Nghiên cứu định hướng khả năng ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm của cây hoàn ngọc

Trang 1

Khĩa luận tốt nghiệp Khoa CNSH - Đại học Mở Hà Nội

'TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP

DE TAI:

NGHIEN CUU DINH HUGNG KHA NANG

UNG DUNG LAM CHAT BAO QUAN THUC PHAM CUA CAY HOAN NGOC

GIÁO VIÊN HUGNG DAN : PGS.TS Nguyễn La Anh SINH VIÊN THỰC HIỆN : Lộc Tú Anh

Lớp : 01

Mã sinh viên :17A31010032

Chuyên ngành : Cơng nghệ sinh học

Hà Nội, 5/2021

Trang 2

MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MUC CHU VIET TAT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẰNG MỞ ĐẦU Muc tiêu nghiên cứ Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG I TỎNG QUAN 1.1 Các vi sinh vat gây hư hỏng ở thực phẩm 1.1.1 Vi khuẩn 1.1.1.1 Clostriditun perƒringens 1.1.1.2 Staphyllococeus aureus 1.1.1.3 Escherichia coli 1.1.1.4 Bacillus cere 1.1.2 Nắm mốc 1.1.3 Nắm men 1.2 Các hợp chất cĩ hoạt tính sinh học từ thực vật ccc-cceoeeeeceererreee 7 1.2.1 Phân loại 1.2.1.1 Polyphenol 1.2.1.3 Flavonoid 1.2.1.4 Quinone 1.2.1.5 Alkaloid 1.2.1.6 Glycoside 1.2.1.7 Saponin 1.2.1.8 Tannin 1.2.1.9 Terpenes va tinh di 1.2.1.10 Peptides 1.2.2 Cơ chế kháng khuẩn 1.3 Cây Hồn ngọc

1.3.1 Tác dụng dược lý của cây Hồn ngọc

Trang 3

Khĩa luận tốt nghiệp Khoa CNSH ~ Đại học Mở Hà Nội CHƯƠNG II: VẬT LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU S22 2.1 Vật liệ 2.1.1 Đối tượng 2.1.2 Hĩa chất thí nghiệm 2.1.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 2.1.4 Mơi trường và dung dịch đệm 2.2 Phương pháp vì sinh

2.2.1 Phương pháp đếm số lượng tế bảo bằng buồng đếm hồng cầu 2.2.2 Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng trang cấy 2.3 Phương pháp tách chiết lá Hồn ngọc 2.3.1 Phương pháp ngâm 2.3.2 Phương pháp trích ly hồi lưu

2.4 Phương pháp kiểm tra khả năng ức chế VSV gây hư hỏng thực phẩm:

2.5 Phương pháp xác định nơng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết lá Hồn ngoc28

2.6 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol „28

2.7 Phương pháp xác định hàm lượng Flavonoid sec 29 2.8 Thử nghiệm dịch chiết lá Hồn ngọc trên thực phẩm - 2

CHUONG III: KET QUA

3.1 Hoạt tính kháng lại một số vì sinh vật gây hư hỏng trong thực phẩm của dịch 30

chiết lá Hồn ngọc

3.2 Ảnh hưởng của các yếu tổ tới hiệu quả tách chiết lá Hồn ngọc 0 3.2.1 Ảnh hưởng của dung mơi

Trang 4

4 {oD Optical Density — mat d6 quang |

Trang 5

Khĩa luận tốt nghiệp Khoa CNSH ~ Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC HÌNH Hình 1: Vĩ khudn Staphylococcus aureus trên kính hiển vi điện tử

Hình 2: Escherichia coli trên kính hiển vi điện tử Hinh 3: Bacillus cereus trên kính hiên vi điện tử

Hinh 4: Aspergillus niger trén kính hiển vi điện tử

Hình 5: Cấu trúc hĩa học của một số nhĩm chat thudc polyphenol Hình 6: Cấu trúc hĩa học của Resveratrol

Hình 7: Cấu trúc hĩa học của một số flavones và flavonoids

Hình §: Cấu trúc hĩa học của một số quinones đại dign 1a quinone va hypericin 11 Hình 9; Cấu trúc hĩa học của một số alkaloids

Hình 10: Cyanidin O-galactoside và flavone C-glycoside 13

Hinh 11: Sarsapogenins trong Yucca

Hình 12: Cấu trúc đại diện của tannin Hình 13: Cơ chế kháng khuẩn của tỉnh dầu

Hình 14: Ảnh hưởng của tỉnh dầu cây Metha piperita tới thành tế bào sợi nắm và sự hình thành bào tử của Aspergillus niger (a,b) and Penicillium hirsutum (c,d) khi nuơi cấy trên đĩa Petri chứa 20 nl tỉnh dầu

Hình 15: Cấu trúc thứ cấp của AMP: A) xoắn ơ, B) vịng x‹ ngẫu nhiên, D) hỗn hợp ø / ÿ Hình 16: Cây Hồn ngọc Hình 17: Cấu trúc lupeol và betulin

Hình 18: Dịch chiết bằng phương pháp trích ly hồi lưu

Hình 19: Hoạt tính kháng lại ching Staphylococcus aureus CNTP 6077 cita dich

chiết lá Hồn ngọc tách chiết ở các nhiệt độ khác nhau

Trang 6

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1 Cơ chế của các hợp chất kháng khuẩn từ thực vậ

Bảng 3 I Hoạt tính kháng tại một số chủng VSV gây hư hỏng thực phẩm

Bảng 3 2 Ảnh hưởng của dung mơi tới hiệu quả tách chiết lá Hồn ngọc 3l

Bảng 3 3 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu quả tách chiết lá Hồn ngo\ 2 Bảng 3 4 Đặc điểm của dịch chiết lá Hồn ngọc thu nhận từ các vùng nguyên liệu

khác nhau 33

Bảng 3 5 Ảnh hưởng của nồng độ chất khơ trong dịch chiết lá Hồn ngọc đối với

chung Staphylococcus aureus CNTP 6077 35

Bang 3 6 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Hồn ngọc tới mật độ tế bào VSV ở mẫu tương ớt Mường Khương trong thời gian lưu trữ -ecesereevŸ7

Trang 7

Khĩa luận tốt nghiệp Khoa CNSH ~ Đại học Mở Hà Nội

MỞ ĐÀU

Trong ngành cơng nghiệp thực phẩm, nguyên nhân chủ yếu dẫn tới các hư hỏng, ngộ độc ở sản phẩm là do nhiễm các vỉ khuẩn như Salmonella typhi, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus; nam men Candida albican hoặc nắm mốc Aspergillus niger, Fusarium oxysporum Do đĩ, việc ngăn ngừa các mầm bệnh này là yếu tơ được ưu tiên hang

đầu của các nhà sản xuất

Một trong những phương pháp truyền thơng là sử dụng nhiệt độ cao (UHT) hoặc nhiệt độ ở áp suất cao để tiệt trùng sản phẩm, chỉ phù hợp với một số sản phẩm đĩng hộp Phương pháp phổ biến hiện nay là sử dụng các hĩa chất (Sodium Benzoate, Potassium Sorbate ) để ức chế các vi sinh vật cĩ mặt trong sản phẩm Hiện nay, xu hướng sản xuất các loại thực phâm chất lượng cao, an tồn, cĩ nguồn gốc tự nhiên, khơng sử dụng các chất bảo quản hĩa học (dù được cho phép) Các cơng ty chế biến thực phẩm lớn ở Việt Nam cũng quan tâm đến hướng nghiên cứu

phát triển này nhằm tăng giá trị và độ an tồn cho sản phẩm của mình Nhiều sản phẩm thực phẩm nếu được bảo quản bằng chất bảo quản tự nhiên như các loại bánh truyền thống (bánh dẻo, bánh cốm, bánh đậu xanh ), các loại sản phẩm gia vị (tương ớt, nước sốt ) thì sẽ cĩ giá trị gia tăng cao hơn

Do đĩ, nhu cầu tìm kiếm các chất bảo quản thay thế, an tồn đối với con người

ngày càng tăng Trong đĩ, thực vật được coi là nguồn tự nhiên phong phú chứa các

hợp chất kháng khuẩn Hơn nữa, các hợp chất này cịn được cho là dễ phân giải, tránh được sự tích tụ trong chuỗi thức ăn

