Xác định đặc điểm hóa sinh của protease được thu nhận tử xạ khuẩn streptomyces sp cnxk72

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: Xác định đặc điểm hóa sinh protease thu nhận từ xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK72 Mã số đề tài: 22/1SV SHTP04 Chủ nhiệm đề tài: Dương Thảo Vi Đơn vị thực hiện: Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh, … LỜI CÁM ƠN Để hồn thành đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường “Xác định đặc điểm hóa sinh protease thu nhận từ xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK72”, xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo trường Đại học Công Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, phịng Quản lý Khoa học hợp tác quốc tế cho hội hỗ trợ nguồn kinh phí để tơi thực đề tài nghiên cứu khoa học Tơi xin chân thành cám ơn Q Thầy Cơ Viện Công nghệ sinh học Thực phẩm hỗ trợ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến Thầy Phạm Tấn Việt, Cô Nguyễn Thị Diệu Hạnh Thầy Nguyễn Ngọc Ẩn tận tâm giảng dạy, hướng dẫn, động viên cho lời khun vơ hữu ích để tơi vững tâm đường học tập nghiên cứu khoa học Tơi cảm ơn bạn phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh hỗ trợ, giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cám ơn! PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thơng tin tổng qt 1.1 Tên đề tài: Xác định đặc điểm hóa sinh protease thu nhận từ xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK72 1.2 Mã số: 22/1SV SHTP04 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Họ tên (học hàm, học vị) Đơn vị công tác Vai trò thực đề tài Dương Thảo Vi Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Chủ nhiệm đề tài Hứa Huỳnh Minh Thảo Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thư ký Nguyễn Mộc Tấn Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên Bùi Nhật Tâm Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên tham gia Dương Thị Thùy Trang Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên tham gia Mạc Thành Tiến Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên tham gia Nguyễn Thị Phương Thắm Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên tham gia Nguyễn Tuyết Hạ Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên tham gia Vũ Duy Từ Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên tham gia 10 Phan Phú Quảng Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên tham gia 1.4 Đơn vị chủ trì: Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng năm 2022 đến tháng năm 2023 1.5.2 Gia hạn (nếu có): khơng có 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng năm 2022 đến tháng năm 2023 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Khơng có thay đổi so với thuyết minh ban đầu 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: 20,000,000 đồng (Hai mươi triệu đồng chẵn) II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề Cùng với phát triển công nghiệp giới gia tăng không ngừng việc sử dụng hóa chất cơng nghiệp, gây ảnh hưởng lớn đến mơi trường xã hội Chính vậy, sản phẩm thân thiện với mơi trường dần thay hóa chất độc hại, nhằm mục đích giảm thiểu tác động xấu chúng đến môi trường, đồng thời cải thiện chất lượng sống người Protease hay peptide hydrolase enzyme xúc tác thủy phân liên kết peptide (CO-NH-) phân tử protein chuỗi peptide Sản phẩm q trình thủy phân acid amin hay polypeptide chuỗi ngắn Nhiều protease cịn xúc tác phản ứng thủy phân liên kết este, liên kết amid phản ứng chuyển vị gốc acid amin [1] Protease ba nhóm enzyme cơng nghiệp lớn nhất, chiếm khoảng 60% tổng lượng enzyme thương mại toàn giới, chúng sử dụng rộng rãi lĩnh vực khác nhau, chẳng hạn dệt may, chất tẩy rửa, da, thức ăn chăn nuôi, chất thải lĩnh vực khác [2-5] Protease có nguồn gốc từ vi sinh vật loại enzyme quan trọng thị trường enzyme giới Nhiều nhà nghiên cứu tiếp tục tìm kiếm protease có nguồn gốc từ vi sinh vật chúng có khả chịu điều kiện khắc nghiệt, cách để ngăn chặn hoạt động tự phân giải protein, ổn định pH tối ưu tính đặc hiệu cao với chất Gần hai phần ba protease thương mại sản xuất từ nấm mốc, nấm men xạ khuẩn [6] Trong đó, xạ khuẩn nguồn quan trọng sử dụng để sản xuất protease, có đặc tính đáng ý ổn định nhiệt độ cao, bền pH, bền dung môi hữu cơ, chất tẩy rửa hợp chất oxy hóa Nhằm khai thác tối đa tiềm Streptomyces sp., nhà nghiên cứu phân lập chủng xạ khuẩn từ nhiều nguồn khác để nghiên cứu đặc tính