Đ ặ c điểm,nguồngốcphátsinhcủaphenol vàPAH
Đ ặ c đ i ể m và n g u ồ n g ố c p h á t s i n h c ủ a p h e n o l 3 1.1.2.Đ ặ c đ i ể m và n g u ồ n g ố c p h á t s i n h c ủ a P A H
Phenol làmột đơn vịcấu trúc vòng thơm đơn giản nhất, mùi hăngv à c ó v ị rất đặc trưng mùi khói Phenol ít tan trong nước ở nhiệt độ phòng, tuy nhiên trên68 o C, nó tan hoàn toàn vào nước Phenol ít bay hơi ở nhiệt độ phòng (tốc độ bay hơichậmhơnnước)vàdễbịbốccháy(Gamietal.,2014).
Hiện nay, phenol được ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất nhựaphenolic, caprolactan và bisphenol A, thuốc tẩy uế, thuốc diệt côn trùng và các sảnphẩm dược phẩm Phenol và các dẫn xuất của nó tồn tại chủyếu ở trongn g u ồ n nướcthảicủanhiềungànhcôngnghiệpvà trongkhôngkhíbị ônh iễmthôngqua các hoạt động sinh hoạt thường ngày của con người: chế biến thức ăn, hút thuốc láv.v… (Al-Khalidet al., 2012) Bên cạnh đó, phenol còn được phát sinh từ các quátrìnhsảnxuấtvàsửdụngthuốctrừsâu,thuốcdiệtcỏnhư:2,4- dichlorophenoxyaceticacid(2,4-D)hay4-chloro-2- methylphenolxyaceticacid(MCPA) và pentachlorophenol (PCP), dinoseb (một loại thuốc diệt cỏ cũng đượcdùng như: thuốc diệt nấm và côn trùng bị EPA cấm sử dụng vào năm 1986 vì gây ranguy cơ dị tật trong sinh sản và vô sinh hoặc thuốc diệt cỏ)(Gamiet al., 2014;Rozánki, 1998) Phenol còn được phát sinh trong các phản ứng giữa chlorobenzenevàsodiumhydrocide,quátrìnhoxihóatoluenevàtổnghợptừbenzenevàpr opylene.Ngoài ra, phenol cũng được hình thành bởi các phản ứng hóa học xảy ratrong khí quyển trongquá trình nước bay hơi hình thànhm â y v à t r o n g q u á t r ì n h sinh tổng hợp bởi thực vật hay các phản ứng phân hủy các chất hữu cơ (US EPA,1980).
Ngoài cácnguồn phátsinh trênthì1nguồn phát sinhphenol đángphảikểđếnđólàtạicácbểthugomnướcthảicủacáckhobểvàcáccửahàngxăngdầudohi ện tượng rò rỉ, rơi rớt xăng dầu trong quá trình xúc rửa các bể chứa dầu, vận chuyểnxăngdầutừ khotớicáccâyxăngdầuđểtiêuthụ(Yuetal.,2013).
PAH (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons) được sử dụng để chỉ một số cácchất hữu cơ gồm hai hay nhiều vòng hydrocarbon thơm liên kết với nhau Có hơn100 loại PAH khác nhau trong đó có 16 loại PAH được nghiên cứu tỉ mỉ do chúngnguy hại hơn so với các loại PAH khác và được xác định là có nồng độ cao nhất tạicác vị trí nguy hiểm trong Danh sách các quốc gia được ưu tiên (NPL - NationalPriorities List) củacơquanbảovệmôitrườngcủaMỹ(Hình1.1).
Trongtựnhiên,PAHthườngtồntạiởdạnghỗnhợp,ítthấyởdạngđơnlẻ.Tại nhiệt độ thường (từ 15-35 o C), PAH tinh khiết tồn tại ở thể rắn, không màu hoặccómàutrắnghaymàuvàngchanhvàcómùihăngnhẹ.Tùythuộcvàokhốilượn g phân tử mà các PAH có những tính chất vật lý, hoá học khác nhau Nhìn chungchúng có nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ sôi cao, áp suất bay hơi thấp và rất ít tantrong nước nhưng tan tốt trong chất béo Một số đặc tính cơ bản của PAH được môtảtrongBảng1.1.
Nhiệt độsôi( o C) Độ tantrong nước(mg/l)
HệsốKp d cao,cácPAHcóxuhướngtăngkhảnănghấpphụlênbềmặtcácvậtliệur ắn,tươngứngvớikhảnănghòatancủanótrongnướccủanócũnggiảm.Độhòatantro ngnướccủaPAHtỷlệnghịchvớichỉsốKp.PAHlànhữngchấtkỵnước.K h ả n ă n g g â y ô n h i ễ m m ô i t r ư ờ n g t ù y t h u ộ c k h ả n ă n g h ò a t a n c ủ a c h ú n g trongmôitrường nước.Số lượngvòng benzene trong cấu trúc hóahọc củacác PAHquyếtđịnhkhảnănghòatancủacácPAHtrongnước.PAHgiảmkhảnănghòatantron g nước hay tăng tính kỵ nước khi số lượng vòng benzene tăng (Cerniglia,1992).Mộtv à i P A H đ ư ợ c s ử d ụ n g t r o n g d ư ợ c p h ẩ m v à đ ư ợ c l à m t h u ố c n h u ộ m ,nhựavàthuốc t r ừ cônt r ù n g Chúngcũngđượctìm thấytrongcá c nguồncơchất như: dầu thô, than đá, nhựa đường, dầu hỏa hay từ các hoạt động phun trào núi lửa.Chúng cũng được tìm thấy ở mọi nơi trong môi trường trong không khí, nước và đấttrong sinh hoạt hàng ngày của con người: việc hút thuốc, đun nấu bằng củi và dầuhỏa, đốt nóng các loại dầu khác nhau và nướng thịt Đặc biệt, PAH xuất hiện nhiềutrong quá trình cracking bẻ gãy các liên kết mạch dài của các chất hữu cơ có trongdầu mỏ, các công đoạn đúc sắt thép và sản xuất nhôm, than chì (US Department ofhealth and human services,1995).Cũng như phenol, nước thải nhiễm dầu tại các bểthu gom nước thải của các kho xăng dầu cũng là 1 nguồn phát sinh PAH lớn(Yuetal.,2013).
T í n h độcvàảnhhưởngcủaphenol,PAHtớimôitrường,sứckhỏe
Tínhđộcvàảnhhưởngcủaphenoltớimôitrường,sứckhỏecon ngườiv à đ ộ n g v ậ t 6 1.2.2.Tínhđộcvàảnhhưởngcủaphenoltớimôitrường,sứckhỏecon ngườiv à đ ộ n g v ậ t
Phenol là một trong những hợp chất vòng thơm đầu tiên được đưa ra trongdanh sách các chất ô nhiễm được chú trọng của USEPA Đã có nhiều nhà khoa họctrên thế giới nghiên cứu về tính độc cũng như ảnh hưởng của phenol lên sức khỏecon người và môi trường Liều gây độc cho người khi uống phải là từ 200 mg đến300 mg và liều gây chết là 3 g đến 30 g (Todoroviê, 2003) Phenol sau khi thấm vàotế bào, trải qua quá trình chuyển hóa chủ yếu với sự tham gia của các oxidase tronghệ thống Cytochrome P450 Quá trình chuyển hóa làm tăng độc tính do sự trao đổiđiện tích dẫn tới việc chúng có thể liên kết và phá hủy các phân tử DNA hoặc cácenzyme khác của cơ thể làm thay đổi cấu trúc của mô, gây đột biến và ung thư(Michałowicz and Duda,
2007) Ngoài ra, phenol còn là một chất gây kích ứng mắt,màng nhầy và da, gây co giật, suy gan, thận và một số cơ quan khác (Wasiet al.,2013).
Khiđộngvậthítlâuhơiphenolởnồngđộtrongkhoảng30đến60ppmcóthể gây tổn thương phổi, giảm cân và tê liệt Tiếp xúc cấp tính với phenol có thể gâysuy tim, suy thận Phenol gây cháy da, làm trắng và ănm ò n d a B ệ n h t ă n g n h ã n á p đãđượcthửnghiệmtrênthỏbằngcáchtiêm5%phenolchothấykhimắtthỏti ếp xúc với phenol dạng tinh thể hoặc dung dịch sẽ gây trắng giác mạc, sau 8 giờ giácmạc bị tê liệt Nhữngc o n c h u ộ t k h i u ố n g p h ả i n ư ớ c p h a
2 5 0 0 p p m p h e n o l t r o n g 103 tuần sẽ có hiện tượng gia tăng bệnh bạch cầu và các u lympho, mặc dù vậy chođến nay, phenol không được coi là chất gây ung thư Bên cạnh đó, khi tiếp xúc vớiphenol trong thời gian dài có thể dẫn đến chán ăn, da phát ban, câm điếc, rối loạntiêu hóa, nôn mửa, giảm cân, đau cơ, đau gan và rối loạn thần kinh Phenol và dẫnxuất của nó rất độc hại và được phân loại là vật liệu nguy hiểm (Gamiet al., 2014;Kumarietal.,2013).
1.2.2 Tính độc và ảnh hưởng của PAH tới môi trường, sức khỏe con người vàđộngvật
Hầu hết các loại thực vật đều rất nhạy cảm với PAH ở những mức độ khácnhau Trong quá trình trao đổi chất, thực vật có thể hấp thụ và hấp phụ PAH từ môitrường đất, nước và không khí vào cơ thể qua thân, rễ, lá của chúng Khi được hấpthụvàonhững tế bàothực vật,PAHlàmgiảmkhảnăngsinhtrưởng,sinhsả nvàpháttriểncủacácloàithựcvậtcũngnhưkìmhãmmộtsốquátrìnhsinhhọctrongh ệ sinh thái PAH được tích tụ trong hệ thực vật sẽ từ đó đi vào chuỗi thức ăn củađộng vật và gây ra những tác hại lâu dài và nghiêm trọng hơn Từ hệ thực vật, PAHđược hấp thụ vào cơ thể của một số loài động thực vật thông qua các chuỗi thức ăn.Do độ hoà tan trong nước của các PAH phân tử lượng nhỏ cao hơn của các PAHphân tử lượng lớn, chúng có khả năng gây độc trực tiếp đối với các cơ thể động vậtcao hơn là các PAH khối lượng phân tử lớn Tuy nhiên, các PAH phân tử lượng lớnlại khó phân huỷ sinh học hơn, chúng thường bị tích tụ rất lâut r o n g m ô i t r ư ờ n g cũng như trong cơ thể động vật (US Department of health and human services,1995).
