0806 nghiên cứu tạo cây đậu xanh chuyển gen có khả năng kháng mọt luận văn tốt nghiệp

KẾTLUẬNVÀĐỀNGHỊ 1.Kếtluận 1.1 Khả kháng mọt giống đậu xanh đánh giá thông qua cácchỉ tiêu khối lượng hạt hao hụt, tỷ lệ nhiễm mọt, hệ số gia tăng quần thể.Giống đậu xanh Tằm TH có khả kháng mọt tốt nhất, số mẫn cảm vớimọtC c h i n e n s i s l , ; g i ố n g đ ậ u x a n h Đ X 2 c ó k h ả n ă n g k h n g m ọ t kémnhất,chỉsốmẫncảmvớimọtlà1058,72vàcaohơnởgiốngTằmTH1,67 lần 1.2 GenVrPDF1phân lập từ đậu xanh gồm 356 bp, có cấu trúc phânđoạn, gồm hai exon intron Đoạn mã hóa genVrPDF1có kíchthước228bp, mã hóa 75 amino acid 1.3 Vector chuyển gen thực vật pBetaPhaso-VrPDF1biểu hạt đượcthiết kế thành công hoạt động tốt thuốc lá.Gen chuyểnVrPDF1đãhợpnhấtvàohệgencủacâythuốcláchuyểngenvàđượcditruyềntừthếhệT0 sang hệ T1 Protein tái tổ hợp VrPDF1 có kích thước khoảng 10 kDađược biểu hạt thuốc có khả ức chế-amylase ruột ấutrùngmọt 1.4 Biến nạp thành công cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1và tạo dòng câyđậu xanh chuyển gen hệ T1 từ giống đậu xanh ĐX22 Xác định đượcprotein tái tổ hợp VrPDF1 biểu hai dòng đậu xanh chuyển gen thếhệ T1 (DX1-3 DX1-7) có kích thước khoảng 10 kDa Hiệu suất chuyển genởgiốngđậuxanhĐX22đạt0,32%.ProteintáitổhợpVrPDF1biểuhiệnứcchế-amylase ấu trùng mọt, hiệu suất ức chế-amylase hai dòng đậuxanh chuyển gen DX1-3 DX1-7 hệ T1 tăng 166,40 % 178,19% sovớicâykhông chuyển gen Đềnghị Tiếp tục theo dõi, đánh giá hai dòng đậu xanh DX1-3 DX1-7 cácthếhệtiếptheo,thửnghiệmkhảnăngkhángmọtthơngqualây nhiễmnh ântạonhằmchọntạodịngđậuxanhchuyểngenổnđịnhvềkhảnăngkhángmọt cao 24 MỞĐẦU Đặtvấnđề Đậux a n h l m ộ t t r o n g b a c â y đậuđ ỗ c h í n h t r o n g n h ó m cá c c â y đậ u ănh t , đ ứ n g s a u đ ậ u t n g v l c H t đ ậ u x a n h l n g u n t h ự c p h ẩ m g i u đạm.Hạtđậuxanhvừacungcấpproteinchoconngười,vừacógiátrịtrong yh ọ c , v c ũ n g l c â y có g i t r ị t r o n g c ả i t o đ ấ t V i ệ t N a m l q u ố c g i a c ó điềuk i ệ n t ố t đ ể p h t t r i ể n s ả n x u ấ t n ô n g n g h i ệ p , t u y n h i ê n c ũ n g l y ế u t ố thuận lợi cho sâu hại phát sinh, phát triển gây tổn thất nghiêm trọng tới năngsuấtvàphẩm chất nơngsản Theoước tính,tổnthấts a u t h u h o c h khoảngtừ1 % 30%s ả n l ợ n g trồngnông n g h i ệ p Điều cóng hĩ a làk h o ả n g % - % l ợ n g l n g t h ự c k h ô n g b a o g i đ ợ c s d ụ n g v cũnglàtỷlệ tổn thất cơng sức tài đầu tư sản xuất nơngnghiệp.Dođó,việc đ n h giá v h n c h ế t ổ n t h ấ t sa u t h u h o c h l công t c rấtc ó ý n g h ĩ a t r o n g v i ệ c đ ả m bảo l n g t h ự c t r o n g đ i ề u k i ệ n h n c h ế d i ệ n tíchtrồngtrọtvàdânsốđanggiatănghiệnnay Đối với nhóm nơng sản hạt ngun nhân chínhgây tổn thất đến số lượng chất lượng hạt côn trùng mà chủ yếu sốthuộcBộcánh cứng (thườnggọilàmọt).Các loà imọtg ây hạichủyếuch o đậuđỗlà:mọtđậuxanh(CallosobruchuschinensisL.),mọtđậuđỏ(Callosobruchus maculatusF.), mọt đậu nành (Ancanthoscelides obtectus)… Trongđ ó , m ọ t đ ậ u x a n h Callosobruchusc h i n e n s i s L.t h u ộ c h ọ Br uchid,bộColeopteralà loài gây hại chủ yếu cho hạt đậu xanh Sự tổn hại mọt gâyralàrấtlớn,dođócơngtácphịngtrừmọtđậunóichungvàmọtđậuxanhnóiriêngđang mộtvấn đề cầnđược quan tâmnghiên cứu Hiện nay, có số nghiên cứu bước đầu đánh giá khả năngkháng mọt, kháng nấm, kháng virus … số loại trồng cóđậuxanh T h eo nghiên cứuđ ã cơngbố,đ ặc tí nh kháng mọthạ ihạt c ủacâytrồngrấtphứctạpvàliên quan đến hoạt động protein defensin.Defensin thực vật nhóm chuỗi peptide nhỏ đặc trưng cấu trúc gấp cuộnba chiều qua cầu nối disulfide cystein Defensin thực vật hoạt độngmạnh tổng hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến kênh trao đổi ion, tác độngđếnhoạtđộngcủaα-amylasevàtrypsin, làmsuyyếu visinh vật… Cơchế