Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo cây đậu tương (glycine max l ) biến đổi gen có khả năng tổng hợp astaxanthin chuyên biệt ở hạt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - HOÀNG VĂN DƢƠNG NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG (Glycine max L.) BIẾN ĐỔI GEN CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP ASTAXANTHIN CHUYÊN BIỆT Ở HẠT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP HỒ CHÍ MINH - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - HOÀNG VĂN DƢƠNG NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƢƠNG (Glycine max L.) BIẾN ĐỔI GEN CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP ASTAXANTHIN CHUYÊN BIỆT Ở HẠT Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Hữu Hổ TS Phan Tƣờng Lộc TP HỒ CHÍ MINH - 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi dƣới hƣớng dẫn khoa học TS Nguyễn Hữu Hổ TS Phan Tƣờng Lộc Nội dung nghiên cứu kết đề tài hoàn toàn trung thực Toàn số liệu kết nghiên cứu chƣa đƣợc sử dụng để cơng bố cơng trình nghiên cứu để nhận học vị, thơng tin trích dẫn luận án đƣợc trích dẫn nguồn gốc rõ ràng Một phần kết nghiên cứu đề tài đƣợc công bố tạp chí khoa học chun ngành nƣớc Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm cam đoan Hoàng Văn Dƣơng ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận Án này, nhận đƣợc nhiều động viên, giúp đỡ từ Thầy Cơ, Gia Đình Bạn Bè Xin bày tỏ gửi lòng biết ơn chân thành, sâu sắc đến: - Thầy - TS Nguyễn Hữu Hổ tận tình hƣớng dẫn, động viên tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian làm luận án - TS Phan Tƣờng Lộc - Anh vừa ngƣời Thầy ln theo sát, tận tình bảo, hƣớng dẫn, động viên, giúp đỡ suốt trình làm luận án - Thầy Lê Tấn Đức bên cạnh ủng hộ, động viên, giúp đỡ tơi hồn thành luận án - Các q Thầy Cơ Học Viện Khoa Học Công Nghệ truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tơi hồn thành luận án - Ban Lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới tạo điều kiện thuận lợi để thực đề tài - Các bạn đồng nghiệp phịng Cơng Nghệ Gen bạn sinh viên giúp đỡ thời gian qua - Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Gia Đình ln sát cánh, ủng hộ, giúp đỡ năm học vừa qua nhƣ bƣớc đƣờng trƣởng thành sống Hoàng Văn Dƣơng iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ viii TÓM TẮT MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chuyển hóa tạo carotenoid thực vật 1.1.1 Sinh tổng hợp tích trữ carotenoid 1.1.2 Thay đổi chuyển hóa sinh tổng hợp carotenoid 10 1.1.3 Tổng quan astaxanthin 11 1.2 Biến đổi gen thực vật 19 1.2.1 Chuyển gen vào thực vật sử dụng Agrobacterium tumefaciens 19 1.2.2 Sử dụng promoter công nghệ chuyển gen thực vật 22 1.2.3 Sự di truyền gen biến nạp chuyển gen 26 1.3 Nghiên cứu phát sinh hình thái biến đổi gen đậu tƣơng 27 1.3.1 Giới thiệu chung đậu tƣơng 27 1.3.2 Nghiên cứu phát sinh hình thái đậu tƣơng 29 1.3.3 Nghiên cứu biến đổi gen đậu tƣơng 35 1.4 Cách tiếp cận đề tài 43 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 46 2.1 Vật liệu 46 2.1.1 Giống đậu tƣơng 46 2.1.2 Chủng vi khuẩn, plasmid 46 2.1.3 Kim châm để tạo vết thƣơng cho mẫu chuyển gen 47 2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy mô 47 2.1.5 Hóa chất thí nghiệm khác 48 2.1.6 Thiết bị sử dụng 49 2.2 Nội dung Phƣơng pháp 50 Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo hoàn chỉnh in vitro từ đốt mầm nửa hạt 50 2.2.1 Tuyển chọn giống đậu tƣơng 50 2.2.2 Khử trùng hạt 50 iv 2.2.3 Ảnh hƣởng BA lên tái sinh