Khi PAH được phóng thích từ các khu vực phát sinh chúng sẽ thâm nhập vàotrong các nguồn nước, đất và không khí ô nhiễm xâm nhập vào cơ thể người thôngqua các con đường: hít thở, ăn, uống, hút thuốc hoặc tiếp xúc qua da khi con ngườitiếp xúc với chúng trong một khoảng thời gian nhất định.P A H t h ư ờ n g t ồ n t ạ i ở dạngh ỗ n h ợ p , í t t h ấ y ở d ạ n g đ ơ n l ẻ d o v ậ y k h i b ị n h i ễ m P A H , c o n n g ư ờ i s ẽ b ị nhiễm hỗn hợp các PAH, chính điều này càng làm cho độc tínhc ủ a c h ú n g đ ư ợ c tăngcường(USDepartmentof healthandhumanservices,1995).
Do độ hoà tan trong nước thấp và độ hoà tan trong dầu cao nên khi xâm nhậpvào cơ thể người qua những con đường khác nhau, PAH có xu hướng bị tích tụnhiều hơn ở thận, gan và các mô mỡ của con người Một lượng nhỏ PAH có thể bịtích tụ ở lá lách, tuyến thượng thận và buồng trứng.Khi bị tích tụ, chúng có thể kếthợp hay phản ứng với một số chất khác trong cơ thể để hình thành nhiều loại hợpchất khác nhau Một số sản phẩm gây ra những tác hại nghiêm trọng hơn PAH vàmột số khác thì ít nghiêm trọng hơn đối với sức khoẻ của con người Tuy nhiên,cũng theo những nghiên cứu này, một số loại PAH thông thường không tồn trữ lâudài trong cơ thể con người. Thời gian lưu giữ của chúng trong cơ thể người chỉkhoảngvàingày,sauđólàđượcthải rangoàiquaphânvànướctiểu.
Khi bị nhiễm các hợp chất PAH thì các yếu tố như: liều lượng, thời gian tiếpxúc, con đường bị nhiễm (ăn, uống, tiếp xúc qua da, v.v…), hay tuổi, giới tínhtìnhtrạng sức khỏe được quan tâm USEPA cũng đưa ra mức nồng độ an toàn của PAHtrong quá trình tiếp xúc để không gây ảnh hưởng có hại cho sức khoẻ con người Cụthể: không nên tiếp xúc với một số chất PAH tại những nồng độ lớn hơn những mứcsau: 0,3 mg anthracene/kg cơ thể người; 0,06 mg acenaphthene/kg cơ thể người,0,04 mg fluoranthene/kg cơ thể người; 0,03 mg pyrene/kg cơ thể người v.v…(USDepartment ofhealthandhumanservices,1995). Để phòng tránh sự xâm nhập của PAH, chúng ta cần hạn chế và kiểm soát sựphát sinh của những hợp chất này trong sản xuất và sinh hoạt Ví dụ như giảm thiểuviệc sử dụng những nguồn nguyên, nhiên liệu có thể sản sinh ra PAH trong giaothông và công nghiệp, kiểm soát nghiêm ngặt các quá trình đốt để tránh các quátrình cháy không hoàn toàn của một số lò đốt rác thải, hạn chế hút thuốc và ăn cácsảnphẩmnướngcháy.
P h â n hủyphenolvàPAHbởivi sinhvật
P h â n h ủ y phenolb ở i v i s i n h v ậ t h i ế u k h í
Trên thế giới đã có nhiều công bố về các nhóm vi sinh vậthiếu khí có khảnăng sử dụng phenol như nguồn carbon và năng lượng duy nhất Chúng thuộc cácchi: Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas aeruginosa,Pseudomonasfluorescens, Bacilluscereus(AgarryvàSolomon,2013;Arifet al.,2012; Gamiet al., 2014; Krastanovet al., 2013; Liuet al., 2016; Nwanyannwu vàAbu,2013;Safontetal.,2012;Taghreed vàMu ft ah, 2012),
Những nghiên cứu về phân hủy sinh học hay chuyển hóa hiếu khí phenol đãđược nhiều tác giả quan tâm từ những năm 1969 Các tác giả đã chỉ ra rằng phenolcó thể được phân hủy theo con đường mở vòng ở vị trímeta-nhờ các loài vi khuẩnPseudomonassp.CF600;Pseudomonasputida,Pseudomonascepacia,Pseudom onaspickettivàAlcaligenedeutrophus(FeistvàHegeman,1969;Mahiudddin, 2012; Paisioet al.,
2013) hoặc ở vị tríortho- trong các nhóm vi sinhvật như:Pseudomonassp. CF600;Trichosporoncutaneum,RhodotorularuburavàAcinetobactercalcoacetium(K atayama-Hirayamaet al., 1991; Mahiudddin, 2012;Palleret al.,1995).
Quá trình phân hủy phenol dưới điều kiện hiếu khí là quá trình gắn thêm 1nhóm -OH vào vòng benzene tạo hợp chất trung gian catechol, hợp chất này sau đóđược mở vòng ở vị tríortho- (intradiol) hoặc vị trímeta- (extradiaol).Catechol bịoxy hóa theo con đường mở vòng ở vị tríortho- bởi catechol 1,2-dioxygenase haymởv ò n g ở v ị t r ímeta-t ạ o 2 - h y d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e b ở i c a t e c h o l 2 , 3 - dioxygenase Các sản phẩm cuối cùng của cả 2 con đường này tham gia vào chutrìnhTCA(tricarboxylicacidcycle)(Hình1.2,
P h â n h ủ y PAHb ở i v i s i n h v ậ t h i ế u k h í
Do độ hòa tan trong nước thấp nên các PAH rất bền vững và có thể được tíchtụ trong môi trường qua chuỗi thức ăn do vậy nó ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏecon người Một vài PAH có các vùng A, B, Bay, K và L Những vùng này khi trảiqua quá trình trao đổi chất tạo ra các epoxide có hoạt tính cao Trong môi trường, sựbềnvữngcủaPAHtrongmôitrườngphụthuộcvàođặctínhvậtlý,hóahọc,nồngđ ộ cũng như khả năng phân hủy sinh học của chúng Các PAH khối lượng phân tửlớn thường độc hơn và bền vững trong môi trường hơn các PAH khối lượng phân tửthấp(Chauhanet al.,2008).
Quá trình chuyển hóa PAH bởi vi sinh vật có thể tạo ra dạng không độc hoặcchuyển hóa hoàn toàn thành CO2dưới sự có mặt của nhiều enzyme do chính các visinh vật tổng hợp (Mahjoubiet al., 2013).Vi sinh vật phân hủy PAH thuộc nhiềunhómvisinhvậtkhácnhau:Pseudomonasputida,Pseudomonasfluorescens,Pseud omonaspaucimobilis,Pseudomonasmendocina,Pseudomonasvesicularis,Pseudomonas cepacia, Alcaligenes denitrificans,
Mycobacteriumsp.,Aeromonassp.,Alcaligenesfaecalis,Bacilluscereus,Vibriosp.,Cyclotro phicussp.,Stenotrophomonas maltophilia,Beijerinckiasp.,Micrococcussp.,Nocardiasp.,vàFlavobacteriumsp.
(Guiraudeta l.,2001; Liuet al., 2016) Các gen mã hóa chocác enzyme xúc tác cho quá trình phân hủy PAH được liệt kê ở Bảng 1.2 (Chauhanetal.,2008).
ChủngVSV Gen PAH Enzyme/chứcnăng
AN10 nahG Naphthalene Naphthalene-salicylate-1- hydroxylase
AKF2 phnC Phenanthrene Dihydroxyphenanthrenedi oxygenase
Nocardiodessp.KP7 phdA Phenanthrene α-dioxygenase
PYR-1 nidA, nidB Pyrene Dioxygenase
Phenanthrene,anthra cene,benzo(b)fluoran thene
Naphthalene,phenant hrene,anthracene Dioxygenase
NCIMB12038 narB Naphthalene cis- naphthalenedihydrodiolde hydrogenase
Phânh ủ y P A H c ó t h ể đ ư ợ c d i ễ n r a t h e o n h i ề u c o n đ ư ờ n g k h á c n h a u p h ụ thuộcvào cácnhóm vi sinh vậtthamgiavàoquátrìnhchuyểnhóa(Hình1.5).
- ChuyểnhóaPAHđếntrans-dihydrodiolbởivikhuẩnvànấm:Cáccytochrome P450 monooxygenease được sinh ra bởi một số loài vi khuẩn và vi nấm.Cácenzymenày chuyểnhóa PAHđếnEpoxide, sauđódạnghợp ch ấ t trun ggiannày được tái sắp xếp (không có sự tham gia của enzyme) thành dạng phenol hoặcđược hydrate hóa bởi epoxyde hydrolase đến dạngtrans-dihydrodiol Trong trườnghợp cácvi sinh vật chỉcóthểthựchiện theocáchchuyểnhóan à y t h ì c h ú n g s ẽ không sử dụng PAH như là nguồn carbon mà chỉ có thể loại bớt tính độc của PAHthànhcác PAHđỡđộchơn(Sutherlandetal., 1995).
- Chuyển hóa PAH tới quinon bởi nấm mục trắng: Sự phân hủy lignin vàcellulosebởimộtsốnấmmụctrắngchuyểnhóaPAHđếnquinonvàcácchấtkhác mà không thông quacishoặctrans-dihydrodiol bởi các enzyme như lignin/Mnperoxydasehaylaccase.
- Chuyển hóa PAH đếncis-dihydrodiol, phenol và sản phẩm cắt vòng bởi vivà vi khuẩn khuẩn lam: Quá trình phân hủy PAH hiếu khí trong hầu hết vi khuẩn vàvikhuẩnlamchủyếuthôngquasựoxyhóacácvòngthơmđếndạngcis-dihydrodiol có sự xúc tác của dioxygenease Sau đó các dạngcis-dihydrodiol đượcchuyển hóa tiếp đến catechol bởi dehydrogenase Hợp chất catechol có thể được mởvòngở v ị t r ío r t h o - t ạ o c i s , c i s- muconica c i d n h ờ h ệ e n z y m e i n t r a d i o l h a y v ị t r ímeta-tạo 2-hydroxymuconic semialdehyde nhờ hệ enzyme extradiol Các sản phẩmtrungnàytrảiquagiaiđoạnkhoánghóatạoCO2.
