Nghiên cứu khả năng kháng viêm giảm đau và tăng cường miễn dịch của cao chiết từ cây ngải mọi

LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đề tài “Nghiên cứu khả kháng viêm, giảm đau tăng cƣờng miễn dịch cao chiết từ Ngải mọi” công trình nghiên cứu riêng tơi số kết cộng tác với cộng khác dƣới hƣớng dẫn thầy cô Viện Công nghệ sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Mở Hà Nội Các số liệu, kết nghiên cứu đƣợc thực hồn tồn trung thực Tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nội dung luận có sai sót Ký ghi rõ họ tên Đỗ Thị Phƣơng i LỜI CẢM ƠN Tôi xin biết ơn sâu sắc tới cán hƣớng dẫn khoa học TS Trịnh Thị Thu Hằng, TS Bùi Thị Hải Hịa, Viện Cơng nghệ sinh học Cơng nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Mở Hà Nội hƣớng dẫn, tận tình giúp đỡ bảo tơi suốt q trình thực để hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng quý trọng biết ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Thị Thu Hiền hƣớng dẫn, tạo điều kiện tốt cho để thực hồn thành tốt luận văn Đồng thời, tơi xin gửi lời cảm ơn tới tồn thể thầy Viện Công nghệ sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi để tơi học tập hồn thành luận văn Chân thành cảm ơn! Hà Nội, Ngày 20 tháng 02 năm 2023 Học viên Đỗ Thị Phƣơng ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan họ Gừng Ngải 1.2 Tổng quan viêm đau 1.3 Một số thảo dƣợc có hoạt tính chống viêm 11 1.4 Tình hình nghiên cứu, phát triển dƣợc liệu nƣớc 15 1.5 Tổng quan miễn dịch 16 1.6 Một số hoạt chất có hoạt tính sinh học thực vật 19 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 22 2.2 Nguyên vật liệu 22 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ 32 3.1 Độc tính cấp bán trƣờng diễn 32 3.2 Tác dụng chống viêm cấp cao chiết từ Ngải mơ hình gây phù chân chuột cống Carrageenan 44 3.3 Tác dụng giảm đau cao Ngải 45 3.4 Tác dụng tăng cƣờng miễn dịch cao chiết từ Ngải 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 61 iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT IL Interleukin IL-1 Interleukin – IL-2 Interleukin – IL-6 Interleukin – TNF - Tumor necrosis factor alpha (Yếu tố hoại tử khối u alpha) Elisa Enzyme – Linker Immunosorbent Assay EtOAc Ethyl acetate IFN Interferon GC - MS Gas chromatography mass spectrometry (Sắc ký khí ghép khối phổ) IC 50 Nồng độ ức chế tối đa nửa IgG Immunoglobulin G Go Globba obscura K.Larsen Globba orixensis Roxb Globba salarkhanii Globba schomburgkii Hook.f Globba sessiliflora Sims Gs Globba sherwoodiana W.J.Kress & V.Gowda Globba spathulata Roxb Globba subscaposa Collett & Hemsl Globba substrigosa King ex Baker iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Thân (rễ) Ngải (Globba Pendula Roxb.) Hình 2.1 Chuột nhắt trắng chủng Swiss 23 Hình 2.2 Tiêm carrageenan vào chân chuột 27 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học hoạt tính sinh học hợp chất tách chiết từ số thực vật họ Gừng Bảng 1.2 Danh sách số loài Globba loài tƣơng tự Bảng 1.3 Các lồi Globba với phận dùng, cơng dụng cách dùng Bảng 1.4 Một số mơ hình chống viêm, giảm đau động vật