Luận văn nghiên cứu xác định đồng thời các este của 2 mcpd, 3 mcpd và glycidol liên kết với các acid béo trong thực phẩm bằng kỹ thuật gc msms

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯƠNG NGỌC QUYÊN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI CÁC ESTE CỦA 2-MCPD, 3-MCPD VÀ GLYCIDOL LIÊN KẾT VỚI ACID BÉO TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT GC-MS/MS Ngành: HỐ PHÂN TÍCH Mã ngành: 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Đình Vũ Luận văn thạc sĩ bảo vệ Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 08 tháng 07 năm 2023 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: PGS.TS Nguyễn Văn Cường - Chủ tịch Hội đồng PGS.TS Trần Quang Hiếu - Phản biện TS Nguyễn Quốc Hùng - Phản biện TS Nguyễn Văn Trọng - Ủy viên TS Đỗ Thị Long - Thư ký (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG PGS.TS Nguyễn Văn Cường TRƯỞNG KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC PGS.TS Nguyễn Văn Cường BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Trương Ngọc Quyên MSHV: 20125561 Ngày, tháng, năm sinh: 28/08/1988 Nơi sinh: Đồng Nai Ngành: Hố phân tích Mã ngành: 8440118 I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu xác định đồng thời este 2-MCPD, 3-MCPD glycidol liên kết với acid béo thực phẩm kỹ thuật GC-MS/MS NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: (1) Xây dựng thẩm định phương pháp thử với đầy đủ thông số đáp ứng theo yêu cầu TCVN ISO 17025:2017 để xác định hàm lượng este 2-MCPD, 3-MCPD, glycidol liên kết với acid béo mẫu thực phẩm kỹ thuật GCMS/MS đáp ứng quy định EU ngưỡng cho phép (2) Ứng dụng quy trình phân tích để đánh giá thực trạng hàm lượng este 2-MCPD, 3-MCPD, glycidol liên kết với acid béo mợt số sản phẩm mì gói, snack thị trường Thành phố Hồ Chí Minh II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 17/10/2022 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/4/2023 IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Lê Đình Vũ Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 20 … NGƯỜI HƯỚNG DẪN PGS.TS Lê Đình Vũ CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO TS Nguyễn Quốc Thắng TRƯỞNG KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC PGS.TS Nguyễn Văn Cường CHƯƠNG THỰC NGHIỆM Thiết bị, dụng cụ Các dụng cụ phịng thí nghiệm ống ly tâm, vial thủy tinh, micropipette loại, bình định mức, màng lọc 0.45 µm polytetrafluoroethylene… Cân phân tích QUINTIX224-1S xác đến 0.01 mg, 0.1 mg 0.01 g (SARTORIUS, Đức) Máy lắc Benchmixer XL Multitube Vortexer BV1010-E (Benchmark, USA) Máy lắc vortex HWASHIN TECHNOLOGY 250VM (Hàn Quốc) Máy ly tâm có làm lạnh 5810R (Eppendorf, Đức) Thiết bị thổi khí Evarorator Xcel Vap 19-5671 (Horizon, Mỹ) Bể siêu âm điều nhiệt Ultrasonic 30L 18123001 (Ovan, Tây Ban Nha) Cột chiết pha rắn (SPE): cột LC-NH2 loại mL Sigma-Aldrich tương đương Hệ thống GC-8890 ghép nối đầu dò khối phổ ba tứ cực 7000D hãng Agilent (Mỹ) Hệ thống GC với bộ tiêm mẫu tự động, cợt mao quản mở DB-5MS kích thước 20 m × 0.18 mm, đợ dày lớp pha tĩnh 0.18 µm Chất chuẩn, hóa chất 2.2.1 