Nghiên cứu định hướng khả năng ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm của cây hoàn ngọc

Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐỊNH HƯỚNG KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG LÀM CHẤT BẢO QUẢN THỰC PHẨM CỦA CÂY HOÀN NGỌC GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN : PGS.TS Nguyễn La Anh SINH VIÊN THỰC HIỆN : Lộc Tú Anh Lớp : 1701 Mã sinh viên : 17A31010032 Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Hà Nội, 5/2021 SVTH: Lộc Tú Anh Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐỊNH HƯỚNG KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG LÀM CHẤT BẢO QUẢN THỰC PHẨM CỦA CÂY HOÀN NGỌC GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN : PGS.TS Nguyễn La Anh SINH VIÊN THỰC HIỆN : Lộc Tú Anh Lớp : 1701 Mã sinh viên : 17A31010032 Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Hà Nội, 5/2021 SVTH: Lộc Tú Anh Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu Khóa luận đề tài: “Nghiên cứu định hướng khả ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm Hồn ngọc” trung thực Tơi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực khóa luận cảm ơn thơng tin trích dẫn chun đề ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 29 tháng năm 2021 Sinh viên thực Lộc Tú Anh SVTH: Lộc Tú Anh Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán thuộc Khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tập hoàn thành đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS.Nguyễn La Anh – chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học Vi sinh, anh chị Bộ môn Công nghệ sinh học Vi sinh, viện Công nghiệp thực phẩm trực tiếp tận tình hướng dẫn dìu dắt em suốt q trình em thực tập hồn thành đề tài Trong q trình thực tập khơng tránh khỏi sai sót, kính mong thầy giáo, anh chị bạn đóng góp ý kiến để em tiếp thu hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 29 tháng năm 2021 Sinh viên Lộc Tú Anh SVTH: Lộc Tú Anh Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC MỤC LỤC .i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG v MỞ ĐẦU Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Các vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm 1.1.1 Vi khuẩn 1.1.1.1 Clostridium perfringens .3 1.1.1.2 Staphyllococcus aureus 1.1.1.3 Escherichia coli 1.1.1.4 Bacillus cereus 1.1.2 Nấm mốc 1.1.3 Nấm men 1.2 Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật 1.2.1 Phân loại 1.2.1.1 Polyphenol 1.2.1.3 Flavonoid 10 1.2.1.4 Quinone 11 1.2.1.5 Alkaloid 11 1.2.1.6 Glycoside 12 1.2.1.7 Saponin .13 1.2.1.8 Tannin 13 1.2.1.9 Terpenes tinh dầu 14 1.2.1.10 Peptides 16 1.2.2 Cơ chế kháng khuẩn 17 1.3 Cây Hoàn ngọc 18 1.3.1 Tác dụng dược lý Hoàn ngọc .19 1.3.2 Các hợp chất có hoạt tính sinh học Hoàn ngọc 20 SVTH: Lộc Tú Anh i Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội CHƯƠNG II: VẬT LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu 22 2.1.1 Đối tượng 22 2.1.2 Hóa chất thí nghiệm 22 2.1.3 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm .22 2.1.4 Môi trường dung dịch đệm 23 2.2 Phương pháp vi sinh 25 2.2.1 Phương pháp đếm số lượng tế bào buồng đếm hồng cầu 25 2.2.2 Phương pháp xác định số lượng tế bào trang cấy 25 2.3 Phương pháp tách chiết Hoàn ngọc 26 2.3.1 Phương pháp ngâm 26 2.3.2 Phương pháp trích ly hồi lưu 26 2.4 Phương pháp kiểm tra khả ức chế VSV gây hư hỏng thực phẩm 27 2.5 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu dịch chiết Hoàn ngọc 28 2.6 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol 28 2.7 Phương pháp xác