Bài giảng Công cụ và kỹ thuật khám phá Protein

Công cụ kỹ thuật khám phá giới Protein Thành Phố Hồ Chí Minh 5/2004 Giới thiệu Proteomics Thuật ngữ Proteome: phần protein chuyên biệt thời gian mặt tế bào biểu từ Genome Bộ gen: ổn định, đồng tế bào sinh vật nhiều thay đổi loài Protein lại biến động theo thời gian dễ dàng phản ứng với yếu tố bên ngoài, đặc biệt khác nhiều loại tế bào khác Giới thiệu Proteomics Proteomics trình nghiên cứu toàn protein hay phần protein bổ sung hình thành từ mô hay dòng tế bào Ngày nay, proteomics chia thành proteomics kinh điển (Classical) Proteomics chức Classical proteomics tập trung nghiên cứu vào toàn hệ protein từ hai dòng tế bào xử lý khác nhau, Proteomics chức nghiên cứu vào nhóm protein giới hạn Có ba vấn đề đặt cho Proteomics: 1) Các loại protein diện? 2) Một protein đặc trưng có tương tác với protein khác? 3) Protein đặc trưng (về mặt cấu trúc)? Giới thiệu Proteomics Thuật ngữ Proteomics bao hàm nghiên cứu rộng nhằm mục đích tìm hiểu giám sát hoạt động chức protein Proteomics bao gồm công việc tương tự tìm trình tự di truyền cấu trúc không gian ba chiều protein chức protein, phát triêûn kỹ thuật tách chiết protein lập hồ sơ protein, nghiên cứu tương tác protein với protein Proteomics hứa hẹn khám phá mục tiêu cho nghiên cứu dược phẩm thông qua việc nghiên cứu chức hàng ngàn protein chưa xác định mà người ta mong muốn phát nghiên cứu gen người Proteomics cung cấp liệu nghiên cứu để cải thiện chương ttrình phần mềm máy tính nhằm dự đoán cấu trúc protein từ trình tự DNA; Nó cho phép giải thích thông tin có chứa toàn gen Proteomes Nghiên cứu protein biểu từ Gene Phân tích Protein cách hệ thống đồng Bộ gen cung cấp điều kỳ diệu??? Tế bào DNA (genes) mRNA proteins Bộ gen cung cấp điều kỳ diệu??? Nhưng, có 30,000 gene gene người, mà có tới 100,000 protein hệ Proteome người Genomics cung cấp lượng lớn liệu, hầu hết chưa giải thích Trong số trường hợp, Genomics cho nhiều câu hỏi câu trả lời Các vấn đề nảy sinh proteomics hứa hẹn trả lời cho số câu hỏi việc nghiên cứu có hệ thống tất protein mã hóa gene CÁC PHƯƠNG PHÁP TRONG PROTEOMICS Điện di hai chiều - Two-dimensional electrophoresis (2-DE) công cụ thí nghiệm truyền thống đáng tin cậy phân tách hàng ngàn protein gel Xác định Protein khối phổ (mass spectrometry) công cụ tốt phân tích protein kỹ thuật chủ yếu lãnh vực nghiên cứu protein Protein microarrays cung cấp trình phân tích định lượng lượng lớn tương tác phân tử Nhiều thí nghiệm sử dụng Microarray thường thực chung với khối phổ Các phương pháp khác: X-ray crystallography, NMR, Edman degradation, etc ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2D-electrophoresis) • Kết hợp isoelectic focusing (IEF) SDS-PAGE – cho kết có độ phân giải cao nhiều so với phương pháp riêng biệt • IEF- phân tách protein dựa điện tích hay đểm đẳng điện (isoelectric points); • SDS-PAGE – Phân tách protein theo kích thước (size) Tối ưu hóa hiệu nhuộm protein  Khay nhuộm  Kệ lắc  Dung dịch nhuộm  Mô tơ quay Thiết bị lắc lý tưởng để tối ưu hoá hiệu nhuộm protein Các thuận lợi dùng 2-DE Các nguyên liệu (các chất phân giải từ tế bào, mô) áp dụng trực tiếp lên gel • Có thể phát gần toàn protein có mẫu • Xem xét thay đổi mẫu chuẩn mẫu cần nghiên cứu • Các protein tách chiết để thực nghiên cứu việc tìm hiểu cấu trúc chức protein Differential Expression A E Coli grown at 30º C B E Coli grown at 42º C Ghi nhận phân tích hình ảnh • Nhân tố quan trọng 2-D việc ghi lại hình ảnh kỹ thuật số, phương tiện thực tế để thu nhận liệu protein • Nó cho phép so sánh cách khách quan thông tin proteome, chuyển giao thông tin nhiều nghiên cứu khác nhau, cho phép lập danh mục số lượng lớn liệu protein • Các hình ảnh xử lý so sánh phần mềm vi tính Các hệ thống thu nhận hình ảnh GS-800™ Calibrated Densitometer Reflectance and Transmittance Modes 30 x 40 cm scanning area Molecular Imager® FX Pro Plus™ Multiimager System Fluorescence and Storage VersaDoc Imaging System CCD–Based UV / Visible, Fluorescence & Chemiluminescence PDQuest 7.1: Nét ý nghóa • • • Tăng cường hình ảnh cho gel nhuộm SYPRO Ruby Hệ liệu phân biệt Cải thiện tính cho công cụ quan sát protein – • Quan sát không gian ba chiều Tăng cường độ nhạy cho công cụ phân tích thống kê – – Cải thiện công cụ phân tích so sánh định lượng, người sử dụng chọn lựa mức độ phân tích khác Có thể phân tích lúc nhiều hai mẫu Xác định Protein OOOOO OOOOO OOOOO OOOOO OOOOO 2-D array gel / blot Imaging systems Image analysis Protein excision Mass spec identification Proteomics: Spot Cutter • Tự động phát cắt điểm protein tách gel • Phân phối vào giếng hay đóa thu mẫu • Hoạt động độc lập hay điều khiển phần mềm Proteomics: Spot Cutter Analysis image Spot Cutter image Xác định Protein • Các protein phân lập từ gel phân nhỏ để giải phóng phân tử peptide xác định trình tự • Xác định phân loại protein Micromass MassPREP Digestion Station • Rửa mẫu • ZipTip microSPE • Automated M@LDI target loading Micromass M@LDI HT Micromass networked MALDI TOF-MS & sample management system “2D-gel-MS analyser for proteomics factories” Mass Spectrometry Peptide-mass fingerprinting (100’s of samples/day) - MALDI-TOF MS Sequence tagging (10 samples/hour) - Proteins Not ID’d by “Fingerprinting” - ES MS/MS (Q-Tof) De novo sequencing (10 samples/day) - ES MS/MS (Q-Tof) MS in proteomics: protein sequencing Công cụ kỹ thuật khám phá giới Protein Chân thành cảm ơn! Thành Phố Hồ Chí Minh 5/2004