gây độccủadefensinđốivớimọtđậuxanhlàsựcảntrởhoạtđộngphângiảitinh 24 DX1-3, DX1-7 bảng 3.10 cho thấy hiệu suất hoạt động của-amylase từ ấutrùng mọt đậu xanh dịch protein chiết từ chuyển gen giảm so với dịchprotein chiết từ không chuyển gen, 33,60% (DX1-3) 21,81%(DX1-7).Nhưvậy cóthểthấy trongnghiêncứunày,proteintáitổhợprVrPDF1 hai dịng đậu xanh chuyển gen T1 ức chế hoạt động-amylase ấu trùng mọt đậu xanh So với không chuyển gen, hiệu suấtức chế-amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh rVrPDF1 dịng đậu xanhchuyểngen DX1-3 tăng 166,40%và 178,19%ởdịngDX1-7 (Hình 3.24) Defensinởhạtđậuxanhcókhảnăngứcchế-amylasecủamọtđậu xanh GenVrPDF1(gen nội tại) mã hóa protein defensin đậu xanh có kíchthước 356 bp, gen chuyểnVrPDF1 có kícht h c 2 b p c ù n g h o t đ ộ n g phiên mã dịch mã tổng hợp protein defensin VrPDF1 protein VrPDF1đều ức chế hoạt động-amylase ấu trùng mọt đậu xanh Kết so sánhhiệu suất ức chế-amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh rVrPDF1 dòngđậu xanh chuyển gen DX1-3 tăng 166,40% 178,19% dịng DX1-7 so vớicây khơng chuyển gen chứng minh tăng cường biểu defensin tronghạt ứng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen biện pháp nâng cao khả năngkháng mọthạihạtcủacâyđậu xanh % bột của-amylase ruột mọt ngăn chặn tiêu hoá tinh bột mọt,ức chế sinh trưởng phát triển mọt Defensin hạt đậu xanh có hàmlượngthấpvàkhácnhaugiữacácgiống,vìthếđểtănghiệuquảứcchếαamylasecủaruộtấutrùngmọt,việcứngdụngcơngnghệgennhằmtăngcườngbiểuhiện,nâng caohàmlượngdefensintronghạtđượcquantâmnghiêncứu.Xuấtpháttừnhữngcơsởtrên,chú ngtơilựachọnđềtàicholuậnánlà:“Nghiêncứutạocâyđậuxanhchuyểngencókhảnăngk hángmọt” Mụctiêunghiên cứu (i) Phânt í c h đ ợ c đ ặ c đ i ể m c ủ a g e n d e f e n s i n ( VrPDF1)p h â n l ậ p t c c giốngđậuxanhViệtNamcó khảnăng kháng mọtkhác (ii) Biểuhiệnđượcgendefensin1trêncâythuốcláchuyểngen (iii) Tạođượccâyđậuxanhchuyểngenchứagenliênquanđếntínhkhángmọt CallosobruchuschinensisL Nộidungnghiên cứu 3.1 Nghiên cứu đánh giá khả kháng mọt số giống đậu xanhtrồngphổbiến ởmiền BắcViệtNam 3.2 Nghiên cứu thông tin, tách dịng xác định trình tự genVrPDF1phânlậpt c â y đậux a n h P h â n t í c h đ ặ c đ i ể m t r ì nh t ự n u c l e o t i d e , t r ì n h t ự a m i n o acidsuydiễncủagenVrPDF1phân lập từ giống đậu xanh có khả khángmọttốtnhấtvà giống đậuxanh kháng mọtkémnhất 3.3 ThiếtkếvectorchuyểngenthựcvậtmanggenVrPDF1vàphântíchhoạt độngcủavectorchuyểngentrên câythuốc láchuyểngenở thếhệ T0và T1 3.4 Nghiên cứu chuyển cấu trúc chứa genVrPDF1và tạo đậu xanhchuyển gen Phân tích biểu protein tái tổ hợp rVrPDF1 đậu xanhchuyểngen ởthếhệ T1 Nhữngđónggópmớicủaluậnán 200,0 180,0 160,0 140,0 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 178,19 166,40 100 100 33,60 21,81 Luậnánlàcơngtr ìnhđầutiênởViệ tNamnghiêncứu cóhệthốngtừ H i ệ u s u ấ t h o t đ ộ 23 n g c ủ a a l p h a - a s e c ủ a d ò n g c â y c h u y ể n a m y l a s e c ủ a d ò n g c â y c h u y ể n H i ệ u s u ấ t ứ c c h ế a l p h a a m y l đánhg i v p h â n n hómcácgiốngđậ uxanhcókhảnăn gkhángmọtkhá c WT ĐX1-3 ĐX1-7 Hình3 B i ể u đ s o s n h hi ệu s u ấ t h o t đ ộn g  amylasev h i ệ u s u ấ t ứ c c hế-amylase protein defensin hỗn hợpamylase từ ấu trùng mọtđậuxanh dịch protein chiếttừ câychuyển gen, câykhông chuyển gen gent ă n g sovớicâyWT nhau;p h â n l ậ p , t c h d ò n g g e n V r P D F đến t h i ế t k ế vectorchuyểngen,tạoc âychuyển gen phân tích sựbiểu hiệngenchuyển VrPDF1, cụ thể là: 1) ĐãphânlậpđượcgenVr PDF1từDNAhệgencủaha igiốngđậuxanhcókhảnăng khángmọtkhácbiệtnhau.G enVrPDF1cókíchthước356 bpgồm 23 Phântíchđịnhtínhhoạtđộcủa-amylasetừấutrùngmọtphângiảicơ chấttinh bộtđượcthể ởhình3.23 Hình3.23.Hìnhảnhphântíchđịnhtínhkhảnăngứcchếα-amylaseấutrùngmọtđậu xanh protein tái