Trong một số vi sinh vật, khả năng phân hủy sinh học PAH tỷ lệ thuận với sốlượng vòng benzene và trọng lượng phân tử của PAH đó (Heitkamp và Cerniglia,1987) Cụ thể, 50% phân tử 3 vòng benzene là phenanthrene trong đất và trầm tíchđượcphânhủytừ16- 126ngày,trongkhi50%phântử4vòngbenzenelàbenzo[α]pyrene(BαP)mấtkhoảng229-]pyrene(Bα]pyrene(BαP)mấtkhoảng229-P)mấtkhoảng229- 1400ngày(ShuttleworthvàCerniglia,1995). Đối với các PAH có trọng lượng phân tử cao có từ 4 vòng benzene trở lênnhư pyrene đã được nghiên cứu cụ thể trong chủngMycobaterium vanbaaleniiPYR-
1doquátrìnhloại1và2nguyêntửoxygene(Breznaetal.,2005).Dựatrêncả đặc tính về gen và protein, Kimvà cộng sự,2007 đã xác định có 27 enzyme cầncho 25 bước tham gia vào quá trình phân hủy hoàn toàn pyrene theo con đườngo-phthalate and theβ- ketoadipate Những gen này thuộc tiểu phầnβhoặcαcủadioxygenase NdiAB2 được tìm thấy trong nhiều chủng vi khuẩn khác nhau (Kimetal.,2007).
Quá trình phân hủy sinh học các hợp chấtô n h i ễ m á p d ụ n g h ạ n c h ế v ớ i những vùng mà tập đoàn vi sinh vật bản địa phân huỷ không hiệu quả chất ô nhiễmhoặc các điều kiện môi trường tại đó không thuận lợi cho vi sinh vật,thời gian xử lýdài hơn, việc kiểm soát quá trình xử lý ô nhiễm khó tiến hành hơn và thường khôngkhảthivớicácvùngônhiễmquánặng.Đểkhắ c phụcnhữngkhókhăntrên,ứng dụng biofilm cho xử lý nước ô nhiễm dầu đang là một hướng đi mới và có nhiềutriểnvọngbởihệvisinhvậttrongbiofilmcókhảnăngphânhuỷnhiềuloạihydrocarbon khác nhau giúp các chủng vi sinh vật có khả năng chống chịu các điềukiện khắc nghiệt của môi trường tốt hơn, hỗ trợ trao đổi chất tốt hơn và hạn chế sựcạnh tranh của các vi sinh vật khác từ đó tăng cường quá trình phân hủy các chất ônhiễm(Chenget al.,2010).
C á c c ô n g n g h ệ x ử l ý
C ô n g n g h ệ s ử d ụ n g b ù n h o ạ t t í n h
Bùn hoạt tính làphương phápmàcác visinh vậtmà chủyếulàv i k h u ẩ n trong nước thải bám vào các chất lơ lửng trong đó để cư trú, sinh sản, phát triển vàcác vi sinh vật này sử dụng nguồn chất hữu cơ trong nước làm thức ăn đồng thờiphân hủy chất hữu cơ làm tăng sinh khối và dần dần tạo thành các hạt bông gọi làbùn hoạt tính Cơ chế quá trình phân huỷ các chất hữu cơ của phương pháp bùn hoạttính bao gồm các quá trình: Oxy hoá (phân huỷ) chất hữu cơ, tổng hợp tế bào
(đồnghoá)vàtựoxyhoá(hôhấpnộibào).Bùnhoạttínhsaukhixửlýsẽlắngxuốngđáy, dovậyphảitháolượngbùncặnnàyra.Nếukhôngkịpthờitáchbùncácsinhkhốivi sinh vật trong bùn sẽ tự phân hủy dẫn tới ô nhiễm nguồn nước thứ cấp, gây hiệntượng bùn khó lắng Nhưng nếu tháo bùn ra quá nhiều, nồng độ bùn hoạt tính trongnước không đủ dể phân hủy các chất hữu cơ dẫn tới giảm hiệu suất xử lý Một môhìnhxửlýsửdụngbùnhoạttính đượcthểhiệnởHình 1.6(Zhenget al.,2013).
Hình1.6.Sơđồhệthốngxử lýbằng phương phápbùnhoạttính
(1)-Bểlắngsơ cấp; (2) Bểbùnhoạttính; (3)-Bểlắngthứ cấp
Côngnghệsửdụngmànglọc
Côngn g h ệ x ử l ý n ư ớ c t h ả i s ử d ụ n g màngl ọ c M B R làcôngnghệđượcsửdụn gkháphổbiến hiệnnayvìn hữngưuđiểmvượt trội C ô n g nghệnày làsự kếthợpcủacảphươngphápsinhhọcvàlýhọc Mỗi đơn vị MBR được cấu tạo gồmnhiều sợi rỗng liên kết với nhau, mỗi sợi rỗng lại cấu tạo giống như một màng lọcvớicáclỗ lọcrấtnhỏmàmộtsốvisinhkhôngcókhảnăngxuyênqua
.CácđơnvịMBRnàysẽliênkếtvớinhauthànhnhữngmo dulelớnhơnvàđặtvàocácbểxử lý Cơ chế hoạt động của vi sinh vật trong công nghệ MBR cũng tương tự như bểbùnhoạttínhhiếukhínhưngthayvìtáchbùnsinhhọcbằngcôngnghệlắngthì côngnghệMBRlạitáchbằng màng.
TrongMBR,visinhvật,chấtônhiễm,bùnhoàntoànbịgiữlạitạibề mặt màng.Đồngthờichỉcónướcsạchmớiquađượcmàng.Phầnnướctrongđượcbơmhútr a n g o à i, p h ầ n b ù n nằm lạit r o n g b ể và đ ị n h k ỳ tháov ề bể c h ứ a b ù n V ì k í c h thước lỗ màng MBR rất nhỏ(0,01 ~ 0,2 àm) nờn bựn sinh học sẽ được giữ lại trongbờ̉, mật độ vi sinh cao và hiệu suất xử lý tăng Nước sạch sẽ bơm hút sang bểchứavàthoátrangoàimàkhôngcầnquabểlắng,lọcvàkhửtrùng.Máythổi khí ngoàicung cấp khí cho vi sinh hoạt động còn làm nhiệm vụ thổi các màng này đểhạn chếbịnghẹtmàng (Hình1.7)(Zhengetal.,2013).
Hai công nghệ kể này có nhiều ưu điểm như hiệu quả xử lý BOD cao tuynhiên cũng có nhiều hạn chế như: khi vận hành có thể phát tán bọt, chi phí điện cao,phải đầu tư thêm bơm tuần hoàn bùn, bơm thổi khí Ngoài ra, hệ thống vận hànhphức tạp do sau khi oxy hóa được 80,5 đến 90% BOD trong nước thải, nếu khôngkhuấy đảo hoặc thổi khí, bùn hoạt tính sẽ lắng xuống đáy, do vậy phải tháo lượngbùncặnnàyra.Nếukhôngkịpthờitáchbùncácsinhkhốivisinhvậttrongbùnsẽt ự phân hủy dẫn tới ô nhiễm nguồn nước thứ cấp, gây hiện tượng bùn khó lắng.Nhưng nếu tháo bùn ra quá nhiều,nồng độ bùn hoạt tính trong nước không đủ dểphânhủycácchấthữucơdẫntớigiảmhiệusuấtxửlý.Bêncạnhđó,dolượngbùn hoạt tính tháo ra sẽ được hồi lưu trở lại, nên luôn phải kiểm tra tuổi của bùn cũngnhư nồng độ bùn trong bể xử lý để đảm bảo cho quá trình xử lý đạt hiệu quả cao.Hơn nữa, những công nghệ này có những khó khăn nhất định khi áp dụng ở nhữngkhu vực có nguồn nước thải phức tạp như tại các bể chứa nước thải của các khoxăng dầu Tại đây, quá trình xúc rửa bể chứa hàng năm cũng xả thải ra một lượngcác hydrocarbon trong đó có các hợp chất vòng thơm khiến pH cũng như nhiệt độtrong nước thải thay đổi và điều này sẽ khiến hệ vi sinh vật bản địa khó thích nghivới điều kiện khó khăn từ đó sẽ làm giảm mật độ tế bào sinh vật do đó sẽ giảm hiệusuấtxử lý.
Chính vì vậy, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài này với mục tiêu là nghiêncứu cơ bản bước đầu về việc ứng dụng biofilmdo tập hợp các vi sinh vật tạo thànhđể xử lý các hợp chất hữu cơ khó phân hủy Trong biofilm các vi sinh vật sẽ liên kếtchặt chẽ với nhau và hỗ trợ nhau vì mỗi chủng vi sinh vật sẽ có 1 ưu thế nhất địnhtrong việc phân hủy 1 hợp chất hữu cơ Phương pháp sử dụng biofilm là sử dụng tậpđoàn các vi sinh vật có khả năng phân hủy dầu tốt được tạo biofilm và được bổ sungvào bể xử lý sinh học Khi được bao bọc bởi lớp màng EPS, biofilm có khả năngchống chịu các điều kiện môi trường thay đổi(thay đổi về pH, nhiệt độ, sự thẩm thấuhay sự mất nước của tế bào, v.v) tốt hơnvà hạn chế được sự cạnh tranh của các visinh vật khác từ đó làm tăng hiệu suất phân hủy các hợp chất ô nhiễm khi xử lýngoàihiệntrường(Hình1.8).
(1)-Bơmnướcthải; (2)-Biofilmtừcácchủng VSV;(3)-Sụckhí; (4)-Vannướcsauxửlý
M à n g sinhhọc (Biofilm)
K h á i n i ệ m v ề b i o f i l m
Biofilm là một tập hợp các vi sinh vật bám trên một bề mặt của vật thể rắnhoặc bề mặt chất lỏng, tạo thành lớp màng bao phủ bề mặt đó Phần lớn các vi sinhvật sinh trưởng trên môi trường bán lỏng đều có khả năng tạo ra biofilm Khu hệ visinh vật trong biofilm có khả năng chống chịu các điều kiện khắc nghiệt của môitrường tốt hơn, hỗ trợ trao đổi chất tốt hơn và hạn chế sự cạnh tranh của các vi sinhvậtkhác(O’Tooleetal.,2000).
