Nghiên cứu xác định đoạn adn mã vạch cho loài gõ đỏ (afzelia xylocarpa (kurz) craib) xuất xứ lào

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC o0o KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐOẠN ADN MÃ VẠCH CHO LOÀI GÕ ĐỎ (Afzelia Xylocarpa (Kurz) Craib) XUẤT XỨ LÀO NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 7420201 Giáo viên hướng dẫn : PGS TS Nguyễn Văn Việt ThS Nguyễn Thị Huyền Sinh viên thực : Lê Thị Loan Mã sinh viên : 1453071818 Lớp : K59B – CNSH Khóa : 2014 - 2018 Hà Nội, 2018 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam em nhận nhiều quan tâm bảo tận tình thầy cơ, đặc biệt thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Văn Việt ThS Nguyễn Thị Huyền Bộ môn Công nghệ tế bào, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, người hướng dẫn trực tiếp em thực khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn tới toàn thể cán Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành luận văn cách tốt Cuối em xin chân thành cảm ơn tới gia đình bạn bè ln ủng hộ, động viên giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Do thời gian có hạn nên làm khó tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp thầy bạn bè để làm hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày 14 tháng năm 2018 Sinh viên Lê Thị Loan MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Gõ đỏ 1.1.1 Giới thiệu Gõ đỏ 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Đặc điểm sinh thái phân bố 1.1.4 Giá trị Gõ đỏ 1.1.5 Tình trạng 1.2 Tổng quan ADN mã vạch 1.2.1 ADN mã vạch (DNA barcode) 1.2.2 Ứng dụng lợi ích mã vạch ADN 1.2.3 Các đặc điểm trình tự mã vạch 1.3 Một số mã vạch ADN thực vật sử dụng phổ biến tình hình nghiên cứu 1.3.1 Mã vạch thực vật 1.3.2 Hiện trạng mã vạch thực vật 15 1.4 Những nghiên cứu ứng dụng ADN mã vạch giám định loài 17 1.4.1 Trên giới 17 1.4.2 Ở Việt Nam 19 CHƢƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.3 Phạm vi địa điểm nghiên cứu 22 2.4 Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 22 2.4.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.4.2 Hóa chất 23 2.4.3 Các thiết bị dùng nghiên cứu 23 2.5 Phương pháp nghiên cứu 24 2.5.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 24 2.5.2 Phương pháp PCR với mồi đặc hiệu 25 2.5.3 Phương pháp điện di 26 2.5.4 Phương pháp tinh sản phẩm PCR giải trình tự 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 Kết tách ADN tổng số 28 3.2 Kết PCR nhân gen với mồi đặc hiệu 28 3.2.1 Kết nhân gen trnL với cặp mồi đặc hiệu 29 3.2.2 Kết nhân gen rbcL với cặp mồi đặc hiệu 30 3.2.3 Kết nhân gen psbA-trnH với cặp mồi đặc hiệu 30 3.2.4 Kết nhân gen matK với cặp mồi đặc hiệu 31 3.3 Kết phân tích trình tự nucleotide đoạn gen matK 31 3.4 Xây dựng phát sinh chủng loại 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 Kết luận 35 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần đệm chiết DNA tổng số 23 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR 25 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt phản ứng PCR 26 Bảng 2.4 Trình tự thơng tin cặp mồi 26 Bảng 3.1 Hệ số tương đồng loài so sánh NCBI 34 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây Gõ đỏ Hình 1.2 Gỗ Gõ đỏ Hình 1.3 Sản phẩm gỗ Gõ đỏ Hình 2.1 Máy PCR 24 Hình 2.2 Bể điện di 24 Hình 2.3 Máy soi gel 24 Hình 3.1: Kết điện di ADN tổng số mẫu Gõ đỏ 28 