chồi đốt mầm nửa hạt 51 2.2.4 Ảnh hƣởng IBA lên tạo rễ chồi in vitro 52 Nội dung 2: Khảo sát điều kiện thích hợp để ứng dụng qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng 53 2.2.5 Ảnh hƣởng PPT lên khả tái sinh đốt mầm nửa hạt 53 2.2.6 Ảnh hƣởng PPT lên sinh trƣởng chồi in vitro 53 2.2.7 Ảnh hƣởng việc tạo vết thƣơng kim châm lên khả tái sinh đốt mầm 53 2.2.8 Ảnh hƣởng việc tạo vết thƣơng dao mổ kết hợp sóng siêu âm lên hiệu chuyển gen gus vào đậu tƣơng 54 2.2.9 Ảnh hƣởng việc tạo vết thƣơng dao mổ kết hợp thấm hút chân không lên hiệu chuyển gen gus vào đậu tƣơng 55 Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens kiểm tra, đánh giá dòng đậu tƣơng chuyển gen 55 2.2.10 Tạo dòng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 chứa plasmid pITB-AST 55 2.2.11 Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng 57 2.2.12 Kiểm tra chuyển gen PCR 58 2.2.13 Kiểm tra chuyển gen Southern blot 60 2.2.14 Phân tích hàm lƣợng astaxanthin hạt 62 2.2.15 Đánh giá giai đoạn sinh trƣởng chuyển gen điều kiện ex vitro 62 2.2.16 Xử lý thống kê 63 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64 Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo hoàn chỉnh in vitro từ đốt mầm nửa hạt 64 3.1 Tuyển chọn giống đậu tƣơng 64 3.2 Hiệu phƣơng pháp khử trùng hạt đậu tƣơng 66 3.3 Ảnh hƣởng BA lên tái sinh đốt mầm nửa hạt 67 3.4 Ảnh hƣởng IBA lên tạo rễ chồi in vitro 73 Nội dung 2: Khảo sát điều kiện thích hợp để ứng dụng qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng 75 3.5 Ảnh hƣởng PPT lên khả tái sinh đốt mầm nửa hạt 75 3.6 Ảnh hƣởng PPT lên sinh trƣởng chồi in vitro 78 3.7 Ảnh hƣởng việc tạo vết thƣơng kim châm lên khả tái sinh đốt mầm 79 3.8 Ảnh hƣởng việc tạo vết thƣơng dao mổ kết hợp sóng siêu âm lên v hiệu chuyển gen gus vào đậu tƣơng (giống MTĐ 176) 80 3.9 Ảnh hƣởng việc tạo vết thƣơng dao mổ kết hợp thấm hút chân không lên hiệu chuyển gen gus vào đậu tƣơng 83 Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tƣơng gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens kiểm tra, đánh giá dòng đậu tƣơng chuyển gen 85 3.10 Tạo dòng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 chứa plasmid pITB-AST 85 3.11 Chuyển gen tạo đậu tƣơng có khả sản xuất astaxanthin chuyên biệt hạt 87 3.11.1 Chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens sử dụng kim châm tạo vết thƣơng mẫu 87 3.11.2 Chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens sử dụng dao mổ kết hợp sóng siêu âm, thấm chân không tạo vết thƣơng mẫu 93 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 111 DANH MỤC CƠNG TRÌNH 113 TÀI LIỆU THAM KHẢO 114 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid BA Benzyl Adenine CBFD Carotenoid β-ring 4-dehydrogenase GGPP Geranylgeranyl Pyrophosphate H Hour HBFD Carotenoid 4-hydroxy-β-ring 4-dehydrogenase HPLC High-performance liquid chromatography IAA Indole-3-acetic acid IBA Indole-3-butyric acid KT Kinetin NAA α-naphthylacetic acid NXS Neoxanthin synthase PCR Polymerase Chain Reaction PDS Phytoene desaturase PPT Phosphinothricin PSY Phytoene synthase QC1 Qui cách QC2 Qui cách S Second SAAT Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation TDZ Thidiazuron VDE Violaxanthin deepoxidase ZDS Zeta-carotene desaturase ZEP Zeaxanthin epoxidase β-LCY β Lycopene cyclase ε-LCY ε Lycopene cyclase vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Nguồn gốc số đặc điểm giống đậu tƣơng đƣợc sử dụng .46 Bảng 2.2 Thành phần loại môi trƣờng nuôi cấy mô