V i s i n h v ậ t t ạ o b i o f i l m
Biofilm là cấu trúc thường gặp trong tự nhiên, trên 99% vi khuẩn sống trongbiofilmvàcóthểhìnhthànhtrênbềmặtsốnghoặcbềmặtnhưcácvángtrênmặtnước,cặnm áylọc,mômềmv.v… Đểtồntạitrongnhữngđiềukiệnkhắcnghiệt(thiếudinhdưỡng;thayđổicủapH,nhiệtđộ,v.v…) visinhvậtphảihọccáchbámlênbềmặt,liênkếtvớicácloàikhácđểcộngsinhvàtựbảovệmình(Ras togivàSani, 2011;Yamagaetal.,2010).
Biofilm có thểđượchình thànhtừm ộ t c h ủ n g ( b i o f i l m đ ơ n c h ủ n g ) h o ặ c nhiềuchủngvisinhvậtkhácnhau(biofilmđachủng),v.v….Trongt ự n h i ê n , bio film thường tồn tại ở dạng đa chủng Một nghiên cứu của đã chỉ ra rằng, biofilmđược tạo thành từ 4 loài vi khuẩnMicrobacterium phyllosphaerae,Shewanellajaponica,Dokdonia donghaensisvàAcinetobacter lwoffiicó mật độ cao hơn 167%so với biofilm đơn chủng của các chủng đó tương ứng (Burmolleet al., 2006). Vikhuẩnbámvàobềmặttheonhiềucáchkhácnhau.Mộtsốvikhuẩntựbảnthânđãcótính kết dính nhờ lipopolysaccharides ngoại bào cộng với những đặc tính cấu trúc tếbàohỗtrợchoviệcdichuyểnđếnbềmặtlàcácphầnphụgốcproteinsnhưlôngnhunghoặclôngroi.Các vikhuẩnkhácchỉtổnghợpchấtkếtdínhcầnthiếtkhixuấthiệnbềmặt cho chúng bám vào, điển hình như trong vòng 15 phút khi vi khuẩn gây viêmđườnghôhấpPseudomonasaeruginosagặpmột mặtkính,nósẽkích hoạtngaymộtgen cần để tổng hợp polysaccharides, khi vi khuẩn đã gắn vào bề mặt, chúng phânchiav à l i ê n t ụ c s ả n x u ấ t n h i ề u p o l y s a c c h a r i d e s đ ể t ạ o n ê n m à n g s i n h h ọ c h o à n chỉnh(Barkenet al.,2008).
Vi khuẩn trong biofilm có nhiều thuận lợi hơn là những vi khuẩn lơ lửng tựdo trong nước Trước hết, chúng chia sẻ thông tin di truyền và hỗ trợ trao đổi chấtcho nhau như trong biofilm ở cao răng, vi khuẩnVeillonellasử dụng lactate do vikhuẩnStreptococcussinh ra Thứ hai, vi khuẩn trong biofilm được bảo vệ khỏi kẻthù và các hoá chất độc hại như các động vật nguyên sinh, các loại tảo độc hại(Dinoflagellates- tảo roi) và khuẩn độc (Myxobacteria- niêm khuẩn); thuốc khángsinh, hoá chất, kháng thể, tế bào miễn dịch, v.v … làm hại ỞP aeruginosa, khi xửlý chất kháng sinh tobramycin với nồng độ 0,05 mg/ml đã làm giảm 82% khả năngsinh trưởng của vi khuẩn này nếu tồn tại ở dạng lơ lửng mà không ảnh hưởng gì nếutồntạidướidạng biofilm(Burmolleetal.,2006;ĐăngHưng,2013).
Một số vi khuẩn có khả năng tạo biofilm phân theo nhóm vi khuẩn Gram. CụthểnhưnhómvikhuẩnGram(-)như:Pseudomnasaeruginosa,Pseudomnasfluorescen s,EscherichiacolivàVibriocholeraehaynhómvikhuẩnGram(+)như:Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Bacillus, Rhodococcusvàmột số cầu khuẩn khác (Khusnuryaniet al., 2014; Luet al., 2012; Vanysackeret al.,2013).
Sự hình thành biofilm được bắt đầu khi vi khuẩn có các tín hiệu môi trườngtrên bề mặt Những tín hiệu môi trường rất đa dạng tùy thuộc vào từng loài vi sinhvật khác nhau Vídụnhư:P aeruginosavàP fluorescenssẽhìnht h à n h b i o f i l m dưới mọi điều kiện mà chúng có thể sinh trưởng được(O’Toole và Kolter, 1998a).Mặt khác, một số chủng như:E coliK-12vàV choleraekhông hình thành biofilmtrong môi trường thiếu acid amine(Watnick và Kolter, 1999) Trong khi đó,E coliO517:H7 chỉ có thể hình thành được biofilm trong môi trường cạn kiệt nguồn dinhdưỡng(Dewanti và Wong, 1995) Ngoài ra, hàm lượng dinh dưỡng, điều kiện môitrường như: nhiệt độ, nồng độ muối, pH, sắt và O2cũng ảnh hưởng tới quá trình tạobiofilm(O’Tooleetal.,2000;WatnickvàKolter, 1999).
Giống như nhóm vi khuẩn Gram (-), nhóm vi khuẩn Gram (+) cũng sảnxuấtEPS hay còn gọi là “chất nhầy” khi chúng phát triển trên một bề mặt.
“Chấtnhầy” ảnh hưởng tới sự phát triển củabiofilm và giữ vai trò quan trọng trong việchìnhthànhcấutrúccủabiofilm.S.epidermidistăngkhảnăngtạo“chấtnhầy”t rong môi trường thiếu sắt khi nguồn dinh dưỡng bị hạn chế (Deighton và Borland, 1993).Bên cạnh đó, việc sản xuất vỏ Polysaccharide/Adhesin có vai trò quan trọng tới việctạo ra “chất nhầy” và cũng là bước quan trọng trong việc gắn kết các tế bào vi sinhvật ở giai đoạn sau (Mulleret al., 1993) Việc tương tác đầu tiên của tế bào và bềmặttrảiquanhiềubiếnđổidosựthayđổicủabiểuhiệncácgen.TrongStaphylococcus mutans, việc biểu hiện gengtfBC(mã hóa cho việc chuyển hóaglucosyl khi có mặt các polymer glucan) trong biofilm cao hơn từ 10-70 lần so vớicác tế bào tự do, trong khi đó, genftftham gia tổng hợp polymer có mứcbiểu hiệngiảmkhoảng 100 lần (Burneet al., 1997).
Bên cạnh vi khuẩn, nấm men là sinh vật điển hình thuộc nhóm vi sinh vậtnhân thật có khả năng tạo biofilm Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nấmmen có thể sử dụng nguồn ô nhiễm làm nguồn dinh dưỡng để sinh tổng hợp nên cácchất hữu cơ và tạo ra các sản phẩm trao đổi chất hữu ích Chính vì vậy,các nhà khoahọc đã tiến hành thử nghiệm và tìm được một số chủng nấm men có khả năng ứngdụngtronglĩnhvựcxửlýsinhhọc(Pathaketal.,2012).
Chủngnấm menYarrowia lipolyticađãđược chứngminhlà cók h ả n ă n g phát triển trên các nguồn dinh dưỡng carbon như: nước thải nhà máy dầu cọ, phânhủy TNT và các hydrocarbon khác như: alkane, acid béo, chất béo và dầu mỏ.Chủng nấm menRhodosporidium toruloidescũng đã được chứng minh là có khảnăng phân hủy sinh học dầu diesel
(Mrinalini và Jayanthi, 2011).Cũng trong năm2011, các tác giả Chandran và Das lần đầu tiên công bố các kết quả về việc sử dụngnấm menCandida tropicalistạo màng trên sỏi để xử lý dầu DO.Kết quả cho thấy,sau 10 ngày, các viên sỏi được bao phủ bằng biofilm do chủng này tạo ra có khảnăng phân hủy tới 97% dầu DO thí nghiệm Một nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng cácchủng nấm menCryptococcus terreusvàRhodotorula creatinivorasống trong điềukiện lạnh 10 o C có khả năng phân hủy phenol khi tạo biofilm trên các hạt zeolit tốthơnởdạngtếbàotự do(Krallishet al.,2006).
S ự h ì n h t h à n h b i o f i l m
Mộtquátrìnhhìnhthành điểnhình của biofilmcó thể đượctómtắt vào3 giai đoạn chính: Giai đoạn đầu là giai đoạn gắn, bị ảnh hưởng nhiều bởi các đặc tính bềmặtvàtỷlệcácvisinhvậtđượcvậnchuyểnđếnbềmặt.Haigiaiđoạnsaulàsựtăngsinh và tăng trưởng, bị ảnh hưởng bởi các yếu tố vận chuyển và sự khuếch tán chấtdinh dưỡng, lực cắt bề mặt của dòng chảy và tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật.Biofilm sẽ phân giải khi việc sản xuất các polymer ngoại bào bị hạn chế do hậu quảcủađộtbiến(Hình1.9).
Vi sinh vật bám vào bề mặt giá thể theo nhiều cách khác nhau Một số vi sinhvật tự bản thân nó đã có tính kết dính nhờ lipopolysaccharides ngoại bào cộng vớinhững đặc tính cấu trúc tế bào hỗ trợ cho việc di chuyển đến bề mặt là các phần phụgốc protein như lông nhung hoặc lông roi ở vi khuẩn Các vi sinh vật khác chỉ tổnghợp chất kết dính cần thiết khi xuất hiện bề mặt cho chúng bám vào, điển hình nhưtrong vòng 15 phút khi vi khuẩn gây viêm đường hô hấpPseudomonas aeruginosagặp một mặt kính, nó sẽ kích hoạt ngay một gen cần để tổng hợp polysaccharides,khi vi khuẩn đã gắn vào bề mặt, chúng phân chia và liêntục sản xuất nhiềupolysaccharides đểtạonênmàngsinh họchoànchỉnh(Barkenet al.,2008).
T h à n h p h ầ n , c ấ u t r ú c c ủ a b i o f i l m
Một biofilm trong tự nhiên gồm 2 thành phần chính: Thành phần tế bào vàEPS bao quanh cáctếbào, tạo nên cấutrúcđặctrưng chob i o f i l m ( H ì n h
5%tổngkhốilượngbiofilm,3-6% là EPS và ion, còn lại là nước Một tế bào riêng lẻ có thể tạo ra vài thành phần ngoạibào khác nhau tùy thuộc vào điều kiện môi trường, đặc tính của từng loài vi khuẩncũngnhư cáchthức hình thànhbiofilmcủachúng(Anderssonetal.,2009).
Hình 1.10 Cấu trúc mô phỏng của 1 biofilm (A) và cấu trúc hiển vi của biofilm dochủngBacillussubtilistạothành dướikínhhiểnviđiệntửquét(B)
Cấutrúcbiofilmbaogồmthànhphầntếbàoliênkếtvớinhaumộtcáchcótr ật tự đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào Mạng lưới cácchất ngoại bào có vai trò quy định sự sắp xếp tế bào đồng thời tạo nên những kênhdẫn truyền nước bên trong biofilm. Nhờ đó một dòng nước chảy có thể đi quabiofilm tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất dinh dưỡng đến khắp cáctế bào trong biofilm cũng như mang đi những chất thải không cần thiết (Dolan,2002) Biofilm có cấu trúc không đồng nhất, bao gồm nhiều lớp vi khuẩn hiếu khíbên trên và nhiều lớp vi khuẩn kỵ khí bên dưới Do các luồng nước chảy qua khuấyđộng nên các vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí song song tồn tại trong các hốc nhỏ phânbố khắp trong biofilm Chiều dày của biofilm thay đổi từ một vài μm thậm chí đếnvài cm tùy thuộc vào loài vi sinh vật,m thậm chí đếnvài cm tùy thuộc vào loài vi sinh vật, tuổi biofilm, lượng dinh dưỡng và áp lực dòngchảy(Chenget al.,2010).
Ngoài ra, cấu trúc của 1 biofilm chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như: đặc tính,cấu trúc của bề mặt; sự khuếch tán, thành phần dinh dưỡng; lực hút giữa bề mặt vớivi sinh vật; khả năng sinhEPS; độ kết dính giữa các tế bào; sự tăng trưởng của cácvisinhvật;lựccắt;nhiệtđộvàpH,v.v (Chengetal.,2010).
M ộ t s ố y ế u t ố ả n h h ư ở n g đ ế n s ự h ì n h t h à n h v à p h á
Đa số các chủng vi sinh vật sẽ hình thành biofilm dưới mọi điều kiện màchúng có thể sinh trưởng được(O’Toole và Kolter, 1998a) Chính vì vậy, các yếu tốảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của vi sinh vật cũng ảnh hưởng tới khả năng tạobiofilmcủachúng.
Chuyển hóa chất dinh dưỡng liên quan trực tiếp và phụ thuộc vào sự có mặtcủa các enzyme Vì vậy, có thể khẳng định rằng sự hình thành của một biofilm phụthuộc vào sự có mặt và tốc độ phản ứng của các enzyme mà kiểm soát sự phát triểncủacáchệthốngsinhlývàsinhhóacủavikhuẩn.Nhiệtđộcótươngquanvớitốcđ ộphảnứngcủacácenzymevìvậynóảnhhưởnglênsựpháttriểncủacáctếbào,từ đó tác động đến quá trình hình thành biofilm Ngoài ra, nhiệt độ môi trường cònảnh hưởng đến các đặc tính vật lý của các hợp chất bên trong và xung quanh tế bào(Garrettetal.,2008).SốlượnglôngroicủatếbàovikhuẩnListeriamonocytogenes phụ thuộc vào nhiệt độ Ở 35 o C có 1 lông roi, trong khi ở 21 o C chúng có 2 hoặc 3lông roi, ở 10 o C các tế bào này có thể biểu hiện tới một vài lông roi Như vậy, tươngtácbanđầugiữavikhuẩnvàbềmặtđểhìnhbiofilmtăngtheochiềugiảmnhiệtđộ do ở nhiệt độ thấp các polysaccharides có cấu trúc đồng nhất hơn (Herald và Zottola,1988).
Bên cạnh yếu tố nhiệt độ thì pH ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng vàphát triển của vi khuẩn Tế bào vi khuẩn có các kênh proton liên kết với màng vì thếmà các proton vận chuyển từ màng sinh chất tạo nên một lực đẩy proton Dòng vậnchuyển proton theo gradient điện thế, đáp ứng với lựcv ậ n c h u y ể n p r o t o n đ ể đ i ề u hòa pH trong bào tương Những đáp ứng vi khuẩn đến thay đổi pH bên trong và bênngoài tế bào thông qua sự điều chỉnh các hoạt động, tổng hợp các protein và liênquan đến nhiều quá trình tế bào khác nhau mà trực tiếp là việc sản xuất các polymerngoạibào(Garrettetal.,2008).
Ngoài 2 yếu tố nhiệt độ và pH thì nồng độ muối NaCl tác động trực tiếp lênsựhình thành biofilm thông qua đápứng với một số gen quy định cho sựh ì n h thành, phát triển biofilm và tác động gián tiếp qua ảnh hưởng đến sinh trưởng vàphát triển của vi sinh vật Đa số vi khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường có nồngđộmuốithấphơn2%,nhưng cũng cóm ộ t s ố l o ạ i v i k h u ẩ n s i n h t r ư ở n g t ố t t r o n g môi trường chứa nồng độ muối trên 30%, đó là các vi khuẩn ưa muối (halophilic)như:Halobacterium,Natronococcus,v.v…(Nesteretal.,1978).
Nguồn dinh dưỡng như: Carbon (C), nitrogen (N), là các chất cần thiết choquá trình sinh tổng hợp của tế bào vi sinh vật Tuy nhiên, nồng độ dinh dưỡng trongmôi trường quá cao cũng có thể ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật do vậy ảnhhưởng đến quá trình hình thành biofilm (O’Tooleet al., 2000) Vi sinh vật có khảnăng đồng hóa nhiều loại C và N khác nhau, trong đó nguồn C có thể là các loạicarbonhydrate đơn giản như: đường đơn, đường đôi hoặc phức tạp như: tinh bột,cellulose, xylan Còn nguồn N tồn tại ở dạng vô cơ như: urea, ammonium sulfate,natri nitrate và ở dạng các hợp chất hữu cơ cao phân tử như: cao thịt, cao thịt bò, bộtđậutương,bộtcáhaypeptone.TùyloàivisinhvậtmànguồnNđượcsửdụngl à khác nhau Đa số các loài có khả năng sử dụng cả nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ,tuy nhiên mức độ đồng hóa từng loại N để sinh trưởng lại phụ thuộc vào từng loài(Nesteret al.,1978).
Ngoài các yếu tố kể trên ra thì đặc tính bề mặt, đặc tính tế bào, tốc độ dòngchảy và tín hiệu liên hệ giữa các tế bào cũng là những yếu tố ảnh hưởng tới sự hìnhthành và tồn tại của biofilm (Davey và O’Toole, 2000; Mangwaniet al.,2012;Morikawaetal., 2006).
Ứ n g dụng c ủ a b io fi lm trongph â nh ủ y sinhhọ c
Ứng dụng biofilm trong phân hủy sinh học cho hiệu quả xử lý và có tính antoàn hơn đã thay thế cho xử lý sinh học với các vi sinh vật dạng tự do Các tế bàotrong biofilm dễ thay đổi để thích ứng và tồn tại đặc biệt suốt thời kỳ bị áp lực,giống như chúng được bảo vệ trong khung polymer ngoại bào (Kokareet al., 2009).Với mật độ sinh khối cao, mối quan hệ gần gũi, các tương tác vật lý và sinh lýh ỗ trợ giữa các vi sinh vật trong biofilm mà việc sử dụng các chất độc hại tốt hơn thôngqua khả năng cố định các hợp chất nhờ hấp phụ sinh học,sự tích lũy sinh học (tăngsự tích tụ của vi khuẩn dưới nguồn ô nhiễm), và sự khoáng hóa, do đó, biofilm đượcứngdụngxửlýsinhhọctheonhiều hướng(Bayatetal.,2017;Singhetal.,2006).
Tại Mỹ, Châu Âu (HàLan, Đức, v.v…) vàN h ậ t B ả n h ệ t h ố n g b i o f i l m đ ã đượcứngdụngthànhcôngvàhiệuquảtrongxửlýmùi.Đâylàmộtphươngphá phấp dẫn để xử lý các chất khí có mùi hôi và các hợp chất hữu cơ bay hơi có nồng độthấp.Tronghệthốngnày,cácvisinhvậtsẽtạothànhmộtmàngsinhhọc.Đâylà một màng mỏng và ẩm bao quanh các nguyên liệu lọc Trong quá trình lọc, khí thảiđược bơm chậm, xuyên qua hệ thống lọc, các chất ô nhiễm trong khí thải sẽ bị cácvật liệu lọc hấp thụ Các chất gây ô nhiễm sẽ bị hấp phụ bởi màng sinh học Tại đây,các vi sinh vật sẽ phân hủy chúng để tạo nên năng lượng và các sản phẩm cuối cùnglà khí cacbonic và nước Hệ thống biofilm trước đây thường được thiết kế để xử lýmùic ủ a c á c h ệ t h ố n g x ử l ý n ư ớ c t h ả i , c á c n h à m á y t á i c h ế , q u á t r ì n h ủ p h â n compost Sau đó, nó được ứng dụng phổ biến trong việc xử lý các hợp chất hữu cơbay hơi và các hợp chất hữu cơ khác (Morikawa, 2006; Neria-
Gonzalezet al., vật tạo thành trong xử lý các hydrocarbon thơm như: benzene, naphthalene, phenol,toluen, xylen, v.v (Meliani và Bensoltane, 2014; Shuklaet al., 2014; Yamagaet al.,2010).Ứngdụngbiofilmtrongphânhủycáchợpchấthữucơđãđượcnghiêncứutừ những năm 1989 Nghiên cứu của nhóm tác giả Hettige và Sheridan (1989) cũngchứngminhcácloàiHormoconisresinae,PenicilliumcorylophilumvàPaecilomyces variotiisinh trưởng tốt trên dầu DO và có khả năng tạo biofilmrất tốt.Bên cạnh đó, các loàiHormoconis resinaevàAspergillus fumigatusphân lập từ cácmẫu ô nhiễm dầudieselcũng được ghi nhậnkhả năng sinh trưởngt ố t c ủ a c h ú n g trênnguồncơchấtnày(Linet al.,2014).