Hình 3.2: Kết nhân đoạn gen trnL từ mẫu Gõ đỏ thu 29 Hình 3.3: Kết nhân đoạn gen rbcL từ mẫu Gõ đỏ thu 30 Hình 3.4: Kết nhân đoạn gen psbA-trnH từ mẫu Gõ đỏ thu 30 Hình 3.5: Kết nhân đoạn gen matK từ mẫu Gõ đỏ thu 31 Hình 3.6 Cây quan hệ di truyền loài Gõ đỏ với loài khác công bố ngân hàng gen quốc tế NCBI 34 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DNA Axit deoxyribonucleic CBOL Consortium for the Barcode of Life COI Cytochrome oxydase subinit I Cytb Cytochrome b matK Maturase K PCR Polymerase Chain Reaction CTAB Hexadecyltrimethyl ammonium bromide CI Cloroform: isoamylalcohol EDTA Ethylenediamine tetraacetate dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase Kb Kilobase Mg/l Miligram/ lít µl Microlit ml Mililit NCBI National Centre for Biotechnology Imformation TAE Tris – Acetic acide – EDTA ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Gõ đỏ (Afzelia Xylocarpa) hay cịn tên gọi khác Hổ Bì, Cà Te Đây loài thực vật thuộc họ Đậu, thường mọc số nước Đông Nam Á gần với Việt Nam như: Lào, Thái Lan, Myanma… Gõ đỏ loài sinh trưởng chậm, ưa sáng, phân bố rừng thường xanh rừng nửa rụng lá, mọc đất sườn thoát nước, tầng đất sâu, thành phần giới đất trung bình Gỗ loài Gõ đỏ loại gỗ quý thường sử dụng để chế tác, sản xuất đồ nội thất, xây dựng nhà cửa Cây gỗ dùng để bảo vệ môi trường đất môi trường tự nhiên sống người Vì lồi gỗ quý nên chúng bị khai thác mức dẫn tới tình trạng suy giảm nghiêm trọng, chúng bị tuyệt chủng ngồi tự nhiên khơng có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Hiện Gõ đỏ thuộc phân hạng EN A1c,d (Sách đỏ Việt Nam, 2007) Vì vậy, cần thiết để xây dựng ADN mã vạch cho loài giá trị nhằm làm sở cho chiến lược bảo tồn phát triển bền vững ADN mã vạch (DNA barcode) phương pháp định danh giám định lồi dựa trình tự ADN ngắn vùng chuẩn hóa ADN hệ gen (Hebert cs, 2003) Ở thực vật, việc nghiên cứu truy tìm vùng ADN hệ gen thích hợp chứng minh khó khăn so với động vật nhiều Tuy nhiên, qua nghiên cứu thấy có vài vùng gen hệ gen lục lạp rbcL, matK hay vùng đệm chép (internal transcribed spacer – ITS) sử dụng việc xác định đoạn mã vạch ADN thực vật phục vụ cho mục đích khác Xuất phát từ lý tiến hành đề tài: Nghiên cứu xác định đoạn ADN mã vạch cho loài Gõ đỏ (Afzelia Xylocarpa (Kurz) Craib) xuất xứ Lào Nhằm góp phần cung cấp thông tin sở liệu việc xác định xác lồi cấp độ phân tử CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Gõ đỏ 1.1.1 Giới thiệu Gõ đỏ Gõ đỏ cịn gọi Cà te hay Hổ bì, tiếng Việt, người Lào gọi Teakha Gõ đỏ có tên khoa học Afzelia Xylocarpa, thuộc họ Fabaceae, phân họ Caesalpinoideae Chúng phân bố Lào (Bolykhamxay, thủ đô Viên Chăn,…), Việt Nam (Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắc, Khánh Hịa tỉnh vùng Đơng Nam Bộ), Thái Lan Mianma (Nguyen Duc Thanh cs, 2012) Gõ đỏ lồi gỗ khơng có giá trị mặt khoa học mà bên cạnh cịn có giá trị kinh tế cao Gỗ Gõ đỏ bền, chắn, không dễ bị mối mọt, vân gỗ đẹp cong vênh, sử dụng để làm đề gỗ cao cấp, hạt Gõ đỏ sử dụng để hút độc rắn bị rắn cắn Theo sách đỏ Việt nam, Gõ đỏ thuộc phân hạng EN A1c,d: Nguy cấp (EN-endangered), suy giảm quần thể (A) 50% (1) nơi phân bố (c) mức độ khai thác (d) Gỗ loài đặc biệt xuất xứ từ Lào ưa chuộng thị trường chúng khai thác cách tràn lan bất hợp pháp làm cho số lượng cá thể trưởng thành loài tổ thành rừng tự nhiên thấp, suy giảm