Nghiên cứu xác định đặc tính enzyme thủy phân lignocellulose của một số chủng vi nấm chịu axit mạnh phân lập tại việt nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH ENZYME THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI NẤM CHỊU AXIT MẠNH PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Vũ Nguyên Thành Sinh viên thực : Nguyễn Thị Hòa Lớp : 17.01 Hà Nội - 2021 Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Vũ Nguyên Thành tận tình hướng dẫn em trình thực tập việc hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn anh chị Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm giúp đỡ, bảo em nhiệt tình suốt q trình hồn thành luận văn Em xin gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè, người thân ln động viên để em có động lực học tập hồn thành khóa luận Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy, cô khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở Hà Nội dạy cho em kiến thức kinh nghiệm quan trọng để hồn thành tốt khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 29 tháng năm 2021 Sinh viên Nguyễn Thị Hòa Nguyễn Thị Hòa K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 1.1 Vi nấm chịu axit khả sinh enzyme vi nấm chịu axit 1.1.1 Đặc điểm nhóm vi nấm chịu axit 10 1.1.2 Khả sinh enzyme vi nấm chịu axit mạnh .13 1.2 Lignocellulose enzyme phân hủy lignocellulose .16 1.2.1 Cellulose enzyme thủy phân cellulose .17 1.2.2 Hemicellulose enzyme thủy phân hemicellulose .19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.2 Hóa chất thiết bị .21 2.2.1 Hóa chất 21 2.2.2 Thiết bị dụng cụ .22 2.3 Môi trường nghiên cứu 22 2.3.1 Môi trường PDA 22 2.3.2 Môi trường pH thấp (pH 1.0) 23 2.3.3 Môi trường nuôi tách chiết enzyme chủng mốc pH thấp 23 2.4 Phương pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào .23 2.4.2 Phương pháp điện di protein SDS-PAGE .24 2.4.3 Phương pháp điện di Zymogram 25 2.4.4 Nuôi cấy tách chiết enzyme 26 2.4.5 Phương pháp xác định hoạt tính phân giải cellulose 26 2.4.6 Xác định hoạt độ enzyme phương pháp DNS 27 2.4.7 Xác định hoạt tính enzyme pH khác 28 2.4.8 Đánh giá độ bền nhiệt enzyme .33 2.4.9 Phương pháp xác định protein (Lowry) 33 3.1 Quan sát chụp ảnh hình thái khuẩn lạc, tế bào 35 3.2 Đặc tính enzyme chủng vi nấm 38 Nguyễn Thị Hòa K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học 3.2.1 Phân tích hàm lượng protein chủng vi nấm .38 3.2.2 Đánh giá khả sinh tổng hợp enzyme chủng vi nấm 39 3.2.3 Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme phân giải lignocellulose chủng vi nấm 41 3.2.4 Phân tích hệ protein hệ enzyme thủy phân lignocellulose .45 3.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực enzyme thủy phân lignocellulose chủng vi nấm 47 3.3.1 Kiểm tra khả hoạt động enzyme pH khác 48 3.3.2 Kiểm tra khả bền nhiệt enzyme phương pháp DNS .50 3.3.3 Kiểm tra khả bền nhiệt enzyme phương pháp điện di 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 61 Nguyễn Thị Hòa K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số chủng vi nấm chịu axit mạnh công bố 12 Bảng 1.2 Khả sinh enzyme số chủng vi nấm chịu axit 13 Bảng 1.3 Tổng quan ứng dụng enzym