hóa sinh hệ enzyme ngoại bào nói chung protease ngoại bào nói riêng Những đánh giá tập trung vào việc so sánh đặc tính protease khác vấn đề phải đối mặt trình sản xuất ứng dụng cấp độ công nghiệp Hiểu rõ vấn đề giúp thúc đẩy protease vi sinh vật mặt kinh tế thương mại tồn giới Mặc dù thực tế có nhiều protease khác xác định, số số chúng ứng dụng vào cơng nghiệp ứng dụng cơng nghiệp, protease phải có tính ổn định điều kiện tương đối khắc nghiệt, thường bao gồm điều kiện khắc nghiệt nhiệt độ, pH, có mặt chất ức chế chất oxy hóa Do đó, enzyme ứng viên phải có tính phù hợp với quy trình độ ổn định kéo dài dùng cho ứng dụng công nghiệp [7] Tuy nhiên, nhiều cơng trình nghiên cứu Việt Nam tập trung vào tuyển chọn, thu nhận chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào nói chung protease ngoại bào nói riêng, chưa có nhiều nghiên cứu sâu tối ưu hóa điều kiện ni cấy xác định đặc tính hóa sinh loại protease Với mục đích thiết lập sở liệu để so sánh, đánh giá với nghiên cứu có liên quan nước, tạo tiền đề cho nghiên cứu lĩnh vực sản xuất ứng dụng protease, tiến hành thực đề tài: “Xác định đặc điểm hóa sinh protease thu nhận từ xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK72” Mục tiêu a) Mục tiêu tổng quát Xác định đặc điểm hóa sinh protease thu nhận từ xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK 72 b) Mục tiêu cụ thể ▪ Xác định điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp protease từ xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK 72 ▪ Tinh protease xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK 72 ▪ Xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động protease từ xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK 72 ▪ Xác định yếu tố liên quan đến việc bảo quản protease ▪ Xác định động học protease Phương pháp nghiên cứu 3.1 Chủng giống Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK72 lưu trữ Bộ sưu tập giống Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh, Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 3.2 Phương pháp 3.2.1 Khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp protease + Nguồn carbohydrate: glucose, lactose, maltose, arabinose, starch + Nồng độ nguồn carbohydrate: 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0% + Nguồn nitrogen: hữu (peptone, cao trùn, cao thịt) vô ((NH4)2SO4, NH4Cl, NH4NO3) + Nồng độ nitrogen: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5% + pH ban đầu môi trường nuôi cấy: 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 + Nhiệt độ nuôi cấy: 25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC 3.2.2 Tinh protease từ xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK72 + Tủa enzyme muối ammonium sulfate + Thẩm tách màng cellophane + Tinh enzyme phương pháp sắc ký lọc gel + Kiểm tra độ tinh SDS-PAGE 3.3.3 Xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động protease + Nhiệt độ phản ứng: 30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC, 80oC + pH phản ứng: 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10,0 + Ảnh hưởng ion kim loại: Na+, K+, Ca2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+, Al3+ 3.3.4 Xác định yếu tố liên quan đến việc bảo quản protease + Bền nhiệt: ủ enzyme nhiệt độ -80oC, -20oC, 0oC, 8oC, 30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC, 80oC, 90oC, 100oC + Bền pH: ủ enzyme buffer có pH 4,0-10,0 3.3.5 Xác định thông số động học: KM Vmax Tổng kết kết nghiên cứu Đề tài “Xác định đặc điểm hóa sinh protease thu nhận từ Streptomyces sp CNXK72” đạt số kết sau: + Chủng CNXK72 có quan hệ gần gũi với Streptomyces odorifer (NBRC 13365) + Môi trường ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp protease Streptomyces sp CNXK72: Gause I cải tiến + 0,5% maltose + 0,3% cao trùn, lắc 150 vòng/phút 30℃, pH 7,0 + Protease tinh sau tủa phân đoạn với muối ammoni sulfate chạy sắc ký lọc gel cho hoạt tính riêng 811,98 U/mg với mức độ tinh 182 lần hiệu suất thu hồi đạt gần 50% Protease có trọng lượng phân tử khoảng 46 kDa + Protease có khả hoạt động khoảng nhiệt độ 30℃-80℃ (cao 55℃), hoạt động pH 4,0-10,0 (cao pH 7,0) + Na+ , K+ , Mg2+ Ca2+ giúp tăng khả xúc tác chất protease Trong ion Mn2+, Fe2+ gây ức chế mạnh mẽ hoạt động protease, ion Zn2+, Cu2+ Al3+ gần ức chế hồn toàn hoạt động protease từ Streptomyces sp CNXK72 + Protease có khả năng: bền nhiệt độ lên đến 60℃ bền khoảng pH rộng pH 4,0-10,0 + Thông