Hồn Ngọc là lồi cây phổ biển ở nước ta, được ứng dụng rộng rãi trong y học cổ truyền đề chữa các bệnh liên quan tới đường tiêu hĩa, làm lành các vết thương Một số nghiên cứu gần dây cho thấy lá cây Hồn Ngọc cĩ tiềm năng ức chế sự phát triển của một số vi khuân gây bệnh, khối u Xuất phát từ lý do trên, tơi thực hiện đề tài “Nghiên cứu định hướng khả năng ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm

của cây hồn ngọc”

Trang 8

Mục

u nghiên cứu

Đánh giá khả năng ức chế các vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm của dịch chiết từ cây Hồn ngọc và ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

Nội dung nghiên cứu

Khảo sát phương pháp tách chiết các hợp chất tự nhiên từ lá hồn ngọc

Đánh giá khả năng kháng nắm và kháng khuẩn của dịch chiết từ lá hồn ngọc Thử nghiệm dịch chiết lá hồn ngọc ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm

Trang 9

CHƯƠNG I TỎNG QUAN 1.1 Các vi sinh vật gây hư hồng ở thực phẩm

Các quá trình hư hỏng của thực phẩm do vi sinh vật gây nên và trong nhiều trường hợp chúng cịn tạo ra các độc tố ảnh hưởng đến sức khỏe con người Khi cĩ mặt trong thực phẩm, các VSV này cĩ thể gây bệnh trực tiếp bằng cách tiết ra độc

tố như: Clostridium botulimum, Staphyllococeus aureus; hoặc thơng qua thực phẩm,

xâm nhập vào cơ thể con người và gây bệnh: Zscherichia coli, Salmonella Tuy nhiên nhiều vi sinh vật mang đặc tính của cả hai dạng gây bệnh này như: Clostridium perfringens, Bacillus cereus

LLL Vi khudn [1][2]13]

1.1.1.1 Clostridium perfringens

Clostridium perfringens (C perfringens) là một loại vi khuẩn Gram (+), di

động và hình thành bào tử, được tìm thấy trong nhiều nguồn mơi trường cũng như: trong thực phẩm, tiêu hĩa của người và động

Cie bao tit ctia C perfringens chịu được nhiệt và sĩng sĩt qua quá trình nấu chín Tế bào cần một lượng lớn amino axit cho sinh trưởng, do vậy chúng cĩ thể sinh trưởng rất hiệu quả trong nhiều loại thực phẩm giàu protein

Trong sé 5 typ C perfringens, cdc ching thuge typ A tham gia gây các bệnh nhiễm trùng, gây độc phát sinh từ thực phẩm Các thực phẩm cĩ thể nhiém khuan này thường là thịt gia cằm, thực phẩm khơ Các triệu chứng do vi sinh vật này gây

ra là đau thắt vùng bụng, bệnh về đường tiêu hĩa và xuất hiện từ 8 - 24 giờ sau khi ăn một lượng lớn tế bào sống (từ 5 — 10° CFU/g) qua đường thực phẩm

1.1.1.2 Sfaphyllcoccus arews

Sfaphyllococcus aureus là một khuẩn cau Gram (+), các tế bào liên kết thành chùm, khơng di động, khơng tạo bảo tử Chúng cĩ khả năng chịu được sự khơ hạn, nơng d6 mudi cao (9 — 10%) Staphyllococcus aureus c6 thé san sinh ra cdc loai độc tố gây dung huyết, diệt bạch cầu, hoại tử da, gây chết, độc tố đường ruột và các yếu tố độc lực ngoại bào Ngồi ra chúng cịn hình thành những nhân tố gây bệnh như: chất làm tan tơ huyết, men làm đơng huyết tương, nhân tố khuếch tán (Trần Thị Phận, 2004)

Trang 10

Staphyllococcus aureus khi nhiém vào thực phẩm sẽ phát triển rất nhanh, sinh và khơng bị phút Điều đáng chú ý là các loại độc tố này hồn tồn khơng ảnh hưởng đến mùi vị hân hủy ở 100% trong 30 ra độc tố đường rust enterotoxin bn nhí

hay cảm quan của thực phẩm Do đĩ, rất khĩ phát hiện tình trạng hư hỏng thực phẩm do nhiễm tụ cầu Khi ăn phải thực phẩm cĩ chứa độc tố này, sau 4 - 6 giờ xuất

hiện các triệu chứng về đường tiêu hĩa Các thực phẩm cĩ chứa hàm lượng muối cao

cĩ nguy cơ nhiễm như jambon, kem tơng hợp, nước soup, vì các loại thực phẩm này ít được xử lý ở nhiệt độ cao

Sự kháng thuốc ở S/aphylococeus aureus là đặc điểm rất đáng lưu ý Đa số

Staphylococcus aureus khang lại các nhĩm kháng sinh nhĩm ƒ-lactams nhờ men j- lactamase (Nguyễn Thanh Bảo, 2003) Một số cịn kháng được methicillin, do nĩ

tạo được các protein gắn vào vị trí tác động của kháng sinh Hiện nay một số các tụ cầu cịn đề kháng được với các thế hệ kháng sinh cephalosporin Staphylococcus aureus gay lên các bệnh nhiễm khuẩn ngồi da như làm mưng mủ các vết thương, làm các tổ chức bị sưng, tạo thành áp se Từ các ư nhiễm trùng

Trang 11

1.1.1.3 Escherichia coli

Escherichia coli thugc ho Enterbacteriaceae, Gram (-), trực khuẩn ngắn, di động, khơng tạo bào tử, chịu được nhiệt Z.coii cĩ thể kháng cồn, khơng bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%

E.coli là vi sinh vật hiểu khí phổ biến trong đường tiêu hĩa người, các lồi động vật máu nĩng Hầu hết các dịng Z.cọi tồn tại khơng gây hại trong đường tiêu hĩa, ngược lại chúng cịn đĩng vai trị quan trọng trong việc ơn định sinh ý đường tiêu hĩa Tuy nhiên cĩ 4 dong sau đây cĩ thể gây bệnh cho người và một số lồi động vật Enteropathogenic E.coli (EPEC) Emerorocienic E.coli (ETEC) Enteroinvasive E.coli (EIEC) Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC) hay E.coli 0157: H7

Dịng vi khuẩn E.coli 0157: H7 1a một lồi vi khuẩn gây hại nhất cĩ trong thực phâm và thường cĩ mặt trong các sản phâm: bánh mì, thịt bị chưa được nấu chín, sữa tươi, nước táo chưa thanh trùng £ coli O157:H7 với kháng nguyên đặc hiệu thân (O) và kháng nguyên lơng (H) đã nhận các gene độc và sinh ra chất

độc Shiga gây ra bệnh tiêu chảy ở người

Hinh 2: Escherichia coli trên kính hiển vi điện tit [33] 1.1.1.4 Bacillus cereus

B cereus là trực khuẩn Gram dương, sinh bảo tử, ky khí tùy ý, sinh trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 5 - 50°C, tối ưu ở 35 - 40°C Tuy nhiên, các chủng

chịu lạnh cũng cĩ thể nhân bản ở nhiệt độ từ 4 ~ 6°C; trong những trường hợp nay,

Trang 12

thời gian nhân bản thường dài hơn đáng kẻ Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, n phẩm khơ, ) các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị,

B cereus tiết ra hai loại độc tố là độc tố gây tiêu chảy và độc tố gây nơn mửa Độc tố gây tiêu chảy sản sinh trên thịt, rau quả, gia vị Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột, gây tiêu chảy cĩ thể nguy hiểm đến tính mạng Độc tố gây nơn mửa bị nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các loại và bản chất độc tố là phospholipid cĩ tính ơn định, khơng bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi Ư cereus khi thực phẩm được chuẩn bị mà khơng được giữ lạnh vài giờ trước khi sử dụng Triệu chứng ngộ độc phơ biến là đau bụng, rối loạn tiêu hĩa, bắt đầu từ 14 — 16 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm Hinh 3: Bacillus cereus trên kính hiển vi điện tử [34] 1.1.2 Nắm mốc Nắm mốc cĩ nhiều loại khác nhau và cĩ một số cĩ khả năng gây bệnh Các loại nắm mốc này sinh trưởng và phát triển trên thực phẩm tạo ra độc tố y độc cho con người như Aspergillus niger, Penicillium, Pyricularia oryzae, Rhezoctonia solani,

