Luận án tiến sĩ nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá đu đủ rừng (trevesia palmata (roxb ex lindl ) vis , họ nhân sâm araliaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ THỊ THANH THẢO NGHIÊN CỨU B ÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG (Trevesia palmata (Roxb e x Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliaceae) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ THỊ THANH THẢO NGHIÊN CỨU B ÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG (Trevesia palmata (Roxb e x Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliaceae) Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm Bào chế thuốc Mã số: 9720202 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS Võ Xuân Minh PGS.TS Đỗ Quyên HÀ NỘI – 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng với hướng dẫn khoa học tập thể cán hướng dẫn Các số liệu, kết nêu luận án trung thực công bố phần báo khoa học Luận án chưa cơng bố cơng trình khác Nếu có điều sai tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm Tác giả Lê Thị Thanh Thảo LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án, tơi nhận giúp đỡ tận tình Thầy cơ, anh chị, bạn đồng nghiệp người thân gia đình Trước hết tơi xin bày tỏ lịng kính trọng đặc biệt biết ơn sâu sắc tới: GS.TS Võ Xuân Minh PGS.TS Đỗ Quyên, người Thầy tận tâm hướng d ẫn khoa học, động viên, khích lệ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi, giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, lời cảm ơn chân thành tới Thầy Cô trong: Ban Giám đốc, Viện Đào tạo Dược, Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Sản xuất thuốc, Bộ môn Dược lý - Học viện Quân Y, phòng Sau đại học tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu Thầy, Cô Bộ môn Thực vật, Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội, Ban Giám hiệu Thầy, Cô Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội, Viện Hóa Sinh biển, Trung tâm phương pháp phổ ứng dụng, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Hà Nội tạo điều k iện tốt để tơi hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Trường Cao đẳng Y tế Hà Đông, Ủy ban nhân dân Thành phố Hà Nội, anh/chị đồng nghiệp, người thân gia đình bạn bè động viên giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận án Ngày tháng năm 2020 Lê Thị Thanh Thảo MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ, ký hiệu viết tắt luận án Danh mục hình Danh mục bảng ĐẶT VẤ N ĐỀ CHƯƠN G TỔN G QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔN G QUAN VỀ ĐU ĐỦ RỪNG 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Tác dụ ng sinh học d ược lý 1.1.4 Công dụng CAO THUỐC 1.2.1 Định nghĩa, phân loạ i 1.2.2 Kỹ thuật điều ch ế cao thuốc 1.3 TỔN G QUAN VỀ TĂN G CƯỜN G MIỄN DỊCH 8 10 23 1.3.1 Khái niệm tăng cường miễn dịch chất tăng cường miễn dịch 23 1.3.2 Mơ hình nghiên cứu đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch số chế phẩm thảo mộc CHƯƠN G ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠN G PHÁP N GHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢN G NGHIÊN CỨ U 24 30 30 2.1.1 Nguyên liệu 30 2.1.2 Động vật thí ngh iệm 30 2.1.3 Thuốc thử, hóa chất dung mơ i 31 2.1.4 Máy móc, trang thiết b ị nghiên cứu 32 2.1.5 Địa điểm ngh iên cứu 33 2.2 PHƯƠN G PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu xây dựng qui trình bào chế cao khơ Đu đủ rừng qu i mơ phịng thí ngh iệm 33 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn sở đánh giá độ ổn định củ a cao khô Đu đủ rừng 46 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch độc tính cao khơ Đu đủ rừng đ ộng vật th ực ngh iệm CHƯƠN G KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48 53 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH BÀO CHẾ CA O KHƠ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG QUI MƠ PHỊN G TH Í N GHIỆM 53 3.1.1 Kết xác định số hợp chất sử dụng làm chất đánh dấu 53 3.1.2 Kết xây dựng tiêu chuẩn sở dược liệu Đu đủ rừng làm nguyên liệu ch iết xuất 56 3.1.3 Kết xây dựng qui tr ình bào chế cao khô Đu đủ rừng 72 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨ N CHẤT LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG 88 3.2.1 Kết xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cao khô Đu đủ rừng 88 3.2.2 Kết đ ánh giá độ ổn định cao khô Đu đủ rừng 95 3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁ C DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH VÀ ĐỘC TÍNH CỦA CAO KHƠ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG TRÊN ĐỘNG VẬ T THỰC NGHIỆM 100 3.3.1 Kết đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch cao khô Đu đủ rừng 100 3.3.2 Đánh giá độc tính cao khơ Đu đủ rừng CHƯƠN G BÀN LUẬ N 108 119 4.1 VỀ XÂ Y DỰNG QUI TRÌNH BÀO CHẾ CAO KHƠ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG 119 4.1.1 Về xác định nhóm h ợp chất sử dụng làm chất đánh dấu xây dựng qui trình bào chế cao khơ Đu đủ rừng 119 4.1.2 Về lựa chọn ph ương pháp đ ịnh lượng 120 4.1.3 Về tiêu chuẩn sở Đu đủ rừng 121 4.1.4 Về qui trình bào chế cao Đu đ ủ rừng 122 4.1.5 Về thiết b ị ch iết xuất, cô đặc kết bào chế cao 3:1 128 4.1.6 Bào chế cao khô Đu đủ rừng phương pháp phun sấy 129 4.2 VỀ XÂ Y DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤ T LƯỢNG VÀ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CA O KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG 135 4.2.1 Xây dựng tiêu chuẩn sở 135 4.2.2 Về đánh giá độ ổn định cao khô Đu đủ rừng 136 4.3 VỀ TÁC DỤNG TĂ NG CƯỜNG MIỄN DỊCH VÀ ĐỘC TÍNH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG 136 4.3.1 Tác dụng tăng cường miễn dịch cao khô Đu đủ rừng 136 4.3.2 Độc tính cao khơ Đu đủ rừng 143 KẾT LUẬN 145 KIẾN NGH Ị 147 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀ I LUẬ N ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢ O PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT STT Viết tắt Phần viết đầy đủ A A er Độ hấp thụ quang Aerosil AO Acid oleanolic BC Bạch cầu C Nồng độ 13 C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ carbon 13) Carr's compressibility index (Chỉ số nén