thí nghiệm 10 Bảng 1.5 Một số loài thực vật phổ biến có tác dụng chống bệnh viêm khớp 12 Bảng 1.6 Thành phần hệ miễn dịch 18 Bảng 1.7 Các đặc điểm số cytokin 18 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị 22 Bảng 2.3 Danh mục dụng cụ 23 Bảng 3.1 Tỷ lệ chuột chết vòng 72 sau uống cao Ngải 33 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng cao Ngải đến thể trọng chuột cống trắng 34 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng cao Ngải đến mật độ hồng cầu 35 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng cao Ngải đến hàm lƣợng huyết sắc tố 35 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng cao Ngải đến hematocrit 36 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng cao Ngải đến thể tích trung bình hồng 36 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng cao Ngải đến số lƣợng bạch cầu 37 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng cao Ngải đến công thức bạch cầu 37 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng cao Ngải đến số lƣợng tiểu cầu 38 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng cao Ngải đến hoạt độ AST 39 Bảng 3.11 Ảnh hƣởng cao Ngải đến hoạt độ ALT 39 Bảng 3.12 Ảnh hƣởng cao Ngải đến nồng độ bilirubin toàn phần 40 Bảng 3.13 Ảnh hƣởng cao Ngải đến nồng độ albumin 40 Bảng 3.14 Ảnh hƣởng cao Ngải đến nồng độ cholesterol toàn phần 41 Bảng 3.15 Ảnh hƣởng cao Ngải đến nồng độ creatinin 43 Bảng 3.16 Tác dụng chống viêm cấp cao Ngải độ phù chân chuột 44 Bảng 3.17 Ảnh hƣởng cao Ngải phản ứng với nhiệt độ 46 Bảng 3.18 Ảnh hƣởng cao Ngải lên số quặn đau acid acetic vi gây 47 Bảng 3.19 Kết tác động cao Ngải lên trọng lƣợng tƣơng đối lách chuột thí nghiệm 49 Bảng 3.20 Ảnh hƣởng cao Ngải lên trọng lƣợng tƣơng đối tuyến ức 49 Bảng 3.21 Ảnh hƣởng cao Ngải lên số lƣợng bạch cầu 51 Bảng 3.22 Ảnh hƣởng cao Ngải lên loại bạch cầu 52 Bảng 3.23 Ảnh hƣởng thuốc thử đến nồng độ IL-2 53 Bảng 3.24 Ảnh hƣởng thuốc thử đến nồng độ TNF-α 54 Bảng 3.25 Ảnh hƣởng cao Ngải lên hàm lƣợng IgG 55 vii MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Khi tác nhân gây bệnh nhƣ vi khuẩn, vi rút, yếu tố sinh học, học, hóa học vật lý… tác động vào thể sinh đáp ứng sinh học gọi viêm Viêm xảy tế bào bạch cầu thể tăng cƣờng hoạt động để bảo vệ thể khỏi bị đả kích tác nhân gây bệnh mơ bị tổn thƣơng phản ứng học, nhiệt, điện, chiếu xạ, hóa chất nhiễm trùng Nếu viêm khơng đƣợc điều trị dẫn loại bệnh khác nghiêm trọng nhƣ viêm khớp, bệnh tim mạch, ung thƣ, tiểu đƣờng, rối loạn hoạt động thần kinh [1] Viêm khớp ảnh hƣởng không nhỏ đến sống ngƣời, có 100 loại viêm khớp nhƣ viêm xƣơng khớp, viêm cột sống dính khớp, viêm khớp dạng thấp…thƣờng xảy khớp bàn chân, đầu gối, cột sống, hông… hậu nặng viêm khớp thƣờng cứng khớp khả vận động Viêm khớp tiến triển nặng gây ảnh hƣởng với khớp lƣng, cột sống, đầu gối… Thống kê năm gần Trung tâm Kiểm soát bệnh tật Mỹ cho thấy, bệnh viêm khớp nguyên nhân hàng đầu gây tàn phế cho ngƣời, vấn đề lƣng cột sống Việt Nam nhƣ nhiều nƣớc giới, viêm khớp bệnh lý thƣờng gặp Bệnh xảy tất lứa tuổi, đó, thƣờng bị bệnh