Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen gmcyp450 nhằm nâng cao tính chống chịu điều kiện hạn và điều kiện mặn

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN GmCYP450 NHẰM NÂNG CAO TÍNH CHỐNG CHỊU ĐIỀU KIỆN HẠN VÀ ĐIỀU KIỆN MẶN Hà Nội - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN GmCYP450 NHẰM NÂNG CAO TÍNH CHỐNG CHỊU ĐIỀU KIỆN HẠN VÀ ĐIỀU KIỆN MẶN” Người thực : NGUYỄN THỊ MAI Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn : TS ĐỖ TIẾN PHÁT : TS Bùi Thị Thu Hương Hà Nội – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu trung thực chưa công bố Nội dung lý thuyết có khóa luận tơi có tham khảo số tài liệu trích dẫn mục tài liệu tham khảo Mọi giúp đỡ cho việc thực khóa luận cám ơn Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên! Hà nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên thực Nguyễn Thị Mai i LỜI CẢM ƠN Để báo cáo khóa luận tốt nghiệp hồn thành, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Đỗ Tiến Phát TS Bùi Thị Thu Hương theo sát hướng dẫn giúp đỡ tơi tận tình suốt thời gian tơi thực khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn ban Lãnh đạo phịng Công nghệ tế bào thực vật Viện Công nghệ sinh học GS.TS Chu Hoàng Hà TS Đỗ Tiến Phát tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam truyền đạt cho kiến thức định hướng thật quý báu ngành học Trong khoảng thời gian thực khóa luận tốt nghiệp, tơi nhận hướng dẫn hỗ trợ tận tình ThS Nguyễn Hồng Nhung với tất cô, anh chị cán phịng Cơng nghệ tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ấm áp đến tất anh chị cán phòng giúp đỡ Đặc biệt lời cảm ơn cuối muốn dành cho gia đình, bạn bè, người thân yêu bên cạnh ủng hộ, giúp đỡ tất phương diện Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên thực Nguyễn Thị Mai ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii BẢNG CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG .vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii TÓM TẮT viii PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài .2 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Ảnh hưởng số điều kiện bất lợi với thực vật .3 2.1.1 Ảnh hưởng điều kiện mặn đến thực vật .3 2.1.2 Ảnh hưởng điều kiện hạn đến thực vật .5 2.2 Cơ chế chống chịu thực vật với điều kiện bất lợi môi trường 2.3 Các gen CYP450 phản ứng với stress phi sinh học thực vật 2.3.1 Các gen CYP450 thực vật 2.3.2 Các gene CYP450 đậu tương .10 2.3.3 Khả chống chịu mặn, hạn liên quan đến gene CYP450 .10 2.4 Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 12 2.4.1 Đặc điểm chung vi khuẩn Agrobacterium 12 2.4.2 Cơ chế chuyển nạp T-DNA vi khuẩn A tumefaciens 13 2.5 Chuyển gene thuốc 15 2.5.1 Giới thiệu chung 15 2.5.2 Một số thành tựu thuốc chuyển gene giới 16 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 iii 3.1 Vật liệu nghiên cứu .18 3.1.1 Vật liệu thực vật 18 3.1.2 Hóa chất 18 3.1.3 Thiết bị 18 3.2 Phương pháp nghiên cứu 19 3.2.1 Chuyển gen GmCYP450 vào thuốc thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 19 3.2.2 Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu thuốc 20 3.2.3 Phương pháp kiểm tra có mặt có gen GmCYP450 phản ứng PCR .21 3.2.4 Phương pháp điện di DNA gel agarose 22 3.2.5 Tách chiết RNA tổng số từ thực vật 23 3.2.6 Thí nghiệm gây stress hạn stress mặn thuốc chuyển gen 24 3.2.7 Định lượng proline tự .25 