định hàm lượng Flavonoid 29 2.8 Thử nghiệm dịch chiết Hoàn ngọc thực phẩm 29 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ 30 3.1 Hoạt tính kháng lại số vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm dịch chiết Hoàn ngọc 30 3.2 Ảnh hưởng yếu tố tới hiệu tách chiết Hoàn ngọc 30 3.2.1 Ảnh hưởng dung môi tách chiết 30 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ tách chiết 31 3.2.3 Ảnh hưởng nguồn nguyên liệu 33 3.3 Nồng độ ức chế tối thiểu dịch chiết Hoàn ngọc Staphylococcus aureus CNTP 6077 35 3.4 Ứng dụng dịch chiết Hoàn ngọc bảo quản tương ớt lên men 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 Kết luận 38 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 SVTH: Lộc Tú Anh ii Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Chữ viết tắt VSV VK MRS OD CFU NA Vi sinh vật Vi khuẩn De Man-Rogosa-Sharp – Môi trường nuôi cấy vi sinh vật Optical Density – mật độ quang Colony Forming Unit – đơn vị hình thành khuẩn lạc Nutrient agar STT SVTH: Lộc Tú Anh iii Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC HÌNH Hình 1: Vi khuẩn Staphylococcus aureus kính hiển vi điện tử Hình 2: Escherichia coli kính hiển vi điện tử Hình 3: Bacillus cereus kính hiển vi điện tử Hình 4: Aspergillus niger kính hiển vi điện tử Hình 5: Cấu trúc hóa học số nhóm chất thuộc polyphenol Hình 6: Cấu trúc hóa học Resveratrol .10 Hình 7: Cấu trúc hóa học số flavones flavonoids 10 Hình 8: Cấu trúc hóa học số quinones đại diện quinone hypericin 11 Hình 9: Cấu trúc hóa học số alkaloids 12 Hình 10: Cyanidin O-galactoside flavone C-glycoside 13 Hình 11: Sarsapogenins Yucca 13 Hình 12: Cấu trúc đại diện tannin 14 Hình 13: Cơ chế kháng khuẩn tinh dầu .15 Hình 14: Ảnh hưởng tinh dầu Metha piperita tới thành tế bào sợi nấm hình thành bào tử Aspergillus niger (a,b) and Penicillium hirsutum (c,d) ni cấy đĩa Petri chứa 20 µl tinh dầu 16 Hình 15: Cấu trúc thứ cấp AMP: A) xoắn α, B) vòng xoắn / tấm, C) cuộn dây ngẫu nhiên, D) hỗn hợp α / β 17 Hình 16: Cây Hoàn ngọc 19 Hình 17: Cấu trúc lupeol betulin 20 Hình 18: Dịch chiết phương pháp trích ly hồi lưu 27 Hình 19: Hoạt tính kháng lại chủng Staphylococcus aureus CNTP 6077 dịch chiết Hoàn ngọc tách chiết nhiệt độ khác 32 Hình 20: Hoạt tính kháng lại chủng Staphylococcus aureus CNTP 6077 dịch chiết Hoàn ngọc từ nguồn khác 34 Hình 21: Kết khảo sát nồng độ MIC đĩa Elisa 96 giếng Staphylococcus aureus CNTP 6077 .35 Hình 22: Sản phẩm tương ớt Mường Khương từ Lào Cai .36 SVTH: Lộc Tú Anh iv Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC BẢNG Bảng Cơ chế hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 17 Bảng Hoạt tính kháng số chủng VSV gây hư hỏng thực phẩm .30 Bảng Ảnh hưởng dung mơi tới hiệu tách chiết Hồn ngọc 31 Bảng 3 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu tách chiết Hoàn ngọc 32 Bảng Đặc điểm dịch chiết Hoàn ngọc thu nhận từ vùng nguyên liệu khác 33 Bảng Ảnh hưởng nồng độ chất khô dịch chiết Hoàn ngọc chủng Staphylococcus aureus CNTP 6077 35 Bảng Ảnh hưởng dịch chiết Hoàn ngọc tới mật độ tế bào VSV mẫu tương ớt Mường Khương thời gian lưu trữ 37 SVTH: Lộc Tú Anh v Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội MỞ ĐẦU Trong ngành công nghiệp thực phẩm, nguyên nhân chủ yếu dẫn tới hư hỏng, ngộ độc sản phẩm nhiễm vi khuẩn Salmonella typhi, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus; nấm men Candida albican nấm mốc Aspergillus niger, Fusarium oxysporum… Do đó, việc ngăn ngừa mầm bệnh yếu tố ưu tiên hàng đầu nhà sản xuất Một phương pháp truyền thống sử dụng nhiệt độ cao (UHT) nhiệt