tổ hợp rVrDEF1 từ hạt đậu xanh chuyểngen ĐX22thếhệT1vàhạtcâyđậuxanhĐX22đốichứngkhôngchuyểngen 3.3.5.ThảoluậnkếtquảtăngcườngbiểuhiệnproteinVrPDF1ởcâyđậu xanhchuyển gen Gen chuyển biểu chuyển gen kiểm tra dựa kếtquả phân tích hoạt động phiên mã dịch mã gen chuyển sử dụngcác kỹ thuật RT-PCR, Real time RT-PCR, Western blot Tương tự phântích biểu gen nghiên cứu trước đây, kết nghiên cứu củachúngtơi,proteintáitổhợpVrPDF1đượcbiểuhiệnởcảcâymơhìnhvàcâychuyển gen với kích thước khoảng 10 kDa Khác với nghiên cứu trên,trong phân tích protein tái tổ hợp chuyển gen sử dụng kỹ thuậtELISAđểsosánhmứcđộbiểuhiện proteintáitổhợpgiữacácdịngcâychuyển gen Theo đó, kết phân tích ELISA dịng đậu xanh chuyển genDX1-3 DX1-7 xác định hàm lượng protein táitổ hợp VrPDF1 ởdịng DX1-7 cao dịng DX1-3 (Hình 3.22) Như vậy, theo hướng tiếp cậnkhả kháng mọt tương quan với hàm lượng protein defensin VrPDF1 thìkết phân ELISA dự đốn hệ đậu xanh chuyển gen T1dịng DX1-7 có khả kháng mọt cao dòng DX1-3 Tuy nhiên, điềunày cần kiểm chứng thực nghiệm phân tích hoạt động ức chế-amylase protein tái tổ hợp VrPDF1 so sánh khả kháng mọt giữacác dòng đậu xanh chuyển gen dịng chuyển gen đối chứngkhơng chuyển gen Trong kết đánh giá hoạt động ức chế-amylase từ ấutrùngm ọ t đ ậ u x a n h c ủ a p r o t e i n t i t ổ h ợ p r V r P D F c ủ a h a i d ò n g đ ậ u x anh 22 1i n t r o n ( b p ) x e n g i ữ a e x o n ( 2 b p ) ; c D N A c ủ a g e n V r P D F c ó 228bp,mãhóa75 amino acid 2) Protein tái tổ hợp rVrPDF1 biểu thuốc chuyển gen vàdịch chiết chứa protein rVrPDF1 từ dòng thuốc chuyển gen T1 có khả năngứcchế-amylase ruộtấu trùngmọt 3) Tạo đậu xanh giống ĐX22 mang gen chuyển VrPDF1 thếhệ T1 biểu thành công protein tái tổ hợp rVrPDF1 Chứng minh đượcdịch chiết chứa protein tái tổ hợp rVrPDF1 biểu ức chế-amylase ấutrùngmọt,hiệusuấtứcchế-amylase hai dòng chuyển gen DX1-3 DX1-7tăng 166,40%và 178,19%so vớicâykhông chuyển gen Ýnghĩakhoahọcvàthựctiễn 5.1 Vềmặtkhoa học Kết nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc genVrPDF1phân lập từ giống đậu xanh Việt Nam có khả kháng mọtkhác Sự tăng cường biểu protein tái tổ hợp rVrPDF biểu hiệnkhả ức chế-amylase ruột ấu trùng mọt protein từ câychuyển gen sở khoa học để khẳng định hiệu việc ứngdụng công nghệ gen nhằm nâng cao khả kháng mọt đậu xanh nóiriêng câytrồng thu hạtnóichung 5.2 Vềmặtthực tiễn Các trình tự genVrPDF1phân lập được, cấu trúc vector chuyển genthực vật mang genVrPDF1,các dòng chuyển gen T1, dịch chiết chứarVrPDF1 có khả ức chế-amylase ruột ấu trùng mọt góp phầngiảiquyếtnhữngvấnđềcụthểvềviệcứng dụngkỹthuậtchuyểngentro ngcảithiệnkhảnăngkhángmọtcủacâyđậuxanh,mởratriểnvọngứngdụngcơng nghệ sinh học đại vào thực tiễn chọn giống trồng thu hạt ViệtNam Cấu trúc luận án:Luận án có 119 trang (kể tài liệu tham khảo)đượcchiathànhcácchương,phần:Mởđầu(4trang),Chương1:Tổng quantàiliệu(31trang);Chương2:Vậtliệuvàphươngphápnghiêncứu(22trang);Chương 3: Kết thảo luận (42 trang); Kết luận đề nghị (1 trang); Cáccơng trình cơng bố liên quan đến luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (18trang).Luận án có 21bảng,31 hình thamkhảo 158 tàiliệu Chương1.TỔNGQUANTÀILIỆU Luận án tham khảo tổng kết 158 tài liệu, có 27 tài liệutiếng Việt, 126 tài liệu tiếng Anh địa trang web vấn đề bảnliên quan, như: (1) Đặc điểm mọt hại đậu xanh thiệt hại mọt gâyra cho đậu xanh; (2) Defensin thực vật; (3) Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen vàbiểuhiện gen defensinthựcvậtởmộtsố loàithuộc chiVigna Đậuxanhlàcâythựcphẩmngắnngàygiátrịkinhtếcao,dễcanhtác,là nguồn thực phẩm chứa đầy thành phần dinh dưỡng cho người vậtni.Hiệnnay,đậuxanh đóngvaitrị quantrọng sauđậutươ ngvàlạc, b ởi 3.3.4.Kiểmtrahoạtđộngứcchếα-amylaseamylasetừấutrùngmọtcủaprotein táitổ hợprVrPDF1 ởthế