Nghiên cứu xác định đặc tính của một số chủng vi khuẩn thủy phân agar phân lập tại việt nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN THỦY PHÂN AGAR PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Vũ Nguyên Thành Sinh viên thực : Nguyễn Thị Lệ Lớp : 17.01 Hà Nội - 2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Đề tài: Nghiên cứu xác định đặc tính số chủng vi khuẩn thủy phân Agar phân lập Việt Nam Người hướng dẫn: PGS.TS Vũ Nguyên Thành Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Lệ Lớp: 17.01 Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Vũ Nguyên Thành, Viện Công nghiệp Thực phẩm hướng dẫn khoa học, gợi mở cho ý tưởng nghiên cứu tạo điều kiện nhiều cho tơi hồn thành khóa luận suốt thời gian nghiên cứu Tiếp theo, xin gửi lời cảm ơn tới anh chị Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp hướng dẫn, giúp đỡ bảo suốt thời gian làm thí nghiệm Trung tâm Tơi xin gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè, người thân ln động viên để tơi có động lực học tập hồn thành khóa luận Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy, cô khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở Hà Nội dạy cho kiến thức kinh nghiệm quan trọng để hồn thànhtốt khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 29 tháng năm 2021 Sinh viên Nguyễn Thị Lệ Nguyễn Thị Lệ K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH BẢNG CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1 Agar 11 1.1.1 Cấu trúc agar 11 1.1.2 Nguồn gốc agar 11 1.1.3 Tính chất hóa lý 12 1.2 Agarase 14 1.2.1 Nguồn gốc agarase 14 1.2.2 α-agarase 16 1.2.3 β-agarase 17 1.3 Ứng dụng agarase 20 1.3.1 Trong công nghệ gen nhằm thu hồi DNA từ gel agarose 20 1.3.2 Tách chiết hợp chất sinh học từ tảo biển tạo tế bào trần từ tảo biển 20 1.3.3 Sản xuất oligosaccharide 21 1.4 Tình hình nghiên cứu nước 21 PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Vật liệu nghiên cứu 23 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23 Nguyễn Thị Lệ K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học 2.1.2 Hố chất, thiết bị, dụng cụ 24 2.1.3 Môi trường 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào 25 2.2.2 Xác định hoạt tính phân giải agar đĩa thạch 25 2.2.3 Nuôi cấy tách chiết enzyme 26 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính phân giải agar 26 2.2.5 Phương pháp điện di protein SDS-PAGE 27 2.2.6 Phương pháp điện di Zymogram 28 2.2.7 Phương pháp xác định hoạt tính bằng DNS 29 PHẦN 3: KẾT QUẢ 32 3.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào 32 3.1.