chuyển gen 47 Bảng 3.1 Kiểm tra thành phần β-carotene giống đậu tƣơng 65 Bảng 3.2 Tỉ lệ nảy mầm giống đậu tƣơng 65 Bảng 3.3 Tỉ lệ hạt đậu tƣơng không nhiễm nảy mầm khử trùng dung dịch Javel khí clo 67 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ BA lên tái sinh đốt mầm nửa hạt giống MTĐ 176 68 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng nồng độ BA lên tái sinh đốt mầm nửa hạt giống HL 07-15 70 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng nồng độ BA lên tái sinh đốt mầm nửa hạt giống OMĐN 29 71 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng IBA đến khả tạo rễ chồi đậu tƣơng in vitro 75 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng PPT lên tái sinh chồi đốt mầm 76 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng PPT lên khả sống chồi in vitro 78 Bảng 3.10 Kết khảo sát ảnh hƣởng việc sử dụng kim châm lên khả tái sinh đốt mầm .80 ảng 11 Tỉ lệ mẫu dƣơng tính GUS xử l sóng siêu âm thời gian khác 82 ảng 12 Tỉ lệ đốt mầm dƣơng tính GUS xử l áp lực âm thời gian khác .84 Bảng 3.13 Kết thu nhận hạt dòng chuyển gen D2 D8 hệ T1 103 Bảng 3.14 Kết định lƣợng astaxanthin hạt dòng chuyển gen 106 Bảng 3.15 So sánh số đặc điểm chuyển gen đối chứng 109 viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Sơ đồ đƣờng sinh tổng hợp carotenoid [19] Hình 1.2 Bột astaxanthin [36] 11 Hình 1.3 So sánh khả chống gốc oxy tự có hại cho thể số chất chống oxy hóa [43] 12 Hình 1.4 Vị trí phân tử astaxanthin màng tế bào [40] 13 Hình 1.5 Qui mô thị trƣờng astaxanthin đến năm 2022 [4] .13 Hình 1.6 Con đƣờng chuyển hố tạo astaxanthin Adonis aestivalis [6] .15 Hình 1.7 Con đƣờng tổng hợp astaxanthin số loài khác [6][57] 16 Hình 1.8 Sơ đồ chuyển hóa tạo astaxanthin đậu tƣơng đƣợc biến nạp gen mã hóa phytoene synthase ketolase [63] 18 Hình 1.9 Vi khuẩn A tumefaciens bám bề mặt tế bào thực vật [71] 20 Hình 1.10 Vi khuẩn A tumefaciens gây khối u thực vật [72] 20 Hình 1.11 Sự ức chế phosphinothricin lên hoạt động enzyme 21 Hình 1.12 Phản ứng X-Gluc với -glucuronidase [77] .22 Hình 1.13 Mơ hình cấu trúc điều hịa phiên mã gen mã hóa protein [79] .23 Hình 1.14 Cây đậu tƣơng 27 Hình 1.15 Sản lƣợng nƣớc sản xuất đậu tƣơng lớn [94] 28 Hình 1.16 Cấu trúc plasmid pITB-AST 45 Hình 2.1 Sơ đồ bƣớc chuẩn bị mẫu đốt mầm 51 Hình 2.2 Sơ đồ bƣớc chuẩn bị mẫu nửa hạt .52 Hình 2.3 Minh họa kích thƣớc theo chiều dài, rộng, dày hạt đậu tƣơng 63 Hình 3.1 Hạt đậu tƣơng nảy mầm sau ngày 65 Hình 3.2 Hạt đậu tƣơng (HL 07-15) nảy mầm ngày sau khử trùng 67 Hình 3.3 Sự hình thành chồi đốt mầm giống MTĐ 176 nồng độ BA khác sau tuần nuôi cấy .69 Hình 3.4 Sự đáp ứng đốt mầm nửa hạt giống MTĐ 176 nồng độ BA khác sau tuần nuôi cấy 69 Hình 3.5 Sự hình thành chồi mẫu nửa hạt giống MTĐ 176 nồng độ BA khác sau tuần nuôi cấy 70 MTSC1 Duncan Subset for alpha = 0.05 NongdoBA N mg/l 0.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l 3 mg/l 2.5 mg/l 7000 mg/l 7633 Sig .0000 2067 3133 5033 5900 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 064 Means for groups in homogeneous subsets are displayed MTTS2 Duncan Subset for alpha = 0.05 NongdoBA N mg/l 0.5 mg/l 37.2247 mg/l 41.1543 1.5 mg/l 59.0044 mg/l 59.0044 2.5 mg/l mg/l Sig 9.0974 68.8550 77.7901 1.000 232 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed MTSC2 Duncan Subset for alpha = 0.05 NongdoBA N mg/l 0.5 mg/l mg/l 3 mg/l 5367 1.5 mg/l 5600 2.5 mg/l mg/l Sig 0000 2233 3400 6967 7867 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed .465 1.000 1.000 Bảng 3.6 Kết ảnh hƣởng nồng độ BA lên tái sinh đốt mầm nửa hạt giống HL 07-15 (Tỉ lệ mẫu tạo chồi đƣợc chuyển đổi sang dạng arcsin√x; Số chồi/mẫu đƣợc chuyển sang dạng log(x+1) trƣớc xử lý thống kê) HLTS1 Duncan Subset for alpha = 0.05 NongdoBA N mg/l 0.