hệ T1 Dịch chiết protein từ hạt đậu xanh hai dòng chuyển gen DX13,DX1-7 hệ T1 kiểm tra biểu protein defensin tái tổ hợp bằngWestern blot ELISA dịch chiết protein từ hạt không chuyển genWTđượcsửdụngthửnghiệmkiểmtrakhảnăngứcchế-amylase ấutrùng mọtđậu xanh Kếtquảđược thểhiệnởbảng3.10 Bảng 3.10.Hoạt độ của-amylasetừ ấu trùng mọt đậu xanh mẫu ủvới dịchchiếtproteintừhạtcủacácdịngđậuxanhchuyểngenT1vàtừhạtcâykhơng chuyển gen vậylànhómcâytrồngđượcưutiênkhuyếnkhích sảnxuất Nhằmnângcao Mẫu ĐC năngsuất,sảnlượngđậu x anh,nhiềucơngtrìnhtậpt rung nghiêncứu,chọntạov đ a r a giống c ó chất lượng,chốngchịuđiềuk i ện b ấ t l ợ i v p h ù hợpvớim ọivùngđấtcanhtác Ch ỉcó α-amylase a m yla set ừấ u 21 Hỗnhợpα-amylase amylasetừấu tr ù ng m ọt đậ ux trùng an hv àd ịc h pr otei n chi ết từ dò ng câ y chuyển gen Sâubệnhlànguyênnhântrựctiếpảnhhưởngtớinăngsuấtvàbảoquản DX1-3 sauthuhoạchcácloàicâylấy H 9,47±0,29 6,19± hạtnhưđậuxanh,đậutương, 0,09 …,làmgiảmchất lượngvàg iát rị thương ph 2,08±0,06 1,35± ẩm củasảnphẩm, tr ongđ 0,05 ócómọt hạiđậu xanh Mọt gây hại đậu xanh(Callosobruchus chinensisL.)khơng gây hạitrong kho dự trữ mà chúng lan truyền gây hại đồng ruộng.Mọt đậu xanh gây hại loại đậu: đậu xanh, đậu tằm, đậu đũa, đậu HàLan, đậu đen hại nặng đậu xanh với tỷ lệ hại 100% (Bùi CơngHiển, 1995) Sự thiệt hại chúng gâyralàrấtlớn,dođócơngtácphịngtrừsâu mọt đậu nói chung mọt đậu xanh nói riêng vấn đề cấp thiếtcần (ĐVHĐ/mg) chế, ảnh hưởng đến chức kênhion, tác động đến hoạt động α-amylase trypsin, làm suy yếu vi sinh vật(Cavalho et al., 2011) Cơ chế gây độc defensin côn trùng hạtđậux a n h đượcmô t ả n h l s ự c ả n trở e nz ym e p h â n g iảit i n h b ộ t , l m cho Bảng 3.10 cho thấy hoạt độ của-amylase thí nghiệm cóamylase từ ấu trùng mọt chất tinh bột 9,47 (ĐVHĐ/mg), khó đóhoạt độ của-amylase hỗn hợp-amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh vàdịch protein chiết từ không chuyển gen 6,19 (ĐVHĐ/mg) Đối với haidòng chuyển gen, hoạt độ của-amylase hỗn hợp-amylase từ ấutrùng mọt đậu xanh dịch protein chiết từ dòng chuyển gen DX1-3 là2,08 (ĐVHĐ/mg), từ dịng DX1-7 1,35 (ĐVHĐ/mg) Như thấy,dịch chiết protein từ chuyển gen khơng chuyển gen có hiệntượng làm giảm hoạt độ-amylase so với thí nghiệm có-amylase từ ấutrùng mọt chất tinh bột Kêt phân tích cho thấy hỗn hợpamylasetừ ấu trùng mọt đậu xanh dịch protein chiết từ hai dịng quantâmnghiêncứu.Trongnhữngnămquacó nhiều cơng trìnhnghiên cứu chọn tạo loại trồng có khả kháng loại côn trùng,nấm virus Các nghiên cứu thống đặc tính kháng mọt hại hạtcủa câytrồngrấtphức tạpvàliên quanđến hoạtđộngcủaproteindefensin Defensin thực vật nhóm chuỗi peptide nhỏ đặc trưng cấu trúc gấpcuộn ba chiều qua tám cầu nối disulfide cystein Defensin thực vậthoạt động mạnh tổng hợp protein ức 21 chuyển gen(DX1-3 DX1-7) có hoạt độamylase thấp khơng chuyển gen.Điều chothấy proteintáitổhợprVrPDF 1tronghaid ị n g đ ậ u x a n h chuyểngen ởthếhệ T1 cókhả năngứcchế-amylase từấutrùng mọt 21 WT khơng xuất băng protein Kết phân tích Western blot đãchứng minh protein tái tổ hợp rVrPDF1 biểu thành cơng haidịng đậu xanh chuyển gen DX1-3 DX1-7 có nguồn gốc từ giống đậu xanhĐX22 Như nhận xét rằng, gen chuyểnVrPDF1đã di truyền quasinhsảnhữutínhtừthếhệT0sangT1,hoạtđộngổnđịnhvàbiểuhiệnởcảha ithế hệ câychuyển gen Hình3.21.Kếtquảphân tíchWesternblottừ3dịngđậu xanhchuyển gen thếhệT1 mọt tồn Khi mọt ăn hạt đậu xanh, defensin ức chế hoạtđộng α-amylase, ngăn chặn tiêu hóa tinh bột, kìm hãm sinhtrưởng,pháttriểnvà dần mọt chết(Henrik etal.,2009;Liu etal., 2006) Trong năm gần có số nghiên cứu cấu trúc hoạttínhsinhhọccủadefensinthựcvật,đềxuấtứngdụngtrongcơngnghệsinhhọctrongngh iêncứuchứcnăngcủagendefensinvànângcaokhảnăngkhángmọtởcâyđậuxanh(Cavalhoetal., 2009,2011;Dosetal., 