độ áp suất cao để tiệt trùng sản phẩm, phù hợp với số sản phẩm đóng hộp Phương pháp phổ biến sử dụng hóa chất (Sodium Benzoate, Potassium Sorbate ) để ức chế vi sinh vật có mặt sản phẩm Hiện nay, xu hướng sản xuất loại thực phẩm chất lượng cao, an tồn, có nguồn gốc tự nhiên, khơng sử dụng chất bảo quản hóa học (dù cho phép) Các công ty chế biến thực phẩm lớn Việt Nam quan tâm đến hướng nghiên cứu phát triển nhằm tăng giá trị độ an tồn cho sản phẩm Nhiều sản phẩm thực phẩm bảo quản chất bảo quản tự nhiên loại bánh truyền thống (bánh dẻo, bánh cốm, bánh đậu xanh ), loại sản phẩm gia vị (tương ớt, nước sốt ) có giá trị gia tăng cao Do đó, nhu cầu tìm kiếm chất bảo quản thay thế, an toàn người ngày tăng Trong đó, thực vật coi nguồn tự nhiên phong phú chứa hợp chất kháng khuẩn Hơn nữa, hợp chất cho dễ phân giải, tránh tích tụ chuỗi thức ăn Hồn Ngọc lồi phổ biến nước ta, ứng dụng rộng rãi y học cổ truyền để chữa bệnh liên quan tới đường tiêu hóa, làm lành vết thương… Một số nghiên cứu gần dây cho thấy Hồn Ngọc có tiềm ức chế phát triển số vi khuẩn gây bệnh, khối u Xuất phát từ lý trên, thực đề tài “Nghiên cứu định hướng khả ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm hoàn ngọc” SVTH: Lộc Tú Anh Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội Hàm lượng polyphenol tổng số tính theo cơng thức sau: P%=(m1 V.100)/(m2.v.1000) P: hàm lượng polyphenol tính theo % chất khơ m1 : số mg axit gallic xác định theo đồ thị chuẩn v: số ml dịch chiết lấy làm thí nghiệm V: tổng số dịch chiết mẫu nghiên cứu (ml) m2 : khối lượng mẫu nghiên cứu tính theo chất khơ (g) 100: tính % 1000: chuyển thành gam 2.7 Phương pháp xác định hàm lượng Flavonoid Hàm lượng flavonoid tổng xác định theo mô tả Chang cs., (2002) [9], có sửa đổi Nguyên tắc: Dựa tương quan hấp thụ quercetin chuẩn + MeOH/AlCl3 2% bước sóng hấp thụ 415 nm với nồng độ chất chuẩn quercetin tương ứng Phương pháp: Mẫu sau trích ly tiến hành pha lỗng đến nồng độ thích hợp Dùng pipet hút ml mẫu vào ống nghiệm khô, bổ sung ml MeOH/AlCl3 2%, so màu máy quang phổ bước sóng 415 nm Hàm lượng flavonoid tính theo cơng thức sau: F = Q × 2,51 F: hàm lượng flavonoid mẫu (mg/L) Q: hàm lượng tính dựa vào đường chuẩn quercetin (mg/L) 2,51 hệ số chuyển đổi từ flavonol sang flavonol glycosid (flavonoid) 2.8 Thử nghiệm dịch chiết Hoàn ngọc thực phẩm Tiến hành thử nghiệm khả kháng khuẩn dịch chiết Hoàn ngọc sản phẩm tương ớt Mường Khương lên men truyền thống, Lào Cai 50g mẫu tương ớt lên men, chứa vi khuẩn Staphylococcus aureus CNTP 6077 với mật độ ban đầu 1,0 x106 CFU/g, bổ sung dịch chiết Hoàn ngọc với nồng độ 16 mg/g tương ớt Để mẫu nhiệt độ phòng Mẫu đối chứng không bổ sung dịch kháng khuẩn Kiểm tra mật độ tế bào hiếu khí sau thời gian bảo quản SVTH: Lộc Tú Anh 29 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội CHƯƠNG III: KẾT QUẢ 3.1 Hoạt tính kháng lại số vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm dịch chiết Hoàn ngọc Dịch chiết từ Hoàn ngọc theo phương pháp trích ly hồi lưu, thu nhận từ Sơn Tây, Hịa Bình, khảo sát khả kháng lại số vi khuẩn Gram (+): Bacillus cereus CNTP 6089, Staphylococcus aureus CNTP 6077, Lactobacillus plantarum JCM 1149; vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli CNTP 6078, Kliebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae CNTP 6079; nấm mốc Penicillium oxalicum Currie & Thom POCT nấm men Saccharomyces cerevisiae 7012 Kết thể Bảng 3.1 Bảng Hoạt tính kháng số chủng VSV gây hư hỏng thực phẩm STT Chủng vi sinh vật kiểm định Hoạt tính kháng VSV Bacillus cereus CNTP 6089 Staphylococcus aureus CNTP 6077 +++ Lactobacillus plantarum JCM 1149 Escherichia coli CNTP 6078 Kliebsiella pneumoniae subsp pneumoniae CNTP 6079 Penicillium oxalicum Currie and Thom POCT Saccharomyces cerevisiae 7012 (+++) Vịng kháng khuẩn > 10 mm (-) Khơng có vịng kháng khuẩn Trong số chủng vi sinh vật khảo sát, dịch chiết Hoàn ngọc ức chế mạnh mẽ phát triển chủng Staphylococcus aureus CNTP 6077 Đối với chủng VSV kiểm định khác, dịch chiết lại khơng thể hoạt tính 3.2 Ảnh hưởng yếu tố tới hiệu tách chiết Hồn ngọc 3.2.1 Ảnh hưởng dung mơi tách chiết Trong q trình chiết xuất, dung mơi sử dụng nhằm hịa tan hợp chất mong muốn thơng qua tương tác phân tử dung môi hợp chất, kéo hợp chất từ pha rắn sang pha lỏng Một dung môi cho tốt vừa có hiệu tách chiết cao vừa có khả trì ổn định mặt cấu trúc hóa học hợp chất có hoạt tính [30] Trong nghiên cứu này, Hồn ngọc trắng SVTH: Lộc Tú Anh 30 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội trích ly với dung môi không phân cực (n – hexan) có độ phân cực khác (methanol, ethanol), phương pháp ngâm 45oC 5h Hiệu suất tách chiết hoạt tính kháng khuẩn thể qua ức chế phát triển chủng Staphylococcus aureus CNTP 6077 thể Bảng 3.2 Bảng Ảnh hưởng dung môi tới hiệu tách chiết Hồn ngọc Dung mơi tách chiết n - Hexan Methanol Ethanol Hiệu suất tách Hoạt tính kháng lại chiết (%) chủng CNTP 6077 1,53 1,79 3,34 ++ + (-) Khơng có vịng kháng khuẩn; (+) Đường kính vịng kháng khuẩn > mm; (++) Đường kính vịng kháng khuẩn > mm Trong ba loại dung môi sử dụng để tách chiết hợp chất từ Hoàn ngọc, dung mơi n – Hexan có hiệu suất tách chiết thấp (1,53%) dịch chiết thu không ức chế phát triển chủng Staphylococcus aureus CNTP 6077 Điều cho thấy, hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn Hồn ngọc chất phân cực Dung môi ethanol, mặc hiệu suất trích ly cao (3,34%) dịch chiết thu có hoạt tính ức chế phát triển chủng CNTP 6077 lại so với dịch chiết methanol Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi (methanol, ethanol acetone) tới hiệu tách chiết hợp chất kháng khuẩn, nấm men, nấm mốc từ loài thực vật Việt Nam Quang-Vinh Nguyen and Jong-Bang Eun (2013) [27], cho thấy, dịch chiết methanol thể hoạt tính kháng khuẩn mạnh so với dịch chiết ethanol tất loài thực vật khảo sát 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ tách chiết Khả thu nhận hợp chất sinh học từ thực vật không phụ thuộc vào dung mơi mà cịn phụ thuộc vào điều kiện tách chiết, đặc biệt nhiệt độ Trong nghiên cứu này, Hồn ngọc trắng trích ly methanol, nhiệt độ phòng trog 24h, 45oC 70oC 5h Hiệu tách chiết thể Bảng 3.3 SVTH: Lộc Tú Anh 31 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội Bảng 3 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu tách chiết Hoàn ngọc Nhiệt độ tách Hiệu suất tách Đường kính vịng kháng chiết (oC) chiết (%) chủng CNTP 6077 (mm) 22 - 25 45 70 1,19 1,79 12,62 8,1 13,3 (-) Khơng có vịng kháng khuẩn Kết Bảng 3.3, cho thấy, tách chiết nhiệt độ phòng, 22 – 25oC, khơng có hiệu việc thu nhận hợp chất từ Hoàn ngọc Hiệu suất tách chiết đạt 1,19% dịch chiết thu khơng có hoạt tính kháng lại chủng Staphylococcus aureus CNTP 6077 Kết khác với kết nghiên cứu Quang-Vinh Nguyen and Jong-Bang Eun (2013) [27], đường kính vịng kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus dịch chiết methanol Hoàn ngọc, thu phương pháp ngâm nhiệt độ phòng, 7,08 7,92 mm với lượng chất khô dịch chiết tương ứng 0,2 mg/khoanh giấy 0,5 mg/khoanh giấy Hình 19: Hoạt tính kháng lại chủng Staphylococcus aureus CNTP 6077 dịch chiết Hoàn ngọc tách