Sàng lọc chủng bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu đục quả đậu tương etiella zinckenella

Nguy Trung Hi L 13-01 Trƣớc tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ts Lê Thị Minh Thành – Phó giám đốc Trung tâm Giống Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình thực đồ án tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Ths Mẫn Hồng Phƣớc cán Trung tâm Giống Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam hết lịng giúp đỡ , tạo điều kiện để thực nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn thầy, cô khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội tận tình hƣớng dẫn bảo cho tơi suốt thời gian qua Xin cảm ơn gia đình, bạn bè ln động viên, chia sẻ khó khăn giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Viê Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 C LỜI MỞ ĐẦU .1 PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan vi khuẩn Bacillus thuringiensis .4 1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng củ i 1.1.2 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng Bt Việt Nam 1.2 Vị trí, đặc điểm hình thái sinh thái học B thuringiensis .8 1.2.1 Vị trí phân loại .8 1.2.2 Đặc điểm hình thái .9 1.2.3 Đặc điểm sinh hóa 1.2.4 Đặc điểm phân loại 10 1.3 Hệ gen vi khuẩn Bacillus thuringiensis 15 1.4 Đặc điểm gen mã hóa protein độc tố diệt trùng 15 1.5 Phân loại gen độc tố diệt côn trùng Bacillus thuringiensis 16 1.5.1 Độc tố Cry 16 1.5.2 Độc tố Cyt 19 1.5.3 Độc tố Vip 19 1.6 Cơ chế tác động protein tinh thể diệt côn trùng 19 1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình hình thành bào tử tính thể độ 21 Tổng quan đậu tƣơng sâu đục đậu tƣơng (Etiella zinckenella) 23 2.1.Tình hình sản xuất đậu tươ sâu đục đậu tương i 23 2.1.1.Tình hình sản xuất đậu tương giới 23 2.2 Tình hình sản xuất đậu tươ sâu đục đậu tương Việt Nam .24 2.2.1.Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam 24 2.2.2 Viê ậu tương Việt Nam 25 Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 2.2.Phân loại nhận dạng sâu đục 13-01 ương 25 2.2.1 Phân loại: 25 2.2.2 Nhận dạng (đặc điểm hình thái) 25 2.2.2.1 Nhận dạng bị sâu hại .25 2.2.2.2 Đặc điểm nhận dạng (đặc điể 26 ục 2.3 Tập tính quy luật phat sinh gây hại ký chủ 28 2.3.1 Tập tính quy luật phát sinh gây hại 28 2.3.2 Thời điểm phát sinh 29 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Thời gian, địa điểm đối tƣợng nghiên cứu 30 2.1.1 Thời gian địa điểm 30 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 30 2.2 Hóa chất trang thiết bị thí nghiệm 30 2.2.1 Hóa chất 30 2.2.2 Trang thiết bị thí nghiệm 30 2.2.3 Môi trường 31 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 32 2.3.1 Phương pháp xác định tổng số .32 2.3.2 Nhóm phương pháp nuôi cấy Bacillus thuringiensis 32 2.3.2.1 Phương pháp hoạt hoá .32 2.3.3.2 Phương pháp tăng sinh khối 32 2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 33 2.3.4 Phươ ết ADN plasmid từ vi khuẩn Bt .33 ủng Bt kỹ thuật PCR 34 2.3.6 Phương pháp điện di DNA gel agarose 36 2.3.7 Phương pháp phân loại typ huyết 37 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1.Kết hoạt hóa lên men chủng Bt t 3.2.Kết thử hoạt tính diệt sâu đục đậu tƣơ ƣ : .39 ủng Bacillus thuringiensis 44 Viê Khoa CNSH Nguy Trung Hi 3.3.Kết khảo s L 13-01 chủng B thuringiensis có hoạt tính diệt sâu đục đậu tƣơng cao 46 3.4.Phân loại d ủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệ ết 48 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 51 Viê Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 Hình 1.1: Mơ hình cấu trúc chung protein tinh thể độc tố Cry 17 Hình 1.2: Cơ chế tác động protein tinh thể độc lên côn trùng 20 Hình 1.3 Quả bị sâu Etiella zinckenella hại 26 Hình 1.4 Ngài trƣởng thành sâu Etiella zinckenella 27 Hình 1.5 Trứng sâu Etiella zinckenella 27 Hình 1.6: Sâu non Etiella zinckenella 28 Hình 3.1: Tăng sinh chủng Bacillus thuringiensis máy lắc ổn nhiệt 44 Hình 3.2: Một số chủng Bacillus thuringiensis sau 72 lên men 44 Hình 3.3: H Bt 45 ủ Hình 3.4 Thử hoạt tính diệ SP13.9 46 Hình 3.5: Kết điện di sản phẩm PCR gel agarrose 1% 47 ng tinh thể chủ 48 Hình 3.7: Sản phẩm ngƣng kết huyết chủng SP10.6 SP13 dƣới kính hiển vi quang học độ phóng đại 100 lần 49 Viê Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 Bảng 1.1 Sự phân loại Bacillus thuringiensis dựa vào kháng nguyên tiên mao H 11 Bảng 1.2 Đặc điểm số protein độc tố Cry 18 Bảng 2.1: Trình tự mồi khuếch đại số gen nhóm cry1 35 Bảng 3.1: Kết hoạt hóa tăng sinh khối chủng Bacillus thuringiensis nghiên cứu 39 Bả thử Viê Bt sau 72 45 Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT STT Viê Viết đầy đủ Viết tắt ADN Acid deoxyribonucleotide Bp Base pair Bt Bacillus thuringiensis dH2O Nƣớc khử ion dNTP deoxyribonucleotide 5’ – triphosphate LB PCR Polymeraza Chair reaction SDS Sodium đoecyl sulphat SOL Solution 10 TAE Tri- acid acetic EDTA Luria-Bertani Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 LỜI MỞ ĐẦU Đậu tƣơng nhóm trồng quan trọng hàng đầu giới Đây loại trồng có tác dụng việc luân xen canh, cải tạo đất hiệu Trong sản lƣợng đậu tƣơng giảm đáng kể 10 năm trở lại đây, từ mức xấp xỉ 0,3 triệu năm 2005 xuống dƣới 0,2 triệu năm 2014 nhu cầu đậu tƣơng nƣớc tăng đột biến, chủ yếu phục vụ sản xuất thức ăn chăn nuôi, khiến lƣợng đậu tƣơng nhập tăng cao (khoảng 1,2-1,5 triệu năm gần đây) Những số cho thấy thị trƣờng tiềm cho sản xuất đậu tƣơng nƣớc cịn cao Tuy nhiên hình thức sản xuất nhỏ lẻ, thiếu tập trung, khó giới hoá, tự động hoá nên giá thành đậu tƣơng nƣớc khó cạnh tranh với đậu tƣơng giới Năng suất đậu tƣơng trung bình Việt Nam cịn thấp, dao động khoảng 1415 tạ/ha, so với giới (Hoa kỳ ~24 tạ/ha) Các yếu tố ảnh hƣởng đến suất yếu bao gồm cỏ dại Năng suất giảm 37% cỏ dại, 11% loại mầm bệnh, 1% virus 11% sâu hại Mức giảm cỏ dại thay đổi không lớn khu vực (35-40%), nhiên mức thiệt hại mầm bệnh sâu hại cao, tƣơng ứng dao động 7-16% mầm bệnh 4-20% sâu hại khác biệt sâu hại vùng, miền (Oerke, 2006) Thiệt hại sâu bệnh chi phí bảo vệ thực