Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn sinh protease từ chượp mắm cá

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG CHỊU MẶN SINH PROTEASE TỪ CHƯỢP MẮM CÁ” Họ tên sinh viên : PHẠM THỊ HOA Mã sinh viên : 620580 Lớp : K62CNSHC Giảng viên hướng dẫn : ThS NGUYỄN THANH HUYỀN HÀ NỘI-2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan khóa luận hồn tồn hồn thiện tìm hiểu nghiên cứu khoa học thân hướng dẫn ThS Nguyễn Thanh Huyền, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tất số liệu, hình ảnh, kết trình bày khóa luận tốt nghiệp hồn tồn trung thực, khơng chép cơng trình nghiên cứu người khác mà không rõ nguồn tham khảo Các tài liệu tham khảo sử dụng khoá luận liệt kê danh mục tài liệu tham khảo khóa luận Tơi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trước Hội đồng chấm khoá luận tốt nghiệp Học viện Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2021 Sinh viên Phạm Thị Hoa i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực khóa luận Bộ mơn Cơng nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, xin chân thành cảm ơn Thầy Cô giáo, cán Phịng thí nghiệm Bộ mơn khoa Công nghệ sinh học giúp đỡ truyền đạt cho kiến thức quan trọng suốt thời gian học tập rèn luyện Học viện Nông nghiệp Việt Nam.Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ThS Nguyễn Thanh Huyền - Giảng viên Bộ môn Công nghệ Vi Sinh Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình giúp đỡ trực tiếp hướng dẫn suốt trình thực khóa luận tốt nghiệp này.Tơi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Xuân Cảnh, PGS TS Nguyễn Văn Giang, ThS Trần Thị Đào, anh chị bạn bè, toàn thể cán thuộc Bộ môn Công nghệ vi sinh, Thầy Cô khoa Công nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi thực tốt khóa luận.Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, anh chị người thân động viên, giúp đỡ tạo động lực cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2021 Sinh viên thực hiên Phạm Thị Hoa ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC VIẾT TẮT vii TÓM TẮT viii PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nước mắm chượp mắm 2.1.1 Sơ lược nước mắm chượp mắm 2.1.2 Cơ chế trình hình thành nước mắm 2.1.3 Giá trị dinh dưỡng nước mắm truyền thống từ cá 2.1.4 Các nhân tố ảnh hưởng đến trình sản xuất nươc mắm 2.2 Tổng quan protease nghiên cứu ứng dụng protease sản xuất nước mắm 2.2.1 Tình hình nghiên cứu protease 2.2.2 Những nghiên cứu ứng dụng protease sản xuất nước mắm 11 PHẦN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Vật liệu nghiên cứu 18 3.1.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 18 3.1.2 Vật liệu 18 3.1.3 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm 18 3.2 Nội dung nghiên cứu 20 iii 3.3 Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1 Phương pháp phân lập, làm thuần, giữ giống 20 3.3.2 Khả chịu muối (Nguyễn Thị Huệ Linh cs, 2017) 21 3.3.3 Khả phân giải protein (Chantawannakula et al., 2002) 21 3.3.4 Xác định hoạt độ enzyme protease phương pháp Anson cải tiến 21 3.3.5 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp protease (Đỗ Thị Bích Thủy cs., 2015) 22 3.3.6 Đánh giá đặc điểm sinh hóa khả sinh enzyme ngoại bào 23 