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc 32 3.1.2 Quan sát hình thái tế bào 34 3.2 Đánh giá định tính khả phân giải agar 35 3.3 Nuôi thu enzyme phân giải agar 38 3.4 Đánh giá định tính hoạt tính enzyme phân giải agar 41 3.5 Đánh giá hệ protein hệ enzyme phân giải agar bằng phương pháp điện di 43 3.5.1 Đánh giá hệ protein bằng phương pháp điện di protein SDS-PAGE 43 3.5.2 Đánh giá hệ enzyme phân giải agar bằng phương pháp điện di Zymogram 44 3.6 Xác định hoạt tính enzyme phân giải agar bằng phương pháp DNS 45 Nguyễn Thị Lệ K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 Kết luận 48 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 52 Nguyễn Thị Lệ K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Các đặc tính enzyme α-agarase tái tổ hợp 17 Bảng Đặc tính số β-agarase tái tổ hợp 18 Bảng Danh sách cac chủng vi khuẩn sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 14 chủng đại diện nuôi thu enzyme 39 Nguyễn Thị Lệ K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học DANH MỤC HÌNH Hình 1 Cấu trúc agarose 11 Hình Các loại tảo đỏ sản xuất agar 12 Hình Sơ đờ vị trí phân cắt agarse 15 Hình Đờ thị đường chuẩn D-Galactose 30 Hình Hình thái khuẩn lạc chủng 33 Hình Hình tế bào chủng 34 Hình 3 Hình ảnh vịng thủy phân agar chủng nhuộm congored 36 Hình Sự phát triển sinh khối theo thời gian 14 chủng vi khuẩn 40 Hình Hình trước sau q trình ni thu enzyme 41 Hình Vịng phân giải thể khả thủy phân agar 0h, 24h, 48h nuôi 42 Hình Phổ điện di SDS-PAGE 14 chủng 43 Hình Phổ điện di SDS-PAGE 14 chủng 45 Hình Kết OD540 mẫu enzyme phản ứng với DNS sau ủ với chất 37ºC (chủng ARSS145-4), 40ºC (chủng ARSS192-1 ARSS2552)theo thời gian 46 Nguyễn Thị Lệ K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MSAY Minimal Salt Yeast Extract Agar SDS Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis DNS 3,5 Dinitrosalicylic acid PCR Polymerase Chain Reaction OD Optical Density APS Ammonium persulfate TEMED N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine U Unit Nguyễn Thị Lệ K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học MỞ ĐẦU Agar polysaccharide dị thể bao gờm agarose chiếm khoảng 70%, cịn lại agaropectin Agarose có cấu trúc mạch thẳng xếp xen kẽ hai phân tử β-D- galactose 3,6-anhydro-α-L-galactopyranose, liên kết với bằng liên kết β-1,4 tạo thành đơn vị neoagarobiose liên kết α-1,3 tạo thành đơn vị agarobiose Trong agaropectin hỡn hợp dị thể có cấu trúc mạch ngắn, thành phần phân tử tương tự agarose gắn thêm liên kết với gốc –OSO3-, –OCH3, glucuronate, pyruvate Agarose thủy phân thành agarooligosaccharides (AOS) neoagarooligosaccharides (NAOS) tác dụng enzyme agarase Enzyme ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực như: thủy phân agar tạo oligosaccharides có hoạt tính sinh học có số cơng dụng hữu ích cơng nghệ thực phẩm, y học, dược phẩm, mỹ phẩm; thu hồi DNA từ gel agarose; chuẩn bị tế bào trần từ tảo biển vật liệu hữu ích nghiên cứu sinh lý học tế bào học Agarase chia thành hai nhóm: α-agarase (E.C 3.2.1.158) phân cắt liên kết α-1,3 tạo thành agarooligosaccharide với đơn phân agarobiose, β-agarase (E.C 3.2.1.81) phân cắt liên kết β-1,4 tạo thành neoagarooligosaccharides với đơn phân neoagarobiose Cho tới agarase tìm thấy từ nhiều ng̀n khác bao gờm: nước biển, trầm tích biển, tảo biển, động vật thân mềm biển, nước đất Mặc dù agarase nhà khoa học giới quan tâm, nghiên cứu nước enzyme nhiều hạn chế Việc nghiên cứu đặc tính agarase