trà hoa vàng Tam Đảo (camellia tamdaoensis)” Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, số 5/2015, trang 123-124 Đinh Hoàng Long Đỗ Lê Thăng (2008) “Cơ sở di truyền học phân tử tế bào” NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguy n Đức Lƣợng (2002), Công nghệ gen, NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Lê Đình Lƣơng Quyền Đình Thi (2004) Kỹ thuật di truyền ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguy n Thị Thanh Nga (2012) “Đánh giá đa dạng di truyền số loài dƣợc liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp) kỹ thuật ADN mã vạch” luận văn Th.sĩ 10 Nguy n Hoàng Nghĩa (1999) Bảo tồn đa dạng sinh học, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 11 Phan Tống Sơn cộng (2005) “Nghiên cứu quy trình chiết tách ENTKAURAN DITECPENOIT có tác dụng chống ung thƣ chống viêm từ Khổ sâm” 12 PGS.TS Khuất Hữu Thanh (2006) Kĩ thuật gen nguyên lí ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội 38 13 Bùi Văn Thắng, Nguy n Thị Hải Hà Vũ Quang Nam Nguy n Thế Đại, Phan Văn Quynh Nguy n Ngọc Ánh (2017) “Giám định số lồi Nƣa hóa dẫn liệu hình thái phân tử” Tạp chí Khoa học công nghệ giống trồng, số 14 Nguy n Văn Thoan Trần Thị Thu Hiền, Nguy n Duy Thuần Phƣơng Thiện Thƣơng (2016): “ Tác dụng chống viêm cấp mạn hợp chất ent- 7βhydroxyl- 15- oxokaur- 16- en- 18- yl acetate từ Khổ sâm cho lá, Tạp chí khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dƣợc, Tập 32, Số 2(2016) 26-31 15 Nguy n Thị Phƣơng Trang Lê Thanh Sơn Nguy n Giang Sơn Phan Kế Long (2011) Phát loài sâm Panax sp (Araliaceae) Việt Nam Tạp chí Dƣợc học, 10: 59- 63 B Tiếng Anh 16 Brozynska M, Furtado A, Henry RJ (2014) Direct chloroplast sequencing: Comparison of sequencing platforms ADN analysis tools for whole chloroplast barcoding PLOS One 9(10): e110387 DOI:10.1371/journal.pone.0110387 17 Chen S, Luo H, Li Y, Sun Y, Wu Q, Niu Y, Song J, Lv A, Zhu Y, Sun C, Steinmetz A, Qian Z (2011) 454 EST analysis detects genes putatively involved in ginsenoside biosynthesis in Panax ginseng Plant Cell Rep 30(9): 1593-1601 18 Dong W, Liu H, Xu C, Zuo Y, Chen Z, Zhou S (2014) A chloroplast genome strategy for designing taxon specific DNA mini-barcodes: a case study on ginsengs BMC Genetics 15: 138 19 Ha WY, Shaw PC, Liu J, Yau FC, Wang J (2002) Authentication of Panax ginseng ADN Panax quinquefolius using amplified fragment length polymorphism (AFLP) ADN directed amplification of minisatellite region DNA (DAMD) J Agric Food Chem 50(7): 1871-1875 20 Hamilton M.B (1999) “Four primer pairs for the aplification of chloroplast intergenic religions with intraspecific varation” Molecular Ecology, 8, pp 51321 Joey Shaw, Edgar B Lickey, Edward E Schilling, ADN RADNall L Small (2007) “Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms: the tortoise an the hare III” American Journal of botany, 94, pp.275-288 39 22 Nerea Larranaga ADN José L Hormaza (2015) “DNA barcoding of perennial fruit tree species of agronomic interest in the genus Annona ( Annonaceae) 23 Pang X, Song J, Zhu Y, Xie C Chen S (2010), Using DNA barcoding to identify species within Euphorbiaceae, Planta Med, doi: 10 1055/s- 00301249806 Epub 2010 Apr 24 Luo H, Sun C, Sun Y, Wu Q, Li Y, Song J, Niu Y, Cheng X, Xu H, Li C, Liu J, Steinmetz A, Chen S (2011) Analysis of the transcriptome of Panax notoginseng root uncovers putative triterpene saponin-biosynthetic genes ADN genetic markers BMC Genomics 12 Suppl 5: S5 25 Shaw PC, But PPH (2007) Authentication of Panax species ADN their adulterants by rADNom-primed polymerase chain reaction Planta Med 61: 466-469 26 Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005) Use of DNA barcodes to identify flowering plants Proc Natl Acad Sci USA 102(23): 8369-8374 27 Xiaohui Pang, Jingyuan Song, Yingjie Zhu (2011), “Applying plant DNA barcodes for Rosaceae species identification” Cladistics, 27(2), 165 – 170 28 Zhang J, Yang W, Cui X, Yu H, Jin H, Chen Z, Shen T (2011) Breeding strains of Panax notoginseng by using ESTSSR markers Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 36(2): 97-101 29 http:// www.barcoding life.org 30 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20379956 40