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Phân lập chủng vi khuẩn 25 4.2 Đánh giá khả phân giải protein chủng vi khuẩn 25 4.3 Xác định hoạt độ enzyme protease phương pháp Anson cải tiến 27 4.4 Khả chịu muối chủng vi khuẩn 28 4.5 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào, nghiên cứu số đặc điểm hóa sinh 29 4.6 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả sinh protease chủng vi khuẩn tuyển chọn 32 4.6.1 Ảnh hưởng thời gian đến khả sinh protease 32 4.6.2 Ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp protease 33 4.6.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp protease 34 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 iv DANH MỤC BẢNG Bảng Các mẫu phân lập 18 Bảng Số lượng vi khuẩn mẫu phân lập 25 Bảng Hoạt lực phân giải protein chủng vi khuẩn .26 Bảng Kết đo OD dựng đường chuẩn Tyrosine 27 Bảng 4 Hoạt độ enzyme protease chủng vi khuẩn .28 Bảng Đặc điểm hình thái 30 Bảng Một số phản ứng sinh hóa, khả sinh enzyme ngoại bào .31 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.Khả phân giải protease chủng môi trường Skim milk 25 Hình Hoạt tính protease chủng sau ngày nuôi cấy 26 Hình Khả chịu muối chủng vi khuẩn 29 Hình 4 Phản ứng sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập 31 Hình Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ protease 32 Hình Ảnh hưởng pH đến hoạt độ protease 33 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease 34 vi DANH MỤC VIẾT TẮT Từ viết tắt Giải nghĩa µmol Micromole BOD Biochemical oxygen Demand CMC Carboxymethyl cellulose COD Chemical Oxygen Demand ĐC Đối chứng EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid LB Luria Betani M.R Methyl Red NA Nutrient agar NB Nutrient broth nM NanoMol TCA Acid Tricloacetic TN Thí nghiệm V.P Voges Proskauer vii TĨM TẮT Trong nhóm enzyme thủy phân, protease hay gọi enzyme phân giải protein, hệ enzyme thủy phân đứng thứ (sau carbohydrase) Enzyme protease ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực công nghệ sữa, công nghệ chế biến thịt, công nghệ thuộc da, công nghệ chế biến tằm, công nghệ sản xuất mỹ phẩm, y học sản xuất nước mắm ngắn ngày (Nguyễn Công Hà Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011) Đặc biệt protease sử dụng nhằm rút ngắn thời gian sản xuất nước mắm Từ trước đến nay, enzyme protease sản xuất chủ yếu từ vi khuẩn nấm mốc hoạt tính hiệu suất thu hồi cao, số thu hồi từ động vật thực vật Từ mẫu chượp mắm cá lấy chợ hải sản tỉnh Thái Bình, chúng tơi phân lập 18 chủng vi khuẩn Trong chủng có khả chịu mặn có hoạt tính protease mạnh tuyển chọn cho thí nghiệm đề tài Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng tuyển chọn bước đầu xác định chủng thuộc chi Baciilus.sp Sau nghiên cứu số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng tới hoạt độ protease chủng CH3, CN6, CH6 chúng tơi nhận thấy chủng CH3 có khả sinh tổng hợp protease cao (1.284 U/ml) điều kiện môi trường NB(bổ sung 5% NaCl) lỏng lắc pH 5, 37ºC sau 48 nuôi cấy; chủng CN6 có khả sinh tổng hợp protease cao (0.867 U/ml) điều kiện môi trường NB(bổ sung 5% NaCl) lỏng lắc pH 7, 37ºC sau 24 ni cấy; chủng CH6 có khả sinh tổng hợp protease cao (0.818 U/ml) điều kiện môi trường NB(bổ sung 5% NaCl) lỏng lắc pH 7, 