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l 3 mg/l 74.6776 mg/l 77.7901 2.5 mg/l 77.7901 9.0974 37.2247 46.9228 61.2197 Sig 1.000 1.000 1.000 1.000 407 Means for groups in homogeneous subsets are displayed HLSC1 Duncan Subset for alpha = 0.05 NongdoBA N mg/l 0.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l 3 mg/l 7400 2.5 mg/l 7700 mg/l 7867 0000 2333 4100 5733 Sig 1.000 1.000 1.000 1.000 154 Means for groups in homogeneous subsets are displayed HLTS2 Duncan Subset for alpha = 0.05 NongdoBA N mg/l 0.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l 2.5 mg/l 74.6776 mg/l 77.7901 mg/l 77.7901 Sig 9.0974 39.2315 48.8457 59.0044 1.000 1.000 1.000 1.000 383 HLTS1 Duncan Subset for alpha = 0.05 NongdoBA N mg/l 0.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l 3 mg/l 74.6776 mg/l 77.7901 2.5 mg/l 77.7901 9.0974 37.2247 46.9228 61.2197 Sig 1.000 1.000 1.000 1.000 407 Means for groups in homogeneous subsets are displayed HLSC2 Duncan Subset for alpha = 0.05 NongdoBA N mg/l 0.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l 2.5 mg/l 7633 mg/l 7633 mg/l 7967 0000 2467 4233 5733 Sig 1.000 1.000 1.000 1.000 323 Means for groups in homogeneous subsets are displayed Bảng 3.7 Kết ảnh hƣởng nồng độ BA lên tái sinh đốt mầm nửa hạt giống OMĐN 29 (Tỉ lệ mẫu tạo chồi đƣợc chuyển đổi sang dạng arcsin√x; Số chồi/mẫu đƣợc chuyển sang dạng log(x+1) trƣớc xử lý thống kê) OMTS1 Duncan Subset for alpha = 0.05 NongdoBA N mg/l 9.0974 0.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l 3 mg/l 74.6776 mg/l 77.7901 2.5 mg/l 77.7901 Sig 37.2247 46.9228 61.2197 1.000 1.000 1.000 1.000 407 Means for groups in homogeneous subsets are displayed OMSC1 Duncan Subset for alpha = 0.05 NongdoBA N mg/l 0000 0.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l 3 mg/l 7167 2.5 mg/l 7533 mg/l 7800 Sig .1933 3833 5833 1.000 1.000 1.000 1.000 066 Means for groups in homogeneous subsets are displayed OMTS2 Duncan Subset for alpha = 0.05 NongdoBA N mg/l 9.0974 0.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l 2.5 mg/l 74.6776 mg/l 77.7901 mg/l 77.7901 Sig 39.2315 52.7753 61.2197 1.000 1.000 1.000 1.000 385 Means for groups in homogeneous subsets are displayed OMSC2 Duncan Subset for alpha = 0.05 NongdoBA N mg/l 0000 0.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l 3 mg/l 7533 2.5 mg/l 7633 mg/l 7867 Sig .2200 4233 5933 1.000 1.000 1.000 1.000 295 Means for groups in homogeneous subsets are displayed Bảng 3.8 Kết ảnh hƣởng IBA đến khả tạo rễ chồi đậu tƣơng in vitro (Tỉ lệ mẫu tạo rễ đƣợc chuyển đổi sang dạng arcsin√x; Số rễ/chồi đƣợc chuyển sang dạng log(x+1) trƣớc xử lý thống kê) Multiple Comparisons LSD Depende (I) (J) nt Nongdo Nongdo Variable IBA IBA HLTR mg/l 0.5 mg/l -9.69818 Std Error Sig Lower Bound Upper Bound * 2.76381 006 -15.8563 -3.5400 mg/l -28.48788 * 2.76381 000 -34.6460 -22.3297 1.5 mg/l -23.06781 * 2.76381 000 -29.2260 -16.9097 mg/l -11.70505 * 2.76381 002 -17.8632 -5.5469 0.5 mg/l mg/l 9.69818 * 2.76381 006 3.5400 15.8563 -18.78970 * 2.76381 000 -24.9479 -12.6316 -13.36963 * 2.76381 001 -19.5278 -7.2115 mg/l -2.00687 2.76381 484 -8.1650 4.1513 mg/l 28.48788 * 2.76381 000 22.3297 34.6460 0.5 mg/l 18.78970 * 2.76381 000 12.6316 