vật hạn chế đáng kể suất khả cạnh tranh đậu tƣơng sản xuất nƣớc Việc phát triển giống đậu tƣơng có khả kháng sâu tốt góp phần tăng suất đậu tƣơng đồng thời giảm ảnh hƣởng việc sử dụng thuốc trừ sâu đến môi trƣờng sức khoẻ ngƣời Nhiều biện pháp khác thực nhằm hạn chế tần phá sâu bệnh Một biện pháp đƣợng sử dụng rộng rãi sử dụng thuốc trừ sâu hóa học Bên cạnh lợi ích thuốc trừ sâu hóa học đem lại nhƣ khả trừ sâu bệnh nhanh chóng phạm vi rộng lớn cịn bộc lộ hạn chế nhƣ: chúng tiêu diệt trùng có ích vi sinh vật Viê Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 ký sinh sâu bọ có hại, gây độc cho ngƣời, động vật, phá hủy cân sinh thái Xa sâu bệnh kháng lại ta sử dụng loại thuốc hóa học nhiều lần… Do biện pháp an toàn hiệu dùng thuốc trừ sâu sinh học, chúng có tác dụng tiêu diệt hiệu mầm bệnh, lại vừa thân thiện với ngƣời, mơi trƣờng sinh thái Trong vịng 100 năm qua, vi khuẩn Bacillus thuringiensis đối tƣợng đƣợc nghiên cứu nhiều số tác nhân vi sinh vật gây bệnh cho côn trùng Hiện nay, chế phẩm sinh học Bt diệt côn trùng chiếm tới 90% thị trƣờng thuốc trừ sâu sinh học Từ gen mã hoá protein tinh thể diệt sâu Bt đƣợc tách dòng đọc trình tự năm 1981 hàng loạt gen mã hóa protein độc tố Bt (cry, vip, cyt) đƣợc nghiên cứu Năm 1985, thuốc giới đƣợc chuyển gen cry vi khuẩn Bt để diệt sâu mở kỷ nguyên chọn tạo giống trồng biến đổi gen mang tính trạng mong muốn Hiện nay, độc tố Bt bao gồm khoảng 800 gen mã hoá, chúng đƣợc phân loại thành 80 họ Các loại độc tố Bt khác tính đặc hiệu loại côn trùng thuộc cánh vảy (Lepidoptera), hai cánh (Diptera), cánh cứng (Coleoptera), cánh ngửa (Homopera), tuyến trùng (Nematoda) Ở Việt Nam, thuốc trừ sâu sinh học Bt đƣợc quan tâm nghiên cứu ứng dụng từ năm 1973, lồi phụ B thuringiensis var kurstakivà B thuringiensis var thuringiensis ậ hành nghiên cứu đề tài: “ tiến chủng Bacillus thuringiensis địa có hoạt tính diệt sâu đục đậu tƣơng (Etiella Zinckennella)” kiếm chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệ tƣơng cao Tạo nguyên Viê ệ Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 Mục tiêu đề tài: - Sàng lọc chủng Bt địa có hoạt tính cao diệt sâu đục đậu tƣơng - Khảo sát gen mã hóa protein độc tố diệt sâu chủng chọn đƣợc N : ủ Hoạ Thử hoạ Khảo sát gen mã hóa protein độc tố diệt sâu chủng Bt ục đậ Bt ả đậu tƣơng Viê Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 81 SP23.10 Lào Cai 24,6.108 82 SP23.11 Lào Cai 54,7.108 83 SP23.13 Lào Cai 85,4.108 84 SP26.1 Lào Cai 34,8.108 85 SP3.1 Lào Cai 72,1.108 86 SP3.11 Lào Cai 41,3.108 87 SP3.15 Lào Cai 15,9.108 88 SP3.16 Lào Cai 25,6.108 89 SP3.17 Lào Cai 24,8.108 90 SP3.20 Lào Cai 29,5.108 91 SP3.21 Lào Cai 24,2.108 92 SP3.23 Lào Cai 19,5.108 93 SP3.25 Lào Cai 75,0.108 94 SP3.4 Lào Cai 17,9.108 95 SP3.9 Lào Cai 45,3.108 96 SP31.20 Lào Cai 83,4.108 97 SP4.1 Lào Cai 26,9.108 98 SP4.13 Lào Cai 35,2.108 99 SP4.2 Lào Cai 90,4.108 100 SP4.5 Lào Cai 23,2.108 101 SP4.6 Lào Cai 42,2.108 102 SP4.7 Lào Cai 96,3.108 103 SP4.8 Lào Cai 99,4.108 104 SP5.1 Lào Cai 