Xác định adn mã vạch của loài sói rừng (sarcandra glabra (thunb ) nakai)

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hƣớng dẫn ThS Nguyễn Thị Thơ, tận tình hƣớng dẫn, bảo suốt trình thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp giúp đỡ, bảo tận tình cho em khơng q trình làm khóa luận mà q trình học tập, bồi dƣỡng Trƣờng Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ngƣời thân động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuân lợi trình học tập, sinh hoạt, làm nghiên cứu khoa học hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp Vì điều kiện thời gian, khả thân cịn có hạn chế nên Khóa luận tốt nghiệp cịn có thiếu sót, em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp q báu thầy giáo, nhà khoa học nhƣ bạn sinh viên để khóa luận em đƣợc hoàn thiện Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên Trần Minh Đức i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Sói rừng 1.1.1 Phân loại học 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Đặc điểm hình thái Sói rừng 1.1.4 Thành phần hóa học Sói rừng 1.1.5 Tác dụng sinh học Sói rừng 1.2 Tổng quan ADN mã vạch (DNA barcode) 1.2.1 Giới thiệu ADN mã vạch 1.2.2 Đặc điểm trình tự mã vạch 1.3 Những locus đƣợc sử dụng phƣơng pháp ADN mã vạch thực vật 10 1.3.1 Trình tự gen nhân 10 1.3.2 Trình tự gen luc lạp 10 1.3.3 Trình tự gen rbcL 12 1.3.4 Trình tự gen matK 12 1.3.5 Trình tự gen ycf5 13 1.3.6 Trình tự gen rpoB rpoC1 13 1.3.7 Trình tự hai gen trnH-psbA 13 1.3.8 Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA) 14 1.3.9 Vùng gen mã hóa ribosome 14 1.4 Ứng dụng mã vạch ADN 15 1.4.1 Ứng dụng thực vật nói chung 15 1.4.2 Ứng dụng mã vạch ADN nhận biết dƣợc liệu 15 ii 1.4.3 Những ứng dụng quan trọng khác mã vạch ADN 17 1.5 Những thành tựu nghiên cứu ADN mã vạch thực vật 18 1.5.1 Những thành tựu nghiên cứu Việt Nam 18 1.5.2 Những thành tựu nghiên cứu giới 20 1.5.3 Nghiên cứu phân tử chi Sarcandra 23 CHƢƠNG MỤC TIÊU, VẬT LIỆU, NỘI DUNG, VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 26 2.2 Nội dung nghiên cứu 26 2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 26 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 26 2.3.2 Hóa chất 26 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.4.1 Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số 27 2.4.2 Phƣơng pháp điện di kiểm tra sản phẩm ADN sau tách chiết 28 2.4.3 Phƣơng pháp PCR với mồi đặc hiệu 29 2.4.4 Phƣơng pháp tinh sản phẩm PCR 30 2.4.5 Phƣơng pháp giải trình tự 31 2.4.6 Phƣơng pháp phân tích số liệu 31 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Tách chiết ADN tổng số 32 3.2 Kết nhân vùng gen nghiên cứu kỹ thuật PCR 33 3.2.1 Kết nhân đoạn gen matK 33 3.2.2 Kết nhân đoạn gen rbcL 34 3.2.3 Kết nhân đoạn gen trnH-psbA 34 3.2.4 Kết nhân đoạn gen ITS2 35 3.3 Kết phân tích trình tự gen 36 3.3.1 Kết so sánh trình tự gen matK 36 3.3.2 Kết so sánh trình tự gen rbcL 39 3.3.3 Kết so sánh trình tự gen trnH-psbA 42 iii 3.3.4 Kết so sánh trình tự gen ITS2 44 3.4 Kết so sánh khả phân biệt đoạn trình tự gen matK, rbcL, ITS2 trnH-psbA 47 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Tồn 48 4.3 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Các từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt bp Cặp base CBOL Consortium for the Barcode of Life cpDNA gen lục lạp Cytb Cytochrome b DNA (ADN) Axit deoxyribonucleic EDTA axit ethylenediamine tetraacetic F-Primer Mồi xuôi IGS vùng liên gen ITS vùng DNA nằm gen kb 1000 cặp base NCBI Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ sinh học PCR Phản ứng chuỗi polymerase PVP Polyvinyl pyrrolidone R- Primer Mồi ngƣợc RAPD Sự khuếch đại ngẫu nhiên DNA đa hình RFLP Phân tích đa hình trình tự DNA RNA Axit ribonucleic rRNA ARN ribosome SR01 Mẫu Sói rừng 01 TAE Tris-Acetate-EDTA tRNA ARN vận chuyển UV Tia cực tím v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần nồng độ chất sử dụng phản ứng PCR 29 Bảng 2.2: Trình tự thơng tin cặp mồi 29 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR mồi ITS2 29 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR mồi matK, rbcL, trnH- psbA 30 Bảng 3.1 Một số lồi có trình tự gen matK tƣơng đồng với trình tự gen matK mẫu SR01 ngân hàng gen NCBI 37 Bảng 3.2 Một số lồi có trình tự gen rbcL tƣơng đồng với trình tự rbcL mẫu SR01 ngân hàng gen NCBI 40 Bảng 3.3: Các vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen rbcL 41 Bảng 3.4 Trình tự gen trnH-psbA tƣơng