Phân lập và xác định cấu trúc của hợp chất chiết từ cao có hoạt tính chống oxy hóa của hoa cây đậu biếc ( clitoria ternatea, fabaceae )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ PHƯƠNG HÂN PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA HỢP CHẤT CHIẾT TỪ CAO CĨ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA HOA CÂY ĐẬU BIẾC (Clitoria ternatea, Fabaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ PHƯƠNG HÂN PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA HỢP CHẤT CHIẾT TỪ CAO CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA HOA CÂY ĐẬU BIẾC (Clitoria ternatea, Fabaceae) Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS VĨNH ĐỊNH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Lê Phương Hân Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ dược học khóa: 2019 – 2021 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất – Mã số: 8720210 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA HỢP CHẤT CHIẾT TỪ CAO CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA HOA CÂY ĐẬU BIẾC (Clitoria ternatea, Fabaceae) Lê Phương Hân Ngươi hướng dẫn khoa học: PGS.TS Vĩnh Định Từ khóa: Đậu biếc, Clitoria ternatea, chống oxy hóa Đặt vấn đề: Cây Đậu biếc (Clitoria ternatea L.) loại thảo dược công dụng làm chất màu thiên nhiên biết đến với khả chống oxy hóa Tuy nhiên, nghiên cứu Đậu biếc Việt Nam hạn chế Đề tài thực nhằm mang lại nguồn dược liệu hữu ích cho y học cổ truyền, làm dồi thêm nguồn thảo dược nước nhà Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Hoa Đậu biếc thu mua huyện Củ Chi vào tháng 10/2021 Thực định danh Đậu biếc Thử tác dụng chống oxy hóa in vitro cao phân đoạn chiết từ hoa Đậu biếc Áp dụng điều kiện chiết tối ưu để chiết xuất hoa Đậu biếc, sau phân lập chất tinh khiết sắc ký cột cổ điển xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết phân lập Kết quả: Định danh Đậu biếc nhờ vào đặc điểm hình thái; vi phẫu thân, lá, cuống lá, soi bột hoa kết trình tự đoạn ADN so sánh với liệu trình tự ADN Clitoria ternatea cơng bố trực tuyến BLAST SEARCH cho kết trùng khớp Cao ethyl acetat có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Điều kiện chiết tối ưu ngấm kiệt ethanol 70 % với tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi = 1:10 (g/mL) 24 Từ 33,7 g cao ethylacetat phân lập xác định cấu trúc hóa học acid palmitic (359,5 mg) Kết luận: Đã phân lập acid palmitic cao ethyl acetat có hoạt tính chống oxy hóa Master’s Thesis – Academic course: 2019 – 2021 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 ISOLATION AND STRUCTURE DETERMINATION OF THE COMPOSITION OF EXTRACT WITH ANTIOXIDANT ACTIVITIES FROM BUTTERFLY PEA FLOWER (Clitoria ternatea, Fabaceae) Phuong-Han Le Supervisor: Assoc Prof Dr Vinh-Dinh Keywords: Butterfly pea, Clitoria ternatea, antioxidant Introduction: Butterfly Pea (Clitoria ternatea L.) is an herbal that is used as a natural colorant and is also known for its antioxidant capacity However, the research on butterfly pea in Vietnam is still limited This study was carried out to fulfill the sourrce of medicinal materials for traditional medicine, enriching the national herbal source Materials and methods: Butterfly pea flowers were purchased in Cu Chi district in October 2021 Identification the scientific name of butterfly pea plant Testing in vitro antioxidant effects of extract from butterfly pea flower Optimum extraction conditions were applied to the butterfly pea flower extract, then the pure substances have been isolated by column chromatography and determined their structure by spectroscopy Results: Identification of butterfly pea plants based on morphological characteristics, microdissection of stems, leaves, petioles, flower powder and DNA sequence results was compared with the DNA sequence data of Clitoria ternatea published online on BLAST SEARCH for the same results Ethyl acetate extract has high antioxidant activity The optimal extraction condition is to soak up 70% ethanol with material/solvent ratio = 1:10 (g/mL) in 24 hours From 33.7 g of ethyl acetate extract, palmitic acid (359.5 mg) was isolated and determined the chemical structure Conclusion: Palmitic acid has been isolated from ethyl acetate extract with antioxidant activity i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU vii CHƯƠNG TỔNG QUAN .1 1.1 Tổng quan thực vật học .1 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật học Đậu biếc 1.2 Tổng quan thành phần hoá học 1.2.1 Thành phần hoá học Đậu biếc 1.3 Tác dụng dược lý công dụng đậu biếc 1.3.1 Tác dụng dược lý .5 1.3.2 Công dụng Đậu biếc y học cổ truyền 1.3.3 Độc tính .7 1.4 Chiết xuất phân lập chất từ Đậu biếc 1.5 Tổng quan chất chống oxy hoá – gốc tự 1.5.1 Khái niệm gốc tự 1.5.2 Bản chất gốc tự 10 1.5.3 Tác động gốc tự liên quan đến bệnh tật người 10 1.5.4 Các chất chống oxy hoá 11 1.5.5 Thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hố in vitro 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu .16 2.1.1 Nguyên liệu nơi thực 16 2.1.2 Dung mơi – hố chất, dụng cụ - trang thiết bị 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Định danh dược liệu 18 2.2.2 Phân tích sơ thành phần hố thực vật 22 2.2.3 Khảo sát điều kiện chiết xuất 22 ii 2.2.4 Chiết xuất cao toàn phần 23 2.2.5 Tách phân đoạn chiết phân bố lỏng – lỏng .23 2.2.6 Phương pháp sàng lọc hoạt tính chống oxy hố mơ hình in vitro 24 2.2.7 Phân lập tinh chế chất từ cao có tác dụng chống oxy hố 25 2.2.8 Xác định khả chống oxy hoá hợp chất phân lập .27 CHƯƠNG KẾT QUẢ 28 3.1 Nghiên cứu thực vật học 28 3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật .28 3.1.2 Đặc điểm vi phẫu Đậu biếc 30 3.1.3 Soi bột hoa Đậu biếc 32 3.1.4 Kết giải trình tự ADN .33 3.2 Nghiên cứu hoá học 34 3.2.1 Phân tích sơ thành phần hố thực vật 34 3.2.2 Khảo sát điều kiện chiết xuất 36 3.2.3 Chiết xuất phân lập chất từ cao có tác dụng chống oxy hoá 40 3.2.4 Phân lập chất từ cao EA 41 3.2.5 Xác định cấu trúc chất DP A1 48 3.2.6 Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hố cao phân đoạn hợp chất phân lập .51 CHƯƠNG BÀN LUẬN .53 4.1 Định danh dược liệu .53 4.2 Khảo sát sơ thành phần hóa học 53 4.3 Khảo sát điều kiện chiết xuất 53 4.4 Khảo sát tác dụng chống oxy hóa invitro cao phân đoạn chiết từ hoa Đậu biếc 54 4.5 Chiết xuất, phân lập tinh chế hợp chất 54 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 5.1 Kết luận 58 5.2 Kiến nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu – Chữ viết tắt Chữ nguyên ADN Acid Deoxyribonucleic br s Broad singlet Đỉnh đơn rộng C ternatea Clitoria ternatea Đậu biếc CF Cloroform CTPT Công thức phân tử DEPT Detortionless Enhancement by Polarization Transfer DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EA Ethyl acetat EtOH Ethanol F254 Fluorescence 254 nm FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power Năng lực chống oxy hoá khử sắt GC-MS Gas chromatography – Mass spectrometry Sắc ký khí đầu dò khối phổ HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence Phổ NMR cho thấy tương quan hai, ba bốn nối proton carbon HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ NMR cho thấy tương quan nối proton carbon IC 50 Inhibitory Concentration 50% Nồng đồ ức chế 50% IR Infrared Hồng ngoại J J - coupling Hằng số ghép kl/tt Khối lượng/ thể tích m multiplet Đỉnh đa MBC Minimum Bactericidal Concentration Nồng độ tối thiểu cần thiết để tiêu diệt vi khuẩn Ý nghĩa Phổ NMR cho biết số lượng proton liên kết carbon iv MeOH Methanol MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ tối thiểu tác dụng ức chế tăng trưởng vi khuẩn mức quan sát MS Mass Spectrometry Khối Phổ NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân ORAC Oxygen Radical Absorbance Capacity Khả hấp thụ gốc tự PĐ Phân đoạn PDA Photodiode Array Dãy diod quang ppm Parts per million Phần triệu Rf Retaration factor Hệ số lưu giữ TT VS Thuốc thử Vanilin – Sulfuric UV Ultraviolet Tử ngoại v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Dung mơi - hố chất 16 Bảng 2.2 Dụng cụ - thiết bị 17 Bảng 2.3 Các primer sử dụng giải trình tự gen .20 Bảng 2.4 Nồng độ thành phần tham gia phản ứng PCR 21 Bảng 2.5 Chương trình phân tích cho primer ITS P4U3 21 Bảng 2.6 Cách pha mẫu đo phương pháp DPPH 25 Bảng 3.1 Sơ thành phần hoá học hoa Đậu biếc - Clitoria ternatea L 35 Bảng 3.2 Kết thử nghiệm HTCO phương pháp DPPH mẫu cao 39 Bảng 3.3 Khối lượng cao sau chiết phân bố lỏng – lỏng 41 Bảng 3.4 Các phân đoạn từ cao EA qua cột nhanh 42 Bảng 3.5 Các phân đoạn kết tinh từ cột A .45 Bảng 3.6 Các phân đoạn kết tính từ cột B 47 Bảng 3.7 Dữ liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR mẫu PDA1 50 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-3 Phụ lục Phổ MS (-) DP A1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-4 Phụ lục Phổ MS (+) DP A1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-5 Phụ lục Phổ IR DP A1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-6 Phụ lục Phổ 1H-NMR DP A1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-7 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-8 Phụ lục Phổ 13C-NMR DP A1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-9 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-10 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-11 Phụ lục Phổ DEPT DP A1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-12 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-13 Phụ lục Phổ HSQC DP A1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-14 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-15 Phụ lục Phổ HMBC DP A1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-16 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-17 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn