Luận án Tiến sĩ Nghiên cứu khả năng phân hủy hợp chất vòng thơm của các chủng vi sinh vật tạo màng sinh học phân lập tại một số địa điểm ô nhiễm dầu ở Việt Nam

VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VIỆT NAM ViƯn c«ng nghƯ sinh häc CUNG THỊ NGỌC MAI CUNG thÞ ngäc MAI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NGHIÊN KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HỢP CHẤTCỨU VÒNG THƠM CỦA CÁC CHỦNG HỢP CHẤT VÒNG THƠM CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TẠO MÀNG SINH HỌC VI SINH VẬT TẠO MÀNG SINH HỌC PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ô NHIỄM DẦU Ở VIỆT NAM Ô NHIỄM DẦU Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc Hµ néi - 2017 HÀ NỘI - 2017 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CUNG THỊ NGỌC MAI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦYHỢP CHẤT VÕNG THƠM CỦA CÁC CHỦNGVI SINH VẬT TẠO MÀNG SINH HỌCPHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂMÔ NHIỄM DẦU Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh Viện Nghiên cứu hệ gen TS Lê Thị Nhi Công Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, 2017 Lời cảm ơn Để hồn thành luận án này, trước tiên tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nghiêm Ngoc Minh, Phó Viện trưởng Viện nghiên cứu hệ gen TS Lê Thị Nhi Cơng, Trưởng phịng CNSH mơi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm qúy báu suốt trình học tập thực đề tài nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến GS Masaaki Morikawa, Khoa Khoa học trái đất, Đại học Hokkaido Nhật Bản tạo điều kiện cho nhóm nghiên cứu sử dụng trang thiết bị phân tích Khoa Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Viện suốt năm qua Bên cạnh đó, tơi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Thị Hải Hà, phụ trách đào tạo Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ tơi hồn thành thủ tục cần thiết suốt trình nghiên cứu sinh bảo vệ luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia Ban chủ nhiệm Chương trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà nước “Nghiên cứu phát triển ứng dụng Công nghệ Sinh học” cấp kinh phí cho đề tài mã số 106.03-2011.53 KC.04.21/11-15 cho nhóm nghiên cứu Bên cạnh đó, xin gửi lời cảm ơn tới đơn vị: phịng Thí nghiệm trọng điểm gen- Viện Cơng nghệ sinh học; phòng Vi sinh vật học- Học viện Quân y 103; phịng Thí nghiệm siêu cấu trúc- Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương; phòng Sinh thái vi sinh vật- Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học; phịng Hóa học phân tích- Viện Hóa học phối hợp thực số kết phân tích luận án Trong thời gian qua, nhận hỗ trợ nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi từ phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học nơi cơng tác, với giúp đỡ nhiệt tình đóng góp quý báu chị, em đồng nghiệp, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người thân gia đình, người bạn thân thiết ln bên cạnh động viên khích lệ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn! Nghiên cứu sinh Cung Thị Ngọc Mai i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Cung Thị Ngọc Mai ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm, nguồn gốc phát sinh phenol PAH 1.1.1 Đặc điểm nguồn gốc phát sinh phenol 1.1.2 Đặc điểm nguồn gốc phát sinh PAH 1.2 Tính độc ảnh hƣởng phenol, PAH tới môi trƣờng, sức khỏe ngƣời động vật 1.2.1 Tính độc ảnh hưởng phenol tới môi trường, sức khỏe người động vật 1.2.2 Tính độc ảnh hưởng phenol tới môi trường, sức khỏe người động vật 1.3 Phân hủy phenol PAH vi sinh vật 1.3.1 Phân hủy phenol vi sinh vật hiếu khí 1.3.2 Phân hủy PAH vi sinh vật hiếu khí 1.4 Các cơng nghệ xử lý 1.4.1 Công nghệ sử dụng bùn hoạt tính 1.4.2 Cơng nghệ sử dụng màng lọc 1.5 Màng sinh học (Biofilm) 1.5.1 Khái niệm biofilm 1.5.2 Vi sinh vật tạo biofilm 1.5.3 Sự hình thành biofilm 1.5.4 Thành phần, cấu trúc biofilm 1.5.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hình thành phát triển biofilm 1.5.6 Ứng dụng biofilm phân hủy sinh học Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.2 Hóa chất, mơi trường ni cấy 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Nhóm phương pháp vi sinh vật 2.2.2 Nhóm phương pháp sinh học phân tử 2.2.3 Nhóm phương pháp phân tích hóa học 2.2.4 Xử lý thống kê Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Làm giàu phân lập chủng vi sinh vật có khả sử dụng iii Trang 3 6 12 16 17 18 21 21 21 23 24 26 28 31 31 31 32 33 34 35 43 47 47 48 hydrocarbon vòng thơm 3.2 Khả tạo biofilm sử dụng hợp chất vòng thơm chủng vi sinh vật phân lập đƣợc 3.2.1 Khả tạo biofilm chủng vi sinh vật 3.2.2 Khả sử dụng hợp chất vòng thơm chủng vi sinh vật 3.3 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học phân loại, định têna chủng vi sinh vật chọn lọc 3.3.1 Đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật 3.3.2 Phân loại định tên chủng vi sinh vật 3.4 Kiểm tra tính đối kháng đánh giá độ an toàn chủng vi sinh vật sàng lọc 3.4.1 Kiểm tra tính đối kháng chủng vi sinh vật 3.4.2 Đánh giá độ an toàn chủng vi sinh vật 3.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng số điều kiện môi trƣờng đến hình thành biofilm chủng vi sinh vật tuyển chọn 3.5.1 Ảnh hưởng pH 3.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 3.5.3 Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl 3.5.4 Ảnh hưởng nguồn carbon 3.5.5 Ảnh hưởng nguồn nitrogen 3.6 Khả phân hủy số hydrocarbon vòng thơm chủng vi sinh vật lựa chọn 3.6.1 Khả phân hủy hydrocarbon vòng thơm vi sinh vật 3.6.2 Khả chuyển hóa iso-pentylbenzene biofilm chủng Candida viswanathii TH1 tạo thành 3.7 Khả phân hủy hợp chất vòng thơm nƣớc nhiễm dầu biofilm chủng vi sinh vật tạo thành 3.7.1 Khả phân hủy hợp chất vịng thơm có nước nhiễm dầu 3.7.2 Mật độ tế bào, cấu trúc biofilm cấu trúc quần thể vi khuẩn trước sau xử lý Chƣơng 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1 Phân lập, phân loại chủng vi sinh vật có khả tạo biofilm sử dụng hợp chất vòng thơm từ mẫu nhiễm dầu 4.2 Các điều kiện ảnh hƣởng tới khả tạo biofilm chủng visinh vật 4.3 Hiệu xử lý hợp chất vịng thơm có nƣớc nhiễm dầu biofilm đa chủng tạo thành KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ iv 48 54 54 56 58 58 60 63 64 64 65 65 67 68 69 70 72 72 73 78 78 83 88 88 92 96 99 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 101 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO 107 PHẦN PHỤ LỤC Phụ lục 1: Khả tạo biofilm chủng vi sinh vật Phụ lục 2: Phân loại vi sinh vật kít chuẩn sinh hóa Phụ lục 3: Khả sinh trưởng chủng vi sinh vật nguồn hydrocarbon khác Phụ lục 4: Kết phân tích GCMS biofilm đa chủng tạo thành v BẢNG CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Biofilm C cs DGGE DNA DO EPS h HKTS ITS LD50 MPA N NM PAH PCR SEM RNA rRNA USEPA VK VSV Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt Màng sinh học Carbon Denaturinggradient gel electrophoresis Dioxyribonucleic acid Diesel oil Extracellular polymeric substances Hour Cộng Điện di gel với dải nồng độ biến tính Dầu diesel Mạng lưới chất ngoại bào Giờ Hiếu khí tổng số Internal transcribed spacer Vùng đệm chuyển tiếp phía Lethal Dose 50 Liều lượng chất độc gây chết cho nửa (50%) động vật thí nghiệm Meat peptone agar Cao thịt peptone thạch Nitrogen Nấm men Polycyclic aromatic Hydrocarbon thơm đa vòng hydrocarbon Polymerase Chain Phản ứng chuỗi trùng hợp Reaction Scanning Electron Kính hiển vi điện tử quét Microscope Ribonucleic acid RNA ribosome United States Cơ quan Bảo vệ môi trường Hoa Kỳ Environmental Protection Agency Vi khuẩn Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 2.1 Bảng 2.2 Bảng 2.3 Bảng 2.4 Bảng 2.5 Bảng 2.6 Bảng 2.7 Bảng 2.8 Bảng 2.9 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 Bảng 3.12 Bảng 3.13 Bảng 3.14 Tính chất vật lý số loại PAH Danh mục gen tham gia 13 Các địa điểm ô nhiễm dầu đặc điểm mẫu thu thập 31 Thành phần môi trường sử dụng nghiên cứu 33 Các thiết bị sử dụng luận án 34 Các điều kiện môi trường khảo sát 40 Các cặp mồi sử dụng kỹ thuật PCR 44 Thành phần phản ứng PCR 44 Các cặp mồi sử dụng kỹ thuật PCR-DGGE 45 Thành phần chu trình phản ứng PCR 45 Các nồng độ biến tính gốc nồng độ biến tính sử dụng 46 Kết phân tích số tiêu có nước thải lấy kho xăng dầu Đỗ Xá, Hà Nội 48 Số lượng VSV dị dưỡng VSV sử dụng hydrocarbon vòng thơm 50 Đặc điểm khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập 51 Đặc điểm khuẩn lạc chủng nấm men phân lập 53 Khả sử dụng hợp chất hydrocarbon thơm chủng vi khuẩn 56 Khả sử dụng hợp chất hydrocarbon thơm chủng nấm men 57 Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn 58 Đặcđiểm sinh học chủng nấm men 59 Tên khoa học, độ tương đồng mã số NCBI chủng VK 61 Tên khoa học, độ tương đồng mã số NCBI chủng NM 63 Kết xác định LD50 chủng vi sinh vật 65 Hiệu suât phân hủy hydrocarbon thơm vi sinh vật 72 Thời gian lưu phổ hấp thụ UV/vis sản phẩm biofilm chủng C viswanathii TH1 chuyển hóa iso-pentylbenzene 74 Mức độ tương đồng trình tự đoạn gen 16S rRNA băng cắt với chủng vi khuẩn NCBI 86 DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Cấu trúc hóa học số loại PAH Mở vịng vị trí ortho- vị trí meta- catechol 10 Phân hủy sinh học hiếu khí phenol theo đường mở vịng vị trí meta- ortho- lồi Pseudomonas sp CF600 11 Hình 1.4 Các vùng trao đổi chất phân hủy PAH 12 Hình 1.5 Các đường phân hủy PAH 14 Hình 1.6 Sơ đồ hệ thống xử lý phương pháp bùn hoạt tính 18 Hình 1.7 Sơ đồ hệ thống xử lý phương pháp MBR 19 Hình 1.8 Sơ đồ hệ thống xử lý sử dụng biofilm 20 Hình 1.9 Chu trình hình thành biofilm 24 Hình 1.10 Cấu trúc mơ biofilm cấu trúc hiển vi biofilm chủng Bacillus subtilis tạo thành kính hiển vi điện tử quét 25 Hình 2.1 Sơ đồ bước thí nghiệm thực luận án 35 Hình 2.2 Sơ đồ bước thử nghiệm khả phân hủy hydrocarbon thơm nước nhiễm dầu biofilm chủng vi sinh vật lựa chọn tạo thành quy mô lít 41 Hình 2.3 Các mơ hình xử lý 42 Hình 3.1 Mẫu làm giàu vi sinh vật lần nguồn chất vị trí thu thập mẫu khác 51 Hình 3.2 Khả tạo biofilm chủng vi khuẩn phân lập 55 Hình 3.3 Khả tạo biofilm chủng nấm men phân lập 56 Hình 3.4 Mức độ sinh trưởng chủng VTPG5 nguồn chất 57 Hình 3.5 Mức độ sinh trưởng chủng nấm men nguồn chất 57 Hình 3.6 Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn 61 Hình 3.7 Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn 62 Hình 3.8 Kết kiểm tra tính đối kháng chủng vi sinh vật 64 Hình 3.9 Ảnh hưởng pH tới khả hình thành biofilm chủng vi khuẩn 66 Hình 3.10 Ảnh hưởng pH tới khả hình thành biofilm chủng nấm men 66 Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả hình thành biofilmcủa Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 117 99 Shukla KS, Mangwani N, Rao TS, Das S (2014) Biofilm-Mediated bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons Microb Biodegrad Bioremediat: 203-232 100 Shuttleworth KL, Cerniglia CE (1995) Environmental aspects of PAH biodegradation Appl Biochem Biotech 54: 291–302 101 Singh R, Paul D, Rakesh JK (2006) Review, Biofilms: implications in bioremediation Trends Microbiol 14(9): 389-97 102 Smith CA and Hussey AM (2005) Gram Stain Protocols Am Soc Microbiol Conf Undergrad Educ– American 103 Sood N, Lal B (2009) Isolation of a novel yeast strain Candida digboiensis TERI ASN6 capable of degrading petroleum hydrocarbons in acidic conditions J Environ Manage 90(5): 1728-1736 104 Suhaila Y.N, Rosfarizan M, Ahmad SA, Latif IA, Ariff A (2013) Nutrients and culture conditions requirements for the degradation of phenol by Rhodococcus UKMP-5M J Environ Biol 34: 1– 105 Sutherland JB, Rafii F, Khan AA, Cerniglia CE (1995) Mechanics of polycylic aromatic hydrocarbon degradation In Microbial transformation and degradation of toxic organic chemicals, ed L.Y.Young &C.E Cerniglia New York: Wiley-Lis: 269-306 106 Taghreed AK, Muftah HE (2012) Aerobic biodegradation of phenols: A comprehensive review Crit Rev Enviro Sci Tec 42: 1631–1690 107 Todoroviê V (2003) Acute phenol poisoning Medicinski Pregled 1: 37-41 108 Ullah MA, Kadhim H, Rastall RA, Evans CS (2000) Evaluation of solid substrates for enzyme production by Coriolus versicolor, for use in bioremediation of chlorophenols in aqueous effluents Appl Microbiol Biotechnol 54: 832–837 109 US Department of health and human services (1995) Toxicological profile for polycyclic aromatic hydrocarbons Public Health Service – Agency for toxic substances and disease registy 118 110 US.EPA (1980) Ambient Water Quality Criteria DOC: Phenol, US EPA440/5-80-066 (PB 81-117772): 1100-1156 111 Vanysacker L, Denis C, Declerck P, Piasecka A, Vankelecom FJI (2013) Microbial adhesion and biofilm formation on microfiltration membranes: A detailed characterization using model organisms with increasing complexity Biomed Res Int: 1-12 112 Viggiani A, Olivieri G, Siani L, Donato DA, Marzocchella A, Salatino P, Barbieri P, Galli E (2006) An airlift biofilm reactor for the biodegadation of phenol by Pseudomonas stutzeri OX1 J Biotechnol 123(4): 464-477 113 Wasi S, Tabrez S, Ahmad M (2013) Toxicological effect of major environmental pollutants: An overview Environ Monit Assess 185: 2585– 2593 114 Watnick PI, Kolter R (1999) Steps in thedevelopment of a Vibrio cholerae El forbiofilm Mol Microbiol 34(3):586–595 115 White TJ, Burns T, Lee S, Taylor J (1990) Amplification and sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics In PCR protocols Aguide to methods and applications Academic Press, Inc, San Diego, California: 315322 116 Xue-Jing Z, Blais JF, Mercier G, Bergeron M, Drogui P (2007) PAH removal from spiked municipal wastewater sewage sludge using biological, chemical and electrochemical treatments Chemosphere68(6): 1143-1152 117 Yamaga F, Washio K and Morikawa M (2010) Sustainable biodegradation of phenol by Acinetobacter calcoacetius P23 isolated from the rhizosphere of Duckweed Lenma aoukikusa Environ Sci Technol 44: 6470-6474 118 Yu L, Han M, He F (2013) A review of treating oily wastewater Arab J Chem 119 Zheng C, Zhao L, Zhou X, Fu Z, Li A (2013) Treatment technologies for organic wastewater Intech: 249-286 120 Zhou B, Chen T (2013) Optimization and characterization of simultaneous phenol degradation with Cr(VI) reduction by Pseudomonas sp JF122 Acta 119 Sci Circum 33(9): 2482–2490 121 Zhou J, Bruns MA and Tiedje JM (1996) DNA Recovery from soils of diverse compostion Appl Eviron Microbiol 62(2): 316-322 122 Zhou J, Yu X, Ding C, Wang Z, Zhou Q, Pao H, Cai W (2011) Optimization of phenol degradation by Candida tropicalis Z-04 using placket-burman design and response surface methodology J Environ Sci 23(1): 22-30 Website tham khảo: 123 http://www.biomerieux.com/ PHẦN PHỤ LỤC Phụ lục 1: KHẢ NĂNG TẠO BIOFILM CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT Hình Khả bắt giữ tím tinh thể biofilm chủng vi khuẩn tạo thành (K: đối chứng vsv) Hình Khả bắt giữ tím tinh thể biofilm chủng nấm men tạo thành (K: đối chứng khơng có vsv) Phụ lục 2: PHÂN LOẠI VI SINH VẬT BẰNG KIT CHUẨN SINH HÓA Bảng Kết phân loại Kit chuẩn sinh hóa API 20E chủng vi khuẩn Gram âm Kít thử TT DGP2 DGP4 DG25 DGP8 QND10 ONPG - + - + - ADH + - + - - LDC - + - - + ODC - - - - - CIT + - + - + H2S - - - + - URE - - - - - TDA - - - + - IND - + - + + 10 VP + + + + - 11 GEL - - - - - 12 GLU + + + + + 13 MAN - + - - - 14 INO - - + - + 15 SOR - - - + - 16 RHA - - - - - 17 SAC - - + - + 18 MEL - + - - + 19 AMY - - - - - 20 ARA + + - - - 21 OX - - - - - (-, âm tính; +, dương tính) Bảng Kết phân loại Kit chuẩn sinh hóa API 20NE chủng vi khuẩn Gram âm TT Kít thử DGP2 DGP4 DG25 DGP8 QND10 NO3 - + + + - TRP + + + - - GLU + + + + + ADH - + + + - URE - - - - - ESC - + + + - GEL + + + + - PNPG + + - + + GLU + + + - - 10 ARA - + + + - 11 MNE - + + + - 12 MAN - + - + - 13 NAG + + + - - 14 MAL + + + + - 15 GNT + + + + - 16 CAP + + + + + 17 ADI - - - - - 18 MLT + + + + + 19 CIT - - - - + 20 PAC - - - - + 21 OX + + + + + (-, âm tính; +, dương tính) Bảng Kết phân loại Kit chuẩn sinh hóa API 50CH chủng vi khuẩn Gram dương Kit thử TT VTPG5 BQN11 TT Kit thử VTPG5 BQN11 0 - - 25 ESC - - GLY - + 26 SAL + + ERY - - 27 CEL - - DARA - + 28 MAL - - LARA + + 29 LAC - + RIB - - 30 MEL - + DXYL - + 31 SAC - + LXYL - - 32 TRE - + ADO - - 33 INU - - Kit thử TT VTPG5 BQN11 TT Kit thử VTPG5 BQN11 MDX - + 34 MLZ - - 10 GAL - + 35 RAF - - 11 GLU - + 36 AMD + + 12 FRU - - 37 GLYG - + 13 MNE - + 38 XLT - + 14 SBE - + 39 GENE - + 15 RHA - - 40 TUR - + 16 DUL - - 41 LYX - - 17 INO + + 42 TAG + + 18 MAN - - 43 DFUC + - 19 SOR - - 44 LFUC + - 20 MDM - - 45 DARL - + 21 MDG - + 46 LARL - + 22 NAG - + 47 GNT - + 23 AMY - + 48 2KG - + 24 ARB + - 49 5KG - + (-, âm tính; +, dương tính) Bảng Kết phân loại Kit chuẩn sinh hóa API 20 C AUX chủng nấm men TT Kít thử B1 TH1 O - - GLU + GLY TH4 TT Kít thử B1 TH1 TH4 - 12 MDG - + + + + 13 NAG - + + -+ + + 14 CEL - + + 2KG + + + 15 LAL - + + ARA - + - 16 MAL + + + XYL - + + 17 SAC + + + ADO - + + 18 TRE + + + XLT - - - 19 MLZ + + + GAL +- + + 20 RAF + - + - - - 10 INO - - - 11 SOR + + + 21 + H/PH (-, âm tính; -+, đổi màu khoảng 15-25%; +-, đổi màu khoảng 25-35%; +, dương tính) 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 OD 600 nm OD 600 nm Phụ lục 3: KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TRÊN CÁC NGUỒN HYDROCARBON KHÁC NHAU 100 ppm 200 ppm 300 ppm 50 ppm 100 ppm 150 ppm 200 ppm 250 ppm 0 24 48 72 96 120 144 168 Thời gian (giờ) Hình 3(A).Khả sinh trưởng chủng BQN11 MT có bổ sung naphthalene nồng độ khác 24 48 72 96 120 144 168 72 96 120 144 168 Thời gian (giờ) Hình 3(B).Khả sinh trưởng chủng VTPG5 MT có bổ sung phenol nồng độ khác 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 50 ppm 100 ppm 150 ppm 200 ppm 48 OD 600 nm OD 600 nm 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 24 50 ppm 100 ppm 150 ppm 200 ppm Thời gian (giờ) Hình 3(C).Khả sinh trưởng chủng DGP2 MT có bổ sung phenol nồng độ khác 24 48 72 96 120 144 168 Thời gian (giờ) Hình 3(D).Khả sinh trưởng chủng DGP4 MT có bổ sung phenol nồng độ khác 2.5 3.5 2.5 OD 600 nm OD 600 nm 50 ppm 100 ppm 150 ppm 200 ppm 1.5 100 ppm 200 ppm 300 ppm 400 ppm 1.5 0.5 0.5 0 24 48 72 96 120 144 168 Thời gian (giờ) Hình 3(E) Khả sinh trưởng chủng DGP8 MT 