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Chuyển gen thuốc thông qua vi khuẩn A tumefaciens 27 4.2 Kết tách chiết DNA kiểm tra có mặt gen chuyển PCR 29 4.3 Đánh giá biểu gen GmCYP450 dòng thuốc chuyển gen 31 4.4 Đánh giá khả chống chịu điều kiện bất lợi dòng thuốc chuyển gen in vitro 31 4.4.1 Khả chống chịu môi trường hạn nhân tạo 32 4.4.2 Khả chống chịu môi trường mặn nhân tạo .34 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC: TÁCH CHIẾT DNA TỪ MẪU LÁ 39 iv BẢNG CHỮ VIẾT TẮT ˚C Độ C Ct µl A tumefaciens Cycle threshold Micro lit Agrobacterium tumefaciens ATP bp Adenosine triphosphate Base pair CTAB DNA ĐC Cetyl trimethyl ammonium bromide Deoxyribonucleic acid Đối chứng EDTA EtBr Ethylene diamine tetra acetic acid Ethidium Bromid kb LPS Kilo base lipopolysaccharides M ml Marker minutes mililitre mM MS milimol Murashige and Skoog N tabacum PBS PCR Nicotiana tabacum L Phosphate-buffered saline Polymerase chain reaction PEG pH RNA ROS rpm RT-PCR TAE polyethylene glycol Potential of hydrogen Ribonucleicacid Reactive oxygen species Revolution perr minute Reverse transcription polymerase chain reaction Tris-acetate-EDTA T-DNA Ti-plasmid vir WT Transfer-deoxyribonucleic acid Tumor inducing Plasmid virulence Mẫu thuốc chưa chuyển gen v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Thành phần môi trường dùng nghiên cứu 20 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 21 Bảng 3.3 Chu trình phản ứng PCR 22 Bảng 3.4 Danh sách mồi sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 3.5 Chuẩn bị dãy đường chuẩn L-proline 25 Bảng 4.1 Kết chuyển gen GmCYP450 vào thuốc thông qua A tumefaciens 28 Bảng 4.2 Kết tách chiết DNA tổng số dòng thuốc chuyển gen GmCYP450 29 Bảng 4.3 Kết giá trị ngưỡng chu kỳ (Ct) kiểm tra biểu gen GmCYP450 dòng thuốc chuyển gen .31 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 4.1 Quy trình chuyển gen vào thuốc (Nicotiana tabacum) thông qua vi khuẩn Agrobacterium; 27 Hình 4.2 Kết xác định dòng chuyển gen PCR; .30 Hình 4.3 Chồi thuốc in vitro sinh trưởng môi trường rễ 32 Hình 4.4 Chồi thuốc sinh trưởng mơi trường rễ có bổ sung PEG15% 32 Hình 4.5 Hàm lượng proline tự dòng thuốc in vitro điều kiện hạn nhân tạo 33 Hình 4.6 Chồi thuốc sinh trưởng mơi trường rễ có bổ sung NaCl 200mM .34 Hình 4.7 Hàm lượng proline tự dòng thuốc in vitro điều kiện mặn nhân tạo 34 vii TĨM TẮT Những tác động bất lợi từ mơi trường đến sinh trưởng phát triển loài trồng gây chủ yếu tình hình khơ hạn, mặn Trong nghiên cứu này, biến nạp thành công vector pFGC5941 – GmCYP450 chứa gen GmCYP450 nhờ vi khuẩn A tumefaciens vào thuốc Các dòng chuyển gen xác định phương pháp PCR real-time PCR Trong điều kiện hạn nhân tạo, chuyển gen in vitro phát triển bình thường không mang gen chuyển bị vàng ngừng phát triển Tương tự, điều mặn nhân tạo, nhận thấy hình thái tương đồng Hơn nữa, xác minh nồng độ proline tự bị ảnh hưởng điều kiện stress Gen GMCYP450 gen tiềm để cải thiện khả chịu mặn chịu hạn trồng mở hội nghiên cứu phát triển sâu trồng chống chịu mặn để ứng phó với biến đổi khí hậu nước biển dâng viii - Đối chứng: MS + 0.1 mg/l NAA + 200 mg/l cefotaxime + 50 mg/l timetin - Stress hạn: 2X MS + 0.1 mg/l NAA + 200 mg/l cefotaxime + 50 mg/l timetin + PEG 8000 15% - Stress mặn: MS + 0.1 mg/l NAA + 200 mg/l cefotaxime + 50 mg/l timetin + NaCl 200mM Các thí nghiệm gây stress nhân tạo khoảng