nhiều 30-50 tuổi (chiếm 73 – 85%) Từ xƣa, ngƣời phát sử dụng nhiều thuốc dân tộc để điều trị bệnh viêm nhiễm, tăng cƣờng khả kháng viêm tăng cƣờng miễn dịch cho thể Ngày nay, nƣớc phát triển, việc điều trị dần hƣớng theo thiên nhiên, sử dụng loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên Nhiều thuốc từ thảo dƣợc chữa bệnh đƣợc ghi sách quý truyền miệng, chƣa đƣợc công bố Việt Nam có hệ thực vật phong phú với nhiều thuốc Có nhiều dạng hợp chất thiên nhiên có tác dụng kháng viêm nhƣ phenolic, flavonoid…Việc nghiên cứu khả kháng viêm hợp chất mới, ứng dụng thuốc đƣợc thúc đẩy mạnh nhằm tìm biện pháp để phịng điều trị bệnh việc vô cần thiết Phƣơng pháp chữa bệnh dƣợc liệu phƣơng pháp đƣợc sử dụng tốt việc điều trị bệnh xƣơng khớp Việt Nam có khí hậu nhiệt đối gió mùa, điều kiện khí hậu thuận lợi cho lồi thực vật phát triển Từ xa xƣa dân gian ngƣời biết sử dụng loại cỏ có tự nhiên để làm thuốc chữa bệnh, tăng cƣờng sức đề kháng Trong số thuốc Việt Nam, Ngải mọc hoang vùng đồi núi đƣợc đồng bào dân tộc trồng số tỉnh nhƣ An Giang, Trà Vinh, Sóc Trăng Dân gian từ xƣa sử dụng Ngải thuốc để chữa bệnh lao, ho máu, đau thắt ngực, bệnh động mạch vành, tiểu đƣờng, hạ huyết áp, rối loạn hệ thần kinh tự chủ, đau lƣng, khớp đau viêm khớp bao gồm viêm xƣơng khớp Xuất phát từ nhu cầu thực tế, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu khả kháng viêm, giảm đau tăng cƣờng miễn dịch cao chiết từ Ngải mọi” Mục tiêu nội dung nghiên cứu 2.1 Mục tiêu nghiên cứu Xác định, đánh giá đƣợc khả kháng viêm, giảm đau tăng cƣờng miễn dịch cao chiết từ ngải mơ hình động vật thí nghiệm 2.2 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp cao chiết từ Ngải - Nghiên cứu tác dụng giảm đau cao chiết từ Ngải - Nghiên cứu khả tăng cƣờng miễn dịch cao chiết từ Ngải CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tổng quan họ Gừng Ngải 1.1.1 Khái quát họ Gừng chi Globba Gừng họ thân thảo có tinh dầu phân bố khắp nƣớc giới Trong số đó, gừng phân bố chủ yếu châu Á với khoảng 1000 loài Một số loài đƣợc nghiên cứu thành phần hóa học, tách chiết đƣợc hoạt tính sinh học đƣợc sử dụng rộng rãi Tại Việt Nam họ Gừng có 19 chi với khoảng gần 200 loài Các họ Gừng sống nơi ẩm ƣớt, không cần nhiều ánh sáng, phụ sinh Bộ rễ to, nằm ngang, thân rễ chứa nhiều chất dự trữ, có ngắn mang hoa, thân đƣợc tạo thành bẹ ôm chặt lấy tạo thành thân giả, ngắn khơng có hay cao 1-3 m, đơi cao tới 4-5 m (Alpinia, Amomum…), không phân nhánh Cây thƣờng có mùi thơm hay có mùi hắc nhƣ số loài chi Zingiber [17] Gừng đƣợc sử dụng với nhiều ứng dụng mục đích khác nhƣ thực phẩm, thuốc cổ truyền, gia vị, thuốc nhuộm hƣơng vị Các nghiên cứu thực vật học thuốc tiết lộ gừng họ lớn đƣợc sử dụng làm thuốc truyền thống, số thuốc chống độc nọc bọ cạp, chống viêm, thấp khớp , bệnh da, sốt, yếu tim thuốc giảm đau Gừng ứng dụng điều trị bệnh nhƣ thuốc chống viêm, thuốc chữa bệnh kích thích tim, viêm khớp dạng thấp, viêm, viêm họng, ho, hen suyễn, chứng khó tiêu, đau dày, béo phì, tiểu đƣờng….ngồi nhiều lồi có chứa hợp chất chuyển hóa thứ cấp đƣợc ứng dụng lĩnh vực dƣợc phẩm, nhƣ chất chống viêm, chống oxy hóa, chống đột biến, chống đái tháo đƣờng, kháng khuẩn, chống viêm gan, chống co giật, giảm đau, thuốc tiêu chảy, rối loạn da liễu, thấp khớp.