24.9479 1.5 mg/l 5.42007 2.76381 078 -.7381 11.5782 2.76381 000 10.6247 22.9410 mg/l 1.5 mg/l mg/l mg/l 16.78283 * 1.5 mg/l mg/l 23.06781 * 2.76381 000 16.9097 29.2260 13.36963 * 2.76381 001 7.2115 19.5278 mg/l -5.42007 2.76381 078 -11.5782 7381 mg/l 11.36276 * 2.76381 002 5.2046 17.5209 11.70505 * 2.76381 002 5.5469 17.8632 2.00687 2.76381 484 -4.1513 8.1650 -16.78283 * 2.76381 000 -22.9410 -10.6247 -11.36276 * 2.76381 002 -17.5209 -5.2046 -.19667 * 03113 000 -.2660 -.1273 -.48000 * 03113 000 -.5494 -.4106 -.38000 * 03113 000 -.4494 -.3106 -.27667 * 03113 000 -.3460 -.2073 19667 * 03113 000 1273 2660 mg/l -.28333 * 03113 000 -.3527 -.2140 1.5 mg/l -.18333 * 03113 000 -.2527 -.1140 -.08000 * 03113 028 -.1494 -.0106 mg/l 48000 * 03113 000 4106 5494 0.5 mg/l 28333 * 03113 000 2140 3527 0.5 mg/l mg/l mg/l 0.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l HLSR 95% Confidence Interval Mean Difference (I-J) mg/l 0.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l mg/l 0.5 mg/l mg/l mg/l mg/l .10000 * 03113 009 0306 1694 20333 * 03113 000 1340 2727 38000 * 03113 000 3106 4494 18333 * 03113 000 1140 2527 -.10000 * 03113 009 -.1694 -.0306 10333 * 03113 008 0340 1727 27667 * 03113 000 2073 3460 08000 * 03113 028 0106 1494 -.20333 * 03113 000 -.2727 -.1340 -.10333 * 03113 008 -.1727 -.0340 -7.69131 * 3.42543 049 -15.3236 -.0590 -17.85003 * 3.42543 000 -25.4824 -10.2177 -36.63571 * 3.42543 000 -44.2681 -29.0034 mg/l -27.70067 * 3.42543 000 -35.3330 -20.0683 0.5 mg/l mg/l 7.69131 * 3.42543 049 0590 15.3236 -10.15872 * 3.42543 014 -17.7911 -2.5264 -28.94441 * 3.42543 000 -36.5767 -21.3121 -20.00936 * 3.42543 000 -27.6417 -12.3770 17.85003 * 3.42543 000 10.2177 25.4824 10.15872 * 3.42543 014 2.5264 17.7911 -18.78568 * 3.42543 000 -26.4180 -11.1533 * 3.42543 017 -17.4830 -2.2183 1.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l mg/l 0.5 mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l 0.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l OMTR mg/l 0.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l mg/l mg/l mg/l 0.5 mg/l 1.5 mg/l mg/l -9.85064 1.5 mg/l mg/l 36.63571 * 3.42543 000 29.0034 44.2681 28.94441 * 3.42543 000 21.3121 36.5767 mg/l 18.78568 * 3.42543 000 11.1533 26.4180 mg/l 8.93504 * 3.42543 026 1.3027 16.5674 27.70067 * 3.42543 000 20.0683 35.3330 20.00936 * 3.42543 000 12.3770 27.6417 9.85064 * 3.42543 017 2.2183 17.4830 -8.93504 * 3.42543 026 -16.5674 -1.3027 -.17000 * 03026 000 -.2374 -.1026 -.32667 * 03026 000 -.3941 -.2592 1.5 mg/l -.54000 * 03026 000 -.6074 -.4726 mg/l -.40667 * 03026 000 -.4741 -.3392 17000 * 03026 000 1026 2374 mg/l -.15667 * 03026 000 -.2241 -.0892 1.5 mg/l -.37000 * 03026 000 -.4374 -.3026 -.23667 * 03026 000 -.3041 -.1692 32667 * 03026 000 2592 3941 15667 * 03026 000 0892 2241 0.5 mg/l mg/l mg/l 0.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l OMSR mg/l 0.5 mg/l mg/l 0.5 mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l 0.5 mg/l 1.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l mg/l 0.5 mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l 0.