tuần đưa vào mơi trường bình thường để quan sát hồi phục Các mẫu thu thập vào ngày cuối thí nghiệm để phân tích biểu gen 3.2.7 Định lượng proline tự Xây dựng đường chuẩn - Dung dịch gốc: 100 mg/ml L-proline - Dung dịch mg/mL L-proline: 20 µl 100 mg/mL betaine + 1980 µl dH O - Dãy pha loãng chất chuẩn: Bảng Chuẩn bị dãy đường chuẩn L-proline Nồng độ 100 200 300 400 500 600 10 20 30 40 50 60 dH2O (µl) 100 90 80 70 60 50 40 Tổng (µl) 100 100 100 100 100 100 100 (µg/ml) 1mg/ml Proline (µl) Đường chuẩn thực đồng thời với trình định lượng proline tự mẫu Tách chiết protein tổng số - Nghiền khoảng 20 mg nitơ lỏng, sau bổ sung ml dung dịch đệm PBS 100 mM lạnh (pH = 7,8), sau lắc °C phút - Ly tâm 10000 vòng/phút 20 phút 4°C - Thu dung dịch protein đo nồng độ phương pháp Bradford 25 Định lượng proline tự - Chuẩn bị dung dịch sau phản ứng (Rec.Sol) gồm: 10 ml axit sulphosalicylic 3%, 10 ml axit axetic 20 ml 2,5% axit-ninhydrin - Thêm 50 µl dung dịch protein tổng số/đường chuẩn L-proline vào ống chứa ml Rec.Sol trộn - Đun sôi nồi cách thủy 15 phút - Làm lạnh đá phút Đo độ hấp thụ dung dịch sau phản ứng bước sóng A520 nm 26 PHẦ ẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Chuyển gen thuốcc thông qua vi khuẩn A tumefaciens Cây thuốcc đư sử dụng rộng rãi nghiên ứu chuyển gen trồng đượcc coi mẫu m khả tiếp nhậnn gen ngoại ngo sinh mức độ tái sinh cao, phân hóa thời th gian ngắn đánh giá sớ ớm hệ sau Trong nghiên cứuu này, thuốc thu (N.tabacum K326) đượ ợc sử dụng làm đối tượng để chuyển gen GmCYP450 Gm đánh giá mức độ biểu hiệện Các thí nghiệm m chuyển gen thực Phịng thí nghiệm nghi Cơng nghệ tế bào thực vậtt (PCB) Thí nghiệm nghi tiếnn hành ba lần l để xác nhận độ tin cậy kết Lá trưởng trư thành cắtt thành miếng mi có kích thước 1cm² đặt giấyy thấm th khử trùng làm ẩm trướcc biến bi nạp, sau ngâm huyềnn phù Agrobacterium 30 phút chuyểển sang môi trường đồng nuôi cấyy mơi trường trư chồi có chứa chấtt kháng sinh (Hình 4.1) Hình 4.1 .1 Quy trình chuyển chuy gen vào thuốc (Nicotiana Nicotiana tabacum) tabacum thông qua vi khuẩn Agrobacterium; A: Mảnh đượcc đặt đ môi trường cảm ứng, B: Mảnh nh bắt b đầu cảm ứng ng sau 10 ngày quan sát, C: Các mảnh m không biến nạp đặtt môi trường trư 27 bổ sung kháng sinh vàng dần chết, D: Cụm chồi xuất môi trường chọn lọc, E: Tách chồi chuyển sang môi trường rễ Bảng 4.1 Kết chuyển gen GmCYP450 vào thuốc thông qua A tumefaciens Số chồi sống sót Số chồi chồi/ môi trường mang gen mẫu chọn lọc chuyển 25 4 30 28 5 30 30 22 5 90 90 75 11 14 14 Số mảnh mẫu mô sẹo 30 30 30 Lơ thí nghiệm Tổng số Số Số Số mẫu tạo chồi Có 90 mảnh chuyển cấu trúc gen pFGC5941:GmCYP450 Tỷ lệ tái sinh mô sẹo môi trường SIM mẫu chuyển gen 100% tỷ lệ tái sinh chồi 83% Các mảnh không biến nạp môi trường chọn lọc khơng có khả tái sinh chồi, vàng dần chết (Hình 4.1C) Ngược lại, mẫu biến nạp đặt mơi trường lọc có khả tái sinh chồi (Hình 4.1D) 14 chồi khỏe mạnh mang gen chuyển chuyển sang mơi trường rễ (Hình 4.1E) 28 4.2 Kết tách chiết DNA kiểm tra có mặt gen chuyển PCR Bảng 4.2 Kết tách chiết DNA tổng số dòng thuốc chuyển gen GmCYP450 STT Tên mẫu Nồng độ (ng/µl) A260/A280 WT 541,1 1,86 1.1 245,1 1,90 2.1 378,6 1,79 3.1 452,3 1,96 4.1 555,2 1,99 5.1 123,7 2,00 5.2 235,4 1,88 7.2 223,1 1,90 8.1 553,2 1,88 10 16.1 623,7 1,93 11 19.1 589,5 1,99 12 21.1 425,8 1,98 13 23.1 235,6 1,98 14 24.1 369,7 1,95 