số động học protease: KM = 2,725 mg/ml Vmax = 2463 U/mg Đánh giá kết đạt kết luận Ý nghĩa khoa học: Đề tài giúp xác định đặc điểm hóa sinh của protease thu nhận từ Streptomyces sp CNXK72 từ cung cấp sở liệu loại enzyme để so sánh với nghiên cứu có liên quan ngồi nước, tạo tiền đề cho nghiên cứu đánh giá tiềm ứng dụng protease số ngành công nghiệp khác Ý nghĩa thực tiễn: Khai thác tiềm ứng dụng Streptomyces sp CNXK72 có khả sinh tổng hợp protease quy trình cơng nghiệp, giảm bớt chi phí sản xuất, cao hiệu xuất thủy phân protein, đồng thời thay hợp chất hóa học gây hại mơi trường sống sức khỏe người Tóm tắt kết (tiếng Việt tiếng Anh) Tiếng Việt: Các protease có nguồn gốc từ xạ khuẩn thường chứng minh có nhiều đặc tính sinh học bật Trong nghiên cứu này, chủng xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK72 thể khả sản xuất protease với độ lớn vòng phân giải 30,5±2,0 mm Đặc điểm đại thể, vi thể trình tự vùng gen mã hóa cho 16S rRNA cho thấy chủng có mối quan hệ gần gũi với Streptomyces odorifer (99,65%) Mơi trường ni cấy thích hợp cho CNXK72 sinh tổng hợp protease hoạt tính cao môi trường Gause I cải tiến+0,5% maltose+0,3% cao trùn, lắc 150 vòng/phút 30℃, pH 7,0, Protease từ Streptomyces sp CNXK72 tinh quy trình gồm hai bước tủa phân đoạn với muối ammonium sulfate chạy sắc ký lọc gel cột Sephadex G-75 Mức độ tinh protease 182 lần với hiệu suất thu hồi khoảng 50% so với dịch chiết thô Trọng lượng phân tử protease ước tính 46,0 kDa dựa kết SDS-PAGE Protease thu nhận từ CNXK72 có khả hoạt động khoảng 30°C-80°C, pH 4,0-10,0, hoạt tính tốt 55°C pH 7,0 đệm Tris-base Trong số ion kim loại kiểm tra ion Na+ , K+ , Mg2+ Ca2+ giúp tăng khả xúc tác chất protease Trong ion Mn2+ Fe2+ gây ức chế mạnh mẽ hoạt động protease Đối với ion lại Zn2+, Cu2+ Al3+ gần ức chế hồn toàn hoạt động protease từ Streptomyces sp CNXK72 Khi xử lý với EDTA, hoạt tính cịn lại protease 25% Hai thống số động học quan trọng KM Vmax protease từ CNXK72 ghi nhận 2,725 mg/ml 2463 U/mg Ngoài ra, protease thể khả bền nhiệt lên đến 60ºC bền pH 4,0-10,0, Khả thủy phân chất tốt nhiệt độ cao hoạt động khoảng pH rộng cho thấy tiềm ứng dụng ngành công nghiệp chất tẩy rửa công nghiệp thuộc da protease Abstract: Proteases derived from actinomycetes have often been shown to possess many remarkable biological properties In this study, CNXK72 was able to produce proteases with resulting diameter of halo zone of 30.5±2.0 mm The macroscopic and microscopic features and sequence of their 16S rRNA gene regions show that this strain was closely related to Streptomyces odorifer (99.65%) The suitable culture medium for CNXK72 to biosynthesize highly active protease was modified Gause I medium + 0.5% maltose + 0.3% earthworm extract, shaken 150 rpm at 30℃, pH 7.0, A protease from Streptomyces sp CNXK72 was purified by a twostep procedure using ammonium sulfate and gel filtration on a Sephadex G-75 column The purification factor was more than 182-fold with a yield of about 50% from the crude extract The molecular mass of the protease was estimated to be 46.0 kDa based on SDS-PAGE Streptomyces sp CNXK 72-derived protease was active between 30°C-80°C, pH range of 4.0-10.0, with maximum activity at 55°C and pH 7.0 in Tris-base buffer Among the metal ions examined, Na+, K+, Mg2+, and Ca2+ ions increased the protease's substrate catalysis ability Meanwhile, Mn2+ and Fe2+ cause strong inhibition of protease activity For the remaining ions, Zn2+, Cu2+, and Al3+, they almost completely inhibited the protease activity of Streptomyces sp CNXK72 When treated with EDTA, the residual protease activity was 25% Two important kinetic parameters KM and Vmax of protease from CNXK72 were recorded as 2.725 mg/ml and 2463 U/mg, respectively In addition, this protease also exhibits temperature stability up to 60ºC and is stable at pH 4.0-10.0, The good substrate hydrolysis at high temperatures and wide pH ranges indicates potential applications in detergent and tanning industries of this protease III Sản phẩm đề tài, công bố kết đào tạo 3.1 Kết nghiên cứu (sản phẩm dạng 1,2,3) TT Yêu cầu khoa học hoặc/và tiêu kinh tế - kỹ thuật Tên sản phẩm Đăng ký Bài báo IUH Đạt báo khoa học Đã chấp nhận đăng tạp cấp trường chí Khoa học Cơng nghệ IUH IV Tình hình sử dụng kinh phí T T A B Nội dung chi Chi phí trực tiếp Th khốn chun mơn Ngun, nhiên vật liệu, con… Thiết bị, dụng cụ Cơng tác phí Dịch vụ thuê Hội nghị, hội thảo, thù lao nghiệm thu kỳ In ấn, Văn phòng phẩm Chi phí khác Chi phí gián tiếp Quản lý phí Chi phí điện, nước Tổng số Kinh phí duyệt (đồng) Kinh phí thực (đồng) 19,221,000 19,221,000 779,000 779,000 20,000,000 20,000,000 Ghi V Kiến nghị (về phát triển kết nghiên cứu đề tài) + Giải trình tự gen chủng CNXK72, từ định danh xác + Xác định trình tự cấu trúc protease để hiểu rõ chế xúc tác + Khảo sát thêm yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp protease CNXK72 quy mơ cơng nghiệp + Tìm điều kiện bảo quản thích hợp cho protease CNXK72 VI Phụ lục sản phẩm (liệt kê minh chứng sản phẩm nêu Phần III) phút Đồng thời hoạt tính cịn lại protease ghi nhận có khác biệt có ý nghĩa thống kê đối chứng so với mốc nhiệt độ xử lý, có khác biệt hai mốc thời gian xử lý 3.6.2 Khả bền pH Hình 3.13 Khả bền pH protease từ Streptomyces sp CNXK72 Protease có khả ổn định khoảng pH rộng thể tiềm to lớn trình công nghiệp Nhằm đánh giá ổn định protease thu nhận từ Streptomyces sp CNXK72 giá trị pH khác từ 3,0 đến 10,0, protease tinh ủ citrate-phosphate buffer (pH 3,0-6.0), phosphate buffer (pH 6,08,0) tris-base (7,0-10,0) Sau xử lý, hoạt tính protease xác định theo phương pháp Anson cải tiến Khả bền pH protease sinh tổng hợp từ Streptomyces sp CNXK72 thể thông q giá trị hoạt tính cịn lại so sánh với đối chứng Kết từ Hình 3.13 cho thấy protease thu nhận từ Streptomyces sp CNXK72 thể khả hoạt động ổn định khoảng pH 5,0-8,0 với hoạt tính cịn lại 80% Tuy nhiên, mơi trường có pH acid kiềm pH 4,0, 9,0 10,0 protease cịn khả xúc tác chất với hoạt tính cịn lại 69%, 50% 47% Bên cạnh đó, protease thể bền 59 ủ mơi trường có pH 3,0 với hoạt tính cịn lại ghi nhận 21,6% Protease thể khả ổn định sau pH 6,0, 7,0 8,0 với loại đệm sử dụng thí nghiệm với hoạt tính cịn lại 90% Tương tự nghiên cứu V N S Alencar cộng (2021) cho thấy protease thu nhận từ Streptomyces parvulus bền với pH 7,0 120 phút với hoạt tính cịn lại gần 100% [70] Kết phân tích phương sai ANOVA yếu tố với độ tin cậy 95% so sánh giá trị Pvalue < 0,05 nhận thấy khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê ủ giá trị pH 6,0, 7,0, 8,0 9,0 lên hoạt tính cịn lại protease Vì vậy, với khả ổn định tốt khoảng pH rộng, protease từ Streptomyces sp CNXK72 cho thấy nhiều khả ứng dụng sâu nghiên cứu, lĩnh vực đời sống 3.7 Động học protease Hình 3.14 Động học protease từ Streptomyces sp CNXK72 Động học enzyme xác định dựa mơ hình Michaelis-Menten cách cố định nồng độ protease thay đổi nồng độ chất casein (từ 0,01-10 mg/ml), phản ứng thực pH 7,0 55ºC Phần mềm GraphPad Prism sử dụng để phân tích thơng số động học enzyme Hai thông số động học quan trọng enzyme KM Vmax, chúng thể khả liên kết enzyme – 60 chất hiệu xúc tác enzyme Giá trị KM Vmax protease ngoại bào thu nhận từ Streptomyces sp CNXK72 2,725 mg/ml 2463 U/mg (Hình 3.14) Kết thí nghiệm cho thấy, sử dụng nồng độ chất gần với giá trị 2,725 mg/ml enzyme thể hoạt động đáng kể hoạt động nhạy cảm với thay đổi điều kiện môi trường (nồng độ chất) Ở giá trị KM, enzyme nhạy cảm với thay đổi nồng độ chất hoạt động Ở giá trị chất cao KM, enzyme có hoạt tính xúc tác lớn khơng nhạy cảm với thay đổi nồng độ chất Trong nghiên cứu Simkhada cộng (2010), Metalloprotease từ chủng Streptomyces olivochromogenes có giá trị KM Vmax 0,74 mg/ml 3876 U/mg [56] Ở nghiên cứu khác Sarkar cộng (2020) xác định giá trị KM Vmax protease từ Streptomyces sp GS-1 59 mg/ml 32,25 μM/min/mg [77] Khi giá trị KM nhỏ, Vmax lớn khả hoạt động enzyme tốt Dựa vào kết cho thấy tìm ứng dụng protease từ Streptomyces sp CNXK72 nhiều ngành công nghiệp khác 61 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận + Chủng CNXK72 có quan hệ gần gũi với Streptomyces odorifer (NBRC 13365) + Mơi trường ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp protease Streptomyces sp CNXK72: Gause I cải tiến + 0,5% maltose + 0,3% cao trùn, lắc 150 vòng/phút 30℃, pH 7,0 + Protease tinh sau tủa phân đoạn với muối ammoni sulfate chạy sắc ký lọc gel cho hoạt tính riêng 811,98 U/mg với mức độ tinh 182 lần hiệu suất thu hồi đạt gần 50% Protease có trọng lượng phân tử khoảng 46 kDa + Protease có khả hoạt động khoảng nhiệt độ 30℃ – 80℃ (cao 55℃), hoạt động pH 4,0-10,0 (cao pH 7,0) + Protease chịu ảnh hướng lớn số ion kim loại Na+ , K+ , Mg2+ Ca2+ giúp tăng khả xúc tác chất protease Trong ion Mn2+, Fe2+ gây ức chế mạnh mẽ hoạt động