Carr) CI CR/DP tỷ lệ % (khối lượng/khối lượng) chất rắn tổng khối lượng dịch phun sấy cs Cộng 10 Cyc Cyclophosphamid 11 DĐVN Dược điển Việt Nam 12 DM/DL Dung môi/dược liệu (ml/g) 13 14 ĐĐR EtOH Đu đủ rừng Ethanol 15 HMBC Heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy (Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết) 16 HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) 17 18 HS chiết HSPL Hiệu suất chiết Hệ số pha loãng 19 HSPS Hiệu suất phun sấy 20 HR-ESI-MS High resolution - electrospray ionization - mass spectroscopy (Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử) 21 22 IL INF Interleukin Interferon 23 KLCT Khối lượng thể 24 25 KTTP KLRbk Kích thước tiểu phân Khối lượng riêng biểu kiến 26 LD 50 Lethal Dose 50 (Liều gây chết 50% số vật thử) 27 LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện) 28 LOQ Limit of Quantification (Giới hạn định lượng) 29 M Khối lượng 30 31 32 Mal MeOH m/z Maltodextrin Methanol Mass to charge ratio (tỉ lệ khối lượng/điện tích) 33 OA Ovalbumin + Al(OH)3 34 RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) 35 SPN Saponin toàn phần 36 SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn) 37 38 SE STT Standard error (Sai số chuẩn) Số thứ tự 39 TCCS Tiêu chuẩn sở 40 TCMD Tăng cường miễn dịch 41 TD/CR Tá dược/Chất rắn 42 TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) 43 44 KLLTĐ KLTƯTĐ Khối lượng lách tương đối Khối lượng tuyến ức tương đối 45 46 TB TNF Trung bình Tumor necrosis factor (Yếu tố hoại tử khối u) 47 UV – VIS Ultraviolet-vis ible (Tử ngoại - khả kiến) DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb ex Lind l.) Vis ,) 1.2 Cấu trúc saponin phân lập t Đu đủ rừng 1.3 Sơ đồ thiết bị b ể ch iết siêu âm que siêu âm 15 1.4 Cấu tạo hệ thống phun sấy 22 2.1 Sơ đồ nghiên cứu mơ hình gây suy giảm miễn dịch Cy clophosphamid 49 3.1 Cấu trúc hóa học hợp ch ất phân lập t Đu đủ rừng 53 3.2 Phổ UV-Vis mẫu t rắng mẫu chuẩn 56 3.3 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc độ hấp thụ quang theo thời gian phản ứng tạo màu 57 3.4 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc độ hấp thụ quang vào lượng acid oleanolic chuẩn 58 3.5 Sắc ký đồ củ a mẫu th ử, mẫu chuẩn mẫu trắng 61 3.6 Đồ th ị mô tả phụ thuộ c diện tích pic vào nồng độ acid oleanolic 62 3.7 Hình ảnh vi phẫ u Đu đủ rừng 65 3.8 Hình ảnh soi t Đu đủ rừng 66 3.9 Hình ảnh sắc ký đồ TLC dược liệu Đu đủ rừng 68 3.10 Ả nh hưởng tỷ lệ dung môi/dược liệu v số lần chiết đến chiết xuất saponin toàn phần 75 3.11 Ả nh hưởng thời g ian đến chiết xuất saponin toàn ph ần 77 3.12 Sơ đồ tóm tắt gia i đoạn điều chế cao Đu đủ rừng 3:1 87 3.13 Sơ đồ tóm tắt g iai đoạn bào chế cao khô Đu đủ rừng 88 3.14 Kết chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) củ a bột cao khô Đu đ ủ rừng 3.15 H ình ảnh TLC củ a cao khô Đu đủ rừng 89 92 HỌC VIỆN QUÂN Y TTNC ỨNG DỤNG SX THUỐC TN CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGH ĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc *** PHỤ LỤC QUI TRÌNH BÀO CHẾ CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG I ĐẶC ĐIỂM THÀNH PHẨM 1.1 Tên thành phẩm: Cao khô Đu đủ rừng 1.2 Chất lượng thành phẩm: 1.2.1 Tính chất: Khối bột khô tơi, màu vàng nâu nhạt, đồng nhất, vị đắng, mùi đặc trưng 1.2.2 M ất khối lượng làm khơ: Khơng q 5% 1.2.3 Tro tồn phần: Không 15,0% 1.2.4 Giới hạn kim loại nặng: As ≤ 1,0 mg/kg; Cd ≤ 1,0 mg/kg; Hg ≤ 0,1 mg/kg; Pb ≤ 3,0 mg/kg 1.2.5 Giới hạn nhiễm khuẩn: Đạt mức 4, DĐVN V - Phụ lục 13.6 - “Thử giới hạn nhiễm khuẩn” phương pháp đĩa thạch 1.2.6 Định tính: sắc ký lớp mỏng, sắc ký đồ mẫu thử phải xuất vết màu có giá trị Rf màu sắc tương ứng với vết acid oleanolic 1.2.7 Định lượng: Hàm lượng saponin tồn phần khơng thấp 100 mg/g khơng cao 200 mg/g tính theo acid oleanolic chế phẩm khô kiệt Hàm lượng acid oleanolic không thấp 7,5 mg/g không cao 12,5 mg/g chế phẩm khô kiệt II ĐẶC ĐIỂM NGUYÊN PHỤ LIỆU Bảng PL Đặc điểm nguyên phụ liệu Mục Tên nguyên liệu Lá đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb ex Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliaceae) Ethanol 96° Nước tinh khiết Aerosil Tiêu chuẩn TCCS DĐVN V DĐVN V BP2014 III THIẾT BỊ - Cân điện tử Mettler Toledo 3000 (Thụy sỹ) - Tủ sấy tĩnh (Trung Quốc) - Máy nghiền, rây dược liệu (Việt Nam) - Hệ thống thu hồi dung mơi 40 lít (Việt Nam) - Cân xác định hàm ẩm A dam (Anh) - Thiết bị chiết siêu âm SONY MEDI SM30-CEP (Hàn Quốc): dung tích 30 lít, cơng suất tạo sóng siêu âm 400W , gồm đầu phát đáy bình, tần số siêu âm 60kHz Kích thước máy: 1020 × 1500 × 750 cm - Thiết bị phun sấy LPG-5 (Trung Quốc) qui mô pilot: Kiểu phun ly tâm tốc độ cao, đĩa phun gồm 24 lỗ hình trịn, đường kính lỗ 3mm Phun dịch chiều với dịng khí nóng, lưu lượng khí 240m /giờ, tốc độ bốc kg/giờ Công suất tiêu thụ điện 12kW Kích thước máy: 2300 × 1280 × 2180 cm Đường kính buồng sấy: 1000 cm IV THƠNG SỐ QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ PHUN SẤY Bảng PL Thơng số qui trình chiết xuất, cao đu đủ rừng qui mô kg dược liệu/mẻ, lô kg (2 mẻ) STT I 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 II 2.1 2.2 Tên phương pháp/ thông số Chiết siêu âm Bột khô ĐĐR Dung môi chiết Nhiệt độ chiết Thiết bị/ thông số Giai đoạn chiết xuất Thiết bị SM30-CEP Kích thước 0,5 - 1mm (qua rây 710) Ethanol 50o 70 ± 2ºC 15 ml /1 g/lần x lần Tỷ lệ DM/ DL  số lần chiết Thời gian chiết Cô cao Cô thu hồi dung môi Cô thủy 90 phút/ lần x lần 70 - 80 ºC 60 - 65 mmHg Bảng PL Thơng số qui trình bào chế cao khô Đu đủ rừng phương pháp phun sấy lô 1,2 kg STT Tên thông số Thông số Dịch phun sấy Cao đu đủ rừng (3:1) Tá dược phun sấy Aerosil Tỷ lệ tá dược/ chất rắn 30% Nhiệt độ đầu vào 130 ± 2ºC Tốc độ cấp dịch 30 ml / phút Tỷ lệ chất rắn dịch phun 14% Áp suất khí nén đầu phun Bar V SƠ ĐỒ CÁC GIAI ĐOẠN B ÀO CHẾ Bột ĐĐR EtOH 50º Đạt TCCS DM/DL = 15ml/1g Chiết siêu âm lần 70 C, 90 phút Gạn, lọc Bã ĐĐR DM/DL = 15ml/1g Chiết siêu âm lần 700 C, 90 phút Gạn, lọc Bã ĐĐR EtOH thu hồi Dịch chiết ĐĐR Dịch chiết ĐĐR Dịch chiết ĐĐR 1+2 Cô thu hồi dung Cao ĐĐR 3:1 Để lắng, gạn EtOH 96º Phần cắn Phần