chiết nhiệt độ khác – Dịch chiết 45oC; – Dịch chiết 70oC; – Dịch chiết nhiệt độ phòng; – Đối chứng methanol SVTH: Lộc Tú Anh 32 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội Phương pháp trích ly 70oC có hiệu suất tách chiết tới 12,62%, cao 10 lần so với trích ly nhiệt độ phịng Dịch chiết thu được, thể hoạt tính kháng chủng CNTP 6077 mạnh so với dịch chiết trích ly 45oC, với đường kính vịng vơ khuẩn đạt tương ứng 13,3 mm 8,1 mm Kết nghiên cứu Truc Cong Ho cs., [31], cho thấy, tách chiết Hoàn ngọc phương pháp chiết nước siêu tới hạn (subcritical water extraction) nhiệt độ 150 – 230oC, thu dịch chiết có hoạt tính kháng lại vi khuẩn mạnh so với chiết nhiệt độ 80 oC 110 – 130oC Tuy nhiên, tăng nhiệt độ tách chiết lên tới 250 – 270oC, hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết lại giảm 3.2.3 Ảnh hưởng nguồn nguyên liệu Bên cạnh kỹ thuật tách chiết, điều kiện khí hậu mơi trường vùng trồng ngun liệu ảnh hưởng tới hiệu thu nhận hoạt chất kháng khuẩn có thực vật Trong nghiên cứu này, Hoàn ngọc trắng thu nhận từ số vùng trồng khác như: Sơn Tây Lương Sơn, Hịa Bình; Vĩnh Phúc, khảo sát Ngồi ra, phần khác Hoàn ngọc trắng (lá cành) kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn Bảng Đặc điểm dịch chiết Hoàn ngọc thu nhận từ vùng nguyên liệu khác Hàm lượng Hiệu suất Hàm lượng Vùng Bộ phận Polyphenol tách chiết Flavonoid nguyên liệu tổng số (%) (mg/g) (mg/g) Cành 7,62 0,14 0,21 Sơn Tây, Hòa Bình Lá 10,97 2,27 1,48 Lương Sơn, Lá 4,79 0,36 1,548 Hịa Bình Vĩnh Phúc Lá 11,09 1,93 1,373 Đường kính vịng kháng chủng CNTP 6077 (mm) 9,3 19,3 10,6 8,9 Kết thể Bảng 3.4 cho thấy hàm lượng polyphenol tổng số bốn mẫu dịch chiết nằm khoảng từ 0,14 đến 2,27 mg/g Trong đó, Hồn ngọc trồng Sơn Tây, Hịa Bình có hàm lượng polyphenol lớn (2,27 mg/g) SVTH: Lộc Tú Anh 33 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội gấp lần so với mẫu dịch chiết Lương Sơn, Hịa Bình Ngược lại, hàm lượng flavonoid Hồn ngọc khơng có khác vùng trồng nguyên liệu Trong số vùng trồng nguyên liệu khảo sát Hồn ngọc trồng khu vực Sơn Tây, Hịa Bình có hoạt tính kháng lại chủng CNTP 6077 cao Hình 20: Hoạt tính kháng lại chủng Staphylococcus aureus CNTP 6077 dịch chiết Hoàn ngọc từ nguồn khác – Methanol; – Dịch chiết từ cành Hoàn ngọc (Sơn Tây, Hịa Bình); – Dịch chiết từ Hồn ngọc (Sơn Tây, Hịa Bình); – Nước cất; – Dịch chiết từ Hoàn ngọc (Lương Sơn, Hịa Bình); – Dịch chiết từ Hoàn ngọc (Vĩnh Phúc) Kết Bảng 3.4 cho thấy, hàm lượng hoạt chất tập trung nhiều so với cành SVTH: Lộc Tú Anh 34 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội 3.3 Nồng độ ức chế tối thiểu dịch chiết Hoàn ngọc Staphylococcus aureus CNTP 6077 Bảng Ảnh hưởng nồng độ chất khơ dịch chiết Hồn ngọc chủng Staphylococcus aureus CNTP 6077 Nồng độ chất khô dịch chiết (mg/ml) Methanol H2 O 0,25 0,5 16 Mẫu + + + + + + + -/+ - ĐC âm (khơng có VSV) - (-) Chủng không phát triển, màu môi trường giống màu đối chứng âm (-/+) Chủng phát triển yếu, môi trường chuyển màu vàng nhạt (+) Chủng phát triển, môi trường chuyển màu vàng Hàm lượng chất khô tối thiểu (MIC) dịch chiết Hoàn ngọc, ức chế phát triển chủng Staphylococcus aureus CNTP 6077, khảo sát dài từ 0,25 – 16 mg/ml Kết Bảng 3.5 cho thấy, giá trị MIC dịch chiết Hoàn ngọc chủng Staphylococcus aureus CNTP 6077 16 mg/ml Đây sở để xác định lượng dịch chiết cần thử nghiệm bảo quản thực phẩm Hồn ngọc Hình 21: Kết khảo sát nồng độ MIC đĩa Elisa 96 giếng Staphylococcus aureus CNTP 6077 SVTH: Lộc Tú Anh 35 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội 3.4 Ứng dụng dịch chiết