Chất chuẩn 2.2.1.1 Chuẩn nội chuẩn tinh khiết Tất chuẩn phân tích chuẩn đồng vị sản phẩm Sigma Aldrich, bảo quản -18 0C Rac 1,2-Bis-palmitoyl-3-chloropropanediol (PP-3-MCPD), P ≥ 98 % 1,3-Dipalmitoyl-2-chloropropanediol (PP-2-MCPD), P ≥ 98 % Glycidyl palmitate, P ≥ 98 % Rac 1,2-Bis-palmitoyl-3-chloropropanediol-d5 (PP-3-MCPD-d5), P ≥ 98 % 1,3-Dipalmitoyl-2-chloropropanediol-d5 (PP-2-MCPD-d5), P ≥ 98 % 27 Glycidyl palmitate-d5 (Gly-P-d5), P ≥ 97 % 2.2.1.2 Dung dịch chuẩn nội chuẩn gốc – 1000 mg/L Cân xác khoảng 10 mg chuẩn tinh khiết dạng ester vào bình định mức 10 mL tương ứng, hịa tan định mức tới vạch toluene Tính tốn lại nồng độ chất chuẩn, quy dạng tự (alcohol) tương ứng dựa vào công thức sau X  m P K 1000 (mg/L) V (2-1) Trong đó: m khối lượng cân chuẩn (mg); P độ tinh khiết chuẩn (%); V thể tích định mức (mL); K hệ số chuyển đổi từ dạng ester sang dạng alcohol tương ứng Bảng 2.1 Hệ số chuyển đổi từ dạng ester sang dạng alcohol tương ứng Cấu tử Khối lượng phân tử dạng ester Khối lượng phân tử dạng alcohol Hệ số K PP-3PP-2PP-3- PP-2Gly-P MCPD- MCPDMCPD MCPD d5 d5 GlyP-d5 587.36 587.36 312.49 592.39 592.39 317.52 110.54 110.54 74.08 115.54 115.54 79.08 0.1882 0.1882 0.2371 0.1950 0.1950 0.2491 2.2.1.3 Chuẩn nội chuẩn trung gian Dung dịch nội chuẩn trung gian: 1.0 mg/L toluene Dung dịch chuẩn trung gian 1: 5.0 mg/L toluene Dung dịch chuẩn trung gian 2: 0.1 mg/L toluene 2.2.1.4 Chuẩn làm việc Cân khoảng 0,1 g dầu olive (mẫu blank) vào 05 ống nghiệm đánh số từ C1 đến C5 thực thêm chuẩn theo Bảng 2.2 28 Bảng 2.2 Bảng cách pha chuẩn Chuẩn Nồng đợ chạy, µg/L C1 C2 C3 C4 C5 5.00 30.0 100 300 1000 Khối lượng cân mẫu blank, g V hút chuẩn hỗn hợp 0,1 mg/L, µL 0,1 50.0 300 - - - - - 20.0 60.0 200 V hút chuẩn hỗn hợp mg/L, µL V hút nợi chuẩn hỗn hợp mg/L, µL 50.0 V hút THF, mL 2.00 2.2.2 Hóa chất Tetra hydrofuran – THF Methanol Toluene Acid sulfuric Sodium hydro cacbonat, NaHCO3 Sodium bromide, NaBr Dung dịch NaHCO3 0.6 % w/v: Hòa tan 0.6 g NaHCO3 100 mL nước Dung dịch NaHCO3 bão hòa: Hòa tan 9.6 g NaHCO3 100 mL nước Dung dịch H2SO4/MeOH 1.8% v/v: Hút 1.8 mL H2SO4 vào bình định mức 100 mL định mức tới vạch metanol Dung dịch sodium sulfate 20 %, w/v : Cân xác 20 g Na2SO4 khan vào bình định mức 100 mL, hòa tan định mức tới vạch nước cất Dung dịch NaBr 10 %, w/v: Cân xác 1,0 g NaBr vào bình định mức 10 mL, hịa tan định mức tới vạch nước cất Dung dịch NaBr 3000 mg/L, acid sulfuric % v/v: Hút 180 µL dung dịch NaBr 10%, 0.3 mL sulfuric acid đậm đặc 5.5 mL nước cất vào ống nhựa 15 mL, đậy nắp lắc Hỗn hợp rửa giải n-hexane: ethyl acetate (85:15, v/v): Trộn 85 mL n-hexane với 15 mL ethyl acetate, lắc chứa bình có nắp vặn 29 Nguyên tắc phương pháp Đây phương pháp phân tích gián tiếp, 2-MCPDE, 3-MCPDE, GE chuyển hóa dạng tự tương ứng cách thủy phân mơi trường acid có methanol, riêng GE bromide hóa chuyển thành 3-MPBD, sau tạo dẫn xuất với PBA Phương pháp trải qua bốn bước : Chiết béo làm sạch: Chất béo mẫu chiết dung môi ethyl acetate, lượng chất béo thu sau làm cách qua cột SPE để loại bỏ mono diglyceride Bromide