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 24 48 72 96 120 144 168 Thời gian (giờ) Hình 3(F).Khả sinh trưởng chủng DG25 mơi có bổ sung phenol nồng độ khác trường có bổ sung pyrene nồng độ khác 2.5 OD 600 nm OD 600 nm 50 ppm 100 ppm 150 ppm 50 ppm 150 ppm 100 ppm 1.5 0.5 0 24 48 72 96 120 144 168 Thời gian (giờ) Hình 3(G).Khả sinh trưởng chủng TH4 MT 24 48 72 96 120 144 168 Thời gian (giờ) Hình 3(H).Khả sinh trưởng chủng QND10 có bổ sung pyrene nồng độ khác MT có bổ sung anthracene nồng độ khác Phụ lục 4: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH GCMS DO BIOFILM ĐA CHỦNG TẠO THÀNH Abundance T I C : N T -1 -1 D 22 1000000 900000 800000 1 700000 8 600000 500000 400000 6 300000 200000 100000 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 T im e > (A) Abundanc e T IC: N T -1 -M D 25000 20000 15000 10000 2113 8 0 01 11.4 1 23 51.2 1556 780 8 81.3 61 1156.9 054 71 71.176.5 6 9 2 22121.4 2015.9 72 8213 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 (B) T ime > Abundanc e T I C : N T -1 -M D 30000 25000 1 2185 1 20000 15000 10000 5000 1 1 2 6 41 222122 11 01033 166 0189 3 9257 5 9 2 72 0232 3 42 5 8 9 2 3293 234 1 1133 11 78 40 02 711 753 5 9 3 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 (C) Hình Sắc ký đồ thành phần hydrocarbon có mẫu thí nghiệm biofilm đa chủng vi sinh vật tạo thành; (A)- đối chứng; (B) - thí nghiệm biofilm đa chủng vi khuẩn; (C)- thí nghiệm biofilm đa chủng nấm men sau 14 ngày T im e > Bảng Kết phân tích GCMS mẫu đối chứng P K 3.8045 Area Pct 0.6612 4.1377 RT Library/ID Ref CAS Qual p-Dimethylbenzene 10754 000106-42-3 95 0.3531 Benzene, 1,3-dimethyl- 10741 000108-38-3 93 4.1694 0.4409 n-Nonane 25155 000111-84-2 95 5.2324 1.0395 Benzene, 1-ethyl-3-methyl- 18927 000620-14-4 93 5.2906 0.3828 Benzene, 1-ethyl-2-methyl- 18922 000611-14-3 90 5.3752 0.5199 Benzene, 1,2,3-trimethyl- 18949 000526-73-8 95 5.5445 0.4305 1-Methyl-2-ethylbenzene 18919 000611-14-3 94 5.8353 1.4916 Benzene, 1,2,4-trimethyl- 18964 000095-63-6 94 5.8724 1.1898 Decane 38801 000124-18-5 93 10 6.2849 0.3323 4-Methyldecane 56256 002847-72-5 74 11 6.3536 0.5914 Benzene, 1,2,3-trimethyl- 18949 000526-73-8 95 12 6.6286 0.6889 1-Phenyl-2-propene 18044 000300-57-2 86 13 6.8349 0.3778 1,2-Diethylbenzene 29901 000135-01-3 81 14 6.9036 0.5733 Benzene, (1-methylpropyl)- 29853 000135-98-8 83 15 7.02 1.3973 Benzene, 4-ethyl-1,2-dimethyl- 29941 000934-80-5 93 16 7.1099 0.5334 Decane, 2-methyl- 56250 006975-98-0 94 17 7.2315 0.4433 Decane, 3-methyl- 56253 013151-34-3 97 18 7.3849 0.5739 1-Methyl-3-isopropylbenzene 29878 000535-77-3 95 19 7.4484 0.6059 1,3-Dimethyl-4-ethylbenzene 29930 000874-41-9 91 20 7.57 1.2029 1-Ethyl-2,4-dimethylbenzene 29930 000874-41-9 94 21 7.6176 0.7666 1-ethenyl-3-ethyl-Benzene 28328 055319-72-7 87 22 7.8239 1.6116 n-Undecane 56237 001120-21-4 95 23 7.9614 0.2841 1,3-Dimethyl-4-ethylbenzene 29930 000874-41-9 94 24 8.2152 0.5048 1,2,3,4-Tetramethylbenzene 29955 000488-23-3 94 25 8.284 0.761 29967 000095-93-2 95 26 8.5748 0.5385 Benzene, 1,2,4,5-tetramethylBenzene, 1-methyl-4-(1methylpropyl)- 44859 001595-16-0 76 27 8.6542 0.6662 44749 002050-24-0 83 28 8.7124 1.5659 28364 000874-35-1 81 29 8.8869 1.5618 28361 000824-22-6 91 30 8.9186 1.7691 1-Methyl-3,5-diethylbenzene 1H-Indene, 2,3-dihydro-5methyl1H-Indene, 2,3-dihydro-4methylBenzene, 1,2,4,5-tetramethyl- 29963 000095-93-2 90 31 9.0032 0.6161 Undecane, 4-methyl- 74420 002980-69-0 89 32 9.0614 0.9075 trans-1-methyl-2-indanol 44525 102330-13-2 68 33 9.109 0.5921 74411 007045-71-8 89 34 9.1672 0.7209 44859 001595-16-0 68 35 9.2359 0.7002 Undecane, 2-methylBenzene, 