Hoàn ngọc bảo quản tương ớt lên men Sản phẩm tương ớt Mường Khương từ Lào Cai lên men truyền thống ủ thời gian khoảng hai tháng liên tục Đây sản phẩm không sử dụng chất tạo màu, tạo mùi chất bảo quản Do khoảng thời gian ủ kéo dài từ lúc chế biến nguyên liệu nên sản phẩm tương ớt bị nhiễm vi khuẩn gây độc Mặc dù tương ớt thành phẩm có pH tương đối thấp (pH 5) độ muối cao (3 – 6%) dễ nhiễm khuẩn, mốc trình bảo quản Đặc biệt vi khuẩn Staphylococcus aureus – loài vi khuẩn chịu muối cao (có mặt gần khắp nơi tự nhiên, da niêm mạc động vật máu nóng, da, mũi đường hô hấp người mức khoảng 25 đến 30% số người), gây nhiễm vào thực phẩm nguyên liệu không nấu sau xử lý, chế biến điều kiện sản xuất không đảm bảo vệ sinh Khi nhiễm vào thực phẩm vi khuẩn Staphylococcus aureus sinh sôi tạo độc tố Độc tố ruột enterotoxin sản xuất S aureus protein ổn định nhiệt tồn 100℃ vịng 30 phút Khơng giống mốc hay nhiễm nhiều loại vi khuẩn khác, thực phẩm bị nhiễm độc tố Staphylococcus aureus khơng có thay đổi màu sắc mùi vị Hình 22: Sản phẩm tương ớt Mường Khương từ Lào Cai SVTH: Lộc Tú Anh 36 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội Trong thí nghiệm này, sản phẩm tương ớt Mường Khương lên men truyền thống, từ Lào Cai, bổ sung chủng Staphylococcus aureus CNTP 6077, mật độ 1,0*106 CFU/g bổ sung dịch chiết Hoàn ngọc trắng nồng độ 16 mg/g tương ớt Kiểm tra mật độ vi sinh vật hiếu khí sau thời gian để mẫu tương ớt nhiệt độ phòng Kết thể Bảng 3.6 Bảng Ảnh hưởng dịch chiết Hoàn ngọc tới mật độ tế bào VSV mẫu tương ớt Mường Khương thời gian lưu trữ Mẫu Mật độ VSV gây nhiễm thời điểm ban đầu (CFU/g) Đối chứng Bổ sung 16 mg/ml dịch chiết Hoàn ngọc 1,0x106 Mật độ VSV hiếu khí sau ngày (CFU/g) 3,73x106 Mật độ VSV hiếu khí sau ngày (CFU/g) 2,38x108 7,0x104 8,75x103 Kết Bảng 3.6 cho thấy, mật độ VSV hiếu khí, mẫu tương ớt khơng bổ sung dịch chiết Hoàn ngọc tăng mạnh từ 1,0x106 CFU/g lên 2,38x108 CFU/g sau ngày lưu trữ nhiệt độ phịng Ngược lại, mẫu tương ớt có bổ sung dịch chiết Hoàn ngọc, mật độ VSV hiếu khí giảm dần thời gian bảo quản, xuống cịn 8,75x103 CFU/g, sau ngày Kết cho thấy, dịch chiết Hồn ngọc có hiệu việc ức chế phát triển VSV hiếu khí sản phẩm thực phẩm lên men SVTH: Lộc Tú Anh 37 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã khảo sát số yếu tố ảnh hưởng tới tách chiết hợp chất kháng VSV từ Hồn ngọc Trong đó, hiệu đạt cao tách chiết Hồn ngọc dung mơi methanol, 700C Nguồn nguyên liệu có hàm lượng hoạt chất cao Sơn Tây, Hịa Bình, với hàm lượng polyphenol tổng số flavonoid đạt 2,27 mg/g 1,48 mg/g ngun liệu khơ Đã khảo sát hoạt tính kháng lại chủng VSV gây hư hỏng thực phẩm dịch chiết Hoàn ngọc, bao gồm: vi khuẩn Gram (+): Bacillus cereus CNTP 6089, Staphylococcus aureus CNTP 6077, Lactobacillus plantarum JCM 1149; vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli CNTP 6078, Kliebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae CNTP 6079; nấm mốc Penicillium oxalicum Currie and Thom POCT nấm men Saccharomyces cerevisiae 7012 Trong đó, dịch chiết Hồn ngọc, ức chế mạnh mẽ phát triển chủng Staphylococcus aureus CNTP 6077 với đường kính vịng vơ khuẩn đạt 19,3 mm, nồng độ mg/khoanh giấy Kết giá trị MIC dịch chiết Hoàn ngọc chủng Staphylococcus aureus CNTP 6077 16 mg/ml Thử nghiệm dịch chiết Hoàn ngọc bảo quản tương ớt lên men cho thấy, nồng độ 16 mg/g tương ớt, làm giảm mật độ VSV từ 1,0x106 CFU/g xuống 8,75x103 CFU/g, sau ngày lưu trữ Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu có hạn nên đề tài có kết ban đầu nghiên cứu tách chiết đánh giá hoạt