đồng với trình tự gen trnH-psbA mẫu SR01 ngân hàng gen NCBI 43 Bảng 3.5: Một số lồi có trình tự gen ITS2 tƣơng đồng với trình tự gen ITS2 mẫu SR01 ngân hàng gen NCBI 44 Bảng 3.6: Các vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen vùng gen ITS2 45 Bảng 3.7: Bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự gen matK, rbcL ITS2 47 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Đặc điểm Sói rừng Hình 3.1: Kết ADN tổng số hai mẫu Sói rừng nghiên cứu 32 Hình 3.2: Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen matK 33 Hình 3.3: Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen rbcL 34 Hình 3.4: Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen trnH-psbA 34 Hình 3.5: Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen ITS2 35 Hình 3.6: So sánh trình tự SR01 MH939147.1,AJ581403.1, GU266593.1 đoạn gen matK 39 Hình 3.7: So sánh trình tự SR01 MH939147.1, L12663.2, AY236833.1 đoạn gen rbcL 41 Hình 3.8: Sự tƣơng đồng trình tự đoạn gen trnH-psbA mẫu SR01 với loài Sarcandra glabra 43 Hình 3.9: So sánh trình tự SR01 MG730169.1 , KJ137956.1, KJ137954.1 đoạn gen rbcL 45 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) lồi giàu dƣợc tính có khả chữa trị bệnh cảm mạo, viêm phổi, viêm ruột thừa, đau lƣng đặc biệt chữa trị số bệnh ung thƣ nhƣ ung thƣ tụy, ung thƣ dày, ung thƣ gan, ung thƣ trực tràng [2] Tuy nhiên năm gần thƣơng lái nƣớc đến thu mua nhiều với khai thác q mức khiến lồi Sói rừng đứng trƣớc nguy cạn kiệt [33] Ở Việt Nam nhiều thuốc quý đƣợc sử dụng làm nguyện liệu chế biến thuốc nhƣng bị khai thác mức dẫn đến giả mạo nguyên liệu thảo dƣợc trở thành vấn đề toàn cầu Các nguyên liệu thảo dƣợc thay loại thảo mộc khác có quan hệ họ hàng gần gũi.[34] Để phục vụ cho việc xác định loài dƣợc liệu, chủng loại vật liệu, kiểm nghiệm nguồn dƣợc liệu Một phƣơng pháp hữu hiệu sử dụng ADN mã vạch phƣơng pháp phục vụ định danh lồi xác Xuất phát từ nguyên nhân trên, tiến hành nghiên cứu đề tài “ Xác định ADN mã vạch lồi Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai)” nhằm xây dựng sở liệu ADN mã vạch, phục vụ cho giám định loài quản lý nguồn tài nguyên sinh vật CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Sói rừng 1.1.1 Phân loại học Tên khoa học: Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai Phân loại: Giới : Plantae Bộ: Chloranthales Họ : Chloranthaceae Chi: Sarcandra Lồi: S glabra Ở Việt Nam Sói rừng cịn có tên gọi khác nhƣ: Sói lãng, cửu tiết kim túc lan, cửu tiết phong, trúc tiết trà, thảo sách hồ, tiếp cốt mộc [4] 1.1.2 Phân bố Cây Sói rừng phân bố nhiều nƣớc: Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Ấn Độ Malaisya Việt Nam mọc hoang vùng núi đất, bìa rừng ven đồi ẩm nhiều nơi nhƣ : Cao Bằng, Lạng Sơn, Hoa Bình đến Kon Tum, Lâm Đồng 1.1.3 Đặc điểm hình thái Sói rừng Cây Sói rừng thƣờng cao khoảng – mét, thân tƣơng đối nhẵn khơng có lơng Các mọc đối nhau, phiến dài hình bầu dục có hình giáo Lá Sói rừng dài từ – 20cm, bề rộng từ – 8cm Phần cƣa mọc mép tƣơng đối nhọn kèm với tuyến Hình 1.1 Đặc điểm Sói rừng (https://vi.wikipedia.org/wiki/Sói_rừng_(thực_vật)/media/File:Sarcandra_glabra2.jpg) Hoa Sói rừng hoa kép, nhánh tƣơng đối nhỏ có màu trắng, hoa thƣờng khơng có cuống, có nhị bầu nhụy có hình trứng khơng có vòi Hoa thƣờng nở vào khoảng tháng tháng Cây đậu sau khoảng – tháng Quả Sói rừng nhỏ hình trịn, đƣờng kính khoảng – 4mm Khi chín chuyển dần từ màu vàng sang màu đỏ đỏ gạch Ngƣời ta thƣờng dùng hoa Sói rừng để ƣớp trà, rễ đƣợc thu hoạch quanh năm để tƣơi phơi khô làm thuốc [4],[7],[32] 1.1.4 Thành phần hóa học Sói rừng Cây Sói rừng chứa tinh dầu, flavonoid, coumarin, axit fumaric, axit succinic hợp chất sesquiterpen (beta atractylenoit, chloranthalacon E, (-)ITSanbulin A sesquiterpen lacton 8beta,9alpha-dihidroxyeudesman4(15),7(11)-dien-8alpha, 12-olid 8beta,9alpha-dihidroxylindan-4(5),7(11)dien-8alpha,12-olid.) Các thành phần Sói rừng có tác dụng chống oxy hóa, giúp giải nhiệt, tiêu độc, làm tăng sản xuất tiểu cầu máu (từ giúp tiêu trừ huyết khối), tăng tuần hoàn máu chống viêm Cũng có tài liệu cho S glabra giúp giảm mệt mỏi điều trị ung thƣ đƣợc đề xuất sử dụng TATGCAGAAATCTTTCTCATTATCATAGTGGATCTTCAAAAAAACAG AGTTTGTATCGAATAAAGTAT 3’ Các trình tự đƣợc xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tƣơng đồng theo đoạn gen matK mẫu SR01 cách sử dụng cơng cụ BLAST Một số lồi có trình tự gen tƣơng đồng dùng so sánh với lồi Sói rừng đƣợc trình bày bảng 3.1 B n ả