nhằm đáp ứng yêu cầu ứng dụng chế biến agar mở rộng đầy hứa hẹn cho nhà khoa học giới Tuy nhiên, hướng nghiên cứu Việt Nam mẻ, chưa tập trung khai thác nghiên cứu Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu xác định đặc tính số chủng vi khuẩn thủy phân Agar phân lập Việt Nam” lựa chọn tiến hành Nguyễn Thị Lệ K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học 3.5 Đánh giá hệ protein hệ enzyme phân giải agar phƯƠNG pháp điện di 3.5.1 Đánh giá hệ protein bằng phương pháp điện di protein SDS-PAGE Sau khảo sát khả phân giải agar bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch, enzyme 14 chủng vi khuẩn tiếp tục phân tích bằng phương pháp điện di Enzyme xử lí với loading dye 100 ºC phút trước điện di Hệ protein ngoại bào phân tích bằng phương pháp điện di SDS-PAGE thể hình ảnh Hình Phổ điện di SDS-PAGE 14 chủng Chú thích: M-Marker protein (#26610, Thermo fisher scientific, USA) Từ hình ảnh phổ băng điện di SDS-PAGE 14 chủng vi khuẩn phân giải agar, thấy chủng vi khuẩn biểu hệ protein ngoại bào đa dạng Cụ thể, kích thước băng protein chủng trải rộng từ 18.4 Nguyễn Thị Lệ 43 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học kDa đến lớn 116.0 kDa Đặc biệt, chủng Paenibacillus sp6 nov ARSS 504 chủng Paenibacillus sp1 nov ARSS 163-3 biểu enzyme ngoại bào có kích thước lớn Bên cạnh đó, phổ băng phổ băng điện di chủng chủng Paenibacillus sp6 nov ARSS234-2 rõ nét chủng lại cho thấy chúng biểu hệ protein ngoại bào tốt Ngoài ra, chủng Paenibacillus sp2 nov ARSS148-1, Paenibacillus sp7 nov ARSS151-2, Paenibacillus sp4 nov ARSS157-3 có phổ băng protein tương đồng định tên khác nhau, tượng giải thích chủng có ng̀n gốc phân lập giống nên thích nghi với mơi trường sinh enzyme tương tự Phổ băng chủng lại không thực rõ ràng, nhiên chúng chứng minh sinh enzyme ngoại bào 3.5.2 Đánh giá hệ enzyme phân giải agar bằng phương pháp điện di Zymogram Ngoài việc đánh giá hệ protein 14 chủng vi khuẩn, enzyme phân giải agar chủng đánh giá dựa phương pháp điện di Zymogram Gel điện di bổ sung chất agar (Agar type I, Himedia, Ấn Độ), chủng sinh enzyme phân giải agar sẽ thể băng nhuộm gel điện di với congo red Kết điện di thể hình sau Nguyễn Thị Lệ 44 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Hình Phổ điện di Zymogram 14 chủng Dựa kết điện di Zymogram, dễ dàng nhận thấy enzyme sinh chủng phân giải chất agar có gel điện di Tuy nhiên, enzyme chủng hầu hết không thành băng rõ ràng mà tạo thành vệt gel sau nhuộm, ngoại trừ chủng Paenibacillus sp1 nov ARSS 163-3 Kết cho thấy kích thước enzyme phân giải agar lớn, ngoại trừ enzyme chủng ARSS192-1 Kết sở quan trọng cho thấy số protein ngoại bào 14 chủng vi khuẩn có loại enzyme phân giải agar 3.6 Xác định hoạt tính enzyme phân giải agar phƯƠng pháp DNS Sau phân tích hệ protein enzyme phân giải agar 14 chủng vi khuẩn phân giải agar, enzyme tiếp tục phân tích hoạt tính bằng phương Nguyễn Thị Lệ 45 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học pháp DNS Dựa sở nghiên cứu công