tính dịch chiết Hoàn ngọc Đề nghị tiếp tục nghiên cứu sâu để thu nhận hợp chất kháng khuẩn dạng tinh Tiếp tục nghiên cứu theo dõi khả ức chế vi khuẩn sản phẩm thời gian dài để đánh giá mức độ an toàn SVTH: Lộc Tú Anh 38 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Kiều Hữu Ảnh (2010), Giáo trình vi sinh vật học thực phẩm, NXB Giáo dục Việt Nam PGS TS Lương Đức Phẩm (2002), Vi sinh vật học an toàn vệ sinh thực phẩm, NXB Nông nghiệp Nguyễn Thúy Hương (2011), Phân tích vi sinh thực phẩm (Dành cho hệ CĐNKN) TS Phan Quốc Kinh (2011), Giáo trình hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học, NXB Giáo dục Việt Nam Trần Công Khánh, Nguyễn Thị Minh Hằng, Đoàn Thị Mai Hương Nguyễn Văn Hùng, 2007, Nghiên cứu thành phần hóa học rễ xuân hoa, tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Tập 45, số 6-2007 PGS TS Nguyễn Văn Hùng cộng sự, 2006, Báo cáo khoa học, Viện Hóa Viện khoa học Cơng nghệ Việt Nam SVTH: Lộc Tú Anh 39 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH A Djilani, A Dicko (2012), The Therapeutic Benefits of Essential Oils, Nutrition Well-Being Health, pp 155–179 A.M Pisoschi, A Pop, C Georgescu, V Turcus (2018), An overview of natural antimicrobials role in food, European Journal of Medicinal Chemistry, 143, 922–935 Chang, C., Yang, M., Wen, H., Chem, J., (2002) Estimation of flavonoid total content in propolis by two complementary colorimetric methods Journal of Food and Drug Analisis 10(3): 178-182 10 E Cândido, H Marlon, S Cardoso, D.A Sousa, J.C Viana, N.G Oliveira, V Miranda, O.L Franco (2014), The use of versatile plant antimicrobial peptides in agribusiness and human health, Peptides 55 65–78 11 Fernandez, A.Alvarez, M.D.Garcia and M T Saenz (2001), Antiinflammatory effect of Pimenta racemosa var ozua and isolation of the triterpene lupeol, Farmaco, Elsevier Science, 56(4), 335-338 12 Gislene G F Nascimento1; Juliana Locatelli1; Paulo C Freitas1,2; Giuliana L Silva1 Brazilian Journal of Microbiology (2000), (2000) Antibacterial activity of plant extracts and phytochemicals on antibiotic-resistant bacteria, Brazilian Journal of Microbiology, 31(4) 13 H Chandra, P Bishnoi, A Yadav, B Patni, A.P Mishra, A.R Nautiyal, (2017) Antimicrobial Resistance and the Alternative Resources with Special Emphasis on Plant-Based Antimicrobials—A Review Plants, 6(4), 16 14 H Tsuchiya, M Sato, T Miyazaki, S Fujiwara, S Tanigaki, M Ohyama, T Tanaka, M Iinuma, (1996), Comparative study on the antibacterial activity of phytochemical flavanones against methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Journal of Ethnopharmacology, 50(1), 27–34 15 Tharmaraj RJJM, Antonysamy JM (2015), Screening of Bactericidal Activity of Selected Plumbago Species Against Bacterial Pathogens J Microbiol Exp 2, 1– SVTH: Lộc Tú Anh 40 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội 16 J.L Guil-Guerrero, L Ramos, C Moreno, J.C Zúñiga-Paredes, M Carlosama -Yepez, P Ruales (2016), Antimicrobial activity of plant-food by products: A review focusing on the tropics, Livestock Sci 189, 32–49 17 K Vijaya, S Ananthan, R Nalini (1995), Antibacterial effect of theaflavin, polyphenon 60 (Camellia sinensis) and Euphorbia hirta on Shigella spp.