nấm ưa axit ngành công nghiệp khác .15 Bảng 1.4 Bảng phân loại hệ enzyme cellulase .18 Bảng 3.1 Danh sách 17 chủng vi nấm chịu axit .35 Bảng 3.2 Kích thước vịng phân giải chất CMC, tinh bột, skim milk .41 Bảng 3.3 Hoạt tính Xylanase chủng vi nấm 42 Bảng 3.4 Hoạt tính CMCase chủng vi nấm .44 Nguyễn Thị Hòa K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các mơi trường có tính axit 10 Hình 1.2 Cấu trúc lignocellulose .16 Hình 1.3 Cấu trúc phân tử cellulose 17 Hình 1.4 Cơ chế phản ứng cellulase 19 Hình 1.5 Cấu trúc phân tử hemicellulose 20 Hình 1.6 Cơ chế phản ứng hemicellulose 20 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào môi trường PDA (trái) môi trường Malt 2Bx pH 1.0 (phải) số chủng vi nấm, chèn 10 µm 37 Hình 3.2 Vòng phân giải chất CMC, tinh bột, skim milk 40 Hình 3.3 Hoạt tính Xylanase chủng vi nấm chịu axit 43 Hình 3.4 Hoạt tính CMCase chủng vi nấm chịu axit 44 Hình 3.5 Gel điện di SDS-PAGE Zymogram dịch enzyme chủng vi nấm 46 Hình 3.6 Gel điện di SDS-PAGE Zymogram khảo sát độ bền nhiệt enzyme 54 Hình 3.7 Vòng phân giải chất CMC khảo sát độ bền nhiệt 56 Nguyễn Thị Hòa K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CMC : Cacboxymethyl cellulose DNS : Dinitrosalicylic acid SDS- PAGE : Sodium dodecyl sulphat polyacrylamide gel electrophoresis Nguyễn Thị Hòa K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học MỞ ĐẦU Vi nấm phát triển môi trường khắc nghiệt quan tâm đặc biệt mặt cơng nghệ cung cấp nguồn enzyme với đặc tính khác biệt, đáp ứng yêu cầu công nghệ đặc thù Enzyme hoạt động điều kiện khắc nghiệt nhiệt độ, pH ứng dụng sản xuất nhằm hạn chế nguy tạp nhiễm Là nước nông nghiệp, hàng năm công nghiệp chế biến Việt Nam tạo nguồn phế phụ phẩm lớn không sử dụng hợp lý dẫn tới vấn đề ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, phần lớn nguồn nguyên liệu ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi công nghệ vi sinh, enzyme Nghiên cứu đề cập tới enzyme sinh từ vi nấm có khả phát triển điều kiện môi trường axit mạnh (1% H 2SO4) nhằm tìm kiếm enzyme có khả hoạt động pH thấp vốn thường gặp trình xử lý nguyên liệu axit Ngoài ra, enzyme hoạt động pH thấp ứng dụng chăn nuôi khả chống chịu điều kiện axit dịch dày động vật Nhằm mục đích nghiên cứu xác định đặc tính hệ enzyme thủy phân lignocellulose tổng hợp từ chủng vi nấm chịu axit mạnh tự nhiên, nên tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu xác định đặc tính enzyme thủy phân lignocellulose số chủng vi nấm chịu axit mạnh phân lập Việt Nam” Đề tài nghiên cứu bao gồm mục tiêu sau: - Chọn chủng vi nấm chịu axit mạnh có khả sinh enzyme thủy phân lignocellulose - Xác định hoạt tính enzyme thủy phân lignocellulose - Xác định hoạt tính enzyme điều kiện pH, nhiệt độ khác Nguyễn Thị Hòa K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi nấm chịu axit khả sinh enzyme vi nấm chịu axit Các sinh vật nhân chuẩn có khả thích nghi cao, có mặt nhiều dạng môi trường khắc nghiệt khác môi trường axit ngoại lệ Môi trường axit mạnh thường kèm với với thái cực khắc nghiệt khác mức dinh dưỡng thấp, nồng độ kim loại độc hại cao / nhiệt độ khắc nghiệt Môi trường axit có hai