bố, loại enzyme phân giải agar có khả cắt liên kết agar giải phóng đường đơn galactose phản ứng tạo màu với DNS, enzyme 14 chủng ủ với chất agar sau đem sản phẩm sau ủ phản ứng DNS nhằm định lượng hoạt tính enzyme Tuy nhiên, q trình thí nghiệm, thời gian phản ứng với chất kéo dài, nên việc định lượng hoạt tính enzyme khơng khả thi Trong khuôn khổ luận văn này, enzyme 14 chủng thử nghiệm phản ứng với DNS điều kiện ủ khác phân tích theo thời gian để tìm điều kiện thích hợp cho phản ứng DNS Kết phân tích DNS cho thấy, sau ủ từ 30 phút đến 180 phút, mẫu enzyme chủng khơng biểu hoạt tính biểu hoạt tính thấp (Phụ lục 4) 1,2 0,8 0,6 0,4 0,2 ARSS255-2 ARSS192-1 30m 60m ARSS145-4 ARSS145-4 180m Overnight ARSS192-1 ARSS255-2 Hình Kết OD540 mẫu enzyme phản ứng với DNS sau ủ với chất 37ºC (chủng ARSS145-4), 40ºC (chủng ARSS192-1 ARSS255-2) theo thời gian Nguyễn Thị Lệ 46 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Sau kéo dài thời gian ủ, số mẫu enzyme lại cho thấy giá trị OD540 sau phản ứng DNS cao, điển chủng Paenibacillus sp5 nov ARSS145-4 ủ 37ºC, chủng S rochei, S.enissocaesilis, S Plicatus ARSS192-1 chủng Paenibacillus sp nov ARSS255-2 ủ 40ºC Kết giải thích chất khơng phù hợp đặc tính enzyme kéo dài thời gian phản ứng Các giả thuyết cần tiếp tục nghiên cứu kiểm chứng bằng phương pháp khác tối ưu phản ứng DNS Nguyễn Thị Lệ 47 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết luận văn, rút kết luận sau: Đã xác định hình thái khuẩn lạc tế bào 29 chủng vi khuẩn có khả phân giải agar, 29 chủng chủ yếu thuộc nhóm gram âm có hình thái đa dạng: trực khuẩn cầu khuẩn chủ yếu Các chủng có khả phân giải agar dựa vịng phân giải tạo thành đĩa ni cấy từng chủng, khả phân giải agar chủng khác biệt Các chủng có vịng phân giải sớm Paenibacillus sp5 nov ARSS 145-4, Paenibacillus sp6 nov ARSS 50-4, S Rochei( S enissocaesilis, S plicatus) ARSS 192-1 sau ngày xuất vòng thủy phân Chủng xuất vòng thủy phân muộn sau 10 ngày Paenibacillus sp nov ARSS 255-2 Đã đánh giá sơ hệ enzyme phân giải agar bằng phương pháp điện di protein SDS-PAGE Chủng Paenibacillus sp6 nov ARSS 50-4 chủng Paenibacillus sp1 nov ARSS 163-3 biểu enzyme ngoại bào có kích thước lớn Phương pháp điện di Zymogram chủng hầu hết không thành băng rõ ràng mà tạo thành vệt gel sau nhuộm, ngoại trừ chủng Paenibacillus sp1 nov ARSS 163-3 Kết cho thấy kích thước enzyme phân giải agar lớn, ngoại trừ enzyme chủng ARSS192-1 Đã bước đầu định lượng hoạt tính enzyme phân giải agar bằng phương pháp DNS, nhiên cần tiếp tục hoàn thiện phương pháp Kiến nghị Nghiên cứu phương pháp phù hợp để định tính hoạt tính enzyme phân giải agar Tiếp tục nghiên cứu khả sinh enzyme chủng lại, so sánh với chủng nghiên cứu Nguyễn Thị Lệ 48 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Trọng Hải (2016) Thu nhận xác định đặc tính β-agarase sản xuất prebiotic, Luận văn (Thạc sỹ khoa học)-Ngành Công nghệ sinh họcTrường Đại học Bách Khoa Hà Nội Tài liệu tiếng anh Araki, T., Inoue, N., & Morishita, T (1998) Purification