39,5.108 105 SP5.7 Lào Cai 23,5.108 106 SP6.1 Lào Cai 25,7.108 107 SP6.2 Lào Cai 61,3.108 108 SP6.4 Lào Cai 34,3.108 109 SP6.5 Lào Cai 42,0.108 110 SP7.1 Lào Cai 34,5.108 Viê 42 Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 111 SP7.10 Lào Cai 72,6.108 112 SP7.11 Lào Cai 61,9.108 113 SP7.12 Lào Cai 24,5.108 114 SP7.15 Lào Cai 15,3.108 115 SP7.2 Lào Cai 25,7.108 116 SP7.3 Lào Cai 12,4.108 117 SP7.4 Lào Cai 53,4.108 118 SP7.6 Lào Cai 23,4.108 119 SP7.8 Lào Cai 23,7.108 120 SP7.9 Lào Cai 23,4.108 121 SP8.1 Lào Cai 26,5.108 122 SP8.3 Lào Cai 36,5.108 123 SP9.1 Lào Cai 7,8.108 124 SP6.3 Lào Cai 6,2.108 125 SP17.3 Lào Cai 35,7.108 126 SP15.7 Lào Cai 45,2.108 127 SP7.2 Lào Cai 3,4.108 128 SP4.1 Lào Cai 33,4.108 129 SP3.3 Lào Cai 25,4.108 130 SP15.3 Lào Cai 3,5.108 131 SP7.4 Lào Cai 4,4.108 132 SP6.4 Lào Cai 25,3.108 133 SP3.1 Lào Cai 4,3.108 134 SP12.1 Lào Cai 4,5.108 135 SP22.16 Lào Cai 15,9.108 136 N4 Lào Cai 26,8.108 Viê 43 Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 Hình 3.1: Tăng sinh chủng Bacillus thuringiensis máy lắc ổn nhiệt Hình 3.2: Một số chủng Bacillus thuringiensis sau 72 lên men Từ bảng 3.1 cho ta thấy, 136 chủng đƣợc nghiên cứu sinh trƣởng phát triển tốt, nồng độ tế bào ≥ 108 cfu/ml Đảm bảo cho thí nghiệm sau thử hoạt tính sinh học với sâu đục đậu tƣơng 3.2 Kết thử hoạt tính diệt sâu đục đậu tƣơng chủng Bacillus thuringiensis Viê 44 Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 136 chủng Bt Tiến hành thử hoạt tính diệt sâu hoạt hóa xác định mật độ tế bào 3.1 13-01 tiến hành phƣơng pháp đƣợc trình bày phần 2.3.3 Kết tỉ lệ sâu chết đƣợc tổng hợp lại bảng 3.2 3.3 Bả Bt sau 72 thử (% ) Số chủng có hoạt tính Tỉ lệ ( % ) - 20 52 38,2 21 - 40 40 29,4 41 - 60 37 27,2 61 - 70 3,72 71 - 80 0 81 – 90 ( SP13.9 86.4% ) 0,74 91 -100 ( SP10.6 93,7% ) 0,74 Tổng 136 100 Hình 3.3: H Bt Từ bảng 3.2 cho thấy sau 72 thử hoạt tính, chủng SP10.6 có hoạt tính diệt sâu cao 93,7%; sau chủng SP13.9 với tỉ lệ 86,4% 3.4) Các chủng lại cho tỉ lệ sâu chết ơn ( 0-20 có 52 chủng chiếm Viê 45 Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 38,2%; 21-40 có 40 chủng chiếm 29,4%; 41-60 có 37 chủng chiếm 27,2%; 61-70 có chủng chiếm 3,72% ) SP10.6 SP13.9 ủ Hình 3.4 Thử hoạt tính diệ SP13.9 Kết sàng lọc cho thấy, chủng SP13.9 SP10.6 chủng có tỉ lệ sâu chết cao Hai chủng đƣợc tiếp tục nghiên cứu, khảo sát gen độc tố protein diệt sâu có chúng 3.3 Kết khảo sát gen mã hóa protein chủng B thuringiensis có hoạt tính diệt sâu đục đậu tƣơng cao Các chủng Bt khác có hoạt tính diệt trùng khác có hoạt tính chống lại lồi thuộc cánh vảy; Nhóm Cry2 có độc tính với hai lồi cánh vảy hai cánh; Nhóm Cry3 có hoạt tính chống lại lồi thuộc cánh cứng; Nhóm Cry4 có hoạt tính với lồi thuộc hai cánh [41] E zinckenella khảo sát , sâu (Lepidoptera Cry1 chủng B cry1 thuringiensis SP10.6 13.9 có hoạt tính diệt sâu đục đậu tƣơng cao (trên 85%) Viê 46 Khoa CNSH Nguy Trung Hi L Tiến hành tách chiết ADN tổng số tách chiết đƣợc 13-01 chủng SP13.9 10.6 ADN dùng làm