Chủng vi khuẩnAcinetobacter calcoaceticusP23 được phân lập từ khu hệ rễbèoLemna aoukikusacó khả năng tạo biofilmvà phân hủy phenol tốt hơn dạng tếbào tự do (Yamagaet al., 2010) Shimada và cộng sự, 2012 đã sử dụng chủng vikhuẩnP s e u d o m o n a s s t u t z e r i T 1 0 2p h â n l ậ p t ừ c á c m ẫ u đ ấ t n h i ễ m d ầ u đ ể t ạ o biofilmvà chứng minh khả năng phân hủy tốt naphthalen của chủng này ở dạng tạobiofilmhơnởdạngtếbàotựdo.HaichủngvikhuẩnthuộcchiVibriovàAcinetobacterđã được phân lập từ các mẫu đất nhiễm dầu thô ở Vịnh Bohai, TrungQuốc có khả năng sinh trưởng tối ưu trên NaCl lên tới 70 g/l với dải pH từ 5,6 – 8,6và ở dạng tạo biofilmthì khả năng phân hủy các hydrocarbon no cao hơn 30% so vớitế bào ở dạng tự do(Linet al.,2014) Bên cạnh đó, bioiflm do chủngAcinetobactersp BS8Y tạo thành khi được gắn trên polyvinyl alcohol có khả năng phân hủyphenol tốt hơn so với dạng tự do và có thể tái sử dụng 10 lần khi được bảo quản ở4 o Ctrong35ngày(Jianget al.,2013). Đặc biệt, biofilmđa chủng được tạo thành từ 5 chi vi khuẩn là:Polaromonas,Sphingomonas, Alcaligenes, CaulobactervàVariovoraxphân lập từ cỏc mẫu lấy ởBắc cựccú khả năng phõn hủy 20 àg/ml pyren và 39 àg/ml phenanthrene sau 60ngày nuôi cấy (Erikssonet al., 2003) Bằng phương pháp nuôi cấy vi sinh thôngthường, 2 chủng vi khuẩn thuộc chiPseudomonascó khả năng phân hủy pyrene rấttốtđãđượcphânlập từbiofilmnày(El-Masryetal,2004).
TạiViệtNam,nghiêncứuứngdụngbiofilmcònởmứcđộphòngthínghiệm nhưng đã đạt được những kết quả khả quan trong thử nghiệm xử lý nước thải y tế vànước thải chế biến thực phẩm Năm 2009, Đỗ Khắc Uẩn và cộng sự đã sử dụngthànhcônghệthốngmànglọcvậtlýgồmcácđơnnguyênmàngvilọc(kíchthướcl ỗ 0,22 àm) để xử lý nitrogen, phosphore và cỏc chất hữu cơ trong nước thải đụ thị.Phạm Thị Hồng Đức và Lờ Văn Cát (2010) đã sử dụng màng lọc sinh học (biofilter)để loại bỏ nitrogentrong hệ xử lý sinh học nhằm mục đích tái sử dụng nước nuôigiống thủy sản Năm 2014, Nguyễn Quang Huy và cộng sự đã có nghiên cứu về khảnăng tíchlũy phosphorevà tạobiofilm củachủngBacilluslicheniformisc ó k h ảnăng chuyển hóa 39,32% lượng phosphore bổ sung sau 7 ngày nuôi cấy với hàmlượngbanđầulà18mg/l.
C ô n g vàcộngs ự ( 2 0 1 1 ) đ ã đánhgiákhảnăng tạo biofilm một số chủng vi khuẩn và nấm men phân huỷ dầu, phân lập từ cácmẫu nước biển bị ô nhiễm dầu ởThanh Hoá và Vũng Tàu Kết quả cho thấy, một sốchủngthuộccácchi:Candida,Acinetobacter,Bacillus,Rhodococcuslànhữngch ủngvừ at ạo b i o f i l m v ừ a cók h ả năn gp hâ n h u ỷ vàch uy ển hoác ác h y d r o c a r b o n trong dầu mỏ rất tốt Hơn nữa, sau 24 giờ nuôi cấy, ở dạng tạo biofilm chúng còn cókhả năng phân huỷ dầu tốt hơn ở dạng tế bào tự do Điều này cho thấy tiềm năngphong phú về chủng loại vi sinh vật vừa tạo biofilmvừa phân huỷ và chuyển hoáhydrocarbontrongcácmẫunhiễmdầuởViệtNam.Nhưvậy,nghiêncứuvềbiofilmsẽmởra khảnăngứngdụng visinhvậttrongđờisốngconngười.
Vậtliệunghiêncứu
Nguyênliệu
Các mẫu nước ô nhiễm dầu được lấy tại các vị trí ô nhiễm dầu vào buổi sáng,nhiệt độ dao động từ 25-32 o C Mẫu sau khi thu thập được lưu trữ ở Phòng Côngnghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học vàCôngnghệViệtNamtrongvòng24giờđểphântích(Bảng2.1).
TT Địađiểm Đặcđiểmmẫu Hìnhảnh mẫu
1 Cảng xăng dầuB12,QuảngN inh
Màu đen, mùi dầuđặctrưng,nhiệtđ ộmẫuđạt 26 o C
Cóvángdầunổitrênbề mặt, mùi dầu đặctrưng, nhiệt độ mẫuđạt25 o C
Màuđen,mùihôivàmùi dầu đặc trưng,nhiệt độ mẫu đạt30 o C
TT Địađiểm Đặcđiểmmẫu Hìnhảnh mẫu
Màuđen,mùihôivàmùi dầu đặc trưng,nhiệt độ mẫu đạt31 o C
Màuđen,mùihôivàmùi dầu đặc trưng,nhiệt độ mẫu đạt32 o C
Cóvángdầunổitrênbề mặt, mùi dầu đặctrưng, nhiệt độ mẫuđạt31 o C
ChủngAcinetobacter calcoacetiusP23 được cung cấp bởi nhóm nghiên cứucủa GS TS MasaakiMorikawa, Khoa Khoa học Trái đất môi trường, Đại họcHokkaidosửdụnglàmđốichứng dương(Yamagaetal.,2010).
H ó a c h ấ t , m ô i t r ư ờ n g n u ô i c ấ y
Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều là hóa chất tinh khiết đượccungcấpbởicáchãngcóuy tíntrênthếgiớinhư:Sigma,Merk,Fermantas,Biobasic,v.v
Môi trường nuôi cấy ở dạng lỏng (nuôi dịch) và dạng rắn (có bổ sung agar18-20g / l ) M ô i t r ư ờ n g t r ư ớ c k h i s ử d ụ n g đ ư ợ c k h ử t r ù n g ở 1 2 1 oC( k h ô n g c ó glucose)v à ở 1 1 5 o C( c ó g l u c o s e ) t r o n g 3 0 p h ú t T h à n h p h ầ n c á c m ô i t r ư ờ n g s ử dụngđượctrìnhbàytrongBảng2.2.
Tênmôitrường Hóa chất Lượng(g/l) Hóa chất Lượng(g/l)
Môi trường Gost (vi khuẩn và nấm men) cải tiến: Thành phần giống như môitrường Gost dịch kể trên nhưng đã được loại bỏ các nguồn nitrogen từ nuối KNO3(Gostvikhuẩn)và(NH4)2HPO4(Gostnấmmen).
Trướckhisửdụng,bổ sung0,1% vitaminvàomôitrường vàđảođều.
PhòngS in ht há iv i s i n h vậ t, V iệ n V i s i n h v ậ t và Cô ng n g hệ si nh họ c, ĐHQuốcGiaHàNội
KhoaKhoa họctrái đất,ĐạihọcHokkaido NhậtBản.
Hệ thiết bị quang phổ hấp phụ phân tử vùng tử ngoại – khảkiếnUV-VIS GBC-CINTRA 40 GBC, Mỹ
Kínhhiểnvi điệntử quétS-4800 Hitachi,NhậtBản
KínhhiểnviEclipse LV-UDM Nikon,NhậtBản
Lòvi sóngNN-S215WF Panasonic,TrungQuốc
MáychạyDGGEDcode TM System Biorad, Mỹ
MáychuẩnpH-CyberScan pH620 Eutech,Singapore
Máyđo quangphổ UV-1601-220V Shimadzu,NhậtBản
Máyđọctrình tựtựđộng ABIPRISM3.100Geneticanalyzer ABI, Mỹ
Máyphân tích GCMSQP2010 Shimadzu,Nhậtbản
MáyphântíchHPLCHewlett-Packard HPHewlett-Packard,Đức
Tủấm và tủ lắcnuôi cấyNB205QF N–Biotek,HànQuốc
Tủ cấyvô trùngAVC-4A1 Esco,Singapore
TủlạnhSJ-169S-DS Sharp,Thái Lan
Làm giàu và phân lập VSV có khả năng sử dụng cáchydrocarbonthơmnhưnguồnCvànănglượng duynhất Đánhgiákhảnăngphânhủymột sốhydrocarbonthơmcủacác chủng lựa chọn
Sàng lọc các chủng vi sinh vật sử dụng các hydrocarbon thơm có khả năng tạo biofilm
Lựa chọn các chủng VSV có tiềm năng ứng dụng
Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện tới khả năng tạo biofilm Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại định tên
Cácbướcthí nghiệmcủaluậnánđược thựchiệntheosơ đồsau: Đánhgiáhiệusuất phânhủyphenol,PAHcó trongnướcnhiễmdầudobiofilmđachủngvikhuẩnvàbiofilmđachủngnấ
2.2.1.1 Làm giàu và phân lậpcác chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng cáchydrocarbonvòngthơm
Hút 5 ml mẫu nước thải nhiễm dầu vào 2 bình tam giác thể tích 250 ml cóchứa50mlmôitrườngmuốikhoángGostdịch,0,1%vitamin,50ppmcáchydrocarbonv òngthơm(gồm:phenol,naphthalene,anthracene,pyrene,iso- pentylbenzene).N u ô i l ắ c c á c b ì n h ở 2 0 0 v ò n g / p h ú t , ở 3 0 o C,s a u 7 n g à y n u ô i , chuyển 10% dịch làm giàu lần 1 sang bình môi trường tươi chứa các thành phầngiống như ở lần làm giàu thứ nhất Quá trình làm giàu được tiến hành qua 3 lần cấytruyền.
Dịch làm giàu được pha loóng trong nước muối sinh lý Hỳt 100 àl dung dịchsau khi pha loãng ở trên nhỏ lên các môi trường khoáng Gost thạch bổ sung 50 ppmcác hợp chất hydrocarbon vòng thơm,gạt mẫu và đặt trong tủ 30 o C Sau 5-7 ngày,các khuẩn lạc riêng rẽ được tách vô trùng sang các đĩa thạch chứa môi trường Gostdịch,nuôitại30 o Ctrong5- 7ngàyvàđược bảoquảntại4 o C.
Các chủng vi sinh vật được đánh giá khả năng tạo biofilm theo mô tả củaLemosetal.,2010;Morikawaetal.,2006vàO’ToolevàKolter(1998).