[18] Bảng 1.1 Thành phần hóa học hoạt tính sinh học hợp chất tách chiết từ số thực vật họ Gừng STT Loài Hedychium thyrsiforme Hợp chất Flaonoids Hoạt tính sinh học Chống oxy hóa, kháng tế bào ung thƣ - Thuốc đối chứng Levamisol có tác dụng làm sản sinh phục hổi loại bạch cầu lympho, bạch cầu trung tính gây Cyclophosphamid - Cao Ngải với hai liều thí nghiệm có tác dụng tƣơng tự Levamisol, điều cho thấy, cao Ngải tác dụng lên khả sản sinh bạch cầu tủy xƣơng, lách tuyến ức 3.4.3 Ảnh hưởng cao Ngải đến khả sinh tổng hợp số cytokin - Các cytokin protein kháng thể đƣợc sản xuất tế bào miễn dịch có tác dụng điều hịa hoạt động hệ thống miễn dịch - Interleukin (IL-2) interleukin hệ thống miễn dịch, điều chỉnh hoạt động tế bào bạch cầu, chịu trách nhiệm khả miễn dịch, phản ứng lại lây nhiễm vi khuẩn, nguồn IL-2 tế bào TCD4+ hoạt hóa TCD8+ hoạt hóa Yếu tố hoại tử khối u (Tumor Necrosis Factoralpha–TNF-α) cytokin thúc đẩy kháng insulin có liên quan đến bệnh tiểu đƣờng, đƣợc hệ thống miễn dịch sử dụng để truyền tín hiệu tế bào Nếu tế bào bạch cầu phát nhiễm trùng chúng giải phóng TNF để cảnh báo tế bào khác hệ thống miễn dịch nhƣ phần phản ứng viêm [25] Bảng 3.23 Ảnh hƣởng thuốc thử đến nồng độ IL-2 Lơ thí nghiệm Số mẫu Lơ đối chứng âm 7,24 Lô đối chứng Cyclophosphamid 2,56 Lô thử nghiệm với Levamisol 7,55 5,58 7,49 Lô thử nghiệm với cao Ngải (0,5 g/chuột) Lô thử nghiệm với cao Ngải (1 g/chuột) Nồng độ IL–2 (pg/ml) Kết nghiên cứu bảng 3.23 cho thấy: - Nồng độ IL-2 lô đối chứng dùng Cyclophosphamid giảm rõ rệt 53 Lơ thí nghiệm dùngLevamisol có tăng nồng độ IL – tăng lên so với lô sử - dụng Cyclophosphamid Cao Ngải liều 0,5 g/chuột có tác dụng làm tăng nồng độ IL -2 so với lô sử - dụng Cyclophosphamid, nhƣng thấp so với lô chuột khoẻ mạnh Cao Ngải liều g/chuột có tác dụng làm tăng rõ rệt nồng độ IL -2 so với lô sử dụng Cyclophosphamid, nồng độ IL -2 lô cao Ngải g/chuột tƣơng đƣơng với Levamisol Interleukin-2 yếu tố quan trọng hệ miễn dịch, protein có vai - trị hoạt hố dịng tế bào lympho T để nhận diện kháng nguyên; giúp kích thích phát triển tế bào diệt tự nhiên (NK); kích thích phát triển tăng tổng hợp kháng thể tế bào B Sự tăng cƣờng tổng hợp lớp inteleukin cao Ngải có ý nghĩa quan trọng việc tăng cƣờng miễn dịch động vật Bảng 3.24 Ảnh hƣởng thuốc thử đến nồng độ TNF-α Lơ thí nghiệm Số mẫu Nồng độ TNF-α (pg/ml) Lô đối chứng âm 5,19 Lô đối chứng Cyclophosphamid 16,27 Lô thử nghiệm với Levamisol 8,14 9,25 9,98 Lô thử nghiệm với cao Ngải (0,5 g/chuột) Lôthử nghiệm với cao Ngải (1 g/chuột) Kết nghiên cứu bảng 3.24 cho thấy: Lô thí nghiệm với Cyclophosphamide có hàm lƣợng TNF – α tăng máu - chuột nhắt - Levamisol có tác dụng làm giảm đáng kể hàm lƣợng TNF – α so với lô sử dụng Cyclophosphamide 54 Cao Ngải với liều 0,5g/chuột 1g/chuột làm giảm hàm lƣợng - TNF– α so với lô sử dụng Cyclophosphamide đạt ý nghĩa thống kê (p