nghiêm trọng Cần tiến hành bảo tồn quần thể nhỏ cịn sót lại nghiên cứu nhân giống để gieo trồng tạo hàng hóa xuất bảo vệ gen (Bộ Khoa học Cơng nghệ, 2007) 1.1.2 Đặc điểm hình thái Cây gỗ to rụng lá, cao tới 30m, đường kính thân 0,8 - 1m Vỏ màu xám, sần sùi, mặt có nhiều lỗ màu nâu Cành non nhẵn, kép lông chim chẵn với tới đôi chét hình trái xoan, gân nhọn, gốc tù, nhẵn, mặt màu lục nhạt, dài - 6, rộng - 5cm Hoa tập hợp thành chùy, dài 10 -12 cm, đỉnh xẻ thùy Cánh hoa 1, màu hồng dài – 12 cm, mặt có lông Nhị 7, hợp gốc Quả đậu to, gần cuống, dài 15 cm, rộng – cm, dày – cm, hoá gỗ mạnh già, màu nâu thẫm Hạt - 8, nằm ngang, hình trứng dài 25 – 30 mm, dày 18 – 24 mm, màu nâu thẫm hay đen, gốc có áo hạt cứng màu da cam Sinh học sinh thái: Tái sinh hạt tốt nơi có nhiều ánh sáng Cây rụng vào tháng 12, non vào đầu tháng 1, có hoa vào tháng - 4, chín vào tháng 10 - 11 (Trần Hợp, 2002; Nguyễn Thượng Hiền, 1995) Hình 1.1: Cây Gõ đỏ (Afzelia Xylocarpa) (Nguồn:hoadepviet.com) 1.1.3 Đặc điểm sinh thái phân bố Cây mọc rừng mưa nhiệt đới thường xanh hay rừng nửa rụng mưa mùa, tập trung độ cao 500 - 700m (có đến 1000m) mọc chung với Bằng lăng (Lagerstroenlia sp.), Giáng hương (Pterrocapus macrocarpus), Gáo vàng (Adina cordifolia), Thung (Commersonia batramia)… Gõ đỏ mọc nơi đất phẳng sườn núi có đất nước nơi đất sâu, sét pha cát, đất đỏ có đá khơng Rất mọc ven suối ẩm ướt (Trần Hợp, 2002; Nguyễn Thượng Hiền, 1995) Phân bố: Gõ đỏ loài đặc hữu Đơng Dương Tại Việt Nam lồi phân bố số địa phương Kon Tum, Gia Lai (An Khê, Chư Prơng Làng Gng), Darlark (Krơng Bơng), Khánh Hồ (Ninh Hồ: núi Vọng Phu), Sơng Bé (Phước Long, Đức Phong), Đồng Nai (Tân Phú, Cát Tiên), Tây Ninh (Trần Hợp, 2002) - Cối, chày sứ; ống Eppendorf loại 2ml 1,5ml; bể ổn nhiệt; tủ hút; máy ly tâm; pipet loại 1000µl  Dụng cụ thiết bị dùng phản ứng PCR: - Các loại Pipet 1000µl, 200µl, 100µl, 20µl, 10µl - Ống Eppendorf loại 1,5ml 0,2ml - Khay giữ mẫu, khay đựng đá - Máy PCR  Dụng cụ thiết bị dùng điện di ADN gel agarose: - Bộ điện di ADN: Nguồn điện di, giá bể điện di, lược tạo giếng điện di, khay thăng nhờ giọt nước đổ gel; cân điện tử; bình chịu nhiệt để đun agarose; lị vi sóng; giấy Paraffin; máy soi gel; máy chụp ảnh (nếu có) Hình 2.1 Máy PCR Hình 2.2 Bể điện di Hình 2.3 Máy soi gel 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.5.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số Quy trình tách chiết ADN tổng số Gõ đỏ thực sau:  Lấy 0,2gr nghiền với 0,8 ml đệm CTAB 4% đến thành dung dịch đồng nhất;  Cho hỗn hợp vừa nghiền vào ống Eppendorf ml ủ 650C 30 phút, 10 phút tiến hành đảo lần ;  Bổ sung 0,8 ml Chloroform : isoamylalcohol tỉ lệ 24 : 1, đảo ly tâm 13.000 vòng/phút 15 phút 40C ; 24  Hút 500 µl dịch pha chuyển sang ống Eppendorf 1,5ml sau bổ sung thể tích tương đương isopropanol lạnh, ủ -200C 60 phút;  Ly tâm 13.000 vòng/phút 15 phút, loại bỏ dịch nổi, thu kết tủa;  Rửa tủa ADN với 500µl ethanol 70%;  Ly tâm 10.000 vịng/phút phút, loại bỏ dịch làm khô tủa  Bổ sung 100 µl H2O deion, ủ 370C phút cho tan hoàn toàn  ADN tổng số điện di kiểm tra gel agarose 1% sau bảo quản -200C để phục vụ thí nghiệm 2.5.2 Phương pháp PCR với mồi đặc hiệu Trong thí nghiệm phản ứng PCR thực với thành phần phản ứng bảng 2.2 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) Master mix 2X 10 H20 deion 10µM mồi xi (F) 10µM mồi ngược (R) 5U/µl DNA khn Tổng thể tích 20 Tổng thể tích cho mẫu phản ứng PCR 20µl, tiến hành giải trình tự tổng thể tích mẫu 50µl với tỉ lệ thành phần phản ứng tương tự bảng 2.2 Chu trình thực phản ứng bảng 2.3 25 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt phản ứng PCR Bƣớc Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kì Khởi động 94 4’ Biến tính 94 45’’ Gắn mồi 51-58 45’’ Kéo dài 72 1’ 30’’ Ổn định 72 7’ Bảo quản ∞ 40 Trình tự nucleotide cặp mồi nghiên cứu trình bày bảng 2.4 Bảng 2.4 Trình tự thơng tin cặp mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Kí hiệu mồi trnL/F CGAAATCGGTAGACGCTACG trnL/R GGGGATAGAGGGACTTGAAC rbcL/F GTAAAATCAAGTCCACCACG rbcL/R GTAAAATCAAGTCCACCGCG Nhiệt độ gắn mồi (0C) 58 54 psbA-trnH/F GTTATGCATGAACGTAATGCTC psbA-trnH/R CGCGCATGGTGGATTCACAATCC 56,5 matK/F ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC matK/R CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG 51 2.5.3 Phương pháp điện di Phương pháp điện di thực sau: • Pha gel 1% sau: cân 1g agarose cho vào bình chứa (nếu pha gel 1,2% cân 1,5gr), bổ sung đệm TAE 1X đến đạt thể tích 100 ml, cho vào lị vi sóng đun đến gel tan hoàn toàn Để nguội đến 600C bổ sung àl Redsafe 20000x 26 ã ỳc gel: Cho gel vào khuôn cho gel ngập lược khoảng 3mm đợi đến gel nguội hoàn toàn đặt gel vào bể điện di • Tra ADN: - Nếu ADN tổng số lấy 5µl ADN trộn với 1µl Loading dye 6X, mix tra vào giếng - Nếu ADN sản phẩm PCR lấy µl tra vào giếng • Sau chạy điện di xong lấy gel quan sát đèn UV, chụp ảnh nhận xét kết 2.5.4 Phương pháp tinh sản phẩm PCR giải trình tự Những sản phẩm PCR sau khuếch đại thành công tinh kit Purification KIT hãng Norgen, Canada sản xuất Các bước tinh sau: Bước 1: Thêm tỉ lệ thể tích 1:5 Binding solution vào ống chứa sản phẩm PCR (1 thể tích sản phẩm PCR cần thể tích Binding solution) sau trộn Bước 2: Chuyển tối đa 750 dung dịch thu từ bước sang cột lọc collection tube Ly tâm với 8000 vòng/phút phút Loại bỏ dung dịch lọc qua cột Lưu ý: Nếu dung dịch thu từ bước nhiều 750 lặp lại bước hết dịch Bước 3: Thêm 500 Washing solution vào cột lọc Ly tâm 10000 vòng/phút phút Bỏ dịch lọc qua cột Bước 4: Lặp lại bước 3, ly tâm 14000 vịng/phút phút để loại bỏ hồn toàn dịch Bước 5: Lắp cột vào ống 1,5 ml Thêm 50 Elution buffer vào trung tâm màng cột collection tube, để nhiệt độ phịng phút sau ly tâm phút 13000 vòng/phút Sản phẩm PCR tinh đưa xác định trình tự nucleotid Trình tự nucleotide đọc máy ABI PRISM®3730xl DNA Analyzer (ABI, Foster City, CA, USA) Selangor, Malaysia 27 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết tách ADN tổng số DNA tổng số tách chiết theo phương pháp CTAB Sahai Maroof cs, (1984) mô tả mục 2.5.1 chứng tỏ quy trình có hiệu để phân lập ADN từ Gõ đỏ ADN tổng số sau tách chiết kiểm tra điện di gel agarose 1% Kết thể hình 3.1 Hình 3.1: Kết điện di ADN tổng số mẫu Gõ đỏ Ghi chú: giếng từ 1-5: mẫu GL1-GL5 Chất lượng ADN tổng số (độ độ nguyên vẹn) sau tách chiết từ mẫu nghiên cứu có ảnh hưởng nhiều đến kết phân tích ADN kĩ thuật sinh học phân tử, đặc biệt phản ứng PCR Kết thu hình 3.1 cho thấy băng ADN tổng số có kích thước lớn, băng sáng, gọn, bị đứt gãy chứng tỏ hàm lượng ADN mẫu cao (không lẫn protein polysaccharide), bên cạnh băng có độ sáng tương đương chứng tỏ mẫu có nồng độ tương đối đồng Những đặc điểm cho thấy phương pháp tách chiết sử dụng