37ºC sau 24 nuôi cấy viii PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nước mắm sản phẩm sản xuất từ cá lên men sử dụng rộng rãi làm gia vị nhiều nước Đông Á Đông Nam Á Việt Nam, Thái Lan, Nhật Bản, Trung Quốc (Park et al., 2001; Sinauwan et al., 2008) Nước mắm thực phẩm giàu dinh dưỡng, có hàm lượng axit amin acid béo chưa bão hòa cao nên có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng (Dincer et al., 2010) Bên cạnh đó, nghiên cứu gần nước mắm cịn có hoạt tính chống oxy hóa cao (Aoshima and Oshima, 2009) Ở Việt Nam, nước mắm sản phẩm truyền thống sản xuất từ lâu đời Ngày nay, nước mắm không sản xuất để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng nước mà xuất sang nhiều nước giới Nước mắm sản xuất theo phương pháp lên men truyền thống thường nhiều thời gian nên lợi nhuận thấp khó đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày lớn thị trường Vì vậy, để tăng lợi nhuận cho người sản xuất đồng thời để đáp ứng nhu cầu sử dụng nước mắm ngày tăng cần có biện pháp rút ngắn thời gian sản xuất Quá trình làm mắm rút ngắn cách điều chỉnh pH, nồng độ muối nhiệt độ trình lên men Sự điều chỉnh với mục đích tối ưu hố hoạt động protease vi khuẩn ruột cá sinh (Yongsaw Atdigul et al.,2007) Một cách khác để rút ngắn trình sản xuất nước mắm bổ sung protease vi khuẩn sinh tổng hợp protease để làm tăng tốc độ thủy phân protein Trong nghiên cứu Siringan et al (2006) bổ sung vi sinh vật lên men cá để rút ngắn trình lên men Tuy nhiên, hoạt tính enzyme protease vi khuẩn bị giảm dần trình lên men hàm lượng muối cao mắm Chính cần sử dụng vi sinh vật chịu mặn sinh protease để khắc phục nhược điểm Những kết nghiên cứu gần cho thấy, bổ sung vi khuẩn chịu mặn sinh protease rút ngắn trình sản xuất nước mắm mà giữ chất lượng (Yongsaw atdigul et al., 2007; Akolkar et al., 2010) CN6 CH3 CH6 Hình Khả chịu muối chủng vi khuẩn *Kết luận: Qua thí nghiệm kiểm tra khả chịu mặn khả sinh protease Chúng nhận thấy chủng vi khuẩn đáng ý là: CH3,CH6, CN6 4.5 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào, nghiên cứu số đặc điểm hóa sinh a Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào: Các chủng vi khuẩn (CN6, CH3, CH6) nuôi môi trường NA 37oC 24 quan sát hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào chủng vi khuẩn Kết thể rõ bảng 4.5 29 Bảng Đặc điểm hình thái STT Tên Hình ảnh Hình thái chủng khuẩn lạc CN6 Khuẩn lạc trịn, Hình Thái tế bào trắng ngà, mép nguyên Gram (+); hình que CH3 Khuẩn lạc trịn, trắng đục, mép ngun Gram (+); hình que ngắn CH6 Khuẩn lạc chia thùy, trắng , có nhân, mép ướt Gram (+); hình que dài,mảnh 30 Chú thích: (+) dương tính (-) âm tính b Đặc điểm hóa sinh Các chủng vi khuẩn tuyển chọn nghiên cứu số đặc điểm hóa sinh như: khả di động, hoạt tính catalase, phản ứng MR, citrate khả sinh enzyme ngoại bào Các đặc điểm thể qua trao đổi chất vi sinh vật, chuyển hóa chất biết mơi trường dinh dưỡng ni cấy vi sinh vật Hình 4 Phản ứng sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập Bảng Một số phản ứng sinh hóa, khả sinh enzyme ngoại bào STT Tên chủng Di động Catalase MR Amylase Cellulase Citrat CN3 + + + + - + CN6 + + + + - - CH6 + + + + - - Dựa vào kết hình thái khuẩn lạc tế bào đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn tuyển chọn (Bảng 4.5 Bảng 4.6.) so sánh với khóa phân loại Bergey (1994) bước đầu xác định chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus sp vi khuẩn Gram dương, có dạng hình que có khả tổng hợp enzyme có hoạt tính cao đặc biệt amylase protease; thuộc nhóm chịu 31 ưa mặn phổ biến sản phẩm lên men từ thủy sản đặc biệt giai đoạn đầu trình lên men (Đồn Văn Thược Vũ Thị Thu Hiền, 2015) 4.6 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả sinh protease chủng vi khuẩn tuyển chọn 4.6.1 Ảnh hưởng thời gian đến khả sinh protease Nhiệt độ nhân tố ảnh hưởng trực tiếp đến trình sinh enzyme vi khuẩn Bacillus Nhiệt độ nuôi cấy cao hay thấp gây ức chế khả sinh enzyme, làm đình trệ phản ứng trao đổi chất ảnh hưởng đến trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn Tiến hành ni lỏng, lắc 180 vịng/phút chủng vi khuẩn tuyển chọn môi trường NB (bổ sung 5% NaCl) 37oC để khảo sát khả sinh protease sau 24 giờ, 48 giờ, 72 Sau đó, dịch ni cấy ly tâm thu enzyme thơ dùng để đo hoạt độ protease Kết thể hình 4.5 Hình Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ protease Kết thí nghiệm cho thấy, hai chủng CN6 CH6 cho hoạt độ cao sau 24h nuôi cấy (0.867 U/ml và0.818 U/ml), đó, chủng CH3 cho hoạt độ cao sau 48h nuôi cấy (1.057 U/ml) 32 Kết nghiên cứu tương tự kết trước Sehar Hameed (2011) chủng vi khuẩn Bacillus sp phân lập từ vùng đất nhiễm mặn 4.6.2 Ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp protease Với điều kiện pH khác khả sinh trưởng phát triển, đồng thời khả sinh tổng hợp enzyme protease chủng vi khuẩn khác Các chủng vi khuẩn tuyển chọn ni lỏng, lắc 180 vịng/phút mơi trường NB (bổ sung 5% NaCl) 37oC 24h chủng CN6 CH6 48h CH3 pH 4, 5, 6, 7, 8, Sau đó, dịch ni cấy ly tâm thu enzyme thơ dùng để xác định hoạt độ protease Kết thu thể hình 4.6 Hình Ảnh hưởng pH đến hoạt độ protease Kết thu được, chủng CH3 cho hoạt độ cao pH với hoạt độ 1.284 U/ml, chủng CN6 CH6 cho hoạt độ cao pH (0.867 U/ml 0.811 U/ml) Đỗ Thị Bích Thủy cs.(2015) khảo sát ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp protease chủng B Subtilis DC5 cho hoạt độ cao pH 33 4.6.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp protease Nhiệt độ yếu tố ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme vi khuẩn Tiến hành ni lỏng, lắc 180 vịng/phút mơi trường NB (bổ sung 5% NaCl) 30oC, 37oC, 45oC, 50oC điều kiện: 48h, pH chủng CH3; 24h, pH chủng CN6, CH6 Sau ly tâm dịch nuôi cấy, thu dịch enzyme xác định hoạt độ protease Kết thu thể hình 4.7 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease Sau chủng vi khuẩn tuyển chọn nuôi cấy điều kiện nhiệt độ khác cho thấy ba chủng CH3, CN6, CH6 cho hoạt độ cao 37oC với hoạt độ 1.284 U/ml, 0.867 U/ml, 0.818 U/ml Như vậy, sau thực thí nghiệm để đánh giá ảnh hưởng yếu tố (thời gian, pH, nhiệt độ) tới hoạt lực enzyme protease chủng vi khuẩn tuyển chọn chúng tơi có kết luận sau: - Chủng CH3: điều kiện pH 5, 37ºC sau 48h ni cấy cho hoạt độ mạnh 1.284 U/ml - Chủng CN6: điều kiện pH 7, 37ºC sau 24h ni cấy cho hoạt độ mạnh 0.867 U/ml - Chủng CH6: điều kiện pH 7, 37ºC sau 24h ni cấy cho hoạt độ mạnh 0.818 U/ml 34 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ mẫu