Nuôi các chủng vi khuẩn trên môi trường MPA và nấm men trên môi trườngHansendịchthể.Sau1 6 hnuôi,lytâm1mlloạidịchvàthusinhkhối(lytâ mở
4.000 rpm, 4 o C trong vòng 10 phút, lặp lại 3 lần để loại bỏ hoàn toàn môi trườngnuôicấy).Đánhtansinhkhốitrong1mlnướccấtvôtrùngvàtiếnhànhphaloãn gđểđạtOD600là0,3.Bổsung3μm thậm chí đếnvài cm tùy thuộc vào loài vi sinh vật,ldịchnàyvàocácốngeppendorf1,5mlchứa297μm thậm chí đếnvài cm tùy thuộc vào loài vi sinh vật,lmôi trườngMPA(đốivớivikhuẩn)vàmôitrườngHansen(đốivớinấmmen).Cứ sau 24 giờ lấy các ống eppendorf chứa mẫu nuôi để đánh giá khả năng tạobiofilm (mỗi chủng tương ứng với 3 ống eppendorf cho mỗi ngày trong 3 ngày liêntiếp) Dùng pipetman hút nhẹ dịch nuôi (không làm vỡ biofilm), rửa bằng 500 μm thậm chí đếnvài cm tùy thuộc vào loài vi sinh vật,lnước cất vô trùng (lặp lại 2 lần) Tiếp đó, bổ sung 300 μm thậm chí đếnvài cm tùy thuộc vào loài vi sinh vật,l dung dịch tím kết tinh0,1% vào các ống eppendorf, cố định 10 phút ở nhiệt độ phòng và rửa 2 lần bằngnước cất vô trùng Sau đó bổ sung 300 μm thậm chí đếnvài cm tùy thuộc vào loài vi sinh vật,ld u n g d ị c h a c e t i c a c i d 3 3 % t r ộ n đ ề u r ồ i phaloãngvàđoODởbướcsóng570nm.Mỗi thínghiệmđượclặp lại3lần.
OD600là 0,3 sau đó được rửa bằng nước cất vô trùng vànuôitrongbìnhtamgiácdungtích100ml(tỉlệgiốnglà10%)cóchứa20mlmôitrường
Gostdịchthể,50ppmtừngloạihydrocarbonvòngthơmnghiêncứu(phenol/naphthalene/ anthracen/pyrene/iso-pentylbenzene) Bình nuôi được đặt trongtủ lắc 30 o C, 200 vòng/phút Quan sát sự thay đổi màu sắc, lượng sinh khối bám trênthànhbìnhvàgiátrịđoOD600trong7ngày.
Các chủng vi khuẩnđược hoạt hóa qua đêm trên môi trường MPA và đượcnhuộmGramtheomôtảcủaSmithvàHussey(2005).
Quá trình quan sát hình thái tế bào vi sinh vật dưới kính hiển vi điện tử quétđượcthựchiệnvớisựphốihợpcủaViệnVệsinhdịchtễ Trungương. Đối với việc xác định hình thái tế bào của các chủng vi sinh vật:
Cácchủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường MPA/Hansen thạch qua đêm. Lấysinh khối tế bào cho vào ốngeppendorf có chứa dung dịch cacodylate 0,1 M, đánhtan rồi ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút (2-3 lần) Cố định mẫu trong đĩa 6 giếngvô trùng bằng 2,5-3%glutaraldehyte/cacodylate 0,1 M pH 7,2-7,4t r o n g 1 g i ờ v à rửa bằng dung dịch cacodylate 0,1M (5 phút/ lần x 3 lần) Tiếp đóm ẫ u đ ư ợ c c ố định mẫu bằng OsO41% trong cacodylate 0,1 M trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng, rửalại bằng dung dịch cacodylate 0,1 M (5 phút/lần x 2 lần) Hút nước trong mẫu bằngcồn các nồng độ 50 o , 70 o , 80 o , 90 o , 100 o C (5 phút/lần x 2 lần) Gắn mẫu trên giấybạc, để khô, phủ mẫu bằng một lớp dẫn điện Pt – Pd và soi mẫu, chụp ảnh trên kínhhiểnviđiệntử quétS-4800,Hitachi,NhậtBản. Đối với việc xác định hình thái tế bào của các biofilm:Biofilm đượcchuyển lên tấm lamen có kích thước 1 cm 2 (đã được nhỏ poly-L-lysine 0,1% (w/v)đểcốđịnhbiofilm).Cốđịnhmẫutrongđĩa6giếngvôtrùngbằng2,5-
3%glutaraldehyte/cacodylate 0,1 M pH 7,2-7,4 trong 1 giờ và rửa bằng dung dịchcacodylate 0,1 M (5 phút/ lần x 3 lần) Thực hiện các bước thí nghiệm tương tự khixácđịnhhìnhtháitếbàocủacácchủngvisinhvậtởtrên.
2.2.1.5 PhânloạivisinhvậtbằngkitsinhhóaAPI20E,API20NE,API50CH,API20CAU
Các chủng vi khuẩn và nấm men được hoạt hóa qua đêm trên môi trườngMPA/Hansen và sử dụng cácbộ kit API2 0 E v à A P I 2 0 N E ( d à n h c h o n h ó m v i khuẩn Gram(-)); API 50CH (dành cho nhóm vi khuẩn Gram (+)) và API 20C AUX(dành cho nấm men) để phân loại vi sinh vật sơ bộ theo đúng hướng dẫn của NhàsảnxuấtBiomerieux -Pháp(http://www.biomerieux.com).
Tính đối kháng của các chủng vi khuẩn và tính đối kháng của các chủng nấmmen được thực hiện theo mô tả của Nguyễn Lân Dũngvà cs, 1981 Cấy vạch cácchủngvisinhvậtlênmôitrườngthạchđĩaMPA/Hansen chocácvạchcấycắtnhau từngcăp môṭ,nuôiở3 0 o Ctrong24giờ.Sựđốikhángcủa2chủngvisinhvậtthể hiệnquadấuhiệugián đoạntạicácvịtrígiao nhaucủa2vạchcấy.
2.2.1.7 Đánhgiá độan toàncủacácchủngvisinhvật Độ an toàn của các chủng vi sinh vật này đã được đánh giá thông qua liều gâychết trung bình 50% động vật thí nghiệm (LD50) Thí nghiệm được tiến hành nhưsau: Các chủng vi sinh vậtđược cấy trongc a n h t h a n g n ã o t i m b ò , đ ể ở n h i ệ t đ ộ 37 o C trong 24 giờ Sauđó lấy một lớp huyền dịch này cấy lênm ô i t r ư ờ n g t h ạ c h máu cừu 5% và thạch dinh dưỡng, để ở nhiệt độ 37 o C trong 24 giờ Lấy khuẩn lạcđiển hình soi dưới kính hiển vi xác định hình thái và kiểm tra tính chất sinh hoá học.Lấy khuẩn lạc hòa vào ống eppendorf 2 ml dung dịch NaCl 0,85% đạt nồng độMcFarland 4 (tương đương 12 x10 9 CFU/ml) được coi là huyền dịch ban đầu chothử nghiệm Mỗi chủng vi sinh vật được pha thành 4 nồng độ để tiêm vào 4 lô, mỗilô 10 con chuột Theo dõi và ghi lại số chuột chết từ ngày thứ 3 đến ngày 14, trongthời gian theo dõi, chuột được nuôi dưỡng chu đáo, ăn thức ăn tổng hợp do xưởngsản xuất thức ăn động vật thí nghiệm cung cấp, nước uống tự do Sử dụng 1 lô tiêmnước muốisinhlývôtrùnglàmđốichứng.
Cách tính liều chết trung bình của 50% động vật thí nghiệm (LD50) được dựatheophươngphápKep∂epa (BộYtế,2009; Labinskaia,1978): logLD50=lgDN-∂x(Σli–0,5)li–0,5) Trongđó: y103. logDN:logaritcơsố10củaliềutiêmlớnnhất
2.2.1.8 Đánhgiámậtđộtếbàovisinhvâtbằngphươngphápđêḿ sốlương khuẩnlacCFU
MậtđộvisinhvậtđượcxácđịnhtheomôtảcủaShimadaetal.,2012cócải tiến. Đối với việc xác định mật độ tế bào vi sinh vật dạng tự do:Toàn bộ dịch nuôiđược lọc qua giấy lọc và rửa bằng nước cất vô trùng 2 lần Hòa tan sinh khối trongnướccấtvôtrùng.Mộtml sinh khối visinh vậtđượchòatrong9mlnước muốisinh lývôtrùng.Saukhiphaloan gtớihạn,hút0,1mltừcácnồngđộphaloãngvàođia môitrườngMPAvàHansenthac ̣hđãđươc chuẩnbịtrướcvàtiếnhànhcấygat Các đia sau khigaṭđươc baogóicẩnthân vànuôiởtủấm 30 o Cđếnkhikhuẩnlac phát triển.Tiến hànhđếmchỉsốsốlượngkhuẩnlạcởsốmũcaonhấtsauđódựavào côngthứctínhchỉsốkhuẩnlac (CFU/ml)nhưsau:
X: là số khuẩn lạc đếm được10:độpha loãng10lần n: số lần pha loóng10:100 àl/1ml Đốivớiviệcxácđịnhmậtđộtếbàovisinhvậttrênbiofilm:Toànbộdịchnuôivà lớp biofilm được lọc qua giấy lọc và rửa bằng nước cất vô trùng 2 lần Hòa tansinhkhốitrongnướccấtvôtrùng(vortexnhẹđểhòatansinhkhối).Tiếnhànhpha loãng tới hạn và thực hiện các bước thí nghiệm tương tự khi xác định mật độ tế bàovisinhvật dạngtựdoởtrên sẽthuđượcmật độtếbàotrênbiofilm.
2.2.1.9 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường đến sự hìnhthànhbiofilm
Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong các eppendorf 1,5 ml chứa 300 àlmụitrườngGost.
Lập các dãy biến thiên về một điều kiện duy nhất là pH (hoặc nhiệt độ/độmặn/nguồn C/nguồn N) Theo dõi quá trình tạo biofilm của các chủng nghiên cứutrong các điều kiện biến thiên đó dựa trên sự bắt màu tím tính thể và giá trị mật độquang tại bước sóng 570 nm (thí nghiệm được lặp lại 3 lần).Các điều kiện khảo sátđượctrìnhbảyở Bảng2.4.