and characterization of β-1, 3-xylanase from a marine bacterium, Alcaligenes sp XY-234 The Journal of general and applied microbiology, 44(4), 269-274 Armisén R (1995), Worldwide use and importance of Gracilaria, J Appl Phycol, 7, pp 231-243 Armisen R., Galatas F (1987), Production, properties and uses of agar In “Production and utilization of products from commercial seaweeds”, FAO Fisheries Technical Paper, Food and Agriculture Organization of the United NationsRome, Italy, pp 1-57 Armisén R., Galatas F., Hispanagar S.A (2000), Agar In “Handbook of Hydrocolloids”, Phillips G.O., Williams P.A., & Eds.Cambridge, UK, Woodhead Publishing Ltd, pp 21–40 Bartosz K., Chorng L.P (2008), Separation and quantification of neoagaroand agaro-oligosaccharide products generated from agarose digestion by βagarase and HCl in liquid chromatography systems, Carbohyd Res, 343, pp 2443–2450 Chew, K W., Juan, J C., Phang, S M., Ling, T C., & Show, P L (2018) An overview on the development of conventional and alternative extractive methods for the purification of agarose from seaweed Separation Science and Technology, 53(3), 467- 480 Flament, D., Barbeyron, T., Jam, M., Potin, P., Czjzek, M., Kloareg, B., & Michel, G (2007) Alpha-agarases define a new family of glycoside Nguyễn Thị Lệ 49 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học hydrolases, distinct from beta-agarase families Appl Environ Microbiol., 73(14), 4691-4694 Hamer G.K., Bhattacharjee S S (1977), Analysis of the enzymic hydrolysis products of agarose by 13C-NMR spectroscopy, Carbohyd Res, 54, pp 7-10 10 Hatada, Y., Ohta, Y., & Horikoshi, K (2006) Hyperproduction and application of α-agarase to enzymatic enhancement of antioxidant activity of porphyran Journal of agricultural and food chemistry, 54(26), 9895-9900 11 Jingbao L., Feng H., Xinzhi L., Xiaoyan F., Cuiping M., Yan Ch., Wengong Y (2007), A simple method of preparing diverse neoagaro-oligosaccharides with βagarase, Carbohyd Res, 342, pp 1030-1033 12 Kang O L., Yong P F., Ma’aruf A G., Osman H., Nazaruddin R (2014), Physicochemical and antioxidant studies on oven-dried, freeze-dried and spraydried agaro-oligosaccharide powders, Int Food Res J, 21(6), pp 2363-2367 13 Kang, N Y., Choi, Y L., Cho, Y S., Kim, B K., Jeon, B S., Cha, J Y., & Lee, Y C (2003) Cloning, expression and characterization of a β-agarase gene from a marine bacterium, Pseudomonas sp SK38 Biotechnology letters, 25(14), 1165-1170 14 Kyung M., Lee D.G., Kim N.Y., Yu D., Jang H.J., Lee S.H., Jang H.J., Lee Y.J., Lee S.H (2009), Purification and characterization of neoagarotetraose from hydrolyzed agar, J Microbiol Biotech, 19(10), pp 1197–1200 15 Lakshmikanth, M., Manohar, S., & Lalitha, J (2009) Purification and characterization of β-agarase from agar-liquefying soil bacterium, Acinetobacter sp., AG LSL-1 Process Biochemistry, 44(9), 999-1003 16 Lee CH, Lee CR, Hong SK (2019) Biochemical characterization of a novel cold- adapted agarotetraose-producing