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l MTTR * 03026 000 -.2808 -.1459 -.08000 * 03026 025 -.1474 -.0126 54000 * 03026 000 4726 6074 37000 * 03026 000 3026 4374 21333 * 03026 000 1459 2808 13333 * 03026 001 0659 2008 40667 * 03026 000 3392 4741 23667 * 03026 000 1692 3041 08000 * 03026 025 0126 1474 -.13333 * 03026 001 -.2008 -.0659 3.76141 023 -18.4556 -1.6937 0.5 mg/l -10.07468 * mg/l -27.75473 * 3.76141 000 -36.1357 -19.3738 -14.29684 * 3.76141 003 -22.6778 -5.9159 mg/l -1.92283 3.76141 620 -10.3038 6.4581 0.5 mg/l mg/l 10.07468 * 3.76141 023 1.6937 18.4556 -17.68005 * 3.76141 001 -26.0610 -9.2991 -4.22216 3.76141 288 -12.6031 4.1588 mg/l 8.15185 3.76141 055 -.2291 16.5328 mg/l 27.75473 * 3.76141 000 19.3738 36.1357 17.68005 * 3.76141 001 9.2991 26.0610 13.45789 * 3.76141 005 5.0769 21.8388 mg/l 25.83190 * 3.76141 000 17.4510 34.2128 1.5 mg/l mg/l 14.29684 * 3.76141 003 5.9159 22.6778 4.22216 3.76141 288 -4.1588 12.6031 3.76141 005 -21.8388 -5.0769 mg/l 1.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l mg/l 0.5 mg/l 1.5 mg/l 0.5 mg/l mg/l mg/l -13.45789 * mg/l 12.37401 * 3.76141 008 3.9931 20.7550 mg/l 1.92283 3.76141 620 -6.4581 10.3038 -8.15185 3.76141 055 -16.5328 2291 -25.83190 * 3.76141 000 -34.2128 -17.4510 -12.37401 * 3.76141 008 -20.7550 -3.9931 -.26000 * 03553 000 -.3392 -.1808 -.47000 * 03553 000 -.5492 -.3908 1.5 mg/l -.33333 * 03553 000 -.4125 -.2542 mg/l -.18667 * 03553 000 -.2658 -.1075 26000 * 03553 000 1808 3392 mg/l -.21000 * 03553 000 -.2892 -.1308 1.5 mg/l -.07333 03553 066 -.1525 0058 mg/l 07333 03553 066 -.0058 1525 mg/l 47000 * 03553 000 3908 5492 21000 * 03553 000 1308 2892 0.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l MTSR -.21333 mg/l 0.5 mg/l mg/l 0.5 mg/l mg/l mg/l 0.5 mg/l .13667 * 03553 003 0575 2158 28333 * 03553 000 2042 3625 33333 * 03553 000 2542 4125 07333 03553 066 -.0058 1525 -.13667 * 03553 003 -.2158 -.0575 14667 * 03553 002 0675 2258 mg/l 18667 * 03553 000 1075 2658 0.5 mg/l -.07333 03553 066 -.1525 0058 -.28333 * 03553 000 -.3625 -.2042 -.14667 * 03553 002 -.2258 -.0675 1.5 mg/l mg/l 1.5 mg/l mg/l 0.5 mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l 1.5 mg/l * The mean difference is significant at the 0.05 level Bảng 3.9 Ảnh hƣởng PPT lên tái sinh chồi đốt mầm (Số liệu đƣợc chuyển đổi sang dạng arcsin√x trƣớc xử lý thống kê) MTD176 Duncan Subset for alpha = 0.05 NongdoPPT N mg/l 9.0974 mg/l 9.0974 mg/l 9.0974 mg/l 21.1450 21.1450 mg/l mg/l 48.8457 mg/l 55.0447 mg/l 59.0044 59.0044 mg/l 71.5651 Sig 30.9956 105 148 156 070 Means for groups in homogeneous subsets are displayed HL0715 Duncan Subset for alpha = 0.05 NongdoPPT N mg/l 9.0974 mg/l 9.0974 mg/l 9.0974 mg/l 9.0974 mg/l 21.1450 mg/l 43.0772 mg/l 51.1150 mg/l 54.7822 mg/l 74.6776 Sig .161 153 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed OMDN29 Duncan Subset for alpha = 0.05 NongdoPPT N mg/l 9.0974 mg/l 9.0974 mg/l 9.0974 mg/l 9.0974 mg/l mg/l 54.7822 mg/l 56.9675 mg/l 59.0044 mg/l Sig 30.9956 74.6776 1.000 1.000 521 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed Bảng 3.10 Ảnh hƣởng PPT lên sinh trƣởng đoạn thân (Số liệu đƣợc chuyển đổi sang dạng arcsin√x trƣớc xử lý thống kê) Multiple Comparisons 95% Confidence (I) Interval (J) Nongdo Nongdo Mean Difference Bound PPT HL0715 mg/l mg/l 5.82254 3.38843 111 -1.5602 13.2053 mg/l 31.60038 * 3.38843 000 24.2176 38.9831 mg/l 39.45977 * 3.38843 000 32.0770 46.8425 mg/l 59.35511 * 3.38843 000 51.9723 66.7379 mg/l 65.58012 * 3.38843 000 58.1974 72.9629 mg/l -5.82254 3.38843 111 -13.2053 1.5602 mg/l 25.77784 * 3.38843 000 18.3951 33.1606 mg/l 33.63724 * 3.38843 000 26.2545 41.0200 mg/l 53.53257 * 3.38843 000 46.1498 60.9153 mg/l 59.75758 * 3.38843 000 52.3748 67.1403 mg/l -31.60038 * 3.38843 000 -38.9831 -24.2176 mg/l -25.77784 * 3.38843 000 -33.1606 -18.3951 mg/l 7.85939 * 3.38843 039 4766 