g M ộ tslo ố icótrìn h ự g nmatKtư e n g đ ồớ vitrìn h ự ge nmatKcủa m u ẫ S R trê ngâ n hà ge n N C B I Tỷ lệ tƣơng STT Tên loài Mã số Sarcandra glabra MH939147.1 100% Sarcandra chloranthoides GU266593.1 99,87% Sarcandra grandiflora AJ581403.1 99,86% đồng Dựa vào bảng 3.1 ta thấy trình tự gen matK mẫu SR01 có tỷ lệ tƣơng đồng 100% với loài Sarcandra glabra mã số: MH939147.1 có mức độ sai khác nhỏ với lồi Sarcandra chloranthoides mã số: GU266593.1, loài Sarcandra grandiflora mã số: AJ581403.1, cụ thể đƣợc thể (hình 3.6) S.glabra ATGCTCCCTCTTTGCATTTATTGCGATTCTTTCTCCACGAGTATCATAATTGGAATAGTT SR01 ATGCTCCCTCTTTGCATTTATTGCGATTCTTTCTCCACGAGTATCATAATTGGAATAGTT S.chloranthoides ATGCTCCCTCTTTGCATTTATTGCGATTCTTTCTCCACGAGTATCATAATTGGAATAGTT S.grandiflora ATGCTCCCTCTTTGCATTTATTGCGATTCTTTCTCCACGAGTATCATAATTGGAATAGTT ************************************************************ S.glabra TCATTACTCCAAAGAAATCCATTTCTCTTTTTTCAAAAGAGAATCAAAGATTCTTCTTGT SR01 TCATTACTCCAAAGAAATCCATTTCTCTTTTTTCAAAAGAGAATCAAAGATTCTTCTTGT S.chloranthoides TCATTACTACAAAGAAATCCATTTCTCTTTTTTCAAAAGAGAATCAAAGATTCTTCTTGT S.grandiflora TCATTACTACAAAGAAATCCATTTCTCTTTTTTCAAAAGAGAATCAAAGATTCTTCTTGT ******** *************************************************** S.glabra TCCTATATAATTCTCATGTATATGAATGCGAATCCGTATTCGTTTTTCTCCGTAAACAGT SR01 TCCTATATAATTCTCATGTATATGAATGCGAATCCGTATTCGTTTTTCTCCGTAAACAGT S.chloranthoides TCCTATATAATTCTCATGTATATGAATGCGAATCCGTATTCGTTTTTCTCCGTAAACAGT S.grandiflora TCCTATATAATTCTCATGTATATGAATGCGAATCCGTATTCGTTTTTCTCCGTAAACAGT ************************************************************ S.glabra CCTCTTATTTACGATCAAAATCTTCTGGAGCCTTTATTGAGCGAACACATTTCTATGGAA SR01 CCTCTTATTTACGATCAAAATCTTCTGGAGCCTTTATTGAGCGAACACATTTCTATGGAA 37 S.chloranthoides CCTCTTATTTACGATCAAAATCTTCTGGAGCCTTTATTGAGCGAACACATTTCTATGGAA S.grandiflora CCTCTTATTTACGATCAAAATCTTCTGGAGCCTTTATTGAGCGAACACATTTCTATGGAA ************************************************************ S.glabra AAATGGAATATCTTGTGGTAGTTCTTCGTAATGATTTTCAGAAAGCTCTATGGTTGTTCA SR01 AAATGGAATATCTTGTGGTAGTTCTTCGTAATGATTTTCAGAAAGCTCTATGGTTGTTCA S.chloranthoides AAATGGAATATCTTGTGGTAGTTCTTCGTAATGATTTTCAGAAAGCTCTATGGTTGTTCA S.grandiflora AAATGGAATATCTTGTGGTAGTTCTTCGTAATGATTTTCAGAAAGCTCTATGGTTGTTCA ************************************************************ S.glabra AGGATCCTTTCATGCATTATGTCAGATATCAAGGAAAAGCACTTCTGGCTTCAAAGGGGA SR01 AGGATCCTTTCATGCATTATGTCAGATATCAAGGAAAAGCACTTCTGGCTTCAAAGGGGA S.chloranthoides AGGATCCTTTCATGCATTATGTCAGATATCAAGGAAAAGCACTTCTGGCTTCAAAGGGGA S.grandiflora AGGATCCTTTCATGCATTATGTCAGATATCAAGGAAAAGCACTTCTGGCTTCAAAGGGGA ************************************************************ S.glabra CTCATCTTCTGATGAAGAAATGGAAATATCACCTTGTCCATTTCTGGCAATGTCATTTTT SR01 CTCATCTTCTGATGAAGAAATGGAAATATCACCTTGTCCATTTCTGGCAATGTCATTTTT S.chloranthoides CTCATCTTCTGATGAAGAAATGGAAATATCACCTTGTCCATTTCTGGCAATGTCATTTTT AJ581403.1 CTCATCTTCTGATGAAGAAATGGAAATATCACCTTGTCCATTTCTGGCAATGTCATTTTT ************************************************************ S.glabra ACTTGTGGTCTCAACCAGATAGGATCCATATAAACCAATTATCCAATCATTCCTTCTATT SR01 ACTTGTGGTCTCAACCAGATAGGATCCATATAAACCAATTATCCAATCATTCCTTCTATT S.chloranthoides ACTTGTGGTCTCAACCAGATAGGATCCATATAAACCAATTATCCAATCATTCCTTCTATT S.grandiflora ACTTGTGGTCTCAACCAGATAGGATCCATATAAACCAATTATCCAATCATTCCTTCTATT ************************************************************ S.glabra TTCTGGGCTATCTTTCAAGTGTACTACTAAATCTTTCGGCGGTAAGGAGTCAAATGCTAG SR01 TTCTGGGCTATCTTTCAAGTGTACTACTAAATCTTTCGGCGGTAAGGAGTCAAATGCTAG S.chloranthoides TTCTGGGCTATCTTTCAAGTGTACTACTAAATCTTTCGGCGGTAAGGAGTCAAATGCTAG S.grandiflora TTCTGGGCTATCTTTCAAGTGTACTACTAAATCTTTCGGCGGTAAGGAGTCAAATGCTAG ************************************************************ S.glabra AGAATTCATTTCTCATAGATACTGCTATTAAGAAATTCGATACCATAGTCCCCATTATTC SR01 AGAATTCATTTCTCATAGATACTGCTATTAAGAAATTCGATACCATAGTCCCCATTATTC S.chloranthoides AGAATTCATTTCTCATAGATACTGCTATTAAGAAATTCGATACCATAGTCCCCATTATTC S.grandiflora AGAATTCATTTCTCATAGATACTGCTATTAAGAAATTCGATACCATAGTCCCCATTATTC ************************************************************ S.glabra CTCTGATTGGAGCATTGGCTAAAGCAAAATTTTGTAACATATCAGGGCACCCCATTAGTA SR01 CTCTGATTGGAGCATTGGCTAAAGCAAAATTTTGTAACATATCAGGGCACCCCATTAGTA S.chloranthoides CTCTGATTGGAGCATTGGCTAAAGCAAAATTTTGTAACATATCAGGGCACCCCATTAGTA S.grandiflora CTCTGATTGGAGCATTGGCTAAAGCAAAATTTTGTAACATATCAGGGCACCCCATTAGTA ************************************************************ S.glabra