protease, cịn ion Zn2+, Cu2+ Al3+ gần ức chế hoàn toàn hoạt động protease từ Streptomyces sp CNXK72 + Protease có khả năng: bền nhiệt độ lên đến 60℃ bền pH 4,0-10,0 + Thông số động học protease: KM = 2,725 mg/ml Vmax = 2463 U/mg Kiến nghị + Giải trình tự gen chủng CNXK72, từ định danh xác + Xác định trình tự cấu trúc protease để hiểu rõ chế xúc tác + Khảo sát thêm yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp protease CNXK72 quy mô công nghiệp + Tìm điều kiện bảo quản thích hợp cho protease CNXK72 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] A Razzaq et al "Microbial proteases applications," Frontiers in bioengineering and biotechnology Vol, 7, p 110, 2019 F J Contesini et al "An overview of Bacillus proteases: from production to application," Critical reviews in biotechnology Vol, 38, no 3, pp 321-334, 2018 R Gupta et al "Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications," Applied microbiology and biotechnology Vol, 59, no 1, pp 15-32, 2002 S Gürkök "Microbial enzymes in detergents: a review," Int J Sci Eng Res Vol, 10, no 9, pp 75-81, 2019 S Raveendran et al "Applications of microbial enzymes in food industry," Food technology and biotechnology Vol, 56, no 1, p 16, 2018 T Mothe and V R Sultanpuram "Production, purification and characterization of a thermotolerant alkaline serine protease from a novel species Bacillus caseinilyticus," Biotech Vol, 6, pp 1-10, 2016 B K Bajaj and P Sharma "An alkali-thermotolerant extracellular protease from a newly isolated Streptomyces sp DP2," New Biotechnology Vol, 28, no 6, pp 725-732, 2011 Nguyễn Đức Lượng Công nghệ enzyme Đại học Bách Khoa: DHQG Thành phố Hồ Chí Minh, 2004 Nguyễn Trọng Cẩn cộng Giáo trình Cơng nghệ enzyme NXB Nơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, 1998 J S Ramírez-Larrota and U Eckhard "An Introduction to bacterial biofilms and their proteases, and their roles in host infection and immune evasion," Biomolecules Vol, 12, no 2, p 306, 2022 T A Hamza "Bacterial protease enzyme: Safe and good alternative for industrial and commercial use," Int J Chem Biomol Sci Vol, 3, no 1, pp 1-10, 2017 B S Mienda et al "An overview of microbial proteases for industrial applications," Res J Pharm Biol Chem Sci Vol, 5, no 1, pp 388-396, 2014 S Ali and Y Muhammad "Industrial application of microbial proteases," EJPMR Vol, 4, pp 623-629, 2017 R Singh et al "Microbial enzymes: industrial progress in 21st century," Biotech Vol, 6, pp 1-15, 2016 H Klasen "A review on the nonoperative removal of necrotic tissue from burn wounds," Burns Vol, 26, no 3, pp 207-222, 2000 K Miyata et al "Serratia protease: Part I Purification and general properties of the enzyme," Agricultural and Biological Chemistry Vol, 34, no 2, pp 310-318, 1970 Nguyễn Văn Thành cộng "Ứng dụng vi sinh vật enzyme protease để cải tiến chất lượng nước tương lên men truyền thống," Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ trang 205-212, 2013 63 [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] P Fernandes "Enzymes in food processing: a condensed overview on strategies for better biocatalysts," Enzyme research Vol, 2010, 2010 J Madhavi et al "Efficient leather dehairing by bacterial thermostable protease," Int J Bio-Sci Bio-Technol Vol, 3, no 1, pp 11-26, 2011 F Khan "New microbial proteases in leather and detergent industries," Innov Res Chem Vol, 1, no 1, pp 1-6, 2013 T A Hamza "Bacterial protease enzyme: safe and good alternative for industrial and commercial use," Int J Chem Biomol Sci Vol, 3, no 1, pp 1-0, 2017 R Singh et al "Microbial enzymes: industrial progress in 21st century," Biotech vol, 6, pp 1-15, 2016 R Singh et al "Microbial proteases in commercial applications," J Pharm Chem Biol Sci Vol, 4, no 3, pp 365-374, 2016 R R Kumar and V J Jadeja "Isolation of actinomycetes: A complete approach," 2016 M Sharma et al "Actinomycetes: source, identification, and their applications," International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences Vol, 3, no 2, pp 801-832, 2014 Q Li et al "Morphological identification of actinobacteria," Actinobacteriabasics and biotechnological applications pp 59-86, 2016 E A Barka et al "Taxonomy, physiology, and natural products of Actinobacteria," Microbiology and molecular biology reviews Vol, 80, no 1, pp 1-43, 2016 C Edwards "Isolation properties and potential applications of