nguồn gốc chính, liên quan tới hoạt động núi lửa liên quan đến việc khai thác than kim loại [1] Trong trường hợp đầu tiên, q trình oxy hóa sinh học nguyên tố lưu huỳnh từ hoạt động núi lửa tạo axit sulfuric vi sinh vật [14] (Hình 1.1a, b) Trong trường hợp thứ hai, hoạt động khai thác than khai thác kim loại làm cho khoáng chất chứa lưu huỳnh, kết hợp nước oxy, tạo điều kiện cho công vi sinh vật [15] Những địa điểm có chứa khống chất pyrit quan tâm đặc biệt bối cảnh (Hình 1.1 c, d) Ở mơi trường pH thấp, chất oxy hóa khống chất sắt FeS2 + Fe3+ → Fe2+ + S2O32 + H+ Fe2+ + 0,25 O2 + H3O+ → Fe3+ + 1,5 H2O Cả hai môi trường sống khác nhiều đặc điểm hóa lý hệ sinh thái vi sinh vật chúng Các sinh vật ưa axit, đặc biệt Acidithiobacillus ferrooxidans Leptospirillum spp., đẩy nhanh tốc độ oxi hóa pyrit đồng thời pH thấp tạo điều kiện cho kim loại hịa tan, nước có tính axit có xu hướng có nồng độ kim loại nặng cao Bất chấp điều kiện môi trường khắc nghiệt này, hầu hết môi trường axit cho thấy mức độ đa dạng sinh vật nhân chuẩn cao không ngờ, chẳng hạn Chlamydomonas, Chlorella Dunaliella thường tìm thấy axit mơi trường, sinh vật nguyên sinh quang hợp Euglena mutabilis [2][3] Nguyễn Thị Hòa K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Hình 1.1 Các môi trường có tính axit (a)Khu vực địa nhiệt có tính axit Seltun, SW Iceland, (b)Lưu huỳnh nguyên tố hình thành từ khí từ núi lửa Soufriere Hills Montserrat, Tây Ấn, (c)Ruộng bậc thang hình thành kết tủa sắt Río Tinto, Tây Ban Nha, (d)Río Tinto, Tây Ban Nha 1.1.1 Đặc điểm nhóm vi nấm chịu axit Dựa vào đặc tính thích nghi chủng nấm môi trường sống khác mà nhà khoa học chọn lọc đưa tên gọi tương ứng với nhóm, nấm chịu axit nấm ưa axit Khơng có phân chia rõ ràng nhóm ưa axit nhóm chịu axit, người ta thường cho nấm ưa axit loại nấm phát triển pH tăng trưởng tối ưu pH (hoặc thấp hơn) cịn lồi chịu axit lồi phát triển mơi trường axit tối ưu pH trở lên [4] Hầu hết loại nấm sống mơi trường có axit nên coi chịu axit ưa axit nghiêm ngặt chúng phát triển pH trung tính chí kiềm [5] Nhìn chung vi nấm tồn dải pH rộng (pH từ 1.0-11.0) tìm thấy mơi trường axit suối núi lửa, dòng thải mỏ axit nước thải cơng nghiệp có tính axit [5] Nhiều lồi số chúng chủ yếu chịu axit, loài thực ưa axit tìm thấy Từ dòng suối chứa nước thải mỏ axit, 189 loài nấm bao gồm nấm men nấm sợi phân lập [6] Hai nhóm nấm Dothideomycetes Eurotiomycetes phân lập từ nước thải mỏ axit có nồng độ pH 0,8 nồng độ kim loại cao từ núi Richmond Iron, California [7] Sự diện Nguyễn Thị Hòa 10 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học  Xylanase Kết phân tích hoạt tính enzyme Xylanase pH 1,3,5, thể đồ thị Khảo sát khả hoạt động Xylanase pH khác Talaromyces verruculosus ASM 137-1 Talaromyces verruculosus AAS 356 Talaromyces sp1 AS 19 Sarocladium sp ASS 30 Sarocladium sp ASS 125-1 Penicillium sp ASM 141-1 Penicillium sp ASM 139-1 Penicillium sp AS 31 Penicillium indicum AS 318-1 Penicillium gerundense ASM 159-1 Penicillium citrinum ASM 138-3 Penicillium citreonigrum ASS 89-1 Penicillium citreonigrum ASS 102-1 Aspergillus unguis ASM 140 Aspergillus fumigatus ASS 69-1 