nghiên cứu phù hợp với đối tượng Gõ đỏ xuất xứ Lào ADN tổng số có độ tinh cao, đáp ứng yêu cầu phục vụ cho thí nghiệm 3.2 Kết PCR nhân gen với mồi đặc hiệu Sau tách chiết ADN tổng số, mẫu ADN dùng làm khuôn để nhân đoạn gen trnL, rbcL, psbA-trnH, matK kỹ thuật PCR 28 với cặp mồi có trình tự nucleotide bảng 2.4 Sau thực phản ứng PCR thu kết sau: 3.2.1 Kết nhân gen trnL với cặp mồi đặc hiệu Thành phần điều kiện phản ứng PCR mô tả phần phương pháp (mục 2.5.3, bảng 2.2 2.3), sản phẩm PCR mẫu tiến hành điện di gel agarose 1,2% Kết điện di thể hình 3.2: M 750bp Hình 3.2: Kết nhân đoạn gen trnL từ mẫu Gõ đỏ thu đƣợc Ghi chú: M: marker 100bp; giếng từ 1-5: mẫu GL1-GL5 Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy, đoạn gen trnL khuyếch đại thành công tất mẫu Ở mẫu thu băng ADN sáng rõ nét, khơng có băng ADN phụ xuất hiện, kích thước khoảng 700 - 750bp phù hợp với kích thước lý thuyết đoạn gen trnL dự kiến nhân Kết lần khẳng định chất lượng kích thước đủ lớn không lẫn tạp chất (polysacarit, phenol) gây ảnh hưởng đến nhân dịng PCR, điều cho thấy sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnL đặc hiệu, sử dụng trực tiếp sản phẩm để xác định trình tự nucleotide 29 3.2.2 Kết nhân gen rbcL với cặp mồi đặc hiệu M 700bp Hình 3.3: Kết nhân đoạn gen rbcL từ mẫu Gõ đỏ thu đƣợc Ghi chú: M: marker 100bp; giếng từ 1-5: mẫu GL1-GL5 rbcL trình tự gen nằm lục lạp nhân cách dễ dàng nhiều thực vật Ở lồi khác kích thước gen khác Từ hình 3.3 cho thấy đoạn gen rbcL khuyếch đại thành công, băng ADN thu rõ nét, đậm nét giếng 5, kích thước khoảng 650 bp phù hợp với kích thước lý thuyết đoạn gen rbcL Điều cho thấy sản phẩm PCR nhân đoạn gen rbcL đặc hiệu, sử dụng trực tiếp sản phẩm để xác định trình tự nucleotide 3.2.3 Kết nhân gen psbA-trnH với cặp mồi đặc hiệu M 445bp Hình 3.4: Kết nhân đoạn gen psbA-trnH từ mẫu Gõ đỏ thu đƣợc Ghi chú: M: marker 100bp; giếng từ 1-5: mẫu GL1-GL5 Đoạn psbA-trnH có kích thước trung bình khoảng 450 bp theo lý thuyết, thực tế thay đổi từ 296 – 1120 bp tùy thuộc loài psbA-trnH có khả xác định lồi cao Trong thí nghiệm này, ADN tách chiết làm khuôn để nhân đoạn gen psbA-trnH phương pháp PCR với cặp mồi 30 đặc hiệu với trình tự mồi nêu bảng 2.4 Kết PCR cho thấy đoạn băng sáng rõ đồng đều, khơng xuất băng phụ Kích thước khoảng 440 bp, đủ điều kiện để tiến hành xác định trình tự nucleotide 3.2.4 Kết nhân gen matK với cặp mồi đặc hiệu M 890 bp Hình 3.5: Kết nhân đoạn gen matK từ mẫu Gõ đỏ thu đƣợc Ghi chú: M: marker 100bp; giếng từ 1-5: mẫu GL1-GL5 Từ kết ADN tổng số, đoạn gen matK tiến hành nhân lên phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu Từ hình 3.5 cho thấy kết ADN lên sáng rõ, đồng tất giếng, khơng xuất băng phụ, kích thước băng khoảng 890 bp Điều cho thấy gen matK phù hợp với cặp mồi tiến hành xác định trình tự nucleotide 3.3 Kết phân tích trình tự nucleotide đoạn gen matK Kết PCR nhân gen nghiên cứu với mồi đặc hiệu sau kiểm tra điện di gel agarose 1,2%, tinh Kit tinh mô tả mục 2.5.4 Các sản phẩm tinh gửi giải trình tự Selangor, Malaysia Chất lượng trình tự nucleotide cao tất mẫu, tỷ lệ đọc thành cơng 100% Trình tự nucleotide sản phẩm PCR cho thấy, đoạn gen matK có kích thước 889 bp Trình tự mã vạch so sánh với loại mã vạch công bố ngân hàng gen thu kết so sánh sau: Sử dụng cơng cụ BLAST có sẵn ngân hàng gen NCBI so sánh đoạn gen matK cho