thermophilic actinomycetes," Applied Biochemistry and Biotechnology Vol, 42, pp 161179, 1993 S B Kim et al "Streptacidiphilus gen nov., acidophilic actinomycetes with wall chemotype I and emendation of the family Streptomycetaceae (Waksman and Henrici (1943)AL) emend Rainey et al 1997," Antonie van Leeuwenhoek Vol, 83, pp 107-116, 2003 M Goodfellow and S Williams "Ecology of actinomycetes," Annual review of microbiology Vol, 37, no 1, pp 189-216, 1983 P Kämpfer et al "A numerical classification of the genera Streptomyces and Streptoverticillium using miniaturized physiological tests," Microbiology Vol, 137, no 8, pp 1831-1891, 1991 S Williams and J Vickers "Detection of actinomycetes in the natural environment: problems and perspectives," Biology of actinomycetes Vol, 88, pp 265-270, 1988 J Euzeby "Genus Streptomyces List of prokaryotic names with standing in nomenclature," Everest Journal of Applied Microbiology Vol, 20, pp 4554, 2008 M Madigan and J Martinko, "Brock Biology of Microorganisms 11th EditionPrentice Hall," ed: USA, 2005 64 [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] L L Yang et al "Thermobifida halotolerans sp nov., isolated from a salt mine sample, and emended description of the genus Thermobifida," International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology Vol, 58, no 8, pp 1821-1825, 2008 T Kieser et al Practical Streptomyces genetics John Innes Foundation Norwich, 2000 K Chater "A morphological and genetic mapping study of white colony mutants of Streptomyces coelicolor," Microbiology Vol, 72, no 1, pp 9-28, 1972 K Flärdh "Growth polarity and cell division in Streptomyces," Current opinion in microbiology Vol, 6, no 6, pp 564-571, 2003 N Zin et al "Cultivation-dependent characterization of endophytic actinomycetes," Research Journal of Microbiology Vol, 5, no 8, pp 717724, 2010 H S Chaudhary et al "Diversity and versatility of actinomycetes and its role in antibiotic production," Journal of Applied Pharmaceutical Science Vol, 3, no 8, pp 83-94, 2013 M Oskay et al "Antibacterial activity of some actinomycetes isolated from farming soils of Turkey," African Journal of Biotechnology Vol, 3, no 9, pp 441-446, 2004 N A Al-Dhabi et al "Isolation and screening of Streptomyces sp Al-Dhabi49 from the environment of Saudi Arabia with concomitant production of lipase and protease in submerged fermentation," Saudi J Biol Sci Vol, 27, no 1, pp 474-479, Jan 2020 S.-M Zhang et al "Isolation and characterization of antifungal lipopeptides produced by endophytic Bacillus amyloliquefaciens TF28," Afr J Microbiol Res Vol, 6, no 8, pp 1747-55, 2012 S Mukhtar et al "Actinomycetes: A Source of Industrially Important Enzymes," Journal of Proteomics & Bioinformatics Vol, 10, no 12, 2017 V Jeyadharshan "Production and partial purification of protease by actinomyces species," International Journal of Scientific and Research Publications Vol, 3, no 4, pp 1-3, 2013 Y Xin et al "Purification and characterization of a novel extracellular thermostable alkaline protease from Streptomyces sp M30," Journal of Microbiology and Biotechnology Vol, 25, no 11, pp 1944-1953, 2015 B Jaouadi et al "Purification and characterization of a thermostable keratinolytic serine alkaline proteinase from Streptomyces sp strain AB1 with high stability in organic solvents," Bioresource technology Vol, 101, no 21, pp 8361-8369, 2010 Nguyễn Thị Phong Lan cộng "Tuyển chọn chủng xạ khuẩn (Streptomyces spp.) đối kháng nấm Pyricularia grisea gây bệnh đạo ôn hại lúa," Tạp chí Khoa học Phát triển Số 13, tập 8, trang 1442-1451, 2015 65 [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] Trần Thị Trinh cộng "Khảo sát số đặc tính sinh học chủng xạ khuẩn biển có khả kháng vi khuẩn gây bệnh," Bản B Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Số 60, tập 10, 2018 Phạm Thị Tuyết Ngân cộng "Tối ưu điều kiện sinh enzyme protease ngoại bào vi khuẩn Streptomyces DH3.4," Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số 57, tập 4, trang 186-193, 2021 P A Pessôa Filho et al "Precipitation and Crystallization," 2011 J L Tymoczko et al Biochemistry: a short course Macmillan, 2011 P A Soares et al "Purification of bromelain from pineapple wastes by ethanol precipitation," Separation and purification technology Vol, 98, pp 389-395, 2012 R T Biaggio et al "Purification and biochemical characterization of