15.2422 mg/l 27.75473 * 3.38843 000 20.3720 35.1375 mg/l 33.97974 * 3.38843 000 26.5970 41.3625 mg/l -39.45977 * 3.38843 000 -46.8425 -32.0770 mg/l -33.63724 * 3.38843 000 -41.0200 -26.2545 mg/l -7.85939 * 3.38843 039 -15.2422 -.4766 mg/l 19.89534 * 3.38843 000 12.5126 27.2781 mg/l 26.12034 * 3.38843 000 18.7376 33.5031 mg/l -59.35511 * 3.38843 000 -66.7379 -51.9723 mg/l -53.53257 * 3.38843 000 -60.9153 -46.1498 mg/l -27.75473 * 3.38843 000 -35.1375 -20.3720 mg/l -19.89534 * 3.38843 000 -27.2781 -12.5126 mg/l 6.22501 3.38843 091 -1.1578 13.6078 mg/l -65.58012 * 3.38843 000 -72.9629 -58.1974 mg/l mg/l mg/l mg/l Sig Bound PPT mg/l Std Error Upper Dependent Variable LSD (I-J) Lower OMDN29 LSD mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l MTD176 LSD mg/l mg/l -59.75758 * 3.38843 000 -67.1403 -52.3748 mg/l -33.97974 * 3.38843 000 -41.3625 -26.5970 mg/l -26.12034 * 3.38843 000 -33.5031 -18.7376 mg/l -6.22501 3.38843 091 -13.6078 1.1578 mg/l 11.24261 * 3.07194 003 4.5494 17.9358 mg/l 39.45977 * 3.07194 000 32.7666 46.1529 mg/l 43.68193 * 3.07194 000 36.9888 50.3751 mg/l 59.35511 * 3.07194 000 52.6619 66.0483 mg/l 65.58012 * 3.07194 000 58.8869 72.2733 mg/l -11.24261 * 3.07194 003 -17.9358 -4.5494 mg/l 28.21717 * 3.07194 000 21.5240 34.9103 mg/l 32.43932 * 3.07194 000 25.7461 39.1325 mg/l 48.11250 * 3.07194 000 41.4193 54.8057 mg/l 54.33751 * 3.07194 000 47.6443 61.0307 mg/l -39.45977 * 3.07194 000 -46.1529 -32.7666 mg/l -28.21717 * 3.07194 000 -34.9103 -21.5240 mg/l 4.22216 3.07194 194 -2.4710 10.9153 mg/l 19.89534 * 3.07194 000 13.2022 26.5885 mg/l 26.12034 * 3.07194 000 19.4272 32.8135 mg/l -43.68193 * 3.07194 000 -50.3751 -36.9888 mg/l -32.43932 * 3.07194 000 -39.1325 -25.7461 mg/l -4.22216 3.07194 194 -10.9153 2.4710 mg/l 15.67318 * 3.07194 000 8.9800 22.3664 mg/l 21.89819 * 3.07194 000 15.2050 28.5914 mg/l -59.35511 * 3.07194 000 -66.0483 -52.6619 mg/l -48.11250 * 3.07194 000 -54.8057 -41.4193 mg/l -19.89534 * 3.07194 000 -26.5885 -13.2022 mg/l -15.67318 * 3.07194 000 -22.3664 -8.9800 mg/l 6.22501 3.07194 066 -.4682 12.9182 mg/l -65.58012 * 3.07194 000 -72.2733 -58.8869 mg/l -54.33751 * 3.07194 000 -61.0307 -47.6443 mg/l -26.12034 * 3.07194 000 -32.8135 -19.4272 mg/l -21.89819 * 3.07194 000 -28.5914 -15.2050 mg/l -6.22501 3.07194 066 -12.9182 4682 mg/l 8.93504 * 3.18418 016 1.9973 15.8728 mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l 36.63571 * 3.18418 000 29.6980 43.5734 mg/l 44.57915 * 3.18418 000 37.6414 51.5169 mg/l 62.46762 * 3.18418 000 55.5299 69.4053 mg/l 68.69262 * 3.18418 000 61.7549 75.6303 mg/l -8.93504 * 3.18418 016 -15.8728 -1.9973 mg/l 27.70067 * 3.18418 000 20.7629 34.6384 mg/l 35.64411 * 3.18418 000 28.7064 42.5818 mg/l 53.53257 * 3.18418 000 46.5949 60.4703 mg/l 59.75758 * 3.18418 000 52.8199 66.6953 mg/l -36.63571 * 3.18418 000 -43.5734 -29.6980 mg/l -27.70067 * 3.18418 000 -34.6384 -20.7629 mg/l 7.94344 * 3.18418 028 1.0057 14.8812 mg/l 25.83190 * 3.18418 000 18.8942 32.7696 mg/l 32.05691 * 3.18418 000 25.1192 38.9946 mg/l -44.57915 * 3.18418 000 -51.5169 -37.6414 mg/l -35.64411 * 3.18418 000 -42.5818 -28.7064 mg/l -7.94344 * 3.18418 028 -14.8812 -1.0057 mg/l 17.88847 * 3.18418 000 10.9507 24.8262 mg/l 24.11347 * 3.18418 000 17.1758 31.0512 mg/l -62.46762 * 3.18418 000 -69.4053 -55.5299 mg/l -53.53257 * 3.18418 000 -60.4703 -46.5949 mg/l -25.83190 * 3.18418 000 -32.7696 -18.8942 mg/l -17.88847 * 3.18418 000 -24.8262 -10.9507 mg/l 6.22501 3.18418 074 -.7127 13.1627 