Một số chủng Aspergillus flavus, A parasiticus, A niger sinh ra déc t6 aflatoxin, loai chat déc gây ung thư, đột biến Các nắm mộc này phát triển ở nhiệt độ từ 7 ~ 40C và tối ưu ở 24 - 28C, do vậy cĩ khả năng tăng trưởng tốt trên các loại ngũ cốc, nơng sản (gạo, lúa, đậu phộng, ) Một sĩ chủng enicillium (đặc biệt PP verrucosum) và Aspergillus sinh độc tố ochratoxin gây ức chế sự vận chuyền của

Trang 13

axit ribonucleie, các axit amin và làm ức chế sự tổng hợp protein trong tế bào và cơ thể; đây là độc tố gây ung thư và nhiễm độc thận Những nắm mốc này rất phổ biến, gây hỏng thực phẩm Aspergillus niger xuat hién trén một số lồi trái cây và rau quả như nho, mơ, hành tây và đậu phộng và gây ra bệnh nấm meo Penicillium phát triển tốt ở mơi trường axit 0,5% gây nên mốc xanh trên quả cĩ múi và thối mĩc trên cà chua Từ các nguyên liệu này, nắm mốc và độc tố cĩ thể nhiễm vào thực phẩm gây ngộ độc cho người Hinh 4: Aspergillus niger trén kinh hién vi điện tử [35] 1.1.3 Nắm men

Nam men là nhĩm nắm cĩ cơ thê đơn bào hoặc tập hợp đơn bào, nhân chuẩn, hiển vi Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong mơi trường cĩ chứa đường, cĩ pH thấp, chăng hạn như trong hoa quả, mật mía, rỉ đường, mật ong, Nắm men làm thực phẩm ít bị biến đổi và chỉ làm lên men các loại thực phẩm cĩ đường

Saccharomyees cerevisiae là mội loai nam tai (Ascomycetes), cĩ dạng hình cầu, sinh sản bằng cách tạo chdi va tao bao ttt Candida tropicalis sng ky sinh & vo của dứa, sản xuất ra protease aspartyl va enzyme phospholipase pha hoại cấu trúc

thành tế bào của vật chủ

1.2 Các hợp chất cĩ hoạt tính sinh học từ thực vật

Nhiều hợp chất cĩ hoạt tính sinh học, tách chiết từ thực vật đã được ứng dụng

trong các lĩnh vực được phẩm, mỹ phẩm Trong ngành thực phẩm, các hợp chất cĩ

Trang 14

hoạt tính kháng khuẩn được sử dụng để kiểm sốt sự hư hỏng và sự phát triển của vi

khuẩn gây hai, thay thé cho các chất hĩa học — những chất chỉ được sử dụng một

liều lượng giới hạn, do tính độc và khả năng gây ung thư và các vấn đề về mơi trường, Các hợp chất này thường là các chất chuyển hĩa thứ cấp, được thực vật tơng hợp trong một giai đoạn sinh trưởng và phát triển hoặc trong những giai đoạn căng thăng nhất định, gây ra bởi sự tắn cơng của vi sinh vật, thiếu chất dinh dưỡng Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ thực vật, phụ thuộc vào nhiều yếu tố: lồi

thực vật, điều kiện mơi trường, khí hậu, phương thức thu hoạch và cơng nghệ tách

chiết Dựa trên cấu trúc hĩa học, đặc tính, các chất chuyền hĩa được phân loại thành các nhĩm khác nhau như: flavonoid, alkaloid, tannin, terpenoid, peptide

1.2.1 Phân loại 1.2.1.1 Polyphenol

Polyphenol là chất chuyền hĩa thứ cấp phơ biến ở tất cả các lồi thực vật bậc

cao và cĩ vai trị chống lại vỉ sinh vật gây hại cho thực vật, chống oxi hiệu quả

điểm chung của polyphenol là trong phân tử cĩ vịng thơm (vịng benzen) chứa một, hai hoặc nhiều nhĩm hydroxyl (OH) gắn trực tiếp vào vịng benzen

Polyphenol được phân loại dựa vào số lượng vịng phenolic và các cấu trúc liên kết với vịng này Polyphenols bao gồm axit phenolic (axit gallic, axit vanillie ), flavonoid (flavonones, flavones, xanthones, catechins ), lignans,

stilbens và các polyphenol khác [4]

Trang 15

by mee 004 Phenolic acids (lydroxy-benzioc & cinnamie acids) Flavonoids chụo — ” œ — a Stitbenes Lignans

Hình 5: Cấu trúc hĩa học của một số nhĩm chất thuộc polyphenol

Axit phenolic là những hợp chất cĩ đặc điểm của nhĩm chức caboxylie, cĩ thé được chia làm hai nhĩm: nhĩm các dẫn xuất của axit benzoic như axit gallie và nhĩm các dẫn xuất của axit cinnamic như axit coumaric, axit caffeic va axit ferulic

Axit caffeic là một axit phenolic phổ biến nhất, chứa trong nhiều loại trái cây và rau

quả, thường được este hĩa với axit quinic trong axit chlorogenic, là một hợp chất

phenolic chủ yếu trong cà phê Một axit phenolic phổ biến khác là axit ferulic, đĩ là chất cĩ trong ngũ cốc và được este hĩa tạo thành các hemicelluose cĩ trong tế bảo Các hợp chất phenolie cĩ chuỗi C3 ở mức độ thấp hơn mức độ oxy hĩa được gọi là tỉnh dầu

1.2.1.2 Resveratrol

Resveratrol (3,5.4'-trihydroxystilbene) là một stilbenoid (dẫn xuất stilbenoid hydroxyl héa), lan dau duge phan lap trong ré cay Hellebore tring [25] Resveratrol

được cây sản xuất ra khi cĩ sự kích thích từ mầm bệnh, tia cực tím hoặc ozone,

Trang 16

OH

Hình 6: Cau trác hĩa học của Resveratrol

1.2.1.3 Flavonoid

Flavonoid là các dẫn xuất polyphenol (cĩ nhiều nhĩm chức phenol), là nhĩm hợp chất tự nhiên được tìm thấy trong thực vật cĩ mạch như dương xỉ, cây hạt trần, Các fTavonoid cĩ cấu trúc cơ bản là diphenylpropan (C6-C3-C6) gồm 2 vịng benzen A, B và vịng pyran C Flavonoid được tơng hợp trong tế bảo thực vật, cĩ hoạt tính kháng khuẩn do chúng cĩ khả năng tạo phức với các protein ngoại bào và với thành tế bào vi khuẩn Flavonoid càng ưu béo càng cĩ khả năng phá vỡ màng tế

bao vi sinh vat [14,18] eG O 0 OH H0 0 XS ‘OH OH OH 0 H0,

flavone catechin chrysin

Hinh 7: Cau tric héa hoc ctia m6t sé flavones va flavonoids

Catechin được chiết xuất từ trà xanh, cĩ thể tạo liên kết trực tiếp với protein gây ra hiện tượng ngưng kết, đây là tính chất đặc trưng cho hoạt tính kháng khuẩn Catechin cĩ tác dụng gây ức ché enzyme glucosyltransferase cula Streptococcus ‘mutans (28), ức chế hoạt động của Shigella [7]

Trang 17

1.2.1.4 Quinone

Quinone là các hợp chất hữu cơ cĩ gốc thơm gồm benzen, naphtalen, anthracene và phenanthren Quinone tồn tại trong thực vật bậc cao như: Polygonaceae, Rubiaceaae, Legumimosae, Rhamnaceae, Labiatae va họ Boraginaceae Một lượng lớn quinones cĩ hoạt tính sinh học, chẳng hạn như các hoạt động kháng khuẩn và chồng ung thư từ hợp chất juglone và puglone được phân lập từ các lồi Fuglans và Plumbago [15] Iuglone cĩ hoạt tính kháng khuẩn với vỉ khuan S aureus bing cách làm thay đổi thành tế bào và ting tính thắm qua màng