an extracellular serine peptidase from Aspergillus terreus," Preparative Biochemistry and Biotechnology Vol, 46, no 3, pp 298-304, 2016 J Yang et al "Characterization of a thermophilic hemoglobin-degrading protease from Streptomyces rutgersensis SCSIO 11720 and its application in antibacterial peptides production," Biotechnology and Bioprocess Engineering Vol, 20, pp 79-90, 2015 J R Simkhada et al "An oxidant-and organic solvent-resistant alkaline metalloprotease from Streptomyces olivochromogenes," Applied biochemistry and biotechnology Vol, 162, pp 1457-1470, 2010 D Dhamodharan "Novel fibrinolytic protease producing Streptomyces radiopugnans VITSD8 from marine sponges," Marine drugs Vol, 17, no 3, p 164, 2019 S Mechri et al "Preparation, characterization, immobilization, and molecular docking analysis of a novel detergent-stable subtilisin-like serine protease from Streptomyces mutabilis strain TN-X30," International Journal of Biological Macromolecules Vol, 222, pp 1326-1342, 2022 Trần Ngọc Diễm My cộng "Khảo sát diện vi sinh vật phân giải cellulose dày còng Perisesarma eumolpe khu vực gãy đổ thuộc rừng ngập mặn Cần Giờ," Tạp chí phát triển Khoa học & Cơng nghệ Tập 2, số 5, 2018 N J Kruger "The Bradford method for protein quantitation," The protein protocols handbook pp 17-24, 2009 J Lanoë and J Dunnigan "Improvements of the Anson assay for measuring proteolytic activities in acidic pH range," Analytical Biochemistry Vol, 89, no 2, pp 461-471, 1978 D G Hurtado-Cantillo et al "Influence of carbon source on extracellular protease production by soil Streptomyces sp AGS-10," Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences Vol, 2021, pp 10,15414/jmbfs 2019.9 2.236-241, 2021 J Wyszkowska et al "Role of actinomyces of the genus Streptomyces in alleviating the effects of soil contamination with diesel oil," Pol J Nat Sci Vol, 23, no 3, pp 709-717, 2008 66 [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] I Schoenian et al "An unprecedented 1, 2‐shift in the biosynthesis of the 3‐aminosalicylate moiety of antimycins," ChemBioChem Vol, 13, no 6, pp 769-773, 2012 N A Al-Dhabi et al "Isolation and screening of Streptomyces sp Al-Dhabi49 from the environment of Saudi Arabia with concomitant production of lipase and protease in submerged fermentation," Saudi journal of biological sciences Vol, 27, no 1, pp 474-479, 2020 D Swarna and J J Gnanadoss "Optimization of protease production by Streptomyces SP LCJ1A using response surface methodology," Int J Life Sci Pharma Res Vol, 11, pp 218-32, 2021 N Akhtar et al "Effects of cultural conditions on the production of extracellular protease by Streptomyces albolongus and Streptomyces aburaviensis," Enzyme Engineering Vol, 2, no 2, pp 1-5, 2013 A I Free "Optimization of alkaline protease production by Streptomyces ambofaciens in free and immobilized form," American Journal of Biochemistry and Biotechnology Vol, 10, no 1, pp 1-13, 2014 N A Al-Dhabi et al "Characterization and fermentation optimization of novel thermo stable alkaline protease from Streptomyces sp Al-Dhabi-82 from the Saudi Arabian environment for eco-friendly and industrial applications," Journal of King Saud University-Science Vol, 32, no 1, pp 1258-1264, 2020 V N Alencar et al "Purification and characterization of fibrinolytic protease from Streptomyces parvulus by polyethylene glycol-phosphate aqueous twophase system," Anais da Academia Brasileira de Ciências Vol, 93, 2021 R Fernandez et al "Screening and characterization of protease producing marine actinobacteria Streptomyces pactum RA71 isolated from Pulicat Lake, Chennai, Tamil Nadu, India," Asian Journal of Microbiology, Biotechnology, and Environmental Sciences20, pp 618-625, 2018 G Pant et al "Production, optimization and partial purification of protease from Bacillus subtilis," Journal of Taibah University for Science Vol, 9, no 1, pp 50-55, 2015 N Annamalai et al "Extraction, purification and application of thermostable and halostable alkaline protease from Bacillus alveayuensis CAS using marine wastes," Food and Bioproducts Processing Vol, 92, no 4, pp 335342, 2014 S Ghorbel et al "Streptomyces flavogriseus HS1: isolation and characterization of extracellular proteases and their compatibility with laundry detergents," BioMed research international Vol, 2014, 2014 F Boughachiche et al "Production of Protease on