Aspergillus fumigatus ASM 158 Aspergillus fumigatus ASM 138-1 0.00 pH~1 pH~3 200.00 pH~5 400.00 600.00 800.00 1000.00 1200.00 1400.00 Hoạt tính Xylanase (U/ml) Phần lớn enzyme chủng vi nấm tối ưu pH 3, pH hoạt tính cao giảm nhiều pH Một vài chủng pH có hoạt lực yếu (nhóm chủng Talaromyces verruculosus, Sarocladium sp., Aspergillus fumigatus), chí hoạt tính chủng Penicillium citrinum ASM 138-3 Aspergillus unguis ASM 140 Theo nghiên cứu công bố từ năm 2005 Kimiyasu Isobe, nhóm tác giả tiến hành phân lập 100 loại vi nấm từ mẫu mơi trường có pH 1.0 2.5 42–45 °C, tiến hành nghiên cứu khả sinh enzyme catalase Trong chủng phân lập được, bốn chủng xác định Aspergillus niger tạo catalase (EC 1.11.1.6) với hoạt tính cao pH 3.0 ổn định pH 2.0 Nghiên cứu Jianmin Gao cộng công bố năm Nguyễn Thị Hòa 49 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học 2008 enzyme cellulase sinh từ chủng vi nấm ưa axit ưa nhiệt Aspergillus terreus M11 hoạt động tối ưu pH 2-3 bền khoảng pH 2-5 Những nghiên cứu cho thấy enzyme có hoạt tính cao ổn định độ pH cực thấp, chí bền với nhiệt thu từ chủng nấm có khả phát triển môi trường axit nhiệt độ cao Dựa nghiên cứu trước nhóm tác giả, chúng tơi tiến hành khảo sát hoạt tính enzyme CMCase xylanase tạo từ chủng vi nấm ưa axit phân lập pH khác (pH 1,3,5) cho thấy enzyme có hoạt tính cao ổn định pH 3.3.2 Kiểm tra khả bền nhiệt enzyme phương pháp DNS Để đáp ứng điều kiện trình sản xuất thức ăn chăn nuôi, enzyme sinh từ chủng vi nấm kì vọng có khả hoạt động pH thấp mà phải giữ hoạt tính nhiệt độ cao Vì chúng tơi tiến hành kiểm tra khả bền nhiệt enzyme CMCase xylanase sinh tổng hợp từ chủng vi nấm sau ủ 70ºC 90ºC 20 phút với phương pháp trình bày Nguyễn Thị Hòa 50 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học  Xylanase Đồ thị thể kết khảo sát độ bền nhiệt chủng 70ºC 90ºC 20 phút Khảo sát độ bền nhiệt Xylanase Talaromyces verruculosus ASM 137-1 Talaromyces verruculosus AAS 356 Talaromyces sp1 AS 19 Sarocladium sp ASS 30 Sarocladium sp ASS 125-1 Penicillium sp ASM 141-1 Penicillium sp ASM 139-1 Penicillium sp AS 31 Penicillium indicum AS 318-1 Penicillium gerundense ASM 159-1 Penicillium citrinum ASM 138-3 Penicillium citreonigrum ASS 89-1 Penicillium citreonigrum ASS 102-1 Aspergillus unguis ASM 140 Aspergillus fumigatus ASS 69-1 Aspergillus fumigatus ASM 158 Aspergillus fumigatus ASM 138-1 0.00 200.00 400.00 600.00 800.00 1000.00 1200.00 1400.00 1600.00 1800.00 Hoạt tính Xylanase (U/ml) Enzyme gia nhiệt 90 độ Enzyme gia nhiệt 70 độ Enzyme gia không gia nhiệt Dựa vào đồ thị nhận thấy hoạt tính xylanase tất chủng vi nấm sau gia nhiệt 20 phút 70ºC 90ºC bị cịn so với enzyme không gia nhiệt Đáng ý enzyme chủng Aspergilus fumigatus ASM 158, Aspergilus fumigatus ASM 138-1 chủng Penicillium citreonigrum ASS 102-1 có hoạt tính sau gia nhiệt 90ºC cao sau gia nhiệt 70ºC Nguyễn Thị Hòa 51 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học  CMCase Kết kiểm tra độ bền nhiệt CMCase chủng thể đồ thị sau Khảo sát độ bền nhiệt CMCase Talaromyces verruculosus ASM 137-1 Talaromyces verruculosus AAS 356 Talaromyces sp1 AS 19 Sarocladium sp ASS 30 Sarocladium