1-methyl-4-(1methylpropyl)5-Ethyldecane 74465 017302-36-2 52 P K RT Area Pct Library/ID Ref CAS Qual 36 9.3629 0.5394 Benzene, 1-methyl-4-(1methylpropyl)- 44859 001595-16-0 90 37 9.5956 0.6248 Benzene, (1-methyl-1-butenyl)- 42930 053172-84-2 92 38 9.6802 3.6543 Naphthalene 25268 000091-20-3 76 39 9.7331 0.8703 1-Cyclopropyl-1-methylspiro 42943 000000-00-0 83 40 9.8336 4.5694 n-Dodecane 74405 000112-40-3 64 41 10.0239 0.4522 Benzene, ethyl-1,2,4-trimethyl- 44754 054120-62-6 87 42 10.0874 0.7175 2,6-Dimethylundecene 93403 017301-23-4 87 43 10.3413 0.7044 62534 001518-83-8 72 44 10.5528 1.1952 42920 000000-00-0 76 45 10.8966 1.7468 42832 006682-71-9 96 46 11.1028 0.5913 229004 013287-24-6 46 47 11.1398 1.069 42832 006682-71-9 93 48 11.2509 1.7751 42713 000000-00-0 42 49 11.4202 0.6083 60409 001076-61-5 64 50 11.4572 0.3766 44748 004706-90-5 62 51 11.5153 0.4104 42832 006682-71-9 96 52 11.6846 0.3318 60335 054340-86-2 86 53 11.7375 0.9212 60371 002613-76-5 64 54 11.8115 1.5277 4-Cyclopentylphenol Bicyclo[4.2.1]nona-2,4,7-triene, 7-ethyl1H-Indene, 2,3-dihydro-4,7dimethylNonadecane, 9-methyl1H-Indene, 2,3-dihydro-4,7dimethyl3-p-Tolylprop-2-enal Naphthalene, 1,2,3,4-tetrahydro6,7-dimethyl1-Isopropyl-3,5dimethylbenzene 1H-Indene, 2,3-dihydro-4,7dimethylBenzene, 4-(2-butenyl)-1,2dimethyl-, (E)1H-Indene, 2,3-dihydro-1,1,3trimethyln-Tridecane 93376 000629-50-5 97 55 11.8803 5.23 1-Methylnaphthalene 38907 000090-12-0 93 56 12.1235 0.4861 Benzo[b]thiophene, 4-methyl- 44168 014315-11-8 53 57 12.1764 2.8148 1-methyl naphthalene 38907 000090-12-0 93 58 13.0279 0.9302 n-Tetratriacontane 363627 014167-59-0 46 59 13.1548 0.5149 Nonadecane, 9-methyl- 229004 013287-24-6 43 60 13.2447 0.5186 79301 116384-72-6 80 61 13.6149 0.9572 5-ethyl-1,3-dimethylindan Benzene, 4-(2-butenyl)-1,2dimethyl- 60335 054340-86-2 91 62 13.7154 3.6954 n-Tetradecane 113303 000629-59-4 96 63 13.9587 1.7551 Naphthalene, 1,6-dimethyl- 56327 000575-43-9 95 64 13.9799 2.602 Naphthalene, 2,7-dimethyl- 56360 000582-16-1 95 65 14.1967 3.2892 Naphthalene, 1,6-dimethyl- 56327 000575-43-9 97 66 14.2813 3.0812 Naphthalene, 1,6-dimethyl- 56327 000575-43-9 96 67 14.588 1.3848 Naphthalene, 1,4-dimethyl- 56318 000571-58-4 96 P K 68 14.6462 Area Pct 0.5819 69 14.8419 70 71 RT Library/ID Ref CAS Qual 1,6-Dimethylnaphthalene 56328 000575-43-9 90 1.1114 1,4-Dimethylnapthalene 56317 000571-58-4 96 15.3813 0.5146 Pyrene 71665 001855-47-6 95 15.4554 0.511 Naphthalene, 1-propyl- 74519 002765-18-6 46 72 15.5189 1.6761 Pentadecane 134012 000629-62-9 96 73 15.741 2.0611 Naphthalene, 1,4,6-trimethyl- 74494 002131-42-2 91 74 16.0689 1.3449 Naphthalene, 1,6,7-trimethyl- 74497 002245-38-7 97 75 16.1958 1.1564 Naphthalene, 2,3,6-trimethyl- 74500 000829-26-5 97 76 16.4338 0.8456 Naphthalene, 1,6,7-trimethyl- 74497 002245-38-7 98 77 16.5343 0.9724 Naphthalene, 1,6,7-trimethyl- 74497 002245-38-7 96 78 16.6352 0.7768 Phenanthrene 74503 000829-26-5 97 79 17.2324 0.8345 Hexadecane 154901 000544-76-3 97 80 17.3276 1.2146 Naphthalene, 1-(2-propenyl)- 71647 002489-86-3 64 81 17.4175 0.6661 2-Methyl-1,1'-biphenyl 71617 000643-58-3 89 82 17.9992 0.4212 1-Acetyl-3-methylazulene 93351 000000-00-0 50 83 18.0386 0.8314 Fluorene 174552 000629-78-7 98 84 20.1998 0.746 Anthracene 87532 002523-37-7 95 85 20.3632 0.4319 Naphthalene, 2,3,6-trimethyl- 84482 000085-01-8 81 86 20.4161 0.7515 n-Octadecane 193185 000593-45-3 98 87 21.897 0.6009 211481 000629-92-5 98 88 22.0345 0.6055 103941 000949-41-7 96 89 22.1191 0.7698 Nonadecane 1HCyclopropa[l]phenanthrene,1a,9 b-dihydroPhenanthrene, 2-methyl- 103929 002531-84-2 96 90 23.3143 0.6147 