Quinone là những hợp chất cĩ nhiều màu sắc gây ra phản ứng hĩa nâu trong trái cây, rau quả và là chất trung gian trơng quá trình tổng hợp sắc tố trên da Ngồi hoạt tính kháng khuẩn, các hợp chất này cịn thể hiện nhiều hoạt tính sinh học khác như chống oxy hĩa, kháng u Đặc biệt, anthraquinon cĩ phổ hoạt động kháng khuẩn rộng bao gồm cả mycobacteria, dựa trên sự ức chế hoạt tính và làm mất chức năng

protein của vi khuẩn Habbal và cộng sự, 2011, đã báo cáo quinine từ dịch chiết cây Lawsonia inermis, ức chế sự phát triển của P aeruginosa [23] OH QO OH i ng ao ÉX 1 Cr X3 OH OOH quinone hypericin Hình 8: Cấu trúc hĩa học của một 1.2.1.5 Alkaloid Alkaloid la hgp tính rất cao nhu aconitin trong 6 dau, strychnin trong hat mã

quinones dai diện là quinone va hypericin it hữu cơ cĩ chứa nitơ, đa số nhân dị vịng Một số

alkaloids cĩ chứa

tiền, gelsemin trong lá ngĩn, solanin trong mầm khoai tây Alkaloid thường chỉ cĩ ở một số thực vật hai lá mầm nhất là ở cac ho Ranunculaceae, Papaveraceae,

Trang 18

nicotine, tropane, atropine, cocaine, quinine, papaverine, morphine, codeine, strychnine, caffeine [4]

Dich chiét 14 Tamarindus indica (Fabaceae) cé tac dung kháng khuẩn đối với vi khuẩn Gram durong nhu S aureus, E coli va Gram âm P aeruginosa nhưng khéng chéng lai Salmonella typhi [21] Dich chiét berberin cita cay hong lién cĩ tác dụng với vi trùng bệnh sốt rét, kháng vi khuân Shigella, tụ cầu khuẩn

Gee “Ty ở

Hình 9: Cấu trúc hĩa học của một số alkaloids

1.2.1.6 Glycoside

Glycoside là hợp chất hữu cơ trong đĩ cĩ một đường liên kết với một nhĩm chức năng thơng qua một liên kết glycosid Nhiều lồi thực vật cĩ hợp chất ở dạng #lycoside khơng hoạt động và được kích hoạt bởi enzyme thủy phân, làm cho phần đường bị phá vỡ đề dé dàng sử dụng được

Trang 19

Khĩa luận tốt nghiệp Khoa CNSH ~ Đại học Mở Hà Nội Hình 10: Cyanidin O-galactoside vé flavone C-glycoside 1.2.1.7 Saponin

Saponin là các hợp chất cĩ nguồn gốc từ steroid hoặc glycoside triterpenoid và hoạt động trên tế bào vi sinh vật bằng cách thẩm thấu qua màng Khi thủy phân bằng axit lỗng hay bằng enzyme thì sẽ nhận được các aglycon steroid được gọi là sapogenin steroid, các sapogenin steroid nay thi tan trong nước và cĩ khả năng tạo bọt Saponins tìm thấy trong thực vật họ cà, chồi non yến mạch, hạt của cây C annuum cĩ khả năng chống lại một số vi khuẩn và nắm men [19] Saponin trong chất chiết xuất từ Yucca cĩ khả năng kháng khuẩn đối với vi khuẩn Gram (+) nhưng khơng ảnh hưởng đến vi khuẩn Gram (-) [16]

Hình 11: Sarsapogenins trong Yucca

1.2.1.8 Tannin

Tannin là những hợp chất polyphenol cĩ trong thực vật cĩ khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử như amino axit và alkaloit Khi liên kết với protein chúng làm mắt hoạt tính của protein chức nang

Trang 20

(protein vị là chất nỗi chuyển, enzyme, tế bao polypeptid, ) Tannin trong thực tiếng với nhiều tính ứng dụng thực tế, đặc bi

là trong y học cơ truyền và cơng

nghiệp thuộc da Chúng được tổng hợp ở tắt cả các bộ phận của cây và tìm được số lượng lớn trong vỏ và lá sồi, vân sam, ĩc chĩ, việt quất và trong quả một số lồi như

Terminalia chebula, Caesalpinia brevifolia [8] Tannin đĩng vai trị quan trọng tăng sức đề kháng của cây đối với virus, vi sinh vật và tác động đến các hoạt động

sinh lý như kích thích hoạt động tế bào thực bào, hoạt động kháng khuẩn và kháng nắm vo Ta “xŠ tay oa whe ap Ho “ors Oh é 2 on ou on Ì no Son on pentagallylgucose procyanidin

Hình 12: Cấu trúc dai dién ctia tannin

1.2.1.9 Terpenes va tinh dầu

Tỉnh dầu là hợp chất thơm dễ bay hơi, khơng tan trong nước nhưng tan trong dung mỗi hữu cơ được tìm thấy trong các bộ phân cây như hoa, quả, lá, và được chiết xuất bằng phương pháp chung cat hoi nước hoặc chiết xuất qua dung mơi hữu cơ Trong tỉnh dầu cĩ 90-95% là monoterpen, sesquiterpene và các dẫn xuất oxy hĩa, andehit, rượu, este [4] Trong đĩ, các hợp chất cĩ khả năng kháng khuẩn và

kháng nắm là terpens (p- cymene, limonene), terpenoids (thymol, carvacrol), phenylpropenes (eugenol, vanilin) và các hợp chất khác như allicin hoặc

Trang 21

Khĩa luận tốt nghiệp Khoa CNSH ~ Đại học Mở Hà Nội “ổn thưởng protein Phá hủy màng tế bào thành tế bảo Cơ chế hoạt động của tỉnh dâu đơi với VSV Thay phan ATP à làm giảm

Hình 13: Cơ chế kháng khuẩn của tỉnh dầu

Cineol trong tỉnh dầu từ cây bạch đàn cĩ tác dung khang Bacillus subtilis va Staphyllococcus aureus nhung kém tác dụng với E coli Tình dầu từ các lồi cây xả

Trang 22

Hình 14: Anh hưởng của tỉnh dâu cây Metha piperita tới thành tế bào sợi nắm và

sự hình thanh bao tir cia Aspergillus niger (a,b) and Penicillium hirsutum (c,d) khi

nuơi cấy trên đĩa Petri chứa 20 ul tinh dau

1.2.1.10 Peptides

Để bảo vệ chống lại mầm bệnh, thực vật tổng hợp protein là các enzyme

(glucanases, proteinases, amylases, oxydases) cĩ vai trị như là chất chuyển hĩa

chính, nhưng cũng cĩ các peptit cĩ trọng lượng phân tử lượng thấp khoảng I0kDa,

được gọi là peptit kháng khuân (AMPs) AMPs được phân lập từ một lượng lớn

thực vật và được phân loại theo cấu trúc thứ cấp và cấu trúc ba chiều gồm peptit mạch thăng; peptit mạch vịng với cấu trúc B và liên kết disulfide; chuỗi xoăn ơ kết hợp với B, liên kết qua liên kết disulfide; các peptit mạch thăng cĩ chứa gốc axit amin; các peptit nhỏ cĩ cấu trúc dạng vịng hoặc cấu trúc khơng xác định [10]

Trang 23

Khĩa luận tốt nghiệp Khoa CNSH ~ Đại học Mở Hà Nội = ' ¬ L5) 5 Hình 15: Cấu trúc thứ cấp của AMP: A) xoắn a, B) vịng xoắn / tắm, C) cuộn dây ngẫu nhiên, D) hỗn hợp œ /ÿ 1.2.2 Cơ chế kháng khuẩn

Theo Dịilani và Dicko [7] các hợp chất từ địch chiết thực vật tác động lên tế bào vi khuẩn theo các cơ chế như: thay đồi cấu trúc màng tế bảo chất: tương tác với protein ngoại bào (ATPase); rối loại và bất hoạt chức năng của màng ngồi vỉ khuẩn Gram (-) bằng cách biến đổi lipopolysaccharides: đơng tụ của các chất chứa

trong tế bào chất; ức chế quá trình tong hop enzyme

Bang 2 1 Co chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật

(Nhĩm Phan nhĩm | Hợp chât Co chi

Phenolics Phenols Catechol Gây mắt chất nền

—— Epicatechin | Tạo ra sự gián đoạn màng tế bào —_ Quinones | Hypericin Tạo phức với thành tế bào, bắt hoạt

ic enzyme

Flavonoids | Chrysin Liên kết với chất kết dính

Flavones | Abyssinin Tạo phức với thành tế bào, vơ hiệu ha enzyme Tannins Ellagitannin | Liên kết với protein, liên kết với chất kết dính, ức chế enzyme, sự mắt chất nền, tạo phức với thành tế bào, gián đoạn màng, sự tạo phức ion kim loại