sp ASS 125-1 Penicillium sp ASM 141-1 Penicillium sp ASM 139-1 Penicillium sp AS 31 Penicillium indicum AS 318-1 Penicillium gerundense ASM 159-1 Penicillium citrinum ASM 138-3 Penicillium citreonigrum ASS 89-1 Penicillium citreonigrum ASS 102-1 Aspergillus unguis ASM 140 Aspergillus fumigatus ASS 69-1 Aspergillus fumigatus ASM 158 Aspergillus fumigatus ASM 138-1 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 Hoạt tính CMCase (U/ml) Enzyme gia nhiệt 90 độ Enzyme gia nhiệt 70 độ Enzyme không gia nhiệt Các chủng Talaromyces sp AS 19, Penicillium sp AS 31, Penicillium citreonigrum AS 102-1 Aspergillus fumigatus ASS 69-1 cịn hoạt tính sau ủ 90ºC 20 phút enzyme chủng cịn lại bị hồn toàn hoạt lực Tuy nhiên nhiệt độ 70ºC hoạt tính enzyme tất chủng giữ 30% so với enzyme không gia nhiệt Đáng ý enzyme chủng Penicillium sp ASM 139-1, Penicillium indicum AS 318-1, Penicillium citreonigrum ASS 89-1 nhóm chủng Talaromyces giữ 65% hoạt tính so với enzyme khơng gia nhiệt Nguyễn Thị Hịa 52 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học 3.3.3 Kiểm tra khả bền nhiệt enzyme phương pháp điện di Để đánh giá xác độ bền nhiệt hệ enzyme sau gia nhiệt điều kiện nhiệt độ trên, tiến hành điện di protein gel SDS-PAGE điện di Zymogram tương ứng với chất CMC xylan Mẫu enzyme điện di protein Zymogram chất CMC làm cột Hi-Trap sau đem xử lý nhiệt, cịn điện di Zymogram chất xylan mẫu enzyme cần pha lỗng tới nồng độ thích hợp dựa kết phân tích theo phương pháp DNS trước đem xử lý nhiệt Các mẫu enzyme sau xử lý nhiệt cần để qua đêm tủ lạnh mát 24h tiến hành chạy điện di Kết điện di thể hình sau Nguyễn Thị Hịa 53 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Hình 3.6 Gel điện di SDS-PAGE Zymogram khảo sát độ bền nhiệt enzyme Chú thích: Enzyme chủng tiến hành load giếng, giếng T: enzyme khơng gia nhiệt + Dye gia nhiệt 100°C phút; giếng T0: enzyme không gia nhiệt + Dye; giếng T70: enzyme gia nhiệt 70°C 20 phút + Dye; giếng T90: enzyme gia nhiệt 90ºC 20 phút + Dye Nguyễn Thị Hòa 54 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học Nhìn vào băng điện di thấy nhũng chủng có xuất băng giếng số thể bền nhiệt enzyme 70ºC 90ºC Hầu hết chủng xuất băng enzyme giếng gel Zymogram CMC, xylan Mặc dù hoạt tính CMCase xylanase chủng sau gia nhiệt 90ºC gần hết khảo sát phương pháp DNS gel Zymogram xuất vạch băng Điều chứng tỏ hệ enzyme CMCase, xylanase chủng có enzyme bền nhiệt 90ºC 20 phút Trên gel Zymogram chất CMC, vạch băng hai giếng đa số chủng lên rõ nét thể bền nhiệt enzyme CMCase Các chủng Sarocladium sp ASS 30, Penicillium sp ASS 89-1, Penicillium gerundense ASM 159-1 Penicillium indicum AS 318-1 có vạch băng giếng tương đối giống cho thấy hệ enzyme CMCase chúng bền nhiệt 70ºC Độ bền nhiệt CMC chủng kiểm tra đồng thời phương pháp khuếch tán đĩa thạch CMC-agar Mỗi chủng nhỏ 30µl mẫu enzyme khơng gia nhiệt, enzyme gia nhiệt 70ºC 20 phút enzyme gia nhiệt 90ºC 20 phút vào giếng Khả phân giải CMC thể tạo thành vòng thủy phân Nguyễn Thị Hòa 55 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Hình 3.7 Vòng phân giải chất CMC khảo sát độ bền nhiệt Chú thích: T: enzyme khơng gia