2010;Henriketal.,2009; Tavars et al, 2008) Defensin thực vật biểu nhiều quan khácnhau tạo tuyến phòng vệ trước đối tượng sâu bệnh.Mặc dù tác động defensin thực vật nhiều đối tượng sâu bệnh cịnchưa hiểu rõ, defensin sử dụng để tạo câytrồng biến đổi gen, giúp cải thiện khả chống chịu mọt Chuyển gendefensinởđậuxanhlàbiệnphápcơngnghệlàmtănghàmlượngdefensinnhằmtăng cường khảnăngứcchếα-amylasecủaấutrùngmọt,từđónângcaokhảnăngkhángmọtởđậuxanh vàcâyđốichứngkhơngchuyển gen Chương2 Hàm lượng protein tái tổ hợp rVrPDF1 hạt hai dòng DX13và DX1-7 hệ T1được phân tích ELISA, kết thể ởhình 3.22 Biểu đồ cho thấy hai dòng đậu xanh chuyển gen tổng hợp rVrPDF1 với hàm lượng protein dao động từ 6,23 µg/mg đến 9,26 µg/mg Dòng DX17làh m l ợ n g p r o t e i n r V r P D F c a o h n p r o t e i n r V r P D F c ủ a d ò n g D X - Kết chứng minh hai dòng đậu xanh chuyển gen, proteinVrPDF1được tăng cường biểu Hình 3.22.Kết phân tích ELISA xác định hàm lượng protein tái tổ hợpVrPDF1 ba dòng đậu xanh chuyển gen (DX1-3, DX1-4, DX1-7) đốichứng khơngchuyểngen(WT) 20 VẬTLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 2.1 VẬTLIỆU NGHIÊN CỨU Sửdụnghạt8giốngđậuxanh,trongđó6giống(TằmTH,ĐX11,ĐX22,ĐXVN5,ĐX VN6,ĐX14)doTrungtâmnghiêncứuvàpháttriểnđậuđỗ,ViệnCâyLươngthựcvàThự cphẩm,ViệnKhoahọcNơngnghiệpViệtNamcungcấp,haigiống(ĐX17,V123)doViệnn ghiêncứuNgơĐanPhượngcungcấp.GiốngthuốcláK326doPhịngCơngnghệtếbàothựcvật,ViệnCơng nghệsinhhọc,ViệnHànlâmKhoahọcvàcơngnghệViệtNamcungcấp Các chủng vi khuẩnE coliDH5α vàA tumefaciensCV58 phịngCơng nghệ tế bào thực vật Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KhoahọcvàCông nghệ Việt Nam cungcấp.Cácloạivector:Vectortáchd ò n g pBT, vector pBeta-Phaseolin vector pDON201SLHEPdoPhịngCơngnghệ ADN ứng dụng, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học vàCơngnghệViệtNamcung cấp 2.2 HỐCHẤT,THIẾTBỊVÀĐỊAĐIỂMNGHIÊNCỨU Hố chất, KIT mua hãng tiếng Thế giới nhưBio-Neer, Fermentas, Invitrogen ; Thí nghiệm đánh giá khả kháng mọtcủa giống đậu xanh nghiên cứu thực phịng thí nghiệm củaTrungtâmCơngnghệsinhhọc,TrườngĐạihọcNơngLâmBắcGiang.C c thínghiệm phânlậpgen,thiếtkếvectorchuyểngenvàocâythuốclávàphântíchcâychuyểngenđượctiếnhànhtạiphịngCơngnghệADN ứngdụng,phịngCơng nghệ Tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoahọc Cơng nghệ Việt Nam Thí nghiệm chuyển gen vào đậu xanh đượctiến hành phịng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học,trườngĐạihọcSưphạm-ĐạihọcTháiNguyên 2.3 PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU 2.3.1 Phương pháp đánh giá kháng mọt giống đậu xanh nghiêncứu Phương pháp lây nhiễm mọt nhân tạo theo Tomooka cs (1992), HàQuangHùng (2005) 2.3.2 Phươngphápphânlập,táchdịngvàxácđịnhtrìnhtựnucleotide KỹthuậttáchdịnggenđượcthựchiệntheoSammbrookvàcs(2001) Trình tự nucleotide củagen VrPDF1 xác định máy đọct r ì n h tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (AppliedBiosystem) sửdụng hoá chất sinh chuẩn BigDye® Terminator v3.1 CycleSequencing 2.3.3 Thiếtkế vector chuyển gen (1) Tạo cấu trúc độc lập mang gen chuyển pDON201-SLHEP-VrPDF1; (2)Gắn cấu trúc mang gen chuyểnVrPDF1vào vector chuyển gen thực vậtpBetaphaso-VrPDF1 2.3.4 PhươngpháptạocâychuyểngennhờvikhuẩnA.tumefaciens Tạo thuốc chuyển gen: Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông quaA.tumefaciensđược tiến hànhtheo phương phápcủa Topping (1998) Tạo đậu xanh chuyển gen: Phương pháp chuyển gen thông qua nách lámầm nhờA tumefaciensđược tiến hành dựa nghiên cứu Sonia cs(2007) tham khảo hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen vào đậu xanh củaNguyễn Thị Luyện(2009), Chu Hoàng Mậu (2010) Nguyễn Vũ ThanhThanh(2012) HiệusuấtchuyểngenVrPDF1ởgiaiđoạnnàyđượcxácđịnhđạt0,79%(5/630 =0,79%) Sử dụng Southern blot kiểm tra kết