α-agarase, AgaWS5, from Catenovulum sediminis WS1-A Appl Microbiol Biotechnol 103(20):8403–8411 17 Liu, J., Liu, Z., Jiang, C., & Mao, X (2019) Biochemical Characterization and Substrate Degradation Mode of a Novel α-Agarase from Catenovulum agarivorans Journal of agricultural and food chemistry, 67(37), 10373-10379 Nguyễn Thị Lệ 50 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học 18 MaC.,LuX.,ShiC.,LiJ.,GuY.,MaY.,ChuY.,HanF.,GongQ.,YuW (2007), Molecular cloning and characterization of a novel beta-agarase, AgaB, from marine Pseudoalteromonas sp CY24, J Biol Chem, 282, pp 3747–3754 19 Tatsuji E., Shinji O., Yoko K., Fuyuko T., Hiroaki S., Kato I (2010), Oligosaccharides from agar inhibit pro-inflammatory mediator release by inducing heme oxygenase 1, Biosci Biotechnol Biochem, 74(4), pp 766-770 20 Temuujin, U., Chi, W J., Chang, Y K., & Hong, S K (2012) Identification and biochemical characterization of Sco3487 from Streptomyces coelicolor A3 (2), an exo- and endo-type β-agarase-producing neoagarobiose Journal of bacteriology, 194(1), 142-149 21 Veerakumar, S., & Manian, R P (2018) Recombinant β-agarases: insights into molecular, biochemical, and physiochemical characteristics Biotech, 8(10), 445 22 Wang L., Liu L., Wang Y.M., Yuan Q.Y., Li Fan., Xu Z.H (2001), Comparative research on the structures and physical-chemical properties of agars from several agarophyta, Ocean Etlimno Sinica, 36, pp 658-664 23 Xu, X Q., Su, B M., Xie, J S., Li, R K., Yang, J., Lin, J., & Ye, X Y (2018) Preparation of bioactive neoagaroligosaccharides through hydrolysis of Gracilaria lemaneiformis agar: A comparative study Food chemistry, 240, 330337 24 Zhang, W., Xu, J., Liu, D., Liu, H., Lu, X., & Yu, W (2018) Characterization of an α-agarase from Thalassomonas sp LD5 and its hydrolysate Applied microbiology and biotechnology, 102(5), 2203-2212 25 (http://www.cazy.org/fam/acc_GH.html) Nguyễn Thị Lệ 51 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học PHỤ LỤC Phụ lục 1: Ảnh khuẩn lạc, tế bào định tính đĩa thạch chủng sử dụng nghiên cứu STT Tên chủng ARSS 75-1 ARSS 148-1 ARSS 160-1 ARSS 163-7 Ảnh khuẩn lạc Ảnh tế bào Ảnh định tính đĩa thạch ARSS 166-2 Nguyễn Thị Lệ 52 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội STT Tên chủng ARSS 169-2 ARSS 145-4 ARSS 184-7 ARSS 157-3 10 ARSS 192-2 11 ARSS 243-2 Nguyễn Thị Lệ Khoa Công nghệ Sinh học Ảnh khuẩn lạc Ảnh tế bào 53 Ảnh định tính đĩa thạch K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội STT Tên chủng 12 ARSS 51-1 13 ARSS 56-2 14 ARSS 68-1 15 ARSS 9-3 16 ARSS 160-2 17 ARSS 174-4 Nguyễn Thị Lệ Khoa Công nghệ Sinh học Ảnh khuẩn lạc Ảnh tế bào 54 Ảnh định tính đĩa thạch K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội STT Tên chủng 18 ARSS 178-1 19 ARSS 184-3 20 ARSS 192-5 21 ARSS 247-1 Khoa Công nghệ Sinh học Ảnh khuẩn lạc Ảnh tế bào Ảnh định tính đĩa thạch Phụ lục Kết đo OD600 theo thời gian khảo sát thời gian nuôi thu enzyme Tên mẫu Mẫu đối chứng ARSS 50-4 ARSS 75-1 ARSS 