nhiệt, T70: enzyme gia nhiệt 70 oC 20 phút, T90: enzyme gia nhiệt 90oC 20 phút, ĐC -: đối chứng âm (đệm Na-citrate 0.05M ph 5.0), ĐC +: đối chứng dương (enzyme cellulase thương phẩm) Kết enzyme hầu hết chủng vi nấm sau gia nhiệt 70ºC 20 phút tạo vịng phân giải CMC với đường kính lớn, điều cho thấy chúng cịn hoạt tính tương đối cao Nhưng sau gia nhiệt 90ºC có hai chủng Sarocladium sp ASS 30 Talaromyces sp AS 19 xuất vòng phân giải hoạt tính cịn lại khơng nhiều Nguyễn Thị Hịa 56 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Kết phân tích độ bền nhiệt enzyme CMCase xylanase 17 chủng vi nấm chịu axit cho thấy hoạt tính CMCase chủng tương đối bền sau gia nhiệt 70ºC 20 phút, cịn hoạt tính xylanase chúng khơng Tuy nhiên chọn chủng Penicillium gerundense ASM 159-1 Penicillium indicum AS 318-1 có khả sinh enzyme CMCase xylanase với hoạt tính cao, ổn định pH ≈ 3.0 bền nhiệt 90ºC 20 phút Nguyễn Thị Hòa 57 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã quan sát, chụp ảnh hình thái khuẩn lạc, tế bào 17 chủng vi nấm chịu axit mạnh Đã xác định số đặc tính enzyme CMCase xylanase 17 chủng vi nấm chịu axit mạnh Qua cho thấy enzyme CMCase xylanase từ chủng Penicillium gerundense ASM 159-1 chủng Penicillium indicum AS 318-1 biểu hoạt tính cao có khả hoạt động ổn định pH ≈ 3.0 bền với nhiệt 90ºC 20 phút Kiến nghị Các enzyme có khả hoạt động ổn định pH thấp có tính bền nhiệt cao cần tinh chế nghiên cứu sâu để tìm kiếm gen q ứng dụng cơng nghệ sinh học Nguyễn Thị Hòa 58 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Johnson D.B (1998), “Biodiversity and ecology of acidophilic microorganisms,” FEMS Microbiol Ecol., vol 27, no 4, pp 307–317 Aguilera A., Manrubia S C., Gómez F., Rodríguez N., and Amils R (2006), “Eukaryotic community distribution and its relationship to water physicochemical parameters in an extreme acidic environment, Río Tinto (Southwestern Spain),” Appl Environ Microbiol., vol 72, no 8, pp 5325–5330 Aguilera A., Zettler E., Gómez F., Amaral-Zettler L., Rodríguez N., and Amils R (2007), “Distribution and seasonal variability in the benthic eukaryotic community of Río Tinto (SW, Spain), an acidic, high metal extreme environment,” Syst Appl Microbiol., vol 30, no 7, pp 531– 546 Hujslová M., Kubátová A., Kostovčík M., and Kolařík M (2003), “Acidiella bohemica gen et sp nov and Acidomyces spp (Teratosphaeriaceae), the indigenous inhabitants of extremely acidic soils in Europe,” Fungal Divers., vol 58, no 1, pp 33–45 Gross S and Robbins E I (2000), “Acidophilic and acid-tolerant fungi and yeasts,” Hydrobiologia, vol 433, no 1996, pp 91–109 Cooke W B (1976), “Fungi in and near streams carrying acid minedrainage”, The Ohio Journal of Science,76(5): 231-240 Baker B J., Lutz M A., Dawson S C., Bond P L., and Banfield J F (2004), “Metabolically active eukaryotic communities in extremely acidic mine drainage,” Appl Environ Microbiol., vol 70, no 10, pp 6264–6271 Tiquia-arashiro S M and Grube M (2019), “Chapter 2: Eukaryotic life in extreme environments: Acidophilic fungi” in Fungi in extreme environtments: Ecological role and Biotechnological significance Thanh