dịch lỏng Để lắng, gạn Phần cắn Phần dịch lỏng Cô thu hồi dung Cao ĐĐR 3:1 Kiểm nghiệm: - Hàm lượng SPN: 165 245 mg/g - Tỷ lệ chất rắn: 20 - 30% Hình PL1 Sơ đồ giai đoạn điều chế cao đu đủ rừng 3:1 Cao ĐĐR 3:1 - Thêm Aer, nước: tỷ lệ A er 30% so với chất rắn, tỷ lệ CR/ DP: 14%; - Khuấy đồng Dịch phun sấy Cấp dịch phun (30ml/phút) Phun sấy Nhiệt độ đầu vào 130 ± C Áp suất khí nén đầu phun Cao khô ĐĐR Kiểm nghiệm theo Đóng gói TCCS Hình PL Sơ đồ tóm tắt giai đoạn bào chế cao khô đu đủ rừng phương pháp phun sấy VI NỘI DUNG QUI TRÌNH 6.1 Quy trình bào chế cao chiết Đu đủ rừng 3:1 6.1.1 C huẩn bị nguyên liệu thiết bị - Chuẩn bị nguyên liệu: Lá đu đủ rừng sấy 40ºC đến có độ ẩm nhỏ 12% Nghiền nguyên liệu máy nghiền búa, rây qua rây 710 Sấy tiếp bột nguyên liệu 40ºC Bột dược liệu sau sấy đóng o o túi PE kín, lớp Bảo quản nguyên liệu điều kiện khô, mát (30 C ± C; độ ẩm ≤ 75%) đến sử dụng - Kiểm tra hệ thống chiết xuất: Hoạt động hệ thống chiết xuất phải kiểm tra đánh giá tình trạng hoạt động trước tiến hành Hệ thống chiết xuất, cô cao phải đảm bảo khơng cịn dư phẩm lần chiết trước Các van dẫn, van xả van an toàn phải hoạt động bình thường - Pha ethanol 500: Cân 25,5 kg ethanol 960 có độ cồn thực 940 (tương ứng với 31,9 lít), thêm nước vừa đủ 55,2 kg; trộn đều, thu 60 lít ethanol 50 6.1.2 Điều chế dịch chiết Chiết xuất ĐĐR phương pháp chiết siêu âm thiết bị SM30 với thơng số qui trình ghi bảng PL 2; bước sau: - Cân, đong nguyên liệu dung môi theo công thức theo mẻ chiết: 2,0 kg bột khơ ĐĐR, 60 lít ethanol 50º chia làm lần, lần 30 lít - Làm ẩm nguyên liệu với khoảng lít dung mơi, sau cho vào túi vải buộc kín, ủ ẩm 15 phút Cho dung mơi cịn lại vào bình chiết, đậy nắp kín - Bật công tắc nguồn thiết bị chiết siêu âm Trên hình hiển thị lựa chọn chế độ chiết nóng có tác động sóng siêu âm, cài đặt thơng số qui trình gồm nhiệt độ (70ºC), thời gian chiết (90 phút/ lần), mức công xuất chiết 100% Khi nhiệt độ đạt mức cài đặt cho ngun liệu túi vải vào dung mơi bình chiết, điều chỉnh để túi dược liệu phân bố thiết diện bình chiết Bật nút “Run” hình để bắt đầu trình chiết xuất - Khi hết thời gian chiết xuất cài đặt, máy tự động tắt chế độ siêu âm gia nhiệt Sau bật bơm để bơm dịch chiết từ bình chiết bình chứa Mở nắp bình chiết, lấy túi vải ra, ép kiệt bã để thu lấy phần dịch ép Gộp phần dịch chiết dịch ép thu dịch chiết thứ - Chiết xuất lần thứ hai: Phần bã sau chiết lần thứ tiếp tục cho vào bình chiết, cân dung mơi theo cơng thức cho vào bình chiết Cài đặt lại thông số chiết siêu âm tiến hành chiết xuất tương tự lần chiết thứ Khi hết thời gian chiết xuất cài đặt, bơm dịch chiết bình chứa, ép kiệt bã thu dịch chiết lần hai - Kết thúc chiết xuất: Rửa bình chiết với nước cách bấm nút “Water Supply”, nước bơm cấp vào bình chiết từ đường ống dẫn nước tinh khiết nối với máy, lượng nước bơm vào bình khoảng 15 lít bấm nút “Stop” để dừng cấp nước Dùng khăn vải mềm vệ sinh bình chiết Sau bấm nút “Auto cleaning” để bơm nước rửa từ bình ngồi thùng chứa Làm vệ sinh lặp lại hai lần Cuối cùng, bơm