Wheat Bran by a Newly Isolated Streptomyces SP Under Solid State Fermentation," Journal of BioScience pp 33-48, 2021 D B Steele et al "Production of a low-molecular-weight, alkaline-active, thermostable protease by a novel, spiral-shaped bacterium, Kurthia 67 spiroforme, sp nov," Enzyme and microbial technology Vol, 14, no 5, pp 358-360, 1992 [77] G Sarkar and K Suthindhiran "Extraction and characterization of alkalineprotease from Streptomyces sp GS-1 and its application as dehairing agent," Biocatalysis and Agricultural Biotechnology Vol, 25, p 101590, 2020 68 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết dựng đường chuẩn tyrosin Kết đo hấp thụ quang bước sóng 660nm tyrosine nồng độ khác Nồng độ tyrosine (µM) 100 200 300 400 500 0,014 0,332 0,612 0,925 1.167 1.305 0,015 0,325 0,624 0,925 1.158 1.311 0,014 0,328 0,618 0,920 1.184 1.309 Trung bình 0,014 0,328 0,618 0,923 1.170 1.308 ∆OD 0,311 0,601 0,906 1.152 1.109 OD660nm Phụ lục 2: Trình tự vùng gene mã hóa cho 16S rRNA chủng xạ khuẩn CNXK72 Các tín hiệu nucleotide vùng trình tự gene mã hóa cho 16S rRNA khuếch đại với mồi 27F 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 69 Các tín hiệu nucleotide vùng trình tự gene mã hóa cho 16S rRNA khuếch đại với mồi 1540R 5’-AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3’ Trình tự vùng gene mã hóa cho 16S rRNA với 1444 nucletides sử dụng để giống trình tự gene tương đồng ngân hàng liệu NCBI phần mềm SeaView xây dựng phát sinh loài phần mềm Mega 5,0 5’CTTACCATGCAAGTCGAACGATGAACCGCTTTCGGGCGGGGATTAGTG GCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAA GCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACTGTCCATCGCATGGTG GATGGTGTAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCT TGTTGGTGAGGTAGTGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGA GAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACG GGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAG CGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGC AGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAAC TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAA TTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAA GCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTT CGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATAT CAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACG CTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAG TCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGT CCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGC AAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAG CATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACA TACACCGGAAACGTCTGGAGACAGGCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAG GTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTC CCGCAACGAGCGCAACCCCTTGTCCCGTGNTGCCAGCAGGCCCTTGTGG TGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGG GGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGC TACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCT CAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGA AGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGT TCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACAC 70 CCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGG GACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGG-3’ Phụ lục 3: Động học protease ngoại bào thu nhận từ Streptomyces sp CNXK72 Phụ lục 4: Kết phân tích SDS-PAGE phần mềm GelAnalyzer 19.1 71 Phụ lục 5: Các cơng thức dùng q trình tinh ▪ Protein tổng (mg) = Nồng độ protein (mg/ml) * Thể tích protein phân đoạn (ml) ▪ Hoạt tính chung (U) = Hoạt tính ml dịch protease (U/ml) * Tổng thể tích phân đoạn (ml) ▪ Hoạt tính riêng (U/mg) = Hoạt tính chung (U) / Protein tổng phân đoạn (mg) ▪ Hiệu suất thu hồi (%) = Hoạt tính chung phân đoạn (U) / Hoạt tính chung dịch enzyme ban đầu (U) * 100% ▪ Mức độ tinh = Hoạt tính riêng phân đoạn (U/mg) / Hoạt tính riêng dịch enzyme ban đầu (U/mg) 72 ▪ PHẦN III PHỤ LỤC ĐÍNH KÈM (tất văn có sẵn, chủ nhiệm cần photo đính kèm sau nội dung trên, sử dụng lý hợp đồng với phịng kế tốn Khi lý, báo cáo in thành 03 cuốn, đó, 01 đóng bìa mạ vàng, 02 đóng bìa cứng thường) Hợp đồng thực đề tài nghiên cứu khoa học Thuyết minh đề tài phê duyệt Quyết định nghiệm thu Hồ sơ nghiệm thu (biên họp, phiếu đánh giá, bảng tổng hợp điểm, giải trình, phiếu phản biện) Sản phẩm nghiên cứu (bài báo, vẽ, mô hình .) 73