V N et al (2019), “Surveying of acid-tolerant thermophilic Nguyễn Thị Hòa 59 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học lignocellulolytic fungi in Vietnam reveals surprisingly high genetic diversity,” Sci Rep., vol 9, no 1, pp 1–12 10 Hujslová M., Bystrianský L., Benada O., and Gryndler M (2019), “Fungi, a neglected component of acidophilic biofilms : they have a potential for biotechnology ?,” Extremophiles, 23(3), 267-275 11 Luo H et al (2009), “A thermophilic and acid stable family-10 xylanase from the acidophilic fungus Bispora sp MEY-1.,” Extremophiles, vol 13, no 5, pp 849–857 12 Gao J., Weng H., Zhu D., Yuan M., Guan F., and Xi Y (2008), “Production and characterization of cellulolytic enzymes from the thermoacidophilic fungal Aspergillus terreus M11 under solid-state cultivation of corn stover,” Bioresour Technol., vol 99, no 16, pp 7623– 7629 13 Pérez J., Muñoz-Dorado J., De La Rubia T., and Martínez J (2002), “Biodegradation and biological treatments of cellulose, hemicellulose and lignin: An overview,” Int Microbiol., vol 5, no 2, pp 53–63 14 Johnson B.D., Aguilera A (2016), “Environmental microbiology in acidophilic environments” In: Manual of environmental microbiology, 4th edn (MEM4), ASM Press, Washington, DC, pp 34–47 15 Aguilera A., Souza-Egipsy V., González-Toril E., Rendueles O., Amils R (2010), “Eukaryotic microbial diversity of phototrophic microbial mats in two icelandic geothermal hot Springs”, Int Microbiol, 13, pp 29–40 16 Isobe, K., Inoue, N., Takamatsu, Y., Kamada, K., & Wakao, N (2006), “Production of catalase by fungi growing at low pH and high temperature”, Journal of bioscience and bioengineering, 101(1), 73-76 Nguyễn Thị Hòa 60 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học PHỤ LỤC Phụ lục Kết khảo sát độ bền nhiệt CMCase chủng vi nấm chịu axit STT Ký hiệu chủng Tên phân loại 10 11 12 13 14 15 16 17 ASM 138-1 ASM 158 ASS 69-1 ASM 140 ASS 102-1 ASS 89-1 ASM 138-3 ASM 159-1 AS 318-1 AS 31 ASM 139-1 ASM 141-1 ASS 125-1 ASS 30 AS 19 AAS 356 ASM 137-1 Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus unguis Penicillium citreonigrum Penicillium citreonigrum Penicillium citrinum Penicillium gerundense Penicillium indicum Penicillium sp Penicillium sp Penicillium sp Sarocladium sp Sarocladium sp Talaromyces sp Talaromyces verruculosus Talaromyces verruculosus Enzyme không gia nhiệt (U/ml) 2.39 2.78 1.80 1.48 0.95 1.20 2.57 2.25 2.68 1.75 1.73 1.87 0.00 2.41 0.71 1.71 1.37 Enzyme gia nhiệt 70 độ (U/ml) 1.00 1.09 0.83 0.49 0.62 0.87 0.94 1.30 1.75 0.58 1.22 0.54 0.00 0.91 1.00 1.24 1.01 Enzyme gia nhiệt 90 độ (U/ml) 0.00 0.00 0.07 0.00 0.04 0.00 0.00 0.00 0.00 0.04 0.00 0.00 0.00 0.00 0.09 0.00 0.00 Rate E70°C/ E0 (%) Rate E90°C/ E0 (%) 41.94 39.10 46.35 33.18 65.08 72.10 36.38 57.75 65.39 33.10 70.64 29.01 0.00 37.83 142.41 72.12 73.63 0.15 0.00 3.91 0.00 4.27 0.00 0.00 0.00 0.00 2.30 0.00 0.00 0.00 0.00 12.95 0.00 0.00 Phụ lục Kết khảo sát độ bền nhiệt Xylanase chủng vi nấm chịu axit STT Ký hiệu chủng 10 11 ASM 138-1 ASM 158 ASS 69-1 ASM 140 ASS 102-1 ASS 89-1 ASM 138-3 ASM 159-1 AS 318-1 AS 31 ASM 139-1 Tên