Nguồn carbon vànănglượng(1%) glucose saccharose lactose maltose
(0,1%) (NH4)2SO4 KNO3 peptone caomen
Các chủng vi sinh vật sau khi hoạt hóa được chuyển sang các bình tam giácthể tích 50 ml chứa 20 ml môi trường Gost dịch và các hydrocarbon thơm nhưphenol/naphthalene/anthracene/pyrene tại các nồng độ khác nhau và nuôi lắc 200vòng/phút ởcácđiềukiệntốiưuđãđượcxácđịnhởtrên.
Sau 7-14 ngày, định lượng xác định hàm lượng hydrocarbon thơm trong mẫuthí nghiệm tại nồng độ mà vi sinh vật sinh trưởng tốt nhất (so với mẫu đối chứngkhông có vi sinh vật) bằng phương pháp sắc kí khí khối phổ (GCMS), sắc ký lỏngcaoáp (HPLC).
Nhân giống vi khuẩn và nấm men
Tạo biofilm đa chủng trong bình trụ thể tích 7 cm3 chứa 4,5 lít môi trường MPA/Hansen trong 48 giờ Thu sinh khối vi sinh vật
Phân tích khả năng phân hủy phenol và các PAH có trong nước
Xử lý sinh học các hợp chất vòng thơm bằng biofilm
Hình 2.2.Sơ đồ các bước thử nghiệm khả năng phân hủy các hydrocarbon thơmtrongnướcônhiễmdầu củabiofilmdocácchủngvisinh vậtlựa chọn tạothànhởquymô 5lít
Cácchủngvikhuẩnvànấmmencókhảnăngtạomàngsinhhọccao, phânh ủytốtcácthànhphầnhydrocacbonkhácnhau,ổnđịnhvàantoànvớimôitrườngđược sửdụngđểnhânnuôitương ứng trên môitrường MPA và Hansen theo tỷ lệsinhkhối:môitrườnglà1%,lắcvớitốcđộ 180 vòng/phútở30 o Ctrong18giờ.
Nhómphươngphápsinhhọcphân tử
7.0 vòng/phút trong 10 phút tại 4 o C.Bổ sung 540 μm thậm chí đếnvài cm tùy thuộc vào loài vi sinh vật,l extration buffer, vortex kỹ.Bổsung 20 μm thậm chớ đếnvài cm tựy thuộc vào loài vi sinh vật,l protease K (20 mg/ml), lắc ở 37 o C trong vũng 30 phỳt sau đú bổ sung 60àl SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 20% rồi ủ ở 65 o C trong 2 h.Bổ sung 600 àl CI(Chloroform : Isoamylalchohol = 24:1), trộn kỹ bằng đảo đều ống eppendorf, ly tâmở12.000vòng/phúttrong15phút.Hútphatrên,chuyểnsangốnge p p e n d o r f mới. Tủa DNA bằng isopropanol (bằng 6 lần thể tích dịch pha trên), ủ ở nhiệt độphòng trong 1giờ.Sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o Cthu tủaDNA.R ử a t ủ a b ằ n g 5 0 0 à l e t h a n o l 7 0 % l ạ n h , l y t õ m 1 2 0 0 0 v ũ n g / p h ỳ t t r o n g 1 0 phỳt ở 4 o C rồi bỏ dịch.Để khụ tự nhiờn và hũa tan tủa trong 25 - 30 àl nước khử ionvôtrùng.
Thusinhkhối nấmmenđãnuôiquađêmbằngcáchlytâm7.000vòng/phúttrong10 phút tại
4 o C Bổ sung 200 àl Hairju (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl,10 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA), vortex nhẹ Ủ mẫu trong tủ -80 o C trongvòng 2 phút, nhúng ngay vào nước nóng (98 o C) trong khoảng 1 phút (lặp lại bướcnày 2 - 3 lần) Vortex nhẹ mẫu trong 30 giõy Bổ sung 200 àl chloroform, vortex 2phỳt sau đú ly tõm thu sinh khối (12000 v/p, 4 o C trong 15 phỳt), loại bỏ dịch Bổsung 400 àl ethanol 100% để tủa DNA Ly tâm 12000 v/p, 4 o C trong 15 phút để thuDNA Rửa tủa bằng 500 àl ethanol 70%l ạ n h , l y t õ m 1 2 0 0 0 v ũ n g / p h ỳ t t r o n g 1 0 phỳt ở4 o Crồibỏ dịch Để khụ tự nhiờn và hũa tan tủa trong 25- 3 0 à l n ư ớ c k h ử ionvôtrùng.
Nhânđoạngen16SrRNAvàITS1-5,8SrRNA-ITS2bằngPCR
DNA tổng số sau khi tách chiết được đo nồng độ bằng máy Nanodrop (hóngBerthold, Đức) đạt nồng độ khoảng 50 ng trong thể tớch 25 àl/phản ứng Sử dụngcác cặp mồi đặc hiệu đối với các đoạn gen lựa chọn để nhân bản gen bằng kỹ thuậtPCR(Mullisetal.,1986).
27f 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG -3’ 16SrRNA dài1500bp Lane,1991 1527r 5’-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3’
10X dungdịch đệm Taq 2,5 dNTP(2,5mM mỗiloại) 2
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau: 94 o C: 5 phút; 32 chu kỳ lặp lại(94 o C: 1 phút; 58 o C (đối với vi khuẩn)/56 o C (đối với nấm men): 50 giây; 72 o C: 1phút30giây);72 o C:7phút;4 o C:giữmẫu.
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch bằng bộ Kit AccuPrep PCR Purification,Bioneer được sử dụng làm khuôn trong phản ứng đọc trình tự trên máy đọc trình tựtự động ABI PRISM 3.100 Avant Genetic Analyzer theo phương pháp của Sanger.Trình tự nucleotide được xử lý bằng phần mềm ABI PRISM 3.100 Avant DataCollection v 1.0 và trình tự DNA đó được so sánh với trình tự các đoạn gen khác đãđược công bố trong NCBI sử dụng phần mềm Blastn Các trình tự gen sau đó đượcxử lý bằng các phần mềm Bioedit, Clusal X và Mega4 để xây dựng cây phát sinhchủngloạivàđượcđăngkýmãsốtrênNCBI.
2.2.2.2 Phântích cấutrúcquầnthểvikhuẩnbằng phươngphápPCR-DGGE
Các mẫu nước trước và sau 7, 14 ngày xử lý được đảo trộn đều và tiến hànhtách chiết DNA và nhân đoạn gen 16S rRNA như đã mô tả ở 2.2.2.1 chỉ khác về cặpmồisử dụng vàchutrìnhnhiệtchophảnứngPCR(Bảng2.7vàBảng2.8).
Bảng2.7.Cáccặpmồi sửdụngtrongkỹthuật PCR-DGGE(Muyzeretal.,1995)
Thànhphần phảnứng Thể tớch(àl) Chukỳnhiệtcủa“touch-down”PCR
Thànhphần phảnứng Thể tớch(àl) Chukỳnhiệtcủa“touch-down”PCR
MgCl2(20mM) 5 Saumỗichukỳ,nhiệtđộgắnmồigiảmđ i 0,5 o C cho tới khi đạt tới 55 o C, ở nhiệt độ nàyphảnứngtiến hành thêm15 chu kỳ
7 o C:5 phút dNTP(2,5 mM mỗi loại) 5
GCvà907rđượcsửdụngđểchạyđiệndiDGGE.Kỹthuậtnàyđượcphântíchtrêng e l acry lamide/bis acrylamide 6%.Dung dịch biến tính 100% chứa 7M urea, dải biếntínhtừ30%đến60%.Điệndidungdịchbiếntính100%chứa7Murea,formalmide(Bản g 2.9) trên thiết bị Dcode TM System (BioRad) trong đệm TAE 1x, ởnhiệt độ 60C, tại 200
V, trong 20 phút sau đó tại 150 V trong vòng 5 giờ Nhuộmgel trong dung dịch ethidiumbromide (5 mg/ml) trong 30 phút, sau đó rửa nước 5phút và chụp ảnh dưới tia UV trên máy GelDoc (BioRad) Quá trình được thực hiệnvới sự phối hợp của Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia HàNội.
Bảng2.9.Cácnồngđộ biếntính gốcvànồng độbiếntínhsửdụng
Acrylamid/bis-acrylamid40% 22,5 ml 22,5 ml
TAE50x 3 ml 3 ml deionizedformanmide - 48 ml
Urea - 50,4 g dH2O tới 150 ml tới 150 ml
Nhómphương phápphântíchhóa học
Hàm lượng hydrocarbon thơm trong mẫu thí nghiệmdo các chủng vi sinh vậtphân hủy được phân tíchbằng các sắc ký như: sắc kí khí khối phổ (GCMS), sắc kýlỏngcaoáp(HPLC).
-Phân tích GCMS: Các dịch chiết xuất cũng sẽ được phân tích trên máyGCMS của hãng Shimadzu QP 2010, cột chạy DB-5 MS với đường kính trong là0,25mm.Mẫuđượcphântíchvớichươngtrình chạynhưsau:nhiệtđộbơmmẫ uđầu vào là 150 o C, nhiệt độ cổng bơm 260 o C, nhiệt độ chạy mẫu là 2 o C/phút, tỷ lệtăng
5 o C/phút đến 200 o C sau đó tăng 15 o C/phút và tăng đến 300 o C giữ trong 10phút, trọng lượng phổ nằm trong khoảng 50-500, nhiệt độ chuyển dòng là 230 o C vànhiệtđộnguồnionlà230 o C.
- Phân tích HPLC: Dịch chiết xuất được phân tích trên máy HPLC Hewlett- Packard(BadHomburg,Germany)sửdụngcộtLiChroCart125-4RP-18end-capped (5-μm thậm chí đếnvài cm tùy thuộc vào loài vi sinh vật,m) (Merck, Darmstadt, Germany) để phân tách các sản phẩm của quátrình chuyển hoá hydrocarbon Pha lỏng gồm: 30% methanol-70% phosphoric acid(0,1%) trong 14 phút đầu, sau đó chuyển sang 100% methanol, tốc độ chảy 1ml/phút.
Các phương pháp phân tích GC-MS, HPLC được thực hiện tại KhoaKhoahọctrái đấtmôitrường,ĐạihọcHokkaido,NhậtBản.
X ử l ý t h ố n g k ê
Xửl ý s ố l i ệ u b ằ n g p h ư ơ n g p h á p t h ố n g k ê s i n h h ọ c D ự a v à o p h ầ n m ề m Excel để tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và vẽ đồ thị Mỗi thí nghiệm được lặplại 3 lần để tính trung bình mẫu Mức khác biệt có ý nghĩa thống kê được đề nghị làp