thấy chi Afzelia có trình tự cơng bố là: Afzelia Africana KX161926; Afzelia Africana KX673213; Afzelia Bipindensis 31 EU361847; Afzelia Bella EU361846; Afzelia Quanzensis EU361848; Afzelia Quanzensis KX161930 So sánh trình tự đoạn gen matK nghiên cứu với đoạn gen matK loài Afzelia Bipindensis mã số EU361847.1 cho thấy có tương đồng 99% (885/889 nucleotide) Có sai khác vị trí là: Thay T A vị trí Thay A G vị trí Thay T C vị trí 20 Thay C A vị trí 781 Score Expect Identities Gaps Strand 1620 bits(877) 0.0 885/889(99%) 0/889(0%) Plus/Plus Query ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTCAAACCCTTCGTTACTGGGTGAAAGATGCCTCTT Sbjct 455 ACCCTATCCATCTGGAAATTTTGGTTCAAACCCTTCGTTACTGGGTGAAAGATGCCTCTT 514 Query 61 CTTTTCATTTATTAAAGCTCTTTCTTCACGAGTATTGTAATTGGAACATTCTTATTACTT 120 |||| 60 ||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 515 CTTTTCATTTATTAAAGCTCTTTCTTCACGAGTATTGTAATTGGAACATTCTTATTACTT 574 Query 121 CaaaaaaaTCGATTTCTACTTTTTCAAACAGGAATCCAAGATTCTTCTTGTTCCTATATA 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 575 CAAAAAAATCGATTTCTACTTTTTCAAACAGGAATCCAAGATTCTTCTTGTTCCTATATA 634 Query 181 ATTTTTATCTATGTGAATACGAATCTATCTTCCTTTTTCTCCGTAACAAATCTTCTCATT 240 Sbjct 635 ATTTTTATCTATGTGAATACGAATCTATCTTCCTTTTTCTCCGTAACAAATCTTCTCATT 694 Query 241 TACAATTAAAATCTTCGGTAGTCCTTTTTGAGCGAATCTATTTCTATGGAAAAATGGAAT 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 695 TACAATTAAAATCTTCGGTAGTCCTTTTTGAGCGAATCTATTTCTATGGAAAAATGGAAT 754 Query 301 ATCTTGTAAAAGTCTTTACTAAGGATTTTCTGTCTATCTTATGGTTTTTCAAGGACCCTT 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 755 Query 361 ATCTTGTAAAAGTCTTTACTAAGGATTTTCTGTCTATCTTATGGTTTTTCAAGGACCCTT 814 TCATTCATTATGCTCGATATAAAGGAGAATCCATTCTGGCTTCAAAGAATACCCCTCTTG 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 815 TCATTCATTATGCTCGATATAAAGGAGAATCCATTCTGGCTTCAAAGAATACCCCTCTTG 874 Query 421 TGATGAATAAATGGAAATACTATCTTATCAATTTATGGCAATGTCATTTTTATGTTTGGT 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 875 TGATGAATAAATGGAAATACTATCTTATCAATTTATGGCAATGTCATTTTTATGTTTGGT 32 934 Query 481 CTCAACCAGGACGGATCCATATAAACCAATTATCCGAGCATTCATTCTACTTTTTGGGTT 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 935 CTCAACCAGGACGGATCCATATAAACCAATTATCCGAGCATTCATTCTACTTTTTGGGTT 994 Query 541 ATTTTTCCAGTGTACGGCGAAATCCTTCAGTGGTACGGAGTCAAATGCTGGAAAATTCAT 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 995 Query 601 ATTTTTCCAGTGTACGGCGAAATCCTTCAGTGGTACGGAGTCAAATGCTGGAAAATTCAT 1054 TTCTAATAGAAAATGTTATGAAAAAGCTTGATACAAAAGTTCCAATTATTCCTATAATTA 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1055 TTCTAATAGAAAATGTTATGAAAAAGCTTGATACAAAAGTTCCAATTATTCCTATAATTA 1114 Query 661 GATCATTGGCTAAAGCGAAATTTTGTACCATATTAGGGCATCCCATTAGTAAGCCGGTCT 720 Sbjct 1115 GATCATTGGCTAAAGCGAAATTTTGTACCATATTAGGGCATCCCATTAGTAAGCCGGTCT 1174 Query 721 GGGCCGATTTATCCAATTTGGATATTCTTGACCTATTTGTGCGAATATGCAGAAATCTTT 780 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1175 GGGCCGATTTATCCAATTTGGATATTCTTGACCTATTTGTGCGAATATGCAGAAATCTTT 1234 Query 781 ATCATTATTACAATGGATCCTCAAAAAAAAAGAGTTTATATCGAATAAAATATATACTTC 840 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1235 CTCATTATTACAATGGATCCTCAAAAAAAAAGAGTTTATATCGAATAAAATATATACTTC Query 841 GGCTTTCTTGTATTAAAACTTTGGCTCGTAAACACAAAAGTACTGTACG Sbjct 1295 1294 889 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCTTTCTTGTATTAAAACTTTGGCTCGTAAACACAAAAGTACTGTACG 