bình chiết Đạy nắp bình chiết Tắt máy cách bấm cơng tắc nguồn chế độ “Off” Bã dược liệu chuyển khu vực chiết - Lọc dịch chiết: Gộp dịch chiết từ hai lần chiết xuất Lọc dịch chiết qua vải thô thu lấy phần dịch 6.1.3 C ô cao loại tạp - Trộn dịch chiết mẻ chiết Chia dịch chiết thành mẻ cô cao, mẻ khoảng 30 lít Cơ thu hồi dung môi nhiệt độ 70 - 80 C đến 1/3 so với lượng dịch chiết ban đầu dừng Gộp dịch tiếp tục đến tỷ lệ cao khoảng 3:1 (ba phần dược liệu phần cao) - Loại tạp: Cao 3:1 để lắng 24 tách riêng phần dịch chiết phần cắn Phần cắn thêm ethanol 96º với tỷ lệ gấp bốn lần, đun nóng cách thủy khuấy Để nguội, sau 24 gạn lọc lấy phần dịch trong, bỏ phần tủa không tan Cô đặc dịch lọc đến tỷ lệ cao 3:1 (phần 2) Gộp hai phần cao trên, trộn đều, cô đặc điều chỉnh tỷ lệ cao 3:1 - Kết thúc cô cao, loại tạp: Vệ sinh nồi cô Ethanol thu hồi phận ngưng tụ xác định độ cồn đựng can riêng Ethanol thu hồi dùng để pha chế dung mơi cho mẻ chiết 6.1.4 Hồn thiện bảo quản cao 3:1 - Cao đu đủ rừng 3:1 từ mẻ chiết xuất, mẻ kg dược liệu gộp lại thành lô (tương ứng với kg dược liệu) - Bảo quản mẫu: Cao 3:1 đựng bình thủy tinh, nắp kín, để tủ bảo quản mẫu nhiệt độ khoảng 4°C 6.1.5 K iểm nghiệm bán thành phẩm Cao 3:1 cần kiểm tra hai tiêu tỷ lệ chất rắn hàm lượng saponin toàn phần Yêu cầu: Tỷ lệ chất rắn khoảng 20 – 30% hàm lượng saponin tồn phần tính khơng nhỏ 165 mg/g không 245 mg/g theo khô tuyệt đối a Xác định tỷ lệ chất rắn cao 3:1 Bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi thiết bị ADA M A MB310, 2g mẫu, 105 C 3h đến khối lượng không đổi Tỷ lệ chất rắn hiệu số 100% trừ hàm ẩm đọc máy b Xác định hàm lượng saponin toàn phần phương pháp UV-Vis + Chuẩn bị mẫu chuẩn: Dung dịch chuẩn gốc acid oleanolic có nồng độ khoảng 1000 µg/ml M eOH Từ dun g dịch chuẩn gốc, pha dãy dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ thay đổi từ 100 đến 300 µg/ml + Chuẩn bị mẫu thử: Cân khoảng 500 mg cao lỏng 3:1, cho vào bình định mức 50 ml, thêm 40ml MeOH, siêu âm nhiệt độ phòng 30 phút, để nguội, bổ sung MeOH vừa đủ đến vạch, lắc Hút xác 5ml cho vào bình định mức 20 ml, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45µm (Dịch A) Mẫu trắng: MeOH Làm phản ứng màu Rosenthaler: Hút xác 0,2ml dịch A dung dịch chuẩn mẫu trắng, cho vào ống nghiệm, thêm 0,2 ml dung dịch vanilin 5%/ acid acetic băng 1,2 ml acid percloric Đậy kín ống nghiệm ủ cách thủy 70o C±1oC 40 phút Ngâm ống nghiệm nước đá chuyển vào bình định mức 5ml, tráng ống nghiệm ethyl acetat bổ sung ethyl acetat vừa đủ 5ml, lắc Đo quang bước sóng 550nm Từ nồng độ độ hấp thụ quang chuẩn acid oleanolic, độ hấp thụ quang mẫu thử để tính hàm lượng saponin tồn phần cao 3:1 theo cơng thức sau: C × n × V × 100 Saponin (mg/g) = M × (100-h) × 1000 C- nồng độ saponin toàn phần cao ĐĐR tính theo acid oleanolic từ đường chuẩn xây dựng (µg/ml); V- Thể tích cao ĐĐR (ml), M- Khối lượng cao ĐĐR (g); n- Hệ số pha loãng; h- Độ ẩm cao ĐĐR (%) 6.2 Quy trình bào chế cao khô đu đủ rừng phương pháp phun sấy a Chuẩn bị: - Chuẩn bị mẫu dịch phun: Lấy