sợi khuôn để tiến hành phản ứng PCR với cry1( bảng 2.1 ) để phát nhóm cặp mồi gen cry1 theo phƣơn Tiến hành chạy phản ứng PCR với chu trình nhiệt nhƣ trình bày Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra phƣơng pháp điện di phầ gel agarose 1% (hình 3.5) M 1000 bp cry1B (830 bp) cry1Aa (724 pb) cry1Ac (487 bp) 500 bp cry1D (414 bp) cry1C (288 bp) cry1Ab (238 bp) 200 bp Hình 3.5: Kết điện di sản phẩm PCR gel agarrose 1% (M: Marker; 1: SP 13.9; 2: SP10.6) Kết hình 3.4 cho ta thấy chủng SP13.9 SP10.6 mang gen cry1Aa (724pb), cry1Ab (238pb), cry1Ac (487pb) Ngoài chủng SP 13.9 mang thêm gen cry1B (830pb), cry1C (288pb), cry1D (414pb) , gen cry1Ac Etiella zinckenella cry1Ab diệt đƣợc loài sâu cánh vẩy Maruca vitrata, Spodoptera exigua; gen cry1Ac, 1C diệt lồi Etiella zinckenella, Spodoptera exigua, Spodoptera litura, Omiodes indicata, Helicoverpa armigera, Helicoverpa zea, Pseudoplusia includens (Palma et al., 2012) Viê 47 Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 tƣơng 3.4 Phân loại diệt chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính huyết Bacillus thuringiensis có khả sinh tinh thể q trình hình thành bào tử Tinh thể có nhiều hình dạng khác tùy lồi Chính vậy, chúng tơi tiến hành tinh thể chủng SP10.6 SP 13.9 kính hiển vi quang học (hình 3.6) Tinh thể Tinh thể SP10.6 SP13.9 ng tinh thể chủ ) tinh thể hình cầu, Từ hình 3,5 cho thấy, chủng SP10.6 có chủng SP13.9 hình tháp Phân loại dƣới loài theo phƣơng pháp huyết Barjac Bomefoi chủng nghiên cứu Bacillus thuringiensis đƣợc chia làm nhiều dƣới loài khác nhau, đƣới loài mang đặc điểm riêng biệt Để phân loại dƣới loài đƣợc chủng SP10.6 SP13.9 thử với 55 typ huyết Kết cho thấy, chủng SP10.6 ngƣng kết với kháng nguyên H7 tƣơng ứng với dƣới loài B.thuringiensis subsp konkukian chủng SP13.9 Viê 48 Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 ngƣng kết với kháng nguyên H34 tƣơng ứng với dƣới lồi B thuringiensis subsp aizawai (hình 3.7) SP10.6 SP13.9 A B Hình 3.7: Sản phẩm ngƣng kết huyết chủng SP10.6 SP139 dƣới kính hiển vi quang học độ phóng đại 100 lần (A: Trƣớc nhỏ huyết thanh, B: Sau nhỏ huyết thanh) Nhƣ vậ Bt xác định đƣợc chủng SP10.6 SP13.9 có hoạt tính điệt sâu đục đậu tƣơng cao > 85% Trong chủng SP10.6 sinh tinh thể hình cầu thuộc dƣới loài Bacillus thuringiensis var kokukian mang gen mã hóa cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac Chủng SP13.9 sinh tinh thể hình tháp thuộc dƣới lồi Bacillus thuringiensis var aizawai mang gen mã hóa cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1C, cry1D Những kết đạt đƣợ tiền đề ốc trừ sâu sinh học Bt điệt sâu đục đậu tƣơng tạo trồng có khả kháng lại sâu đục đậu tƣơng lai Viê 49 Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN: 136 chủng Bacillus thuringiensis xác định đƣợc chủng có hoạt tính điệt sâu đục đậu tƣơng cao >85% , chủng SP10.6 có hoạt tính diệt sâu chủng SP13.9 86,4% SP10.6 Bacillus thuringiensis subsp konkukian, mang gen chủng SP13.9 gen cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac Bacillus thuringiensis subsp aizawai, mang cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1C, cry1D 4.2 KIẾN NGHỊ: chủng SP10.9 SP13.9 nhằm thuốc trừ sâu sinh học Bt đậ Viê nghiên cứu sản xuất tạo trồng kháng sâu đục 50 Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 */ TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đái Duy Ban 2006.Công nghệ gen NXB khoa học kỹ thuật Trang 153 Khuất Hữu Thanh 2003 Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen NXB Khoa học Kỹ thuật Trang 137-140, 206-210 Ngơ Đình Bính 2005 Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt 2002 Thu nhận huyết miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học 2000-2001 296-303 Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt 2002 Thu nhận huyết miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học 2000-2001:296-303 Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thƣởng, Phạm Minh Hƣơng, Vi Thị Đoan Chính 1995 Nghiên cứu bảo quản lâu dài chủng giống vi sinh vật Kỷ yếu NXB Khoa học kĩ thuật, trang 378-383 Nguyễn Quỳnh Châu, Ngơ Đình Bính, Nguyễn Tuấn, Nguyễn Thùy Châu, Đinh Duy Kháng 2003 Phân lập chủng Bacillus thuringiensis kurstaki Việt Nam Di truyền học ứng dụng, 3, 52-59 Nguyễn Xuân Cảnh,, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Thanh Hạnh, Nguyễn Quỳnh Châu, Ngơ Đình Bính 2004 Nghiên cứu đa dạng sinh học vi khuẩn Bacillus Thuringiensis Việt Nam Báo cáo khoa học, nghiên cứu Khoa học sống định hƣớng Nông lâm nghiệp miền núi, Thái Nguyên 2004 NXB KHKT 59-62 Phan Cự Nhân, Nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh Di truyền, tập NXB Đại học Sƣ phạm Trang 49-53 Viê 51 Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 */ TÀI LIỆU TIẾNG ANH 10 Barjac, D H & Frachon, E.1990 Classification of Bacillus thuringiensis strains Entomophaga 35, 233-240 11 Barjac, D H 1981 Indentification of H- serotypes of Bacillus thuringiensis 36-42 Burges H.D (edited) In microbial control of pests anđ plant Diseasis 1970- 1980 12 Bernhard, K., P Jarrett, M Meadows, J Butt, D J Ellis, G M Roberts, S Pauli, P Rodgers, and H D Burges 1997 Natural isolates of Bacillus thuringiensis: worldwide distribution, characterization, and activity against insect pests J Invertebr Pathol 70:59-68 13 Bietlot, H P., J P Schernthaner, R E Milne, F R Clairmont, R S Bhella, and H Kaplan 1993 Evidence that the CryIA crystal protein from Bacillus thuringiensis is associated with DNA J Biol Chem 268:82408245 14 Bravo, A 1997 Phylogenetic relationships of Bacillus thurigiensis δ- endotoxin family proteins anh their functional domains J Bacteriol., 179, 2793-2801 15 Burges, H D 2001 Bacillus thuringiensis in Pest Control Pesticide Outlook P 90- 98 16 Carlson, C R., and A.