phân loại Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus unguis Penicillium citreonigrum Penicillium citreonigrum Penicillium citrinum Penicillium gerundense Penicillium indicum Penicillium sp Penicillium sp Nguyễn Thị Hịa Enzyme khơng gia nhiệt (U/ml) 379.98 409.03 72.85 39.00 274.59 289.40 96.31 518.15 1615.23 466.00 49.90 61 Enzyme gia nhiệt 70 độ (U/ml) 9.38 3.76 5.63 0.09 1.32 17.19 7.85 8.30 30.76 29.96 14.38 Enzyme gia nhiệt 90 độ (U/ml) 38.43 54.79 0.09 0.25 22.64 21.83 10.21 5.05 28.32 25.08 2.29 Rate E70°C/ E0 (%) Rate E90°C/ E0 (%) 2.47 0.92 7.73 0.23 0.48 5.94 8.15 1.60 1.90 6.43 28.82 10.11 13.39 0.12 0.65 8.24 7.54 10.60 0.97 1.75 5.38 4.60 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội 12 13 14 15 16 17 ASM 141-1 ASS 125-1 ASS 30 AS 19 AAS 356 ASM 137-1 Khoa Công nghệ Sinh học Penicillium sp Sarocladium sp Sarocladium sp Talaromyces sp Talaromyces verruculosus Talaromyces verruculosus 313.57 1.11 58.94 88.74 123.52 45.28 49.66 0.03 14.38 5.24 2.63 15.49 40.38 0.55 4.04 0.75 6.74 15.17 15.84 2.35 24.40 5.91 2.13 34.22 12.88 49.41 6.86 0.84 5.46 33.50 Phụ lục Khảo sát khả hoạt động enzyme CMCasecủa chủng vi nấm chịu axit pH 1,3,5 STT 10 11 12 13 14 15 16 17 Ký hiệu chủng ASM 138-1 ASM 158 ASS 69-1 ASM 140 ASS 102-1 ASS 89-1 ASM 138-3 ASM 159-1 AS 318-1 AS 31 ASM 139-1 ASM 141-1 ASS 125-1 ASS 30 AS 19 AAS 356 ASM 137-1 CMCase (U/ml) Tên phân loại Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus unguis Penicillium citreonigrum Penicillium citreonigrum Penicillium citrinum Penicillium gerundense Penicillium indicum Penicillium sp Penicillium sp Penicillium sp Sarocladium sp Sarocladium sp Talaromyces sp Talaromyces verruculosus Talaromyces verruculosus pH pH pH 2.31 2.17 1.58 1.69 1.81 1.82 2.13 1.81 1.89 1.63 2.17 2.38 1.74 2.87 3.10 2.22 2.96 2.64 2.98 0.36 1.70 0.34 1.59 2.72 2.93 4.46 1.34 1.85 2.37 0.33 5.15 2.82 1.18 5.09 3.35 3.20 1.13 1.93 0.59 1.88 2.58 3.15 3.71 1.71 2.02 2.38 0.74 3.05 1.86 1.31 3.45 Phụ lục Khảo sát khả hoạt động enzyme Xylanase chủng vi nấm chịu axit pH 1,3,5 STT Ký hiệu chủng ASM 138-1 ASM 158 ASS 69-1 ASM 140 ASS 102-1 ASS 89-1 ASM 138-3 ASM 159-1 Nguyễn Thị Hòa Xylanase (U/ml) Tên phân loại Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus Aspergillus unguis Penicillium citreonigrum Penicillium citreonigrum Penicillium citrinum Penicillium gerundense 62 pH pH pH 16.34 25.67 1.28 0.00 65.46 69.68 0.00 35.01 231.10 294.55 35.29 4.91 139.74 371.96 21.38 460.17 207.93 258.46 29.38 25.72 71.35 166.59 64.04 369.51 K24-CNSH Trường Đại học Mở Hà Nội 10 11 12 13 14 15 16 17 AS 318-1 AS 31 ASM 139-1 ASM 141-1 ASS 125-1 ASS 30 AS 19 AAS 356 ASM 137-1 Khoa Công nghệ Sinh học Penicillium indicum Penicillium sp Penicillium sp Penicillium sp Sarocladium sp Sarocladium sp Talaromyces sp Talaromyces verruculosus Talaromyces verruculosus 156.70 43.90 31.84 32.34 2.28 22.84 86.13 5.43 6.11 1289.38 114.69 68.22 232.00 2.90 84.20 148.89 32.34 84.08 876.83 105.38 31.59 210.48 2.10 38.48 27.29 9.41 18.78 Phụ lục Gel điện di SDS-PAGE, Zymogram CMC, xylan khảo sát độ bền nhiệt chủng vi nấm Nguyễn Thị Hòa 63 K24-CNSH