cao 3:1 tủ bảo quản ra, đun nóng cách thủy nhiệt độ 50 - 60°C 30 phút để cao chảy lỏng, khuấy đến đồng để nguội nhiệt độ phòng Dựa tỷ lệ chất rắn xác định cho lô chiết để tính tốn lượng tá dược nước thêm vào theo tỷ lệ công thức Bảng PL Sau thêm tá dược nước vào cao 3:1, khuấy máy khuấy Ika 10 phút để thu dịch phun sấy đồng - Chuẩn bị thiết bị phun sấy: M áy phun sấy vệ sinh Đảm bảo khơng cịn dư phẩm lần phun trước Lắp thiết bị vào phần thân máy - Chuẩn bị bao bì đóng gói: Túi PE, giấy nhơm, bình thủy tinh nút mài b Tiến hành phun sấy : - Bật cầu giao điện, bật công tắc nguồn máy phun sấy Trên hình phần “Fan”, bật nút “ON” để khởi động quạt gió kiểm tra hệ thống để đảm bảo không bị hở đầu nối ống dẫn cửa buồng phun Khi đảm bảo chắn khơng có dự dị khí cài đặt thơng số nhiệt độ phun sấy (120 C) cách bật nút “ON” mục “Heating”, nhiệt độ đầu vào đạt ngưỡng cài đặt khởi động đầu phun cách bật nút “ON” mục “Spray gun”, điều chỉnh áp suất vòi phun Bar, sau 10 giây bật tiếp cấp dịch phun cách bật nút “ON” mục “Peristalsis pump”, điều chỉnh tốc độ cấp dịch thiết bị cấp dịch 10 vòng phút (tương ứng 30 ml/phút) Tiến hành phun sấy đến hết dịch phun tiếp tục phun sấy với 200 ml nước - Thu bột phun sấy: Bột phun sấy lấy bình đựng mẫu, sau khoảng thời gian cách khoảng 30 phút thu sản phẩm lần Sản phẩm đóng gói bình thủy tinh nút mài, nắp kín, bọc giấy nhơm màng cho chống ẩm - Kết thúc phun sấy: Khi phun sấy xong, tắt thiết bị theo thứ tự súng phun > cấp dịch > gia nhiệt cách bấm vào nút “OFF” mục điều khiển, lần cách – 10 giây Sau để quạt gió hoạt động để làm nguội buồng phun Khi nhiệt độ đầu giảm xuống khoảng 60 - 700 C tắt quạt gió để vệ sinh thiết bị - Vệ sinh thiết bị phun sấy: Tháo phận thiết bị khỏi phần thân máy, dùng máy bơm rửa nước buồng phun đến bột bám thành buồng phun, rửa ống dẫn, bình đựng mẫu để khơ tự nhiên VII PHƯƠNG PHÁP KIỂM SOÁT, KIỂM NGHIỆM Bảng PL Kiểm soát, kiểm nghiệm STT I 1.1 1.2 1.3 Giai đoạn bào chế Nội dung kiểm tra, kiểm soát Yêu cầu Giai đoạn chiết xuất Dược liệu Kiểm nghiệm nguyên liệu theo TCCS xây dựng Nghiền, rây nguyên liệu Rây số 710 Cân nguyên phụ liệu Theo công thức Chiết xuất máy chiết siêu âm 1.4 Cô đặc 1.5 Bào chế cao ĐĐR 3:1 II Giai đoạn phun sấy Đạt Đúng Nhiệt độ chiết 70 ± 20 C, thời gian chiết 90 phút/ lần, tỷ lệ dung môi/ Đúng dược liệu 15ml/1g/lần, chiết lần Nhiệt độ cô thu hồi dung môi 80 850 C; nhiệt độ cô cách thủy 85 - 900C Đúng Hàm lượng saponin: 165 - 245 mg/g Đạt Tỷ lệ chất rắn cao: 20 - 30% Đạt Pha chế dịch phun theo công thức: 2.1 Chuẩn bị dịch phun Aerosil tỷ lệ 30% so với chất rắn Đúng cao, tỷ lệ chất rắn/ dịch phun 14% Nhiệt độ phun sấy 130 ± 20C, tốc độ 2.2 Phun sấy cấp dịch 30 ml/phút, áp suất khí nén Đúng đầu phun Bar 2.3 Kiểm nghiệm cao khô ĐĐ R Theo TCCS 10 Đạt VIII DƯ PHẨM, PHẾ PHẨM Dược liệu, cao khô đu đủ rừng không đạt, rơi vãi, bẩn phải huỷ IX CÁC HỒ SƠ LÀM VIỆC CẦN THIẾT DĐVN V Sổ pha chế Nội qui phịng bào chế Qui trình vận hành thiết bị Tiêu chuẩn sở cao khô đu đủ rừng Các hồ s nội qui khác có liên quan 11