AGCCGGTCCGGGTCGATTCGTCAGATTCTGATATTATCGATCGATTTGGGCGGATATGCA SR01 AGCCGGTCCGGGTCGATTCGTCAGATTCTGATATTATCGATCGATTTGGGCGGATATGCA 38 S.chloranthoides AGCCGGTCCGGGTCGATTCGTCAGATTCTGATATTATCGATCGATTTGGGCGGATATGCA S.grandiflora AGCCGGTCCGGGTCGATTCGTCAGATTCTGATATTATCGATCGATTTGGGCGGATATGCA ************************************************************ S.glabra GA SR01 GA S.chloranthoides GA S.grandiflora GA ** Hình 3.6: So sánh trình tự SR01 MH939147.1,AJ581403.1, GU266593.1 đoạn gen matK Nhƣ vậy, trình tự đoạn gen matK mẫu SR01 Sarcandra glabra khơng có khác biệt Trình tự đoạn gen matK SR01 khác với trình tự đoạn gen matK tƣơng ứng loài Sarcandra chloranthoides mã số: GU266593.1 Sarcandra grandiflora mã số: AJ581403.1 01 nucleotit vị trí 69 Cụ thể mẫu SR01 nucleotide loại C loài Sarcandra chloranthoides, Sarcandra grandiflora nucleotide loại A 3.3.2 Kết so sánh trình tự gen rbcL Thực tế nhân gen thu đƣợc đoạn gen rbcL có kích thƣớc xấp xỉ 600 bp nhƣng phân tích trình tự gen Bioedit cơng cụ BLAST, chúng tơi có đoạn gen rbcL với kích thƣớc 527 bp có chất lƣợng tốt Vì chúng tơi sử dụng phần kích thƣớc đoạn gen rbcL để phân tích, so sánh Ngồi ra, hai trình tự gen hai mẫu SR01 SR02 khơng có sai khác Vì vậy, chúng tơi sử dụng kết trình tự mẫu SR01 để so sánh với số trình tự Genbank Kết giải trình tự đoạn gen rbcL mẫu SR01 nhƣ sau: 5’AGCTGGTGTTAAAGAGTACAAATTAAATTATTATACTCCTGACTAT GAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGACTAACTCCTCA ACCCGGAGTTCCTGCTGAGGAAGCAGGGGCTGCGGTAGCTGCTGAAT CTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGATGGACTTACCAGC CTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGG GGAGGAAAATCAATACATTGCTTATGTAGCTTACCCTTTAGACCTTTT TGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGT 39 ATTTGGGTTCAAAGCCCTACGAGCTCTACGTCTGGAGGATCTGAGAA TTCCTCCTGCTTATACCAAAACTTTCCAAGGCCCACCCCATGGCATCC AAGTTGAGCGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTATTGGGA TGTACTATTAAACCAAAATTGGGGTTATCTGCTAAAAACTATGGTAG AGCGGTTT 3’ Các trình tự đƣợc xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ loài loài có trình tự tƣơng đồng theo đoạn gen rbcL mẫu SR01 cách sử dụng công cụ BLAST Một số lồi có trình tự gen tƣơng đồng dùng so sánh với mẫu SR01 đƣợc trình bày bảng 3.2 B n ả g M ộ tslo ố icótrìn h ự g nrbcLtư e n g đ ồớ vitrìn h ựrbcLcủa m u ẫ S R 1trê ng n â hà ge n N C B I Tỷ lệ tƣơng STT Tên loài Mã số Sarcandra glabra MH939147.1 100% Sarcandra grandiflora L12663.2 99,03 % Sarcandra chloranthoides AY236833.1 98,29% đồng Dựa vào bảng 3.2 ta thấy trình tự gen rbcL mẫu SR01 mà chúng tơi nhân đƣợc có tỷ lệ tƣơng đồng 100% với loài Sarcandra glabra mã số: MH939147.1 Và có mức độ sai khác nhỏ với lồi Sarcandra grandiflora với mã số: L12663.2, có mức độ sai khác lớn loài Sarcandra chloranthoides với mã số: AY236833.1 cụ thể vị trí nuleotide bị sai khác đƣợc thể hình 3.7 S.glabra SR01 S.chloranthoides S.grandiflora AGCTGGTGTTAAAGAGTACAAATTAAATTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATAC AGCTGGTGTTAAAGAGTACAAATTAAATTATTATACTCCTGACTATGAAACCAAAGATAC AGCTGGTGTTAAAGAGTACAAATTAAATTATTATACTCCTGACTATCACACCAAAGATAC AGCTGGTGTTAAAGAGTACAAATTAAATTATTATACTCCTGACTATCACACCAAAGATAC ********************************************** * *********** S.glabra SR01 S.chloranthoides S.grandiflora TGATATCTTGGCAGCATTCCGACTAACTCCTCAACCCGGAGTTCCTGCTGAGGAAGCAGG TGATATCTTGGCAGCATTCCGACTAACTCCTCAACCCGGAGTTCCTGCTGAGGAAGCAGG TGATATCTTGGCAGCATTCCGACTAACTCCTCAACCCGGAGTTCCACCTGAGGAAGCAGG TGATATCTTGGCAGCATTCCGACTAACTCCTCAACCCGGAGTTCCACCTGAGGAAGCAGG ********************************************* ************* S.glabra SR01 S.chloranthoides S.grandiflora GGCTGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGATGGACT GGCTGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGATGGACT GGCTGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGATGGACT GGCTGCGGTAGCTGCTGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACCGATGGACT ************************************************************ 40 S.glabra SR01 S.chloranthoides S.grandiflora TACCAGCCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAGGA TACCAGCCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAGGA TACCAGCCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAGGA TACCAGCCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCGAGCCCGTTGCTGGGGAGGA ************************************************************ S.glabra SR01 S.chloranthoides S.grandiflora AAATCAATACATTGCTTATGTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTAC AAATCAATACATTGCTTATGTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTAC AAATCAATACATTGCTTATGTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTAC AAATCAATACATTGCTTATGTAGCTTACCCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTAC ************************************************************ S.glabra SR01 S.chloranthoides S.grandiflora TAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTACGAGCTCTACG TAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTACGAGCTCTACG TAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTACGAGCTCTACG TAACATGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGGGTTCAAAGCCCTACGAGCTCTACG ************************************************************ S.glabra SR01 S.chloranthoides S.grandiflora TCTGGAGGATCTGAGAATTCCTCCTGCTTATACCAAAACTTTCCAAGGCCCACCCCATGG TCTGGAGGATCTGAGAATTCCTCCTGCTTATACCAAAACTTTCCAAGGCCCACCCCATGG TCTGGAGGATCTGAGAATTCCTACTGCTTATACCAAAACTTTCCAAGGCCCACCCCATGG TCTGGAGGATCTGAGAATTCCTACTGCTTATACCAAAACTTTCCAAGGCCCACCCCATGG ********************** ************************************* S.glabra SR01 S.chloranthoides S.grandiflora CATCCAAGTTGAGCGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTATTGGGATGTACTAT CATCCAAGTTGAGCGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTATTGGGATGTACTAT CATCCAAGTTGAGCGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTATTGGGATGTACTAT CATCCAAGTTGAGCGAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGTCCCCTATTGGGATGTACTAT ************************************************************ S.glabra SR01 S.chloranthoides S.grandiflora TAAACCAAAATTGGGGTTATCTGCTAAAAACTATGGTA TAAACCAAAATTGGGGTTATCTGCTAAAAACTATGGTA TAAACCAAAATTGGGGTTATCTGCTAARAACTATGGTA TAAACCAAAATTGGGGTTATCTGCTAAAAACTATGGTA *************************** ********** Hình 3.7: So sánh trình tự SR01 MH939147.1, L12663.2, AY236833.1 đoạn gen rbcL Nhƣ vậy, trình tự đoạn gen rbcL mẫu SR01 Sarcandra glabra mã số: MH939147.1 khơng có khác biệt Trình tự đoạn gen rbcL SR01 khác với trình tự đoạn gen rbcL tƣơng ứng loài Sarcandra chloranthoides mã số: AY236833.1 Sarcandra grandiflora mã số: L12663.2 vị trí đƣợc thể bảng 3.3: B n ả g :C cvịtrísa ikhá cd ù n g đ ể p h n â lo iủ ca đ o n g erbcL Vị tr Loài 47 49 105 106 383 507 SR01 G A T G C A Sarcandra glabra G A T G C A Sarcandra chloranthoides C C A C A R Sarcandra grandiflora C C A C A A Từ bảng 3.3 ta thấy mẫu SR01 có vị trí sai khác lồi Sarcandra chloranthoides với tỷ lệ sai khác 1,13% có vị trí sai khác lồi 41 Sarcandra grandiflora với tỷ lệ sai khác 0,94% Các vị trí sai khác đƣợc thể cụ thể nhƣ sau: Ở trình tự gen mẫu SR01 vị trí 47, mẫu SR01 với nucleotide loại G cịn lồi Sarcandra chloranthoides, Sarcandra grandiflora nucleotide loại C Vị trí 49, mẫu SR01 nucleotide loại A, lồi cịn lại nucleotide loại C Vị trí 105, mẫu SR01 nucleotide loại T, lồi cịn lại nucleotide loại A Vị trí 106, mẫu SR01 nucleotide loại G, lồi cịn lại nucleotide loại C Vị trí 383, mẫu SR01 nucleotide loại C, lồi cịn lại nucleotide loại A Vị trí 507: mẫu SR01 lồi Sarcandra grandiflora nucleotide loại A cịn lồi Sarcandra chloranthoides ký hiệu chữ R, vị trí chƣa xác định đƣợc xác nucleotide Khi kiểm tra lại trình tự nucleotide mẫu SR01 vị trí 507 thấy sóng nucleotide A cao, đẹp, khơng chèn với sóng Từ vị trí sai khác đoạn gen rbcL với cặp mồi rP1F rP1R, sở để sử dụng làm mã vạch để phân biệt lồi Sói rừng mà chúng tơi nghiên cứu với lồi chi với 3.3.3 Kết so sánh trình tự gen trnH-psbA Thực tế nhân gen chúng tơi thu đƣợc đoạn gen trnH-psbA có kích thƣớc > 300 bp nhƣng phân tích trình tự gen Bioedit cơng cụ BLAST, chúng tơi có đoạn gen trnH-psbA với kích thƣớc 272 bp có chất lƣợng tốt Vì chúng tơi sử dụng phần kích thƣớc đoạn gen trnH-psbA để phân tích, so sánh Ngồi ra, hai trình tự gen hai mẫu SR01 SR02 khơng có sai khác Vì vậy, chúng tơi sử dụng kết trình tự mẫu SR01 để so sánh với số trình tự Genbank Kết giải trình tự đoạn gen trnH-psbA mẫu SR01 nhƣ sau: 5’TATTCAGTCGTTACATTGGCTACATCCGCCCCTCCTCTATCTCTAAA GGATGCAATTTCTTCTTCTACCATCCATCATTTCCTGTAAATGTAAAA ACAAAAAATGCTGATTATGAATAAAAAACTACTAAATCGAACAGAG CAATACCAAACCTCTTGAGAAAACAAGAAATTGGGTATTGCTCCTTC AACGACTCGTATACACTAAAACCGAAACCGAAGTATTATCCATTTGT AGATGGAGCTTCGACAGCAGCTAGGTCTAGAGACTGG 3’ 42 Các trình tự đƣợc xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tƣơng đồng theo đoạn gen trnHpsbA lồi Sói rừng cách sử dụng công cụ BLAST Tuy nhiên phát loài Sarcandra glabra chi với lồi Sói rừng mà chúng tơi nghiên