1343 3.4 Xây dựng phát sinh chủng loại Dựa vào kết sơ trên, chúng tơi xây dựng quan hệ lồi A Xylocarpa nghiên cứu với loài Afzelia ngân hàng gen NCBI (Afzelia Africana KX161926; Afzelia Bipindensis EU361847; Afzelia Bella EU361846; Afzelia Quanzensis KX161930, Afzelia Quanzensis EU361848; Afzelia Bipindensis KX161929) ClustalW2 (có sẵn địa website http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle) để tạo quan hệ di truyền với loài khác công bố NCBI là: 33 Bảng 3.1 Hệ số tƣơng đồng loài so sánh NCBI Hệ số tƣơng đồng so STT Tên loài với mẫu A xylocarpa Afzelia Africana (KX161926) 99% Afzelia bipindensis (EU361847) 99% Afzelia bella (EU361846) 99% Afzelia quanzensis (KX161930) 99% Afzelia quanzensis (EU361848) 99% Afzelia bipindensis (KX161929) 98% Kết thể Hình 3.6: Hình 3.6 Cây quan hệ di truyền loài Gõ đỏ với lồi khác đƣợc cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI Kết hình 3.6 cho thấy lồi Gõ đỏ (Afzelia Xylocarpa) có quan hệ gần gũi với loài Afzelia Bipindensis (KX161929) cách xa so với loài khác Các kết thu nghiên cứu sở liệu góp phần phục vụ công tác nhận diện giám định loài Gõ đỏ (Afzelia Xylocarpa) 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua trình nghiên cứu phân tích, đề tài rút số kết luận sau: Đã tách chiết thành công ADN tổng số từ mẫu Gõ đỏ xuất xứ Lào Đã nhân thành công đoạn gen trnL, rbcL, psbA-trnH, matK từ nguồn ADN tổng số loài Gõ đỏ kĩ thuật PCR Đã xác định trình tự nucleotide đoạn gen matK sản phẩm PCR có kích thước 889 bp sai khác cặp nucleotide đoạn gen matK loài Gõ đỏ (Afzelia Xylocarpa) loài Afzelia Bipindensis Đã xây dựng quan hệ di truyền lồi Gõ đỏ với lồi khác cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI cho thấy loài Gõ đỏ (Afzelia Xylocarpa) có quan hệ di truyền gần với loài Afzelia Bipindensis Kiến nghị Do trình nghiên cứu cịn hạn hẹp nên đề tài đưa số kiến nghị sau: Tiếp tục giải trình tự đoạn gen trnL, rbcL, psbA-trnH lồi Gõ đỏ so sánh với đoạn gen ngân hàng gen để thuận lợi cho việc giám định loài Tiếp tục nghiên cứu thêm loài khác thuộc Gõ đỏ để đánh giá tồn diện tính đa dạng phân bố Nghiên cứu ứng dụng mã vạch ADN để xây dựng sở liệu ADN mã vạch cho loài thực vật Việt Nam 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Mộng Chân (2000) Thực vật rừng Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Thượng Hiền (1995) Thực vật đặc sản rừng Trường Đại Học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh Trần Hợp (2002) Tài nguyên gỗ Việt Nam Nhà xuất Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015) Xác định mã vạch cho Trà hoa vàng Tam Đảo (camellia tamdaoensis) Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, số 5/2015, trang 123-124 Võ Thương Lan cộng (1990) Nghiên cứu tính đa dạng số loài rong câu vùng ven biển miền Nam Việt Nam kĩ thuật RAPD-PCR Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc, Tr 1321-1327 Đinh Hoàng Long, Đỗ Lê Thăng (2008) Cơ sở di truyền học phân tử tế bào NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Đức Lượng (2002) Công nghệ gen NXB Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Thanh Nga (2012) Đánh giá đa dạng di truyền số loài dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp) kỹ thuật AND mã vạch Luận văn ThS Di truyền học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội 10 Nguyễn Hoàng