115-1 ARSS 145-4 ARSS 148-1 ARSS 151-2 ARSS 157-3 ARSS 163-3 ARSS 166-2 Nguyễn Thị Lệ 0h 0.057 0.13 0.061 0.053 0.056 0.064 0.068 0.069 0.08 0.059 24h 0.071 0.552 0.542 0.703 0.784 0.862 0.897 0.812 0.611 0.915 Thời gian nuôi 48h 0.074 0.664 0.437 0.674 0.968 0.989 0.883 0.867 0.939 0.976 55 72h 0.077 0.652 0.329 0.606 0.882 0.96 0.944 0.896 0.918 1.012 96h 0.081 0.497 0.316 0.581 0.857 0.905 0.957 0.866 0.856 0.943 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Tên mẫu ARSS 184-5 ARSS 192-1 ARSS 192-2 ARSS 234-2 ARSS 255-2 0h 0.06 0.055 0.066 0.07 0.063 Khoa Công nghệ Sinh học 24h 0.903 0.311 0.138 0.281 1.189 Thời gian nuôi 48h 0.916 0.456 0.262 0.319 0.979 72h 0.926 0.561 0.319 0.268 0.951 96h 0.871 0.371 0.391 0.246 0.952 Phụ lục Kết đo OD nuôi thu enzyme Tên mẫu Mẫu đối chứng ARSS 50-4 ARSS 75-1 ARSS 115-1 ARSS 145-4 ARSS 148-1 ARSS 151-2 ARSS 157-3 ARSS 163-3 ARSS 166-2 ARSS 184-5 ARSS 192-1 ARSS 192-2 ARSS 234-2 ARSS 255-2 Thời gian nuôi 0h 0.041 0.04 0.04 0.043 0.041 0.042 0.041 0.044 0.051 0.05 0.055 0.051 0.048 0.044 0.045 24h 0.061 0.486 0.659 0.701 0.214 0.673 0.652 0.658 0.425 1.029 0.746 1.047 0.183 0.502 0.763 48h 0.064 0.524 0.608 0.796 0.9 0.98 0.882 0.878 0.515 0.95 0.937 1.053 0.115 0.607 0.97 Phụ lục Kết đo OD540 phân tích DNS Tên mẫu Thời gian ủ 60m 180m 30m Qua đêm 37ºC Đối chứng chất ARSS50-4 ARSS75-1 ARSS115-1 ARSS145-4 ARSS148-1 ARSS151-2 ARSS157-3 Nguyễn Thị Lệ 0,078 0,078 0,06 0,088 0,088 0,082 0,096 0,067 0,07 0,088 0,067 0,058 0,073 0,058 0,065 0,059 56 0,062 0,061 0,058 0,064 0,062 0,062 0,059 0,062 0,061 0,067 0,063 0,072 1,115 0,073 0,062 0,077 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Tên mẫu ARSS163-3 ARSS166-2 ARSS184-5 ARSS192-1 ARSS192-2 ARSS234-2 ARSS255-2 Khoa Công nghệ Sinh học Thời gian ủ 60m 180m 0,06 0,078 0,065 0,059 0,055 0,057 0,056 0,056 0,059 0,055 0,057 0,057 0,06 0,061 30m 0,076 0,07 0,067 0,079 0,066 0,068 0,073 Qua đêm 0,063 1,114 0,065 0,087 0,083 0,084 40ºC Đối chứng chất ARSS50-4 ARSS75-1 ARSS115-1 ARSS145-4 ARSS148-1 ARSS151-2 ARSS157-3 ARSS163-3 ARSS166-2 ARSS184-5 ARSS192-1 ARSS192-2 ARSS234-2 ARSS255-2 0,06 0,061 0,056 0,07 0,056 0,06 0,051 0,07 0,071 0,055 0,058 0,059 0,052 0,063 0,059 0,068 0,06 0,039 0,062 0,065 0,052 0,056 0,06 0,057 0,059 0,077 0,06 0,06 0,06 0,054 0,056 0,061 0,057 0,069 0,065 0,067 0,062 0,059 0,081 0,064 0,06 0,083 0,081 0,056 0,092 0,068 0,098 0,055 0,076 0,067 0,063 0,07 0,077 0,062 1,154 0,066 1,126 0,076 0,085 0,061 0,055 0,061 0,065 0,074 0,069 0,061 0,06 0,06 0,058 0,078 0,071 0,064 0,056 0,067 0,069 0,056 0,059 0,087 0,071 0,058 0,067 0,079 0,129 0,197 0,064 0,085 0,062 0,071 0,067 0,076 0,061 0,071 0,066 0,055 0,056 0,062 0,056 1,108 0,06 0,073 0,07 1,11 45ºC Đối chứng chất ARSS50-4 ARSS75-1 ARSS115-1 ARSS145-4 ARSS148-1 ARSS151-2 ARSS157-3 ARSS163-3 ARSS166-2 ARSS184-5 ARSS192-1 ARSS192-2 ARSS234-2 ARSS255-2 Nguyễn Thị Lệ 0,067 0,058 0,052 0,058 0,067 0,058 0,059 0,058 0,057 0,056 0,057 0,059 0,067 0,061 0,064 57 0,069 K24-CNSH