gắn gen chuyểnVrPDF1vàohệg e n c ủ a t ế b o c h ủ N ă m d ò n g đ ậ u x a n h c h u y ể n g e n T d n g t í n h v i PCR DX0-1, DX0-3, DX0-4, DX0-7, DX0-8 đối chứng khơng chuyểngen WT sử dụng để phân tích Southern blot, kết thể hình3.20 19 KbM ( + ) W T 10,0 7,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,5 Hình 3.20.Kết phân tích Southern blot DNA tổng số đậu xanhchuyển genVrPDF1với đoạn dònptIIđ ợ c đ n h d ấ u b ằ n g b i o t i n M : M a r k e r 1kb, (-):cây đậu xanh ĐX22 khơng chuyển gen; DX0-1, DX0-3, DX0-4, DX0-7vàDX0-8: cácdịngđậuxanhchuyểngenT0dươngtínhvớiPCR Như vậy, chứng có mặt dung hợp genchuyển hệ gen chuyển gen hệ T0 PCR vàSouthern blot kết bước đầu tạo sở cho thành cơng quytrình chuyển genVrPDF1vào đậu xanh Các dịng đậu xanh chuyểngen chăm sóc ưu tiên phát triển phục vụ phân tích vềkhả hoạt động biểu mạnh gen chuyểnVrPDF1trong câychuyển gen 3.3.3.PhântíchsựbiểuhiệncủagenchuyểnVrPDF1trongcácdịngcây đậuxanh chuyển genT1 Kết lai Western phân tích biểu protein tái tổ hợp từ hạt 3dòng đậu xanh chuyển gen WT hình 3.21 cho thấy, mànglaixuấthiệnbăngmàuởvịtríkíchthướckhoảnggần10kDaở2dịngcâ yđậuxanhchuyểngen(DX1-3,DX1-7)ởthếhệT1.DịngchuyểngenDX1-4 2.3.5.Nhómphươngphápphân tíchcây chuyểngen KiểmtrasựcómặtcủagenchuyểnbằngkỹthuậtPCR.Phântíchcây đậux a n h c h u y ể n g e n b ằ n g Đối T S S S S Số SouthernblotởthếhệT0 ch ổ ố ố ố ố câ đượct h ự c h i ệ n t h e o ứn n m c c c ys gv g ẫ h h â ốn SouthernEM(1975).Phântích àt biểuhiệnproteintáitổhợpVrP s u ồ y g DF1tronghạt hí ố tạ i i s só câychuyểngenởthếhệT1bằn ng m oc k r ố ttr gphươngphápđiệndiprotein hi theoLaemmli ẫ h é a n on ệ u ồi o r g gn m ễ t hà r ê n gi dài thể(1970)vàWesternblot.ĐịnhlượngproteinVrPD lưới ELISAtheophươngphápcủaSunvàcs(2006) Bảng 3.9.Kết biến nạp cấu trúc pPhaso-dest-VrPDF1 vào giống đậu xanhĐX22 ĐC0* ĐC1* 30 30 30 45 25 10 10 Thínghiệm 630 247 107 46 * Ghi chú: ĐC0 mầm đậu xanh không chuyển gen cấy mơi trường táisinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1*lá mầm đậu xanh không chuyển gen cấytrên môi trườngtáisinhkhôngbổsung khángsinh 3.3.2 Xác định có mặt dung hợp gen chuyểnVrPDF1tronghệ gencâyđậuxanhchuyển gen Để kiểm tra có mặt gen chuyểnVrPDF1trong hệ gen 18 35 23 cácdòngcây đậuxanh đư ợc c huyển gen, th ự ch i ệ n phảnứ ngPCRvớ i cặp mồ i đặc hiệu,kếtquảt h ể hiệnởhình 3.19 F Chương3 Chỉs ố m ẫ n c ả m mọtđượcxácđịnhth ôngquacácchỉtiêu: k h ố i lượngđ ậ u x a n h h a o hụt,tỷlệnhiễmmọtv àhệsốgiatăngquầnth ể m ọ t Giống có số mẫn cảm mọtnhỏthìkhảnăngkhángmọtcaovà ngược lại.Kếtquả thểhiện qua bảng 3.1 KẾTQUẢVÀTHẢ OLUẬN 3.1 ĐÁNH GIÁKHẢNĂNGKHÁ NG MỌT VÀ PHÂNLẬPGENVrPD F1 CỦACÂYĐẬUXANH 3.1.1 Khảnăngkhángmọtc ủacácgiốngđậuxanh M (+) nghiêncứu 0,5kb 0,25kb  ~ , k b  ~ , k b (-) 56 Giống TằmTH ĐX11 ĐX22 ĐXVN5 ĐXVN6 ĐX14 ĐX17 V123 ểngenT0đượckýhiệulàDX0Chỉsố 1;DX0-3,DX0-4,DX0mẫnc 634,63 828,89 1058,71 760,35 792,55 961,54 902,88 687,76 ảm 7,DX0-8 mọt Bảng 3.1 cho thấy, giống đậu xanh Tằm TH có số mẫn cảm mọtthấp (634,63) giống ĐX22 có số mẫn cảm mọt cao (1058,72).Kết hợp các kết phân tích nhận thấy giống đậu xanh TằmTH có khả kháng mọt tốt giống ĐX22 kháng mọt Lựachọn2giống nàyđể tiếp tục phân lập, tách dònggen Bảng 3.1 Kết đánh giá khả kháng mọt giống đậu xanh quacácthờigiann hiễmmọt khơng chuyểngen;1-8: dịngcâyđậuxanhđược chuyểngenVrPDF1 Hình 3.19.Kết điện dikiểm trasản phẩm PCR nhân genV r P D F t c c dòng đậu xanh chuyển gen hệ T0 cặp mồiVrPDF1HinIII-F/VrPDF1-SalI-R.M: thang DNA chuẩn kb; (+): đối chứng dương plasmidpBT-VrPDF1; (-) sản phẩm PCR nhân genVrPDF1cây đậu xanh Kếtquảtrênđãchỉrarằ ng,tronghệgencủacâyđậuxan hchuyểngentươngứng vớilànđiệndisố1,3,4,7,8đãcóm ặtcủagenchuyểnVrPDF1.Tro ng630mẫubiếnnạpthuđược5c âyđậuxanhT0dươngtínhvớiP