Nghĩa (1999) Bảo tồn đa dạng sinh học Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 12 Sách đỏ Việt Nam (2007) NXB Khoa học kỹ thuật, phần 11 Khuất Hữu Thanh (2006) Kĩ thuật gen nguyên lí ứng dụng NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội 12 Bùi Văn Thắng, Nguyễn Thị Hải Hà, Vũ Quang Nam, Nguyễn Thế Đại, Phan Văn Quynh, Nguyễn Ngọc Ánh (2017) Giám định số lồi Nưa hóa dẫn liệu hình thái phân tử Tạp chí Khoa học công nghệ Lâm nghiệp, số 13 Nguyễn Thị Phương Trang, Trần Thu Hương, Ludwig Triest, Nguyễn Minh Tâm (2014) Đặc điểm di truyền ba loài (Hopea) bị đe dọa tuyệt chủng Việt Nam Tạp chí Sinh học, số 36, tr 316-322 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 14 Ana S Barreira (2016) The multiple applications of DNA barcodes in avian evolutionary studies Genome, 59 (11), 899-911 15 Anders R (2012) DNA barcoding as a tool for the identification of unknown plant material: A casestudy on medicinal roots traded in the medina of Marrakech Uppsala University, Master of science (1 year) 16 Aron J Fazekas, Royce Steeves, Steven G Newmaster and Peter M Hollingsworth (2010) Stopping the stutter: ImProvements in sequence quality from regions with mononucleotide repeat can increase the usefulness pf non – coding regions for DNA barcoding taxon, 59,pp 694- 694 17 Asadatun Abdullah Hartmut Rehbein (2016) DNA barcoding for the species identification of commercially important fishery products in Indonesian markets Food Science Technology, 52(1), 266 – 274 18 Hamilton, M.B (1999) Four primer pairs for the aplification of chloroplast intergenic religions with intraspecific varation Molecular Ecology, 8, pp 513-525 19 Joey Shaw, Edgar B Lickey, Edward E Schilling, And Randall L Small (2007) Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms: the tortoise an the hare III American Journal of botany, 94, pp.275-288 20 Lichao Jiao , Min Yu , Alex C Wiedenhoeft , Tuo He , Jianing Li , Bo Liu , Xiaomei Jiang & Yafang Yin (2017) DNA Barcode Authentication and Library Development for the Wood of Six Commercial Pterocarpus Species: the Critical Role of Xylarium Specimens Scientific Reportsvolume, (1945) 21 Michael J Raupach (2015) The Application of DNA Barcodes for the Identification of Marine Crustaceans from the North Sea and Adjacent Regions Plos One 22 Nguyen Duc Thanh, Le Thi Bich Thuy, Nguyen Hoang Nghia (2012) Genetic diversity of Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib in Vietnam based on analyses of chloroplast markers and radom amplified polymorphic DNA (RAPD) African Journal of Biotechnology, 11 (80), 14529-14535 23 SaghaiMaroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A., Allard R.W (1984) Ribosomal DNA spacer – length polymorphism in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dynamics Proc Natl Acad Sci, 81, 80148019 24 S Ghaffariyan, S A Mohammadi and S Ahari zad (2012) DNA isolation protocol for the medicinal plant lemon balm (Melissa officinalis, Lamiaceae) Genetics and Molecular Research, 11 (2): 1049-1057 25 Soorner, D M (2009) DNA barcoding will frequently fail in complicated groups: an example in wild potatoes Am J Bot., 96, 1177 – 1189 26 Xiaohui Pang, Jingyuan Song, Yingjie Zhu (2011) Applying plant DNA barcodes for Rosaceae species identification Cladistics, 27(2), 165 – 170 27 http:// www.barcoding life.org