hóa: GE sau chuyển thành 3-MBPDE mơi trường acid có chứa NaBr Thủy phân: Sau brom hóa, MCPDE 3-MBPDE thủy phân môi trường acid thành methyl ester alcohol tương ứng (3-MCPD, 2-MCPD 3-MBPD) Chiết chất phân tích dạng tự (alcohol) tạo dẫn xuất: Chiết alcohol sinh ethyl acetate tạo dẫn xuất với PBA để phân tích GC-MS/MS Chuẩn bị mẫu sơ Đối với mẫu thực phẩm sản phẩm đóng hợp đồng nhất sữa bột, sữa nước, nước tương trộn mẫu trước cân Đối với mẫu mì gói, chúng tơi tiến hành xay vắt trước, sau cho gói rau, gói dầu sa tế gia vị vào đồng nhất, lấy hết lượng dầu gói dầu sa tế, đồng nhất mẫu theo đơn vị mẫu Đối với thịt sấy, snack dùng cối đồng nhất mẫu Đồng nhất mẫu theo đơn vị mẫu Tất mẫu sau đồng nhất bảo quản nhiệt đợ phịng 30 Thơng số, điều kiện thiết bị 2.5.1 Điều kiện thiết bị GC Sau tạo dẫn xuất chất phân tích chuyển thành hợp chất phân cực, theo tham khảo tài liệu chúng tơi sử dụng cợt DB-5MS kích thước 20 m × 0.18 mm, độ dày lớp pha tĩnh 0.18 µm Tham khảo chọn thể tích tiêm, chọn chế đợ tiêm, khí mang sử dụng, cài đặt tốc đợ dịng khí Tối ưu chương trình nhiệt lị cợt Sau tiến hành chạy chuẩn đơn với nồng đợ 1.0 µg/ml tạo dẫn x́t với PBA 2-MCPD, 3-MCPD, 3-MBPD (sau bromide hóa) để xác định thời gian lưu chuẩn đơn nợi chuẩn 2.5.2 Điều kiện đầu dị MS Với nguồn ion hóa EI lượng ion hóa khoảng 70 eV, chúng tơi chọn chế đợ full scan để tìm mảnh ion mẹ cho chất Chúng khảo sát lượng bắn phá thích hợp để lựa chọn ion định danh, định lượng Sau chạy scan dẫn xuất PBA với chuẩn đơn nội chuẩn đơn chất nồng đợ 1.0 µg/mL chúng tơi có phổ MS chất Dựa thực tế tham chiếu AOAC 2018.03, cường đợ tín hiệu mảnh chúng tơi có mảnh ion mẹ, mảnh ion con, mảnh ion định danh, mảnh ion định lượng Tiêu chí lựa chọn dựa vào quy định tỉ lệ ion xác định so với ion định lượng [52] số điểm identification point (IP) theo quy định EC Bảng 2.3 Qui định EC số điểm IP cho một kỹ thuật phân tích [52] Kỹ thuật GC-MS (EI CI) GC-MS (EI CI) GC-MS (EI CI) tạo dẫn xuất LC-MS GC-MS/MS Số lượng mảnh ion N (EI) + (CI) (Chất dẫn xuất A) + (Chất dẫn xuất B) N mảnh mẹ mảnh 31 Số điểm IP N 4 N Kỹ thuật GC-MS/MS LC-MS/MS LC-MS/MS/MS HR-MS GC-MS LC-MS GC-MS HR-MS Số lượng mảnh ion mảnh mẹ mảnh mảnh mẹ mảnh mảnh mẹ, mảnh mảnh ion N 2+2 2+2 Số điểm IP 5.5 2n 4 Tối ưu quy trình xử lý mẫu 2.6.1 Tối ưu khối lượng mẫu cân thực phẩm Vì MCPDE, GE thường xuất mẫu chứa chất béo có xử lý nhiệt nên lượng mẫu cân cần thiết có ảnh hưởng đến hiệu suất chiết chất béo mẫu hiệu suất chiết chất phân tích, đồng thời ảnh hưởng đến việc đảm bảo lượng béo đủ lớn để đạt giới hạn phát Theo AOAC 2018.03 phân tích MCPDE, GE sữa lượng mẫu tương ứng với phần trăm chất béo có mẫu, chẳng hạn sữa bợt có béo từ 20-30% lượng mẫu cân 0.5g, sữa dạng lỏng có béo từ 3-5% lượng mẫu cân 3.0 g, sữa có hàm lượng béo từ -12% lượng mẫu cân 1.5 g Như vậy, với mẫu chuẩn bị thẩm định mì gói (hàm lượng béo 10-20%), nước tương (hàm lượng béo 0%, lượng vết), thịt sấy (hàm lượng béo 1016%), sữa bột (hàm lượng béo 20 -30%) khảo sát lượng mẫu cân từ 0.5g, 1.0g, 2.0g mì gói, sữa bợt, có hàm lượng béo cao thẩm