cứu B n ả g T rìn h tự g ntrnH-psbAtư e n g đ ồg vitrìn h ự g ntrnH-psbAm e u ẫ S R trê ng n â h ge n N C B I Tỷ lệ tƣơng đồng Sarcandra glabra 100% MH939147.1 Từ ngân hàng gen quốc tế NCBI so sánh trình tự gen trnH-psbA STT Mã số Tên lồi mẫu SR01 với trình tự gen loài Sarcandra glabra với mã số: MH939147.1 ngân hàng gen quốc tế, nhận đƣợc tƣơng đồng đoạn gen đƣợc thể nhƣ sau: SR01 16 TTGGCTACATCCGCCCCTCCTCTATCTCTAAAGGATGCAATTTCTTCTTCTACCATCCAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 75 S.Glabra 61 TTGGCTACATCCGCCCCTCCTCTATCTCTAAAGGATGCAATTTCTTCTTCTACCATCCAT 120 SR01 76 CATTTCCTGTAAATGTAAAAACAAAAAATGCTGATTATGAATAAAAAACTACTAAATCGA 135 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| S.Glabra 121 CATTTCCTGTAAATGTAAAAACAAAAAATGCTGATTATGAATAAAAAACTACTAAATCGA 180 SR01 136 ACAGAGCAATACCAAACCTCTTGAGAAAACAAGAAATTGGGTATTGCTCCTTCAACGACT 195 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| S.Glabra 181 ACAGAGCAATACCAAACCTCTTGAGAAAACAAGAAATTGGGTATTGCTCCTTCAACGACT 240 SR01 196 CGTATACACTAAAACCGAAACCGAAGTATTATCCATTTGTAGATGGAGCTTCGACAGCAG 255 S.Glabra 241 CGTATACACTAAAACCGAAACCGAAGTATTATCCATTTGTAGATGGAGCTTCGACAGCAG SR01 256 CTAGGTCTAGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 300 267 |||||||||||| S.Glabra 301 CTAGGTCTAGAG 312 Hình 3.8: Sự tƣơng đồng trình tự đoạn gen trnH-psbA mẫu SR01 với lồi Sarcandra glabra Dựa vào hình 3.8 chúng tơi khơng tìm thấy điểm sai khác so sánh trình tự gen trnH-psbA loài SR01 Sarcandra glabra 43 Từ kết chúng tơi kết luận, trình tự gen trnH-psbA chƣa đủ sở để làm mã vạch phân loại lồi 3.3.4 Kết so sánh trình tự gen ITS2 Thực tế nhân gen chúng tơi thu đƣợc đoạn gen ITS2có kích thƣớc khoảng 300 bp nhƣng phân tích trình tự gen Bioedit cơng cụ BLAST, chúng tơi có đoạn gen ITS2 với kích thƣớc 298 bp có chất lƣợng tốt Vì chúng tơi sử dụng phần kích thƣớc đoạn gen ITS2 để phân tích, so sánh Ngồi ra, hai trình tự gen hai mẫu SR01 SR02 khơng có sai khác Vì vậy, chúng tơi sử dụng kết trình tự mẫu SR01 để so sánh với số trình tự Genbank Kết giải trình tự đoạn gen ITS2 mẫu SR01 nhƣ sau: 5’TCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCGTCAGGTCGAGGG CACGCCTGCCTGGGCGTCACGCCTTACGTCGCTCTCAAACAATTGTCC CCCTCGGGGATGTCGAGTTGAGATGCGGAGATTGGCCACCCGCGCTC TGTTCGCGCGGCTGGCTCAAGAGCGGCCTTGCCGGTGCAGGGCGCGA TTAGTTGTGGATGATAGAAGCTACATTTCGGTGATCGCGTCCTGCGA CCGTCTTTGGACCTTACCTGATGTCGTTTTATGGCATTCGGACTGCGA CCCCAGGTCAGGCGG 3’ Các trình tự đƣợc xử lý ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm khác biệt cấp độ lồi lồi có trình tự tƣơng đồng theo đoạn gen ITS2 lồi Sói rừng cách sử dụng cơng cụ BLAST Một số lồi có trình tự gen tƣơng đồng dùng so sánh với lồi Sói rừng đƣợc trình bày bảng 3.5: B n ả g :M ộ tslo ố icótrìn h ự g nITS2tư e n g đ g vitrìn h ự g nITS2ủ e ca m u ẫ S R 1trê ng n â h ge n N C B I Tỷ lệ tƣơng STT Tên loài Mã số Sarcandra glabra MG730169.1 100% Sarcandra hainanensis KJ137956.1 98,21% Sarcandra chloranthoides KJ137954.1 97,13% đồng Dựa vào bảng 3.5 ta thấy trình tự gen ITS2 mẫu SR01 mà nhân đƣợc có tỷ lệ tƣơng đồng 100% với lồi Sarcandra glabra mã số: MG730169.1 Và có mức độ sai khác lớn loài Sarcandra hainanensis 44 mã số: KJ137956.1 loài Sarcandra chloranthoides mã số: KJ137954.1 cụ thể vị trí nucleotide bị sai khác đƣợc thể cụ thể hình 3.9: S.chloranthoides TCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCGTCAGGTTGAGGGCACGCCTGCCTGGG S.glabra TCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCGTCAGGTCGAGGGCACGCCTGCCTGGG SR01 TCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCGTCAGGTCGAGGGCACGCCTGCCTGGG S.hainanensis TCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCGTCAGGTCGAGGGCACGCCTGCCTGGG **************************************** ******************* S.chloranthoides CGTCACGCCTTACGTCGCTCTCAAACAATTGTCCCCCTCGGGGATGTCGAGTTGAGATGC S.glabra CGTCACGCCTTACGTCGCTCTCAAACAATTGTCCCCCTCGGGGATGTCGAGTTGAGATGC SR01 CGTCACGCCTTACGTCGCTCTCAAACAATTGTCCCCCTCGGGGATGTCGAGTTGAGATGC S.hainanensis CGTCACGCCTTACGTCGCTCTCAAACAATTGTCCCCCTCGGGGATGTTGAGTTGAGATGC *********************************************** ************ S.chloranthoides GGAGATTGGCCACCTGCGCTCTATTTGCGCGGCTGGCTCAAGAGCGGCCTTACCGGTGCA S.glabra GGAGATTGGCCACCCGCGCTCTGTTCGCGCGGCTGGCTCAAGAGCGGCCTTGCCGGTGCA SR01 GGAGATTGGCCACCCGCGCTCTGTTCGCGCGGCTGGCTCAAGAGCGGCCTTGCCGGTGCA S.hainanensis GGAGATTGGCCACYCGCGCTCTGTTCGCGCGGCTGGCTCAAGAGCGGCCTTGTCGGTGCA ************* ******* ** ************************* ******* S.chloranthoides