-B Kolstø 1993 A complete physical map of a Bacillus thuringiensis chromosome J Bacteriol 175:1053-1060 17 Chicott, C N., Wigley, P J 1993 Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crytal protein Proceedings of the 2nd Canberra Bacillus thuringiensis meeting P 43-52 18 Crickmore N, Wheeler VC, Ellar DJ 1994 Use of an operon fusion to induce expression and crystallization of a Bacillus thuringiensis δendotoxin encoded by a cryptic gene Mol Gen Genet 242: 365-368 19 Crickmore, N D R Zeigler, J Feitelson, E Schnepf, J Van Rie, D Lereclus, J Baum, and D H Dean 1998 Revision of the Viê 52 Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins Microbiol Mol Biol Rev 62:807-813 20 Dankocsik, C Donovan WP, Jany CS 1990 Activation of a cryptic protein gene of Bacillus thuringiensis subspecies kurrstaki by gene fusion and determination of the crystal protein insecticidal specificity Mol Microbiol 4: 2087- 2094 21 De Barjac, H.D., E Frachon 1990 Entomophaga, Vol.35 233240 22 Deacon, J The microbial world: Bacillus thuringiensis www.helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/Bacillus thuringiensis.htm 23 Donovan, WP, Dankocsik CC, Gilbert MP, Gawron- Burke MC, Groat RG, Carlton BC 1988 Amino acid sequence and entomocidal activity of the P2 crystal protein J Biol Chem 263: 561-567 24 Dwu, XL Cao, Y.Y Bai, AND AI Aronson 1991 Sequensing of an operon containing a novel δ- endotoxin gene from Bacillus thuringiensis FEMS microbial Lett.81-31-36 25 Ereclus D, Deléclese A and Lecadet M Diversity of bacillus thuringiensis toxin and genes In Bacillus thuringiensis an environmental pesticide Theory and Practice Dited by P.F Entwistle, J.S Cory, M J bailey and S Higgs 1993, 37-60 26 Eugene W Nester, linda S Thomashow, Matthew Metz and Milton Gordon (2002) 100 years of bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with wide spectrum of activities against lepidopteran insects”, Proc Natl Acad Sci USA 93, 5389-5394 27 Faiza Saleem and Abdul Rauf Shakoori 2010 Characterization of cry2A-type Gene(s) from Pakistani Isolates of Bacillus thuringiensis Toxic to Lepidopteran and Dipteran Insects Pakistan J Zool., vol 42(3), pp 181193 Viê 53 Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 28 Feitelson, J S 1993 The Bacillus thuringiensis family tree, p 6371 In L Kim (ed.), Advanced engineered pesticides Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y 29 Grochulski, P., L Masson, S Borisova, M Pusztai-Carey, J.-L Schwartz, R Brousseau, and M Cygler 1995 Bacillus thuringiensis CryIA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation J Mol Biol 254:447-464 30 Kalman, S., K L Kiehne, N Cooper, M S Reynoso, and T Yamamoto 1995 Enhanced production of insecticidal proteins in Bacillus thuringiensis strains carrying an additional crystal protein gene in their chromosomes Appl Environ Microbiol 61:3063-3068 31 Kronstad, J W., and H R Whiteley 1986 Three classes of homologous Bacillus thuringiensis crystal-protein genes Gene 43:29-40 32 Lee, M K., Walters, F S., Hart, H., Palekar, N., Chen, J.-S 2003 The Mode of Action of the Bacillus thuringiensis Vegetative Insecticidal Protein Vip3A Differs from That of Cry1Ab δ-Endotoxin Appl Environ Microbiol 69: 4648-4657 33 Lee, M K., Walters, F S., Hart, H., Palekar, N., Chen, J.