Coumarins | Warfarin Tương tác với DNA

[Terpenoids, Capsaicin Tao ra sự gián đoạn mảng tế bào

Trang 24

Í essential oils Alkaloids Berberine Xen vio thành tế bào hoặc DNA Piperine

| Lectins and Mannose- Ngăn chặn sự dung hợp hoặc hap Polypeptides specific phụ của virus; tao cau nơi disulfide agglutinin Fabatin Các hợp chất kháng khuẩn tác động tới các vị trí đích của tế bào vi khuẩn, bao

gồm: màng tế ác protein (protein thụ thể, protein vận chuyển ion, các enzyme, protein điều hịa, protein cấu trúc) và axit nucleic

Cấu trúc màng tế bào bị suy giảm do đặc tính ưa béo của các terpenoit Các hợp chất ky nước này làm thay đơi phospholipid kép-của màng, tạo thành ra các lỗ

rỗng-cho phép khuếch tán hoặc vận chuyển các hợp chất cĩ hại Các chất chuyền

hĩa thứ cắp khác cĩ thể tương tác với các protein ngoại bảo, protein vận chuyển, ngăn chặn chức năng truyền tín hiệu và vận chuyển của các protein này Các tác động này dẫn sự chết của các tế bảo

Các chất kháng khuẩn thực vật cĩ thể tương tác với protein tế bào, do đĩ làm thay đơi cấu trúc bậc hai và bậc ba của những phân tử quan trọng này Khi cấu trúc ba chiều của protein bị thay đơi, cấu trúc và chức năng trao đồi chất của chúng cũng bị ảnh hưởng và gây ra những hậu quả đối với tế bào sống Những thay đổi về cầu trúc cĩ thể kích hoạt hoặc bất hoạt một protein Các chất chuyển hĩa thứ cấp cũng cĩ thê thay đổi cấu trúc trung tâm xúc tác của các enzyme gây mắt chức năng xúc

tác

Các chất chuyển hĩa thứ cấp cĩ chứa các nhĩm alkyl hoặc các phân tử tương

tự như các bazơ nitơ trong ADN hoặc ARN cĩ thể sửa đơi các axit nucleic bằng

cách alkyl hĩa và sự thêm vào chuỗi ADN Những thay đổi này cĩ thê dẫn đến đột biến điểm và cuối cùng trình tự các axit amin trong protein bị sửa đổi Trên thực tế, các chất chuyển hĩa của chất kháng khuẩn cĩ thể ảnh hưởng đến tồn bộ hệ thống sao chép, phiên mã và dịch mã [20]

1.3 Cây Hồn ngọc

Cây hồn ngọc trắng, cĩ tên khoa học là Pseuderanthemum palatiferum

(Nees) Radlk, là một loại dược liệu, thuộc dạng cây bụi sống lâu năm, cĩ chiều cao

Trang 25

từ I — 2m, thân non màu xanh lục, phân nhiều cành mảnh, lá hình mũi mác mọc đối, dai 12-17 cm, rộng 3-3,5 em, gốc thuơn, đầu nhọn, mép nguyên Cây hồn ngọc

trắng phát triển phổ biến ở các nước nhiệt đới, cĩ vùng phân bố rộng ở khu vực Đơng Nam Á, Trung Quốc, Ở Việt Nam được thấy nhiều ở tỉnh Ninh Bình (Cúc Phương)

Hình 16: Cây Hồn ngọc 1.3.1 Tác dụng được lý của cây Hồn ngọc

Theo nghiên cứu dược lý hiện đại, cây Hồn ngọc chứa hàm lượng đáng kể

cdc sterol, flavonoid, carotenoid, acid hữu cơ và đường khử

Năm 2006, trường Đại học Cần Thơ, Đại học Nơng nghiệp và cơng nghệ

Tokyo kết hợp với Trung tâm nghiên cứu quốc tế về khoa học nơng nghiệp Nhật

Bản đã cơng bố về tác dụng phịng chống 25 loại bệnh của lá hồn ngọc như gan nhiễm mỡ, u xơ, huyết áp, tiểu đường, nhiễm khuẩn, rối loạn chức năng

Năm 2010, P Padee và cs., đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cao dịch chiết 80% cthanol lá cây Hồn ngọc (P palarjerum) trên chuột bị bệnh tiêu đường, bình thường và chuột bị bệnh tiểu đường do streptozotocin gây ra Kết quả cho thấy, dịch chiết đã thể hiện tác dụng hạ đường huyết trên chuột bị tiểu đường ở mức liều 250 mg/kg chuột Dịch chiết cũng cĩ tác dụng ngăn chặn các biến chứng do bệnh

tiểu đường gây ra và tăng cường chức năng của gan và thận [26]

Trang 26

Năm 2011, nghiên cứu ứr viro và in vivo được thực hiện trên chuột của địch chiết từ

P.Khonsung và cộng sự cho tÌ cây hồn ngọc cĩ tác dụng hạ huyết áp và làm chậm nhịp tim hiệu quả

1.3.2 Các hợp chất cĩ hoạt tính sinh học của cây Hồn ngọc

Các nghiên cứu của Trần Cơng Khánh và cs., [5] cho thấy, các hợp chất cĩ : B- sitosterol, phytol, 3-O-(B-D-

glucopyranosyl)-sitosterol, hỗn hợp stigmasterol và poriferasterol, I-triacoltanol, hoạt tính sinh học trong cây Hồn ngọc bao gồi

glycerol 1-hexadecanoate, axit palmitic va axit salicylic

Kết quả nghiên cứu của PGS TS Nguyễn Văn Hùng và cs., [6], cho thấy cây Hồn ngọc chứa nhiều các hợp chất cĩ hoạt tính sinh học cĩ giá trị như: lupeol,

lupenone, betulin, axit pomolic, epifriedelanol, sitosterol, beta-sitosterol glucoside Trong dé, lupeol và betulin là hai triterpene cĩ hàm lượng cao nhất, chiếm tương ứng 0,56% và 0,36% so với khối lượng khơ JA, ro * Lupeol “ Betmlin

Hình 17: Cấu trúc lupeol và betulin

Betulin là một trong các hợp chất tự nhiên được phân lập sớm nhất, cĩ nhiều trong vỏ cây bạch dương (8e/la) Hợp chất này đã được chứng minh là cĩ hoạt

tính chống ung thư, kháng nấm và chống virus Ngồi ra, các nghiên cứu cho thấy,

betulin cịn cĩ tác dụng bảo vệ gan, ngăn ngừa và điều trị sự trúng độc cấp do rượu gây ra

Các nhà khoa học ở đại học Minnesota (Mỹ) và Irkutsk (Nga) đã phát hiện cơ chế ức chế hoạt động của betulin đối với virut HIV và nhiều dịng tế bào ung thư

khác Theo đĩ, betulin cĩ khả năng ức chế HIV thâm nhập vào tế bào T bằng cách phong tỏa gp41 ~ một protein cần thiết để virut HIV truyền bệnh vào tế bào lành

Trang 27

Ngồi ra, độc tố cao của betulin cĩ khả năng giết chết nhiều loại tế bào ung thư do kích thích cơ chế phá hủy tế bào bệnh Betulin được chuyên hĩa thành axit betulinic là một hợp chất quý hiếm cĩ khả năng ức chế khối u và ức chế HIV rất hiệu quả so với một số thuốc khác hiện đang được dùng để điều trị bệnh HIV

Lupeol là hợp chất tritecpen cĩ mặt trong nhiều lồi thực vật như ơ liu, sung, Lupeol đã được chứng minh là hoạt chất của nhiều cây thuốc dân gian như:

xồi

Cay Bin (Crateva nurvala), vỏ cây gạo (Bombax ceiba) Hoạt tính kháng viêm và chống viêm khớp của lupeol được đề cập đến thường xuyên hơn cả axit betulinic và betulin