Eicosane 228992 000112-95-8 98 91 23.8484 0.5192 Naphthalene 125000 001576-69-8 94 92 24.6629 0.5644 Acenaphthalene 134048 000629-62-9 95 93 25.9586 0.3558 Hexadecane 154904 000544-76-3 97 94 27.1962 0.3928 Tricosane 275686 000638-67-5 98 95 28.9243 0.7859 Benzo(k)fluoranthene 154914 000544-76-3 95 Bảng Kết phân tích GCMS biofilm đa chủng vi khuẩn tạo thành P K 13.48 Area Pct 5.5839 13.7101 RT Library/ID Ref CAS Qual Naphthalene 38929 000091-57-6 96 5.0129 Acenaphthylene 113301 000629-59-4 94 13.9904 11.4563 1,5-Dimethylnaphthalene 56324 000571-61-9 90 14.2072 11.3701 Naphthalene, 1,7-dimethyl- 56332 000575-37-1 96 14.2866 7.4606 2,7-Dimethylnaphthalene 56361 000582-16-1 87 15.5135 5.4875 n-Pentadecane 134011 000629-62-9 74 10 P K 15.7515 Area Pct 8.4094 16.0088 10 RT Library/ID Ref CAS Qual Anthracene 74506 018242-86-9 87 4.8038 Naphthalene, 2,3,6-trimethyl- 74500 000829-26-5 91 16.0485 5.3377 Fluorene 74500 000829-26-5 91 17.227 5.8372 n-Tridecane 93372 000629-50-5 68 11 19.9251 5.5728 Benzo(k)fluoranthene 90602 055836-29-8 93 12 20.2914 7.8182 Pyrene 244391 004292-19-7 95 13 21.945 5.1168 Phenanthrene 103905 007151-64-6 98 14 22.1243 5.1788 Anthracene, 2-methyl- 103918 000613-12-7 80 15 23.9436 5.5539 2,7-Dimethylphenanthrene 124999 001576-69-8 80 Bảng Kết phân tích GCMS biofilm đa chủng nấm men tạo thành P K RT 9.8334 Area Pct 1.8119 Library/ID Ref CAS Qual 74406 000112-40-3 47 42830 006682-71-9 76 93366 000629-50-5 95 10.8964 1.0733 11.8113 1.8647 Dodecane 1H-Indene, dimethylPhenanthrene 11.8907 5.1625 Naphthalene 38933 000091-57-6 97 12.1869 3.4642 1-Methylnaphthalene 38918 000090-12-0 91 13.2446 0.6147 Hexacosane 311166 000630-01-3 43 13.71 2.7969 Tetradecane 113289 000629-59-4 95 13.7476 2.0884 Anthracene 56296 000939-27-5 93 13.9903 6.3202 Naphthalene, 1,7-dimethyl- 56332 000575-37-1 95 10 14.2018 5.3006 Benzo(k)fluoranthene 56315 000571-58-4 96 11 14.2864 5.3188 2,7-Dimethylnaphthalene 56361 000582-16-1 96 12 14.7038 0.7186 Fluorene 56314 000571-58-4 94 13 15.5187 3.0978 Pentadecane 134049 000629-62-9 94 14 15.7567 3.9871 1,4,6-Trimethylnaphthalene 74495 002131-42-2 93 15 16.074 3.2925 2,3,6-Trimethylnaphthalene 74504 000829-26-5 97 16 16.1956 3.2339 Naphthalene, 1,6,7-trimethyl- 74497 002245-38-7 97 17 16.4336 1.8333 4,6,8-Trimethylazulene 74479 000941-81-1 91 18 16.5394 1.7511 2,3,6-Trimethylnaphthalene 74501 000829-26-5 91 19 16.7351 0.6124 2,3,6-Trimethylnaphthalene 74501 000829-26-5 87 20 17.2322 1.7423 Hexadecane 154908 000544-76-3 93 21 17.3433 2.7081 1-Isopropenylnaphthalene 71665 001855-47-6 45 22 17.4279 2.061 2-Methylbiphenyl 71617 000643-58-3 50 23 18.8664 1.8798 Heptadecane 174548 000629-78-7 93 24 19.1256 2.4333 4,4'-Dimethylbiphenyl 90542 000613-33-2 43 25 21.8968 1.5435 n-Tetradecane 113297 000629-59-4 86 26 22.0396 2.0087 METHYL-ANTHRACENE 103909 000610-48-0 58 2,3-dihydro-4,7- 11 P K 27 22.1348 Area Pct 2.9698 28 23.3142 29 30 RT Library/ID Ref CAS Qual Anthracene, 9-methyl- 103921 000779-02-2 81 1.2577 n-Eicosane 228993 000112-95-8 94 23.9329 3.2792 Pyrene 125000 001576-69-8 95 24.0334 2.0898 3,6-Dimethylphenanthrene 125004 001576-67-6 76 31 24.6628 2.5805 154914 000544-76-3 90 32 25.144 1.8888 145347 000000-00-0 59 33 25.5089 1.4153 n-Hexadecane 11-Methylene-2-oxa-4,4,7trimethyltricyclo(1,6)]dodecane Phenanthrene, 2,3,5-trimethyl- 145448 003674-73-5 91 34 25.9532 1.1889 n-Docosane 261311 000629-97-0 95 35 27.196 1.3854 n-Octadecane 193184 000593-45-3 83 36 28.2749 5.7557 Acenaphthylene 313828 000123-79-5 98 37 28.4442 3.406 Hexadecane 154901 000544-76-3 38 38 29.9144 1.7846 Eicosane 228988 000112-95-8 38 12