-S Shotkoski, F 2003 Vip3A: A novel Insceticidal protein with broad spectrum lepidoteran activity 34 Lereclus, D., G Menou, and M.-M Lecadet 1983 Isolation of a DNA sequence related to several plasmids from Bacillus thuringiensis after a mating involving the Streptococcus faecalis plasmid pAM Mol Gen Genet.191:307-313 35 Li, J., J Carroll, and D J Ellar 1991 Crystal structure of insecticidal δ- endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 Å resolution Nature 353:815-821 36 M-M Lecadet, E Frachon, V Cosmao Dumanoir, H Ripouteaus, S Hamon, P Laurent and I Thiery 1999 Updating the HViê 54 Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 antigen classification of Bacillus thuringiensis The society for Applied Microbiology Journal of Applied Microbiology 660:672 37 Moar, W.J., Trumble,J.T., Hice, R.H and Backman, P.A 1994 Insecticidal activity of the CryIIA protein from NRD- 12 isolate of Bacillus thuringiensis subsp kurstaki expressed in Escherichia coli an Bacillus thuringiensis and in a leaf- colonizing strain of Bacillus cereus Applied and Environmental Microbiology 60, 896-902 38 Ohba, M., and Aizawa, K 1986 Distribution of Bacillus thuringiensis in soil of Japan J invertebr Pathol Vol.47, 12-20 39 Ruud A de Maagd, Alejandra Bravo, Neil Crickmore 2001 How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world TRENDS in Genetics, p 193-199, Vol 17, No 40 Shimizu, T., and K Morikawa 1996 The β-prism: a new folding motif Trends Biochem Sci 21:3-6 41 Takashi Yamamoto and Gary K Powell 1993 Bacillus thuringiensis Crystal Proteins: Recent Advances in Understanding Its Insecticidal Activity Advanced Engineered Pesticides Edited by Leo Kim Marcel Dekker, Inc., NY 3-42 42 Thiery and E Frachon 1997 Identification, isolation, culture and preservation entomopathogenic bacteria Biotechniques Manual of Technology in insect Pathology A academic press 55-57 43 Windner WR, Whiteley HR 1989 Effect of a 20-kilodalton protein from bacillus thuringiensis subsp israelensis on production of the CytA protein by Escherichia coli J Bacteriol 173: 1748-1756 44 Yamamoto T, McLaughlin RE 1981 Isolation of a protein from the parasporal crystal of Bacillus thuringiensis var kurstaki toxic to the mosquito larva, Aedes taeniorhynchus Biochem Biophys Res Commun 103: 414-421; Viê 55 Khoa CNSH Nguy Trung Hi L 13-01 45 Yamamoto T 1983 Indentification of entomocidal toxin of Bacillus thuringiensis by high-performance liquid chromatography ACS Symp Ser 432:46-60; 2595-2603 */ TÀI LIỆU WEBSITE: 46 http://www.impe-qn.org.vn/impe-qn/vn/portal 47 http://www.impehcm.org.vn/index 48 http://en.wikipedia.org/wiki/Muscidae 49 http://www.promege.com/vectors/ 50 http://www.ptomege.com pGEM- T Easy Vector Systems Technical Manual No 042 Instruction for use of products A1360, A1380, A3600 and A3610 51.http://text.123doc.org/document/2873778-sau-duc-qua-dau-tuongetiella-zinckenella.htm Viê 56 Khoa CNSH