Lupeol cĩ khả năng ức chế khơng cao (ở mức độ vừa phải) nhưng rất đặc hiệu đối với các dịng tế bào ung thư Đối với tế bảo ung thư tuyến tiền liệt nhạy với androgen, nĩ ức chế sự sinh sản của các tế bào ung thư bằng cách tắn cơng vào các đích tín hiệu ÿ-catenin Lupeol ức chế quá trình thu nhận tín hiệu của các tế bảo ung thư tuyến tụy Nĩ cịn cĩ tác dụng chống lại sự phát triển của khối u trên mẫu sinh khối u ở da chuột nên cĩ thể dùng để điều trị và ngăn ngừa các rồi loạn về da và ung thư da Lupeol đã được chứng minh là cĩ tác dụng gây ra sự biệt hĩa và ức chế sự phát triển của khối u ác tính ở chuột và các tế bào bạch cầu ở người Lupeol cũng cĩ tác dụng bảo vệ tế bào chống lại sự gây độc của các gốc tự do Ngồi ra, Lupeol cịn cĩ tác dụng chống viêm Fernandez và cs., [11], đã báo cáo dịch chiết cita Pimenta racemosa vat osua chứa lupeol cĩ hoạt tính cao chống lại hai mơ hình

viêm cấp thực nghiệm: phù chân và phủ tai ở chuột

Trang 28

CHƯƠNG II: VẬT LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật

2.1.1 Đối tượng

Nguyên liệu: Cành và lá Hồn ngọc trắng tươi thu mua từ các tỉnh Hịa Bình, Vĩnh Phúc, Hà Nội được rửa sạch bằng nước máy, đề ráo và sấy khơ ở 45°C trong 2 ngày Sau đĩ, các nguyên liệu này được nghiền thành bột và bảo quản ở 4°C

Các chủng VSV kiểm định từ Bộ sưu tập giống của Viện Cơng nghiệp Thực pham gém: Bacillus cereus CNTP 6089, Staphylococcus aureus CNTP 6077, Lactobacillus plantarum JCM 1149, Escherichia coli CNTP 6078, Klebsiella pneumoniae subsp Pneumoniae CNTP 6079, Salmonella enterica subsp Enterica ATCC 14028, Penicillium oxalicum currie & thom POCT va Saccharomyces cerevisiae 7012

2.1.2 Hĩa chất thí nghiệm

‘ac héa chất pha mơi trường: Cao nấm men, cao thịt glucose,

CHICOONa.3H:O, K¿HPO¿3H:O, MgSO¿7H2O, MnSO.H2O, Saccharose, NaNO¿, KCI, FeSOa, Na¿COa và một số hĩa chất khác

Chất chuẩn quercetin, axit gallic và thuốc thử Folin ~ Ciocalteau

Dung mơi: methanol, ethanol, n-hexan

bị và dụng cụ thí nghiệm

hp tiệt trùng: SA - 300VF (Đài Loan) Máy ly tâm: SORVALL RC 6, Đức

May ly tim eppendoft: Mikro 22R, Hettich Zentrifugen, Đức Tủ cấy vơ trùng: Bassaire, Anh

Trang 29

2.1.4 Mơi trường và dung dịch đệm

* Mơi trường MRS (De Man ~ Rogosa ~ Sharp)

MRS là mơi trường được dùng để hoạt hĩa, nhân giống, bảo quản chủng vỉ khuan Lactobacillus plantarum JCM 1149 Thanh phan: g/l Cao thit Ỹ 10,0 Cao nam men 15,0 Glucose § 20.0 Tween 80 : 1,0 CH;COONa.3H2O : 8,29 Amino citrate ÿ 2,62 K2HPOs.3H20 : 2/15 MgSO¿.7H2O 5 4,0 MnSOs.H20 i 5,0 pH=6,5-68

Thanh triing 6 121°C trong 15 phút * Mơi trường Czapek

Trang 30

* Mơi trường Hansen

Mơi trường Hansen là mơi trường dùng để nuơi cấy chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae T012 Thanh phan: g/l Glucose ĩ 50,0 Cao thịt i 10,0 KH2POs š 3,0 MgSO 7H20 § 20 pH= 5.0~6,0

Thanh tring 6 121°C trong 15 phat * Moi trudng NA (Nutrient agar)

Trang 31

2.2 Phương pháp vi sinh

2.2.1 Phương pháp đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu

Nguyên tắc: Các VSV đơn bào như nắm men, vi khuẩn sử dụng phương pháp định lượng dựa trên sự quan sát và đếm trực tiếp số lượng tế bào VSV bằng buồng

đếm hồng c

Phương pháp: Pha lỗng dịch lên men VSV đến nồng độ cần thiết Dùng pipet vơ trùng nhỏ 1 giọt dung dịch mẫu nhỏ vào giữa buồng đếm, đậy lại bằng phiến

kính Đặt buồng đếm lên bàn soi dưới kính hiển vi và chỉnh cửa sập kính hiển vi

cho cường độ ánh sáng phù hợp đề tiền hành đếm số lượng tế bào Đếm số lượng tế bào trong các ơ theo đường chéo hoặc theo các gĩc ở trung tâm khung đếm Mật độ tế bào = A*0,25*10°n Trong đĩ: A: số lượng tế bào trung bình của một ơ lớn n: hệ số pha lỗng, 2.2.2 Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng trang cấy c vỉ sinh vật khi được nuơi cấy trên mơi trường rắn thích hợp sẽ Nguyên tắc hình thành các khuẩn lạc và cĩ thể quan sát được bằng mắt thường

Phương pháp: pha lỗng 10 lần liên tiếp đến nồng độ cần thiết, hút 0,1ml mẫu nhỏ vào đĩa mơi trường, dùng que chang vơ trùng trang đều khắp bề mặt đĩa thạch Nuơi ở nhiệt độ và thời gian thích hợp tùy từng với chủng Đếm số khuẩn lạc hình thành Mỗi nồng độ trang cấy 2 đĩa, số khuẩn lạc được tính là trung bình số khuẩn lạc của 2 đĩa đĩ

Cơng thức: N=(M/0,1)*n (CFU/ml) Trong đĩ

N: mật độ tế bào

M: số khuẩn lạc trung bình

0,1: là thể tích mẫu đem trang cấy n:là hệ số pha lỗng mẫu

Trang 32

2.3 Phương pháp tách chiết lá Hồn ngọc 2.3.1 Phương pháp ngâm

Phương pháp nảy thực hiện theo mơ tả của Truc Cong Ho và cs [31],

Hồn ngọc và dumg mơi, tỷ lệ 1/10 (w/v) được phân phối vào bình Sehort

được đặt trên máy để ở nhiệt độ phịng, lắc 250 rpm trong 24h Sau đĩ, hỗn hợp được ly tâm 9000 rpm/15 phút để thu dịch trong phía trên Phần bã phía dưới được trích ly lần 2 với các điều kiện như trên Dịch thu được từ 2 lần trích ly được lọc qua giấy lọc và loại bỏ dung mơi bằng thiết bị cơ quay chân khơng ở 45°C Phần chất rắn khơ, được cân khối lượng để tính hiệu suất tách chiết và bảo quản ở 4°C cho tới khi phân tích

Hiệu suất tách chiết = R/S*100

Trong đĩ: R: khối lượng khơ của chất rắn sau tách chiết S: khối lượng khơ của nguyên liệu ban đầu

2.3.2 Phương pháp trích ly hồi lưu

Lá Hồn ngọc được tách chiết ở nhiệt độ bay hơi của dung mơi Phương pháp này được thực hiện như sau: Phân phối hỗn hợp nguyên liệu và dung mơi, tỷ lệ 1/10 (w/v), vào bình chiết và đặt trong bể ồn nhiệt Gia nhiệt bể ồn nhiệt lên 70°C, khi thấy hỗn hợp dịch trong bình cầu sơi lăn tăn Duy trì ở nhiệt độ này trong 5h Kết

thúc quá trình trích ly, hỗn hợp được làm nguội về nhiệt độ phịng và ly tâm Phần dịch sau đĩ được xử lý như mơ tả ở phần trước

Trang 33

Hình 18: Dịch chiết bằng phương pháp trích ly héi lưu

2.4 Phương pháp kiểm tra khá năng ức chế VSV gây hư hỏng thực phẩm Hoạt tính kháng lại một số VSV gây hư hỏng thực phẩm của dịch chiết lá Hồn ngọc, được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, theo mơ tả của Mostafa và cs [22]