—a cell culture study, Journal of ethnopharmacology, 49, 115–118 18 K.L Compean, R.A Ynalvez (2014), Antimicrobial activity of plant secondary metabolites: A review, Res J Medicinal Plant (5): 204-213 19 M Iorizzi, V Lanzotti, S De Marino, F Zollo (2002), Antimicrobial Furostanol Saponins from the Seeds of Capsicum annuum L Var acuminatum, Journal of Agricultural and Food Chemistry Chem, 50, 4310–4316 20 M Wrink, Functions and biotechnology of Plant Secondary Metabolites, Annual Plant Reviewes, vol 39, Wiley-Blackwell Pub London, UK, 2010, p 24– 39 21 M.G Abukakar, A.N Ukwuani, R.A Shehu (2008), Phytochemical screening and antibacterial activity of Tamarindus Indica pulp extract, Asian J Biochem 3,134–138 22 Mostafa, AA, Al-Askar, AA, Almaary, KS Dawoul, TM, Sholkamy, EN Bakri, MM (2018) Antimicrobial activity of some plant extracts against bacterial strains causing food poisoning diseases Saudi Journal of Biological Sciences, 25(2), 361-366 23 O Habbal, S.S Hasson, A.H El-Hag, Z Al-Mahrooqui, N Al-Hashmi, M.S Al Balushi, A.A Al-Jabri (2011), Antibacterial activity of Lawsonia inermis Linn (Henna) against Pseudomonas aeruginosa, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 1(3), 173–176 24 P Avato, R Bucci, A Tava, C Vitali, Z Bialy (2006), Antimicrobial activity of saponins from Medicago sp.: structure‐activity relationship, Phytotherapy Research vol 20, p454–457 25 P Jeandet, A.C Douillet-Breuil, R Bessis, S Debord, M Sbaghi, M Adrian (2002), Phytoalexins from the Vitaceae: biosynthesis, phytoalexin gene expression SVTH: Lộc Tú Anh 41 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội in transgenic plants, antifungal activity, and metabolism, Journal of Agricultural and food chemistry 50 (10) 2731–2741 26 P Padee, S Nualkaew, C Talubmook, S Sakuljaitrong (2010), Hypoglycemic effect of a leaf extract of Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk in normal and streptozotocin-induced diabetic rats, Journal of Ethnopharmacology , 132, 491496 27 Quang-Vinh Nguyen and Jong-Bang Eun (2013), Antimicrobial activity of some Vietnamese medicinal plants extracts, Academic fournals Vol 7(35), pp 2597-2605 28 S Sakanaka, N Shimura, M Alzawa, M Kim, T Yamamoto (1992), Preventive Effect of Green Tea Polyphenols against Dental Caries in Conventional Rats, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Vol 56, pp592-594 29 Singleton, V.L., Orthofer, R., Lamuela - Raventos, R.M (1999) Analysis of total phenol andother oxydation substrates and antioxydants by means of Folin Ciocalteu reagent Method Enzymol, Methods in enzymology Vol 299, pp 152 – 178 30 Thouri, A., Chahdoura, H., El Arem, A., Omri Hichri, A., Ben Hassin, R., & Achour, L (2017) Effect of solvents extraction on phytochemical components and biological activities of Tunisian date seeds (var Korkobbi and Arechti) BMC Complementary and Alternative Medicine 17 Vol 248 31 Truc Cong Ho and Byung-Soo Chun (2019), Extraction of Bioactive Compounds from Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk Using Subcritical Water and Conventional Solvents: A Comparison Study, Journal food science Vol 84(5), pp1201-1207 32 CDC/ Matthew J Arduino, DRPH; Janice Carr – This media comes from the Centers for Disease Control and Prevention's Public Health Image Library (PHIL), with identification number #6486 33 Courtesy of Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH 34 Mogana Das Murtey, Patchamuthu Ramasamy (2016), Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy – Life Sciences SVTH: Lộc Tú Anh 42 Khóa luận tốt nghiệp 35 Dr Nick Khoa CNSH – Đại học Mở Hà Nội Read, Fungal Cell Biology Group (2007), https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Aspergillus_niger Hà Nội, ngày 29 tháng năm 2021 Người hướng dẫn Sinh viên thực (Ký ghi rõ họ tên) (Ký ghi rõ họ tên) Lộc Tú Anh SVTH: Lộc Tú Anh 43