15 25.1 395,1 2,01 Để thực phản ứng PCR, việc tách chiết DNA với chất lượng cao Trong nghiên cứu này, DNA tổng số tách chiết từ non thuốc dại thuốc chuyển gen thu thập chiết tách phương pháp CTAB Như hình 4.2A, dải DNA sắc nét mạnh mẽ mà không bị suy giảm xuất gel Phù hợp với kết điện di, kết máy 29 quang phổ NanoDrop cho thấy th chất lượng tốt củaa DNA b gen với tỷ lệ A260/A280 từ 1,86 đếnn 2,01 (Bảng 4.2) Hình 4.2 Kếtt qu xác định dòng chuyển n gen b PCR; A: Kết điệnn di DNA tổng t số gel agarose 0,8%; B: Kết K điện di sản phẩm khuếch đạii đặc đ hiệu gen GmCYP450;; WT: không chuyển chuy gen, ĐC+: đối chứng ng dương plasmid pBI121:GmCYP450, pBI121: , 1.1-25.1: 1.1 dịng thuốc chuyển gen Phân tích PCR m kỹ thuật hiệu với ứng dụng ng để đ phát gen chuyển DNA tổng số đ tách chiết chất lượng tốt sử dụụng để làm template cho phản ứng PCR vớii cặp c mồi CYP-F CYP-R, để xác định nh s diện gen GmCYP450 thuốc thu Các sản phẩm PCR đượcc kiểm ki tra gel agarose 1,5% Đối ứng dương với plasmid pFGC5941:GmCYP450 GmCYP450 đối chứng âm chứa tất thành phần ph phản ứng ng PCR khơng có mẫu DNA sử dụng ng để đ xác nhận độ xác phản ứng ng PCR 30 Kết gen GmCYP450 không khuếch đại mẫu WT Có 14 thuốc chuyển gen mang gen GmCYP450 có dải ADN có kích thước xấp xỉ 0,6 kb Kết cho thấy dòng thuốc chuyển gen mang gen GmCYP450 tạo thành công 4.3 Đánh giá biểu gen GmCYP450 dịng thuốc chuyển gen Chúng tơi tiến hành chọn ngẫu nhiên dòng mang gen chuyển để đánh giá mức độ biểu gen GmCYP450 Mức độ biểu gen GmCYP450 phân tích dòng thuốc chuyển gen 3.1 4.1 realtime PCR Chỉ số Ct hai dòng thuốc chuyển gen xấp xỉ với số Ct gen nội chuẩn Theo bảng 4.3, dịng 3.1 có mức độ biểu gen cao dòng 4.1 Kết xác nhận gen chuyển GmCYP450 tích hợp vào gen thuốc trình phiên mã gen GmCYP450 thực Bảng 4.3 Kết giá trị ngưỡng chu kỳ (Ct) kiểm tra biểu gen GmCYP450 dòng thuốc chuyển gen Dòng chuyển gen 3.1 4.1 Ct (GmCYP450) Ct (L25) 3.1(1) 13,825 14,76 3.1(2) 14,43 15,01 3.1(3) 14,115 15,05 4.1(1) 15,47 15,23 4.1(2) 15,245 15,06 4.1(3) 15,4 15,28 4.4 Đánh giá khả chống chịu điều kiện bất lợi dòng thuốc chuyển gen in vitro Do điều kiện phịng thí nghiệm chi phí có hạn nên chúng tơi lựa chọn ngẫu nhiên dòng thuốc chuyển gen để tiến hành thí nghiệm đánh giá 31 khả chống chịuu điều kiện bất lợi dòng thuốcc chuyển chuy gen in vitro 4.4.1 Khả chốngg chịu ch mơi trường hạn nhân tạo o Hình 4.3 Chồii thuốc thu in vitro sinh trưởng ng môi trường trư rễ Hình 4.4 Chồii thuốc thu sinh trưởng mơi trường ng rễ r có bổ sung PEG15% Dịng khơng chuyển chuy gen dịng chuyển gen 3.1 có tốcc độ đ sinh trưởng phát triển bình thường ng hình thái đồng chọn để đưa vào thí nghiệm nghi stress mặn stress hạnn điều kiện in vitro Cây thuốcc khơng chuyển chuy gen dịng thuốcc chuyển chuy gen cấy chuyển vào môi trường trư hạn mặn nhân tạo,, theo dõi tron tuần Các quan sát hình thái củaa dịng thuốc thu 32 chuyểnn gen WT điều kiện mặn nhân tạoo (Hình 4.5) cho thấy phát triển bình thường củaa dịng thuốc thu chuyển gen bị stress mặn, m WT bị vàng ngừng ng phát triển Hình 4.5 Hàm lượng ng proline tự t dòng thuốcc in vitro điều kiện hạn nhân tạo Hàm lượng ng proline c dòng thuốc WT, 3.1 đãã khảo nghiệm sau bị stress mặặn 14 ngày Kết cho thấyy hàm lượng lư proline bị tác động điền kiệện stress Hàm lượng proline tự dòng 3.1 điều kiện hạn nhân tạoo tăng xấp x xỉ lần so với trước chịu hạn (P