GGGCGCGATTAGTTGTGGATGATAGAAGCTACATTTCGGTGATCGCGTGCTGCGGCCGTC S.glabra GGGCGCGATTAGTTGTGGATGATAGAAGCTACATTTCGGTGATCGCGTCCTGCGACCGTC SR01 GGGCGCGATTAGTTGTGGATGATAGAAGCTACATTTCGGTGATCGCGTCCTGCGACCGTC S.hainanensis GGGCGCGATTAGTTGTGGATGATAGAAGCTACATTTCGGTGATCGCGTCCTACGGCCGTC ************************************************ ** ** ***** S.chloranthoides TTTGGACCTTACCTCATGTCGTTTTATGGCATTCGGACT S.glabra TTTGGACCTTACCTGATGTCGTTTTATGGCATTCGGACT SR01 TTTGGACCTTACCTGATGTCGTTTTATGGCATTCGGACT S.hainanensis TTTGGACCTTACCTGATGTCGTTTTATGGCATTCGGACT ************** ************************ Hình 3.9: So sánh trình tự SR01 MG730169.1 , KJ137956.1, KJ137954.1 đoạn gen rbcL Nhƣ vậy, trình tự đoạn gen ITS2 mẫu SR01 Sarcandra glabra mã số: MG730169.1 khơng có khác biệt Trình tự đoạn gen ITS2 SR01 khác với trình tự đoạn gen ITS2 tƣơng ứng lồi Sarcandra chloranthoides mã số: KJ137954.1 Sarcandra hainanensis mã số: KJ137956.1 vị trí đƣợc thể bảng 3.6: B n ả g :C cvịtrísa ikhá cd ù n g đ ể p h n â lo iủ ca đ o n g e vù n ge nITS2 45 Vị tr Loài 41 108 134 135 143 146 172 173 228 231 234 255 SR01 C C C C G C G C C G A G S glabra C C C C G C G C C G A G S.hainanensis C T Y C G C G T C A G G S.chloranthoides T C C T A T A C G G G C Từ bảng 3.6 ta thấy mẫu SR01 có vị trí sai khác lồi Sarcandra hainanensis với tỷ lệ sai khác 1,67% có vị trí sai khác lồi Sarcandra chloranthoides với tỷ lệ sai khác 2,68% Các vị trí sai khác cụ thể nhƣ sau: Ở vị trí 41 135, mẫu SR01 loài Sarcandra hainanensis nucleotide loại C, cịn lồi Sarcandra chloranthoides nucleotide loại T Vị trí 108 173, mẫu SR01 lồi Sarcandra chloranthoides nucleotide loại C, cịn lồi Sarcandra hainanensis nucleotide loại T Vị trí 134, mẫu SR01 loài Sarcandra hainanensis nucleotide loại C, loài Sarcandra chloranthoides ký hiệu chữ Y, vị trí chƣa xác định đƣợc xác loại nucleotide Khi kiểm tra lại trình tự nucleotide mẫu SR01 vị trí 507 thấy sóng nucleotide C cao, đẹp, khơng chèn với sóng Ở vị trí 143 172, mẫu SR01 loài Sarcandra hainanensis nucleotide loại A, cịn lồi Sarcandra chloranthoides nucleotide loại A Vị trí 146, mẫu SR01 lồi Sarcandra hainanensis nucleotide loại C, cịn lồi Sarcandra chloranthoides nucleotide loại T Vị trí 228, mẫu SR01 lồi Sarcandra hainanensis là nucleotide loại C, cịn lồi Sarcandra chloranthoides nucleotide loại G Vị trí 231, mẫu SR01 lồi Sarcandra chloranthoides nucleotide loại G, cịn lồi Sarcandra hainanensis nucleotide loại A Vị trí 234, mẫu SR01 nucleotide loại A, lồi cịn lại nucleotide loại G Vị trí 255, mẫu SR01 lồi Sarcandra hainanensis nucleotide loại G, cịn lồi Sarcandra chloranthoides nucleotide loại C 46 Từ vị trí sai khác đoạn gen ITS2 với cặp mồi ITS2PF ITS2PR, sở để sử dụng làm mã vạch để phân biệt lồi Sói rừng mà chúng tơi nghiên cứu với lồi chi với 3.4 Kết so sánh khả phân biệt đoạn trình tự gen matK, rbcL, ITS2 trnH-psbA Dựa vào kết nhận thấy đoạn gen trnH-psbA chƣa đủ sở để dùng so sánh, phân biệt nên chúng ôi so sánh kết trình tự đoạn gen matK, rbcL ITS2 mẫu SR01 với trình tự gen loài Sarcandra chloranthoides, ta lập đƣợc bảng so sánh khả phân biệt đoạn trình tự gen matK, rbcL ITS2 nhƣ sau: B n ả g :B n ả g soá n h kả nă g p h n â b ệ iủ tca cđ oạ n trìh ự ge nmatK, rbcLvàITS2 Tên đoạn gen matK rbcL ITS2 Số điểm sai khác Kích thƣớc trình tự 782 527 298 Tỷ lệ sai khác 0.12 % 1.13% 2.68 % Từ kết phân tích cho thấy so sánh đoạn trình tự gen ITS2 mẫu SR01 với lồi Sarcandra chloranthoides có điểm sai khác với tỷ lệ sai khác 2,68%, trình tự gen rbcL mẫu SR01 với lồi Sarcandra chloranthoides có điểm sai khác với tỷ lệ sai khác 1.13%, cịn trình tự gen matK có điểm sai khác nên tỷ lệ sai khác thấp, đạt 0,12% Nhƣ vậy, đoạn gen ITS2 có khả phân biệt cao so với đoạn gen matK rbcL so sánh trình tự gen mẫu SR01 với loài Sarcandra chloranthoides Từ kết kết hợp đoạn gen rbcL, ITS2 làm sở để phân biệt lồi Sói rừng với lồi khác thuộc chi Sarcandra 47 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã tách chiết đƣợc 02 mẫu ADN tổng số lồi Sói rừng - Đã nhân gen thành công đoạn gen matK, rbcL, ITS2, trnHpbsA kỹ thuật PCR từ ADN tổng số - Đã xác định đƣợc trình tự nucleotide đoạn gen matK, rbcL, ITS2, trnH-pbsA - Với đoạn gen ITS2 có khả phân biệt cao so với đoạn gen matK rbcL với tỷ lệ sai khác 2,68% - Có thể kết hợp đoạn gen rbcL, ITS2 làm sở để phân biệt loài Sói rừng với lồi khác thuộc chi Sarcandra 4.2 Tồn - Do hạn chế thời gian kinh phí nên chúng tơi chƣa xác định đƣợc thêm đoạn ADN