CRvà5dịngcâyđậuxanhchuy 18 3.1.2 ĐX22 KhuếchđạivàtáchdònggenVrPDF1từgiốngđậuxanhTằmTHvà Lựa chọn hạt giống Tằm TH (kháng mọt tốt nhất) giống ĐX22(kháng mọt nhất) làm đối tượng để phân tích đặc điểm genVrPDF1.RNA tổng số, DNA tổng số tách từ mầm hạt đậu xanh kiểm trabằngđiệnditrên gelagarose.Kếtquảđược thể hiệnởhình 3.2 M 3.3.T Ạ O C  Y Đ Ậ U X A N H C H U Y Ể N G E N V À B I Ể U H I Ệ N P R O T E I N TÁITỔHỢP rVrPDF1 ỞGIỐNGĐẬUXANHĐX22 3.1.1.ChuyểncấutrúcpPhaso-amylasedest-amylaseVrPDF1vàtạocâyđậuxanhchuyểngen Chuyển cấu trúc pBetaPhaso-dest-VrPDF1vào giống đậu xanh ĐX22được thực nhờA.tumefacienslây nhiễm qua nách mầm Kết đượcthểhiệnởhình 3.18 bảng3.9 12M34 A B F G C E 0,5 kb cDNA ~ Gen 0,22 kb DNA)  b Hình 3.2.Kết điện di kiểm tra sảnphẩm PCR nhân genVrPDF1của haigiống đậu xanh Tằm TH ĐX22 (M:Thang DNA chuẩn kb plus; 1, 3: sảnphẩm PCR nhân từ mRNA DNAhệgen ~0,35kb Tằm TH ; 2, 4:sản phẩm PCRnhân từmRNA vàDNA hệgencủaĐX22) 17 H ì n h K ế t q u ả đ i ệ n d i k i ể m t r a s ả n p h ẩ m ; c o l o n y P C R n h â n l c , E , c o l i , D H  ( M : g e n V r P D F t : c c d ò n g T h a n g k h u ẩ n c c D N A l c d ò n g c h u ẩ n c h ứ a k h u ẩ n k b v e c t o 17 r m a n g c D N A v D N A g e n V r P D F c ủ a g i ố n g T ằ m T H ; , P D F m a n g , , c ủ a c D N A v : c c D N A V r d ò n g k h u ẩ n l c K g i ố n g Đ X 2L ) M N Hình 3.2 cho thấy, băng DNA có kích thước khoảng 0,25 kb 0,35 kbđúngnhưtínhtốnlýthuyếtvềkíchthước cDNA kích thước genVrPDF1.Sản phẩmPCR đư ợ c tách khỏi bảngel,ti n h sạchvàgắn trực ti ếp vào vectortáchdịngpBT,sauđóđượcnhândịng tế bàoE coliDH5.Tiến hành chọn dòng phản ứng colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc Kếtquả điện di cho thấy sản phẩm colonyPCR xuất băng DNA có kíchthước khoảng 0,22 kb 0,35 kb tính tốn lý thuyết (Hình c h ứ a v e c t o r J I H O 3.3) Kếtquả ởhình3.3 cho thấy kếtquảchọndịngthànhcơng vàcácd ị n g khuẩnl c d n gtínhvớiPCRđượcsửdụ ngtáchchiếtplasmidtáit ổ h ợ p phụcvụ việc xác định trình tựnucleotide 17 Hình 3.18.Hình ảnh q trình biến nạp cấu trúc pBetaPhasoVrPDF1quamơ nách mầm tái sinh đậu xanh chuyển gen.A: Hạt đậu xanhĐX22; B: Khử trùng hạt khí clo; C: Gieo hạt môi trường GM; D:Nảy mầm hạtsau3ngày;E:lámầmvànáchlá mầm làm nguyên liệu biếnnạp; F: Nhiễm khuẩn 30 phút; G: Đồng nuôi cấy CCM; H: Cảmứng tạo chồi SIM 1; I: Sau tuần SIM 1; J: Cảm ứng tạo chồi 2tuần SIM 2; K: Chọn lọc kéo dài chồi SEM; L: Ra rễ; M: Câyragiá thể;NO:Câytrồngtrongchậuở điều kiện nhà lưới 17 10 8,57 5,69 5,35 3,57 0 WT T1-7 T1-8 T1-10 T1-11 Hình 3.16.Biểu đồ so sánh hàm lượng protein rVrPDF1 tái tổ hợp (g/mg proteintổngsố)giữacácdịngthuốcláchuyểngen.WT:câythuốclákhơngchuyểngen,T1-7, T1-8, T1-10, T111: bốn dòng thuốc chuyển gen Các số liệu cộtbiểu đồ hàm lượng protein rVrPDF1(g/mg protein tổng số) Thanh đứng trênmỗicột biểuđồlà sai số chuẩn 3.1.3.Đặc điểmcủa genVrPDF1phânlậptừhaigiốngđậuxanhTằmTH ĐX22 Đặcđiểmcủađoạn mãhóathuộc genVrPDF1phân lập từmRNA Kếtquảđọctrìnhtựnucleotidecho thấy:ĐoạncDNAgenVrPDF 1có 228 nucleotide BLAST NCBI cho thấy: So với trình tự genPDF1mang mã số AB020613.1 với genVrPDF1phân lập từ mRNA củagiống Tằm TH DX22 có độ tương đồng tương ứng là99% 96% (Hình3.4) Trình tự nucleotide genVrPDF1(cDNA) phân lập từ mRNA haigiống đậu xanh Tằm THv Đ X 2 đ ã đ ợ c đ ă n g k ý t r ê n n g â n h n g g e n v i mã số LN913082.1 LN913083.1 So với AB020613.1 genVrPDF1củaTằmTHcó5vịtrínucleotide saikhác ĐX22c ó vịtrínucleotide Thửnghiệmhoạtđộngứcchếα-amylasecủaproteintáitổhợprVrPDF1 Đểp h â n t í c h c h ứ c n ă n g s i n h h ọ c c ủ a p r o t e i n t i t ổ h ợ p r V r D E F tronghạtcủacácdòngthuốcláchuyểngenởthếhệT1.Dịchchiếtchứaenzyme-amylase ấu trùng mọt đậu xanh ủ với dịch chiết protein từhạtcácdòngcâychuyểngenvàdịchchiết