mg/l -68.69262 * 3.18418 000 -75.6303 -61.7549 mg/l -59.75758 * 3.18418 000 -66.6953 -52.8199 mg/l -32.05691 * 3.18418 000 -38.9946 -25.1192 mg/l -24.11347 * 3.18418 000 -31.0512 -17.1758 mg/l -6.22501 3.18418 074 -13.1627 7127 * The mean difference is significant at the 0.05 level Bảng 3.11 Kết khảo sát ảnh hƣởng việc sử dụng kim châm lên khả tái sinh đốt mầm (Số liệu đƣợc chuyển đổi sang dạng arcsin√x trƣớc xử lý thống kê) MTD176 Duncan Subset for alpha = 0.05 Solancham N lan lan 3 lan 71.5651 lan 74.6776 lan 74.6776 lan 77.7901 Sig 41.1543 54.7822 1.000 1.000 125 Means for groups in homogeneous subsets are displayed HL0715 Duncan Subset for alpha = 0.05 Solancham N lan lan lan 71.5651 lan 71.9675 lan 74.6776 lan 77.7901 Sig 37.2247 52.7753 1.000 1.000 194 Means for groups in homogeneous subsets are displayed OMDN29 Duncan Subset for alpha = 0.05 Solancham N lan lan 3 lan 71.9675 lan 74.6776 39.2315 48.8457 lan 74.6776 lan 77.7901 Sig 1.000 1.000 244 Means for groups in homogeneous subsets are displayed ảng 12 Tỉ lệ mẫu dƣơng tính GUS xử l sóng siêu âm thời gian khác (Số liệu đƣợc chuyển đổi sang dạng arcsin√x trƣớc xử lý thống kê) Multiple Comparisons Dependent Variable:GUSsieuam (I) (J) 95% Confidence Interval Thoigia Thoigia Mean Difference LSD n n (I-J) 0s 15s -19.97912 * 2.78926 000 -26.1940 -13.7643 30s -32.02667 * 2.78926 000 -38.2415 -25.8118 45s -32.02667 * 2.78926 000 -38.2415 -25.8118 60s -32.02667 * 2.78926 000 -38.2415 -25.8118 0s 19.97912 * 2.78926 000 13.7643 26.1940 30s -12.04755 * 2.78926 002 -18.2624 -5.8327 45s -12.04755 * 2.78926 002 -18.2624 -5.8327 60s -12.04755 * 2.78926 002 -18.2624 -5.8327 0s 32.02667 * 2.78926 000 25.8118 38.2415 15s 12.04755 * 2.78926 002 5.8327 18.2624 45s 00000 2.78926 1.000 -6.2149 6.2149 60s 00000 2.78926 1.000 -6.2149 6.2149 15s 30s 45s 60s Std Error Sig Lower Bound Upper Bound 0s 32.02667 * 2.78926 000 25.8118 38.2415 15s 12.04755 * 2.78926 002 5.8327 18.2624 30s 00000 2.78926 1.000 -6.2149 6.2149 60s 00000 2.78926 1.000 -6.2149 6.2149 0s 32.02667 * 2.78926 000 25.8118 38.2415 15s 12.04755 * 2.78926 002 5.8327 18.2624 30s 00000 2.78926 1.000 -6.2149 6.2149 45s 00000 2.78926 1.000 -6.2149 6.2149 * The mean difference is significant at the 0.05 level ảng 13 Tỉ lệ đốt mầm dƣơng tính GUS xử l áp lực âm thời gian khác (Số liệu đƣợc chuyển đổi sang dạng arcsin√x trƣớc xử lý thống kê) Multiple Comparisons Dependent Variable:GUSaplucam (I) (J) 95% Confidence Interval Thoigia Thoigia Mean Difference LSD n n 0s 15s -3.92970 3.30424 262 -11.2920 3.4326 30s -12.69696 * 3.30424 003 -20.0593 -5.3347 45s -15.29246 * 3.30424 001 -22.6548 -7.9302 60s -30.05004 * 3.30424 000 -37.4123 -22.6877 3.92970 3.30424 262 -3.4326 11.2920 * 3.30424 024 -16.1296 -1.4050 15s 30s 45s 60s 0s (I-J) Std Error Sig Lower Bound Upper Bound 30s -8.76726 45s -11.36276 * 3.30424 006 -18.7251 -4.0005 60s -26.12034 * 3.30424 000 -33.4826 -18.7580 0s 12.69696 * 3.30424 003 5.3347 20.0593 15s 8.76726 * 3.30424 024 1.4050 16.1296 45s -2.59550 3.30424 450 -9.9578 4.7668 60s -17.35308 * 3.30424 000 -24.7154 -9.9908 0s 15.29246 * 3.30424 001 7.9302 22.6548 15s 11.36276 * 3.30424 006 4.0005 18.7251 30s 2.59550 3.30424 450 -4.7668 9.9578 60s -14.75758 * 3.30424 001 -22.1199 -7.3953 0s 30.05004 * 3.30424 000 22.6877 37.4123 15s 26.12034 * 3.30424 000 18.7580 33.4826 30s 17.35308 * 3.30424 000 9.9908 24.7154 45s 14.75758 * 3.30424 001 7.3953 22.1199 * The mean difference is significant at the 0.05 level