cho lồi Sói rừng 4.3 Kiến nghị - Tiếp tục xác định đoạn ADN mã vạch khác đối tƣợng Sói rừng - Sử dụng thị gen ITS2 rbcL nghiên cứu để giám định loài Sarcandra glabra ( Thunb.) Nakai làm sở cho công tác phân loại, chọn tạo giống, lấy vật liệu nhân giống 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (2005), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục – Hà Nội, trang 191-198 Nguyễn Thị Bích Hằng, Phạm Thanh Kỳ, Đỗ Thị Oanh (2010) “Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học Sói rừng ” luận văn thạc sỹ dƣợc sỹ Hà Văn Huân (2015( Nghiên cứu ứng dụng thị phân tử ADN mã vạch phân tích đa dạng di truyền giám định sinh vật Việt Nam Ngân hàng liệu ADN Việt Nam Trần Cơng Khanh ( 2011) Cây Sói rừng & Lan kim tuyến TSHK Trần Công Khanh tạp chí Thuốc & Sức khỏe số 431 Nguyễn Đức Lƣợng (2002) Công nghệ gen NXB Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Đinh Đồn Long, Đỗ Lê Thăng (2008) Cơ sở di truyền học phân tử tế bào NXB Đại học quốc gia Hà Nội Mai Hồng Oanh (2016), Nghiên cứu đặc điểm hình thái số trình tự gen phân loại Sói rừng Sarcandra glabra ( Thunb.) Nakai Luận văn Thạc sĩ Trung tâm nghiên cứu Tài nguyên Mơi trƣờng ĐHQGHN, Danh mục lồi thực vật Việt Nam, tập II, NXB Nông Nghiệp (2012) TIẾNG ANH Alvarez I.W.J.F (2003) Ribosomal ITS sequences and plant phylogenic inference Molecular phylogentics and Evolution 29: 417-434 10 Chase M W., Nicolas S., Mike W., James M D., Rao P K., Nadia H., and Vincent S (2005), “Land plants and ADN mã vạchs: short-term and long-term goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), pp 1889-1895 11 CBOL plant working group (2009) A ADN mã vạch for land plants, 106: 12794-12797 12 Chen S.Y.H, Han J., Liu C., Song J., et al (2010) Validation of the ITS2 region as a novel ADN mã vạchs for identifying medicinal plant species Plos one 5: e8613 13 Gao T.Y.H., Song J., Lui C., Zhu., et al (2010) Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential ADN mã vạch ITS2 Journal of Eth 130: 116-121 14 Hebert P.D.N., Ball C.A., et al (2003) Biological identification through ADN mã vạchs Bio Sci 270: 313-321 15 He, RR; Yao, XS; Li, HY; Dai, Y; Duan, YH; Li, YF; Kurihara, H (2009) "The anti-stress effects of Sarcandra glabra extract on restraint-evoked immunocompromise" 16 Kress W J., Erickson D L (2008), “DNA barcodes: Gens, genomics, and bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp 2761-2762 17 Jaakola L.S.M., Haggman H (2010) Novel approaches based on ADN barcoding and high-resolution melting of amplicons for authenticity analyses 18 Lahaye R.V.D.B.M., Bogarin D., Warner J., et al (2008) ADN barcoding the floras of biodiversity hotspots PNAS 105: 2923-2928 19 Mark Y.S.H (2008) Barcode of life Scien Ameri 82-88 20 Nianhe Xia and Joël Jérémie (1999), "Sarcandra Gardner, Calcutta J Nat Hist 6: 348 1845", Flora of China, 4, pp 132–138 21 Tautz, D Arctander, P.Minelli, A Thomas, R.H Vogler (2003) A plea for ADN taxanomy Trends Ecol 18: 70-74 22 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 23 Shaw J.L.E.B., Schiling E.E., Small R.L (2007) Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogentic studies in angiosperms: the tortoise and the hare III Amer Jour Bota 94: 275-288 24 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14 25 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 26 Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R (2010) “ADN barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology (10), pp.205 27 Wei Liu, Ying Zheng, Zhenzhen Zhang, Wenbing Yao and Xiangdong Gao, „’Hypoglycemic, hypolipidemic and antioxidant effects of Sarcandra glabra polysaccharide in type diabetic mice’’ 28 Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), “Combining bioinformatics and phylogentics to identify large sets of single-copy orthologous gens (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade”, Gentics (174), pp 1407-1420 29 Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5), pp.13102 WEBSITE 30 http://www.biodivn.com/2013/11/ Sarcandra-glabra.html 31 https://giadinhkhoeaz.com/cay-soi-rung/ 32 https://vi.wikipedia.org/wiki (Sói_rừng_(thực_vật) 33 https://dantri.com.vn/suc-khoe/soi-rung-khang-khuan-tieu-viem1360334364.htm 34 https://vnexpress.net/suc-khoe/thuoc-gia-thuc-pham-chuc-nang-gia-bungphat-vao-cuoi-nam-3503493.html 35 http://iasvn.org/homepage/Ma-vach-DNA-(DNA-BARCODE)-va-huongnghien-cuu-ung-dung-o-Viet-Nam-5898.html