proteintừhạtcâyđốichứngkhôngchuyển gen để kiểm tra ảnh hưởng protein tái tổ hợp rVrDEF1 đến hoạtđộngcủa-amylasephân giảitinh bột,kếtquảđượctrình bàyởhình3.17 WT 120 100 100,00 80 60 40 20 32,1229,40 19,24 16 27,95 T1-7 T1-8 T1-10T1-11 giống Tằm TH ĐX22 với protein suy diễn từ AB020613.1 trênNgânhàng Gen, kếtquả thể hiệnởhình3.5 Hình ốAB020613 rình ênGenBank cleotide Tiếp tục phân tích, PDF1 so sánh trình NA) tự amino iống acid suy diễn anh Tằm từ trình 22 tựcDNA mang ế t H o t Hình3.17.Biểuđồsosánh kếtquảthửnghiệmhoạtđộngứcc hếcủarVrPDF1 đốivới-amylasetừấutrùng mọtđậuxanh Kếtquả biểu hiệngenởcâythuốc mơhình thành cơnglà cơsở để chúngtơitiến hànhchuyểncấu trúcvàocâyđậuxanh Hình3.5.Trìnhtựaminoacid suydiễntừgenVrPDF1củah aigiốngđậuxanhTằmTH, ĐX22 vàđoạntrìnhtựmangmãsốAB02 0613 p r o t e i n đ ộ c ủ a c ủ a a l p h a a m y l a s e c â y c h u y ể n g e n s o v i k h i ủ v i d ị c h c h i ế t p r o t e i n c ủ a c â y đ ố i c h ứ n g t ấ u t r ù n g m ọ t k h i ủ v i d ị c h c h i 16 Từh ì n h c h o t h ấ y , p r o t e i n V r P D F g m a m i n o a c i d v c ó đ ộ tươngđồngcao.SovớiproteinmangmãsốAB020613thìtrìnhtựaminoacidsuydiễncủagiốngTằmTHcóđộ tương đồng 96%, mẫu ĐX22 có độtương đồng 92%; cịn trình tự amino acid suy diễnVrPDF1của hai giống đậuxanhtương đồng 88% Trình tự genVrPDF1(cDNA) phân lập từ mRNA giống Tằm THkháng mọt tốt sử dụng để thiết kế vector chuyển genVrPDF1nhằmmụcđíchnângcaokhảnăngkháng mọt câyđậu xanh ĐặcđiểmcủagenVrPDF1phân lậptừDNAtổng số KếtquảgiảitrìnhtựnucleotidecủagenVrPDF1phânlậptừDNAt ổ n g sốcủagiốngđ ậuxanhTằmTHvàĐX22chothấy:GenVrPDF1cókíchthước356nucleotidevàbằngBL ASTtrongNCBIđộtươngđồngcủagenVrPDF1sovớigenPDF1mang mã số AB020613.1 GenBank từ 95% đến 99% Việc sosánh trình tự genVrPDF1phân lập từ DNA từ cDNA hai giống đậu xanhTằmTHvàĐX22chophépxácđịnhđượcđặcđiểmcấutrúccủagen vào thuốc gen chuyểnVrPDF1đã hợp vào hệ gen câythuốc 3.2.4 Phân tích biểu protein VrPDF1 tái tổ hợp thuốc láchuyển genở hệT1 Trong dòng thuốc chuyển gen cho kết lai Southern có câychuyển gen thu hạt Hạt T0 hệ chuyển genT1 dịng thuốc chuyển gen T0 thu hạt ký hiệu T1-4, T17,T1-8, T1-10, T1-11 Sử dụng dòng thuốc chuyển gen T1 đối chứngkhông chuyển gen để phân tích biểu protein VrPDF1 tái tổ hợp tronghạt Kếtquả thểhiện quahình 3.15 MW T T - T - 25kDa 15kDa Kết so sánh trình tự nucleotide genVrPDF1phân lập từ DNA hệgen genVrPDF1phân lập từ mRNA khẳng định genVrPDF1đã phânlập thành công từ hệ gen hai giống đậu xanh Tằm TH ĐX22 Hai trình tựgen VrPDF1 giống Tằm TH ĐX22 công bố Ngân hàngGenvớicác mã số LT797533, LT797534 3.1.4.Thảoluậnvềcấu trúccủa proteindefensin Kết so sánh vùng chức VrPDF1 giống đậu xanhkháng mọt tốt kháng mọt khơng thấy có thay đổi cầu nốidisunfidegiữa4 cặp Cyst r o n g vùng chức năngcủa defeinsin(Hình )vàcấutrúc khơng giangiữahaiprotein VrPDF1 khơng có sựkhác L1 L2 L3 L4 T1-8T - T - 1 35kDa 10kDa  Hình3.15.Kết quảlai Westerncủaproteinhạt từmột sốdịngthuốcl chuyển gen hệ T1 với kháng thể cmyc M: thang protein chuẩn từ 10 đến180 kDa; WT: protein thuốc đối chứng (không chuyển gen); T1-4, T1-7, T1-8, T1-10, T1-11: protein dòng thuốc chuyển gen dươngtínhvớilaiSouthern Hình 3.15 cho thấy, màng lai nitrocellulose xuất băng màu ởvị trí kích thước khoảng gần 10 kDa dòng thuốc chuyển gen (T17,T1-8, T1-10, T1-11)ởthếhệT1 Đểđ n h g i m ứ c đ ộ b i ể u h i ệ n p r o t e i n t i t ổ h p s d ụ n g k ỹ t h uật L5L6L ELISA,k ế t q u ả đ ợ c t h ể hiệnở b i ể u đồ t r ê n hình3 16 T rênh ình3 16 c ác c dịngthuốclá chuyển gen có hàm lượngproteinrVrPDF1 dao động từ3 ,57 TamTHDX22 10  g / m 15 gproteintổng mgprotein einVrPDF1cao nhất(8,57g/mgprotein tổngsố) a d l ợ n g p r o t 10 b H ì n h S đ c c c ầ u n ố i d i s u l f i d e g i ữ a c c c ặ p C y 15