định Với ba lượng mẫu cân trên, chúng tơi tiến hành thí nghiệm với quy trình tham khảo, ghi nhận hàm lượng MCPDE, GE đánh giá kết 2.6.2 Khảo sát nồng độ NaBr, nồng độ H2SO4, thời gian phản ứng ảnh hưởng đến q trình bromide hóa GE Vịng epoxide GE mở mợt ngun tử carbon epoxide bị tấn công tác nhân nucleophile điều kiện kiềm trung tính acid [53] Trong đó, với mơi trường acid tốc đợ nucleophile tăng lên đáng kể phản ứng thuận nghịch khả phản ứng mạnh acid liên hợp với epoxide 32 [54] Tuy nhiên, môi trường acid có khả làm tăng hình thành ex-novo hợp chất halogen hóa, chẳng hạn 3-MCPD, phản ứng một phần acylglycerol (thành phần dầu chất béo) với ion halogen Như nồng độ H2SO4 yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng chuyển hóa GE thành 3-MBPD Ở khảo sát với nồng độ 1%, 3%, 5%, 7%, cách thêm chuẩn 1.0 µg/mL dầu olive Bên cạnh đó, nồng đợ bromide điều kiện quan trọng cho phản ứng, ảnh hưởng trực tiếp đến tín hiệu 3-MBPD thiết bị Mặc dù phản ứng bromide với GE diễn nhanh phản ứng mạnh mẽ vòng epoxide nồng độ bromide thấp dẫn đến phản ứng khơng hồn tồn Ngược lại, nồng đợ bromide q cao acylglycerol khơng loại bỏ hồn tồn q trình xử lý mẫu phản ứng với bromide dẫn đến hàm lượng GE bị sai số dương Như vậy, nồng độ bromide ảnh hưởng trực tiếp đến đợ xác hàm lượng GE Do đó, chúng tơi khảo sát nồng đợ bromide giai đoạn cách thay đổi nồng độ bromide so với tài liệu tham khảo mức 1000, 3000, 4000, 7000 mg/L Khảo sát thực với chuẩn hỗn hợp 1.0 µg/mL dầu olive Thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng xem xét khảo sát để đưa quy trình tối ưu cho việc thẩm định Theo nhiều tài liệu nhiệt độ áp dụng 50 0C, thời gian phản ứng 15 phút Ở thay đổi thời gian phản ứng để khảo sát 3-MBPD hình thành bền thời gian bao lâu, điều ảnh hưởng phần đến tín hiệu 3-MBPD thiết bị Thời gian khảo sát phút, 10 phút, 15 phút, 30 phút chuẩn 1.0 µg/mL 2.6.3 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng muối ăn đến phương pháp Có nhiều nghiên cứu chuyển hóa thuận nghịch glycidol 3-MCPD có ion Cl- mơi trường acid [14, 51], bên cạnh phản ứng bromide hóa GE, có mặt ion Cl- mơi trường acid xảy canh tranh phản ứng bromide chloride với GE dẫn đến tín hiệu GE bị giảm, ảnh hưởng đến kết phân tích GE 3-MCPDE Trong đặc trưng mẫu thực phẩm 33 biến; nguồn thứ hai loại dầu dùng để chiên, loại dầu có sẵn lượng MCPDE GE, lượng bị giảm theo chất lượng dầu mức độ xuất thường không vượt mức cho phép mức đợ tích tụ vào sợi mì miếng snack không tránh khỏi Trong một nghiên cứu tạp chí Journal of Agricultural and Food Chemistry (2011) tác giả Küsters.M cộng có cơng bố hàm lượng MCPDE, GE mợt số loại thực phẩm Bảng 1.2 [27] Bảng 1.2 Hàm lượng 3-MCPDE GE công bố sau phân tích theo phương pháp nghiên cứu tác giả Küsters M Loại thực phẩm Oxtail soup (powder) Gravy (powder) Sauce for chicke (powder) Vegetable soup (powder) Bread Cookies Cornflakes Chocolate-hazelnut bar Mayonnaise Margarien Sunflower oil Olive oil Seasame oil Rapeseed oil Glycidyl ester (µg/kg) 307 ± 72 ± 67 ± 10 3-MCPD ester (µg/kg) 386 ± 15 660 ± 44 372 ± 140±1