500 tI dịch nuơi cấy của từng chủng VSV kiêm định (với mật độ 103 Cell/ml

~ đối với các chủng vi khuẩn, 10% cell/mI — đối với nắm men và 10 bào tử/ml - đối

với nắm mĩc) được trang đều trên các đĩa thạch chứa mơi trường dinh dưỡng phù hợp với từng lồi Đặt các khoanh giấy vơ trùng cĩ đường kính 6 mm lên bề mặt đĩa thạch

Chất rắn thu được của dịch chiết, được hịa lại trong methanol ở nồng độ 100 mg/ml 10 gl dịch chiết này được nhỏ vào khoanh giấy Methanol và nước cắt được 4°C trong 2 giờ cho dịch chiết khuếch

tán Sau đĩ các đĩa này được nuơi ở nhiệt độ thích hợp đối với từng chủng VSV

sử dụng làm đối chứng Đĩa thạch được đẻ

Hoạt tính kháng khuẩn, được thể hiện bằng đường kính vịng vơ khuẩn, gồm cả

khoanh giấy, sau 24 — 48h nuơi cấy

Trang 34

2.5 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết lá Hồn

ngọc

Nong độ ức chế tối thiểu (MIC) của dịch chiết lá Hồn ngọc đối với chủng vi khudn Staphylococcus aureus CNTP 6077 duge thyc hign theo mé ta cua Quang- Vinh Nguyen and Jong-Bang Eun [27], cĩ sửa đổi

y chủng CNTP 6077 ở 30°C, trong 24h (10%, v/v), được ly tâm

Dịch nuơi

9000 rpm/10 phút Sinh khối sau khi rửa lại bằng NaCl 0,85%, được bổ sung vào

mơi trường MSB cĩ nồng độ đậm đặc gắp 2 lần, chứa 0,05% phenol red như là chất chi thi pH Sau d6, 100 pl dich mơi trường này được phân phối vào các giếng trên đĩa Elisa 96 giếng Mỗi giếng, bỗ sung 100 u] hỗn hợp dịch gồm nước cất và dịch chiết lá Hồn ngọc sao cho nồng độ methanol cuối cùng trong mơi trường là 5% và nồng độ chất khơ của dịch chiết cuối cùng trong mơi trường nằm trong đải khảo sát 0,25 - 16 mg/ml Mẫu đối chứng âm, khơng bổ sung VSV Nhỏ parafin vào mỗi giếng So sánh màu sắc mơi trường giữa các giếng của mẫu và giếng đối chứng âm sau 24 — 48h nuơi cấy Giá trị MIC được ghi nhận ở giếng cĩ nồng độ thấp nhất ức chế sự phát triển của chủng CNTP 6077 quan sát thấy bằng mắt: màu của mơi trường giống với màu của mẫu đối chứng âm - khơng cĩ VSV)

2.6 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol

Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định theo phương pháp của Singleton và cs., (1999) [29], cĩ sửa đối

Nguyên tắc: Cho các hợp chất polyphenol cĩ trong mẫu thực vật sẽ bị oxy hố bởi thuốc thử Folin — Denis tạo ra sản phẩm màu xanh lam Cường độ màu của hỗn hợp tỷ lệ thuận với hàm lượng polyphenol trong dung dịch Căn cứ vào cường độ màu đo được trên máy so màu ở bước sĩng 770 nm và đồ thị chuẩn của axit gallic

với thuốc thử này cĩ thể xác định được hàm lượng polyphenol trong mẫu nghiên

cứu

Phương pháp: Dùng pipet hút 500 ul mẫu cho vào các ống nghiệm khơ Cho thêm 3,95 ml nước cất, 0,25 ml thuốc thử Folin — Ciocalteau lắc đều Sau 5 phút lịch NaaCOạ, lắc đều Để yên

(khơng được để quá 8 phúu, cho thêm 0,75 ml dung

30 phút trong bĩng tối, so màu trên máy quang phổ ở bước sĩng 770nm

Trang 35

Khĩa luận tốt nghiệp Khoa CNSH ~ Đại học Mở Hà Nội Hàm lượng polyphenol tổng số được tính theo cơng thức sau: P%=(mi V.100)/(m›.v.1000) P: hàm lượng polyphenol tính theo % chất khơ

mị : số mg axit gallic xác định theo đồ thị chuẩn v: số ml dịch chiết lấy làm thí nghiệm

V: tổng số dịch chiết của mẫu nghiên cứu (ml)

m : khối lượng mẫu nghiên cứu tính theo chất khơ (g) 100: tính ra %

1000: chuyển thành gam

2.7 Phương pháp xác định hàm lượng Flavonoid

Hàm lượng flavonoid tổng được xác định theo mơ tả của Chang và cs., (2002)

[9] cĩ sửa đổi

Nguyên tắc: Dựa trên sự tương quan giữa sự hấp thụ của quercetin chuẩn + MeOH/AICl; 2% tại bước sĩng hấp thụ 415 nm với nồng độ chất chuẩn quercetin tương ứng

Phương pháp: Mẫu sau khi được trích ly sẽ tiến hành pha lỗng đến nồng độ thích hợp Dùng pipet hút 2 ml mẫu vào ống nghiệm khơ, bổ sung 2 ml MeOH/AICl 2%, so màu trên máy quang phổ ở bước sĩng 415 nm

Hàm lượng flavonoid được tính theo cơng thức sau: F = Q x 2,51 F: hàm lượng flavonoid trong mẫu (mg/L)

Q: hàm lượng tính dựa vào đường chuẩn quercetin (mg/L)

2,51 là hệ số chuyển đổi tir flavonol sang flavonol glycosid (flavonoid) 2.8 Thử nghiệm dịch chiết lá Hồn ngọc trên thực phẩm

Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá Hồn ngọc trên sản phẩm tương ớt Mường Khương được lên men truyền thống, tại Lào Cai 50g us aureus CNTP 6077 với mật 46 ban dau 1,0 x10° CFU/g, duge bé sung dịch chiết lá Hồn ngọc với nồng độ 16

mẫu tương ét lén men, chtra vi khuan Staphyloc

mg/g tương ớt Để các mẫu ở nhiệt

phịng Mẫu đối chứng khơng bổ sung dịch kháng khuẩn Kiểm tra mật độ tế bào hiếu khí sau thời gian bảo quản

Trang 36

CHUONG I 3.1 Hoạt tính kháng lại một số vị lịch chiết lá Hồn ngọc KET QUA ‘inh vật gây hư hỏng trong thực phẩm của Dịch chiết từ lá Hồn ngọc theo phương pháp trích ly hồi lưu, thu nhận từ Sơn vi khuẩn Gram (+): Bacillus cereus CNTP 6089, Staphylococcus aureus CNTP 6077, Lactobacillus plantarum JCM 1149; vi khuan Gram (-): Escherichia coli CNTP 6078, Kliebsiella Tây, Hịa Bình, được khảo sát khả năng kháng lại một

pneumoniae subsp.pneumoniae CNTP 6079; nam méc Penicillium oxalicum Currie & Thom POCT va nam men Saccharomyces cerevisiae 7012 Két qua thé hign & Bảng 3.1 Bảng 3 1 Hoạt tính kháng tại một số chủng VSV gây hư hỏng thực phẩm STT_| Ching vi sinh vật kiêm định Hoạt tính kháng VSV Bacillus cereus CNTP 6089 : | Staphylococcus aureus CNTP 6077 HH Lactobacillus plantarum JCM 1149 = Escherichia coli CNTP 6078 - Kliebsiella pneumoniae subsp pneumoniae CNTP 6079 6 | Penicillium oxalicum Currie and Thom POCT 7 | Saccharomyces cerevisiae 7012 = (+++) Vơng kháng khuẩn > 10 mm fa foro] €) Khơng cĩ vịng kháng khuẩn

Trong số 7 chủng vi sinh vật được khảo sát, dịch chiết lá Hồn ngọc chỉ ức chế mạnh mẽ sự phát triển của chủng Staphylococcus aureus CNTP 6077 Đối với

các chủng VSV kiểm định khác, dịch chiết này lại khơng thể hiện hoạt tính

3.2 Ảnh hưởng của các yếu tố tới u quả tách chiết lá Hồn ngọc

3.2.1 Ảnh hướng của dung mơi tách chiết

Trong quá trình chiết xuất, dung mơi được sử dụng nhằm hịa tan các hợp chất mong muốn thơng qua sự tương tác giữa các phân tử của dung mơi và hợp chất, kéo

it khi vừa cĩ

các hợp chất này từ pha rắn sang pha lỏng Một dung mơi được cho là

hiệu quả tách chiết cao vừa cĩ khả năng duy trì sự ồn định về mặt cấu trúc hĩa học của các hợp chất cĩ hoạt tính [30] Trong nghiên cứu này, lá Hồn ngọc trắng được

Trang 37

trích ly với các dung mơi khơng phân cực (n ~ hexan) và cĩ độ phân cực khác nhau

(methanol, ethanol), bằng phương pháp ngâm ở 45°C trong 5h Hiệu suất tách chiết

và hoạt tính kháng khuẩn thể hiện qua sự ức chế sự phát triển của chủng Staphylococcus aureus CNTP 6077 được thể hiện ở Bảng 3.2

Bảng 3 2 Ảnh hưởng của dung mơi tới hiệu quả tách chiết lá Hồn ngọc

suất tách | Hoạt tính kháng lại

Dung mơi tách chiet (%) chủng CNTP 6077 | Methanol n- Hexan ++ - Eth + ing Khang khuẩn; (+) Đường kính vịng kháng khuẩn > 6 mm; (++) Đường kính vịng kháng khuẩn > 8 mm

Trong ba loại dung mơi sử dụng để tách chiết các hợp chất từ lá Hồn ngọc, thì dung mơi n ~ Hexan cĩ hiệu suất tách chiết thấp nhất (1,53%) và dịch chiết thu được khơng ức ché duge sy phat trién cia ching Staphylococcus aureus CNTP 6077 Điều này cho thấy, các hợp chất cĩ hoạt tính kháng khuẩn của lá Hồn ngọc

cĩ thể là những chất phân cực Dung mơi ethanol, mặc dù cho hiệu suất trích ly cao

nhất (3,34%) nhưng dịch chiết thu được cĩ hoạt tính ức

CNTP 6077 lại kém hơn so với dịch chiết methanol

ự phát triển của chủng Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung mơi (methanol, ethanol va acetone) t6i hiệu quả tách chiết các hợp chất kháng khuẩn, nắm men, nắm mốc từ 6 lồi thực vật ở Việt Nam của Quang-Vinh Nguyen and Jong-Bang Eun (2013) [27], cho thấy, dịch chiết methanol thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn so với dịch chiết ethanol ở tắt cả các lồi thực vật được khảo sát

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tách chiết

Khả năng thu nhận các hợp chất sinh học từ thực vật khơng chỉ phụ thuộc vào dung mơi mả cịn phụ thuộc vào các điều kiện tách chiết, đặc biệt là nhiệt độ Trong nghiên cứu này, lá Hồn ngọc trắng được trích ly trong methanol, ở nhiệt độ phịng

trog 24h, 45°C va 70°C trong 5h Hiệu quả tách chiết của thể hiện ở Bảng 3.3

Trang 38

Bang 3 3 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu quả tách chiết lá Hồn ngọc Nhiệt độ tách | Hiệu suất tách | Đường kính vịng kháng chiét (°C) chiét (%) chủng CNTP 6077 (mm) 22-25 1,19 s 45 1,79 81 70 (-) Khơng cĩ vịng kháng khuẩn 12,62 133

Kết quả Bảng 3.3, cho thấy, tách chiết ở nhiệt độ phịng, 22 — 25°C, khơng cĩ hiệu quả trong việc thu nhận các hợp chất từ lá Hồn ngọc Hiệu suất tách chiết này

chỉ đạt 1,19% và dịch chiết thu được khơng cĩ hoạt tính kháng lại chủng

Staphylococcus aureus CNTP 6077 Kết quả này khác với các kết quả nghiên cứu của Quang-Vinh Nguyen and Jong-Bang Eun (2013) [27], đường kính vịng kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus cia dich chiét methanol 14 Hoan ngge, thu duge

bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phịng, là 7,08 va 7,92 mm với lượng chất khơ

trong dịch chiết tương ứng là 0,2 mg/khoanh giấy và 0,5 mg/khoanh giấy

Trang 39

Phương pháp trích ly ở 70°C cĩ hiệu suất tách chiết tới 12,62%, cao hơn 10 lần so với khi trích ly ở nhiệt độ phịng Dịch chiết thu được, thể hiện hoạt tính kháng chủng CNTP 6077 mạnh hơn so với

ịch chiết khi trích ly ở 45°C, với đường kính vịng vơ khuẩn đạt tương ứng là 13,3 mm và 8,! mm

Kết quả nghiên cứu của Truc Cong Ho và cs., [31], cho thấy, khi tách chiết lá Hồn ngọc bằng phương pháp chiết nước siêu tới hạn (subcritical water extraction) ở nhiệt độ 150 - 230°C, thu được dịch chiết cĩ hoạt tính kháng lại vi khuẩn mạnh hơn so với khi chiết ở nhiệt độ 80 °C và 110 ~ 130°C Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ tách chiết lên tới 250 — 270°C, hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết lại giảm đi 3.2.3 Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu

Bên cạnh kỹ thuật tách chiết, thì các điều kiện về khí hậu và mơi trường của vùng trồng nguyên liệu cũng ảnh hưởng tới hiệu quả thu nhận các hoạt chất kháng khuẩn cĩ trong thực vật Trong nghiên cứu này, Hồn ngọc trắng thu nhận từ một số vùng trồng khác nhau như: Sơn Tây và Lương Sơn, Hịa Bình; Vĩnh Phúc, được khảo sát Ngồi ra, các phần khác nhau của cây Hồn ngọc trắng (lá và cành) cũng được kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn

Bảng 3 4 Đặc điểm của dịch chiết lá Hồn ngọc thu nhận từ các vùng nguyên liệu khác nhau 2 ấ | Hằm lượng|.„, Đường kính

nguyên liệu |cùacây | 2) tơng — số| (mem chủng CNTP

(mg/g) es 6077 (mm)

| son tay, [AMY] 762 014 021 93

Hoa Binh * [Been La 10,97 2,27 1,48 19,3 Lương Sơn,|,„ Ho Bi (oe 4,79 0,36 1,548 10,6 'Vĩnh Phúc Lá 11,09 1,93 1373 §9 Kết quả thê hiện ở Bảng 3.4 cho thấy hàm lượng polyphenol tổng số của bốn

mẫu dịch chiết nằm trong khoảng từ 0,14 đến 2,27 mg/g Trong đĩ, lá cây Hồn ngọc trồng ở Sơn Tây, Hịa Bình cĩ hàm lượng polyphenol lớn nhất (2,27 mg/g)

Trang 40

gấp hơn 6 lần so với mẫu dịch chiết lá Lương Sơn, Hịa Bình Ngược lại, hàm lượng flavonoid trong lá cây Hồn ngọc khơng cĩ sự khác nhau giữa các vùng trồng nguyên liệu Trong số các vùng trồng nguyên liệu được khảo sát thì lá cây Hồn ngọc trồng ở khu vực Sơn Tây, Hịa Bình cĩ hoạt tính kháng lại chủng CNTP 6077

cao nhất

Hình 20: Hoạt tính kháng lại chúng Staphylocoeeus aureus CNTP 6077 của dịch

chiết lá Hồn ngọc từ các nguồn khác nhau

1~ Methanol; 2 ~ Dịch chiết từ cành và ngọn cây Hồn ngọc (Sơn Tây, Hịa Bình); 3— Dịch chiết từ lá cây Hồn ngọc (Sơn Tây, Hịa Bình); 4~ Nước cất;

3 — Dịch chiết từ lá cây Hồn ngọc (Lương Sơn, Hịa Bình); 6~ Dịch chiết từ lá cây Hồn ngọc (Vĩnh Phúc)

Kết quả Bảng 3.4 cũng cho thấy, hàm lượng các hoạt chất tập trung ở lá nhiều

hơn so với cành và ngọn cay

Định dạng
Số trang	49
Dung lượng	5,56 MB