chượp mắm cá thu tỉnh Thái Bình, chúng tơi phân lập 18 chủng vi khuẩn Tuyển chọn chủng CH3, CN6 CH6 có khả chịu mặn có hoạt tính protease mạnh với hoạt độ 1.284 U/ml, 0.867 U/ml 0.818 U/ml Nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào đặc điểm sinh hóa từ định danh sơ khẳng định chủng vi khuẩn phân lập thuộc chi Bacillus sp - Chủng CH3 sinh tổng hợp enzyme protease mạnh nuôi NB (bổ sung 5% NaCl) lỏng lắc pH 5, 37ºC sau 48h nuôi cấy - Chủng CN6 sinh tổng hợp enzyme protease mạnh nuôi NB (bổ sung 5% NaCl) lỏng lắc pH 7, 37ºC sau 24h nuôi cấy - Chủng CH6 sinh tổng hợp enzyme protease mạnh nuôi NB (bổ sung 5% NaCl) lỏng lắc pH 7, 37ºC sau 24h nuôi cấy 5.2 Kiến nghị Do thời gian điều kiện nghiên cứu có hạn nên chúng tơi chưa thể sâu vào nghiên cứu, chúng tơi có số kiến nghị sau: - Tiếp tục nghiên cứu sâu chủng có tiềm chịu mặn sinh protease như: tách DNA tổng số, giải trình tự - Nghiên cứu tách chiết enzyme protease ứng dụng vào sản xuất nước mắm, chế biến thủy hải sản 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt (1) Đoàn Văn Thược Vũ Thị Thu Hiền (2015) Tuyển chọn nghiên cứu khả sinh tổng hợp proease chủng Bacillus phân lập từ mắm cá (2) Lê Ngọc Tú, La Văn Chử, Phạm Thị Trân Châu (1982), “Vi Sinh Vật, tập 1” NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội 1982 (3) Lê Văn Việt Mẫn, Trần Thị Ánh Tuyết (2006), “Characterization of protease from Aspergillus oryzae surface culture and application in fish sauce processsing” (Khảo sát số tính chất chế phẩm protease từ canh trường nuôi cấy bề mặt Aspergillus oryzae ứng dụng enzyme sản xuất nước mắm), Science & Technology Development (tạp chí phát triển KH&CN), Vol 9, No.5-2006, p.53-58 (4) Lương Đức Phẩm (2004) Công nghệ vi sinh vật NXB Nông nghiệp, Hà Nội (5) Lương Đức Phẩm (2006) Công nghệ sinh học bảo quản chế biến thực phẩm Tài liệu dùng lớp cao học sinh học Viện KHCN Việt Nam (6) Lưu Thị Nguyệt Minh (2007), “Phân tách Protease Bacillus subtilis hệ hai pha Polyethylene glycol/ Potassium phosphate”, Đồ án tốt nghiệp (7) Nguyễn Bài cộng (1995), “Sản xuất nước mắm ngắn ngày enzim proteaze”, Đề tài khoa học cấp Nhà nước 1995 (8) Nguyễn Lân Dũng (2006) Giáo trình vi sinh vật học NXB giáo dục (9) Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học- Tập III NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội (10) Nguyễn Trọng Cẩn & Đỗ Minh Phụng (1990), “Công nghệ chế biến thực phẩm thuỷ sản” - tập 2: Ướp muối, chế biến nước mắm, chế biến khơ, thức ăn chín, NXB Nông nghiệp (11) Phạm Vân Thủy, Nguyễn Công Khẩn, Y Lima (2006), “Đánh giá cảm\ quan nước mắm bổ sung chất sắt”, tạp chí Y học dự phịng, tập XVI, số 5, tr.84 (12) ThS Phạm Khánh Phương(2013) Nghiên cứu ứng dụng enzyme vào cải tiến quy trình sản xuất nước mắm (13) Trần Cơng Hịa (2010), “Nghiên cứu ảnh hưởng enzyme bromelain 36 nồng độ muối đến trình sản xuất nước mắm”, luận văn thạc sỹ kỹ thuật, Trường Đại học Đà Nẵng (14) Trần Linh Thước (2017) Phương pháp phân tích vi sinh vật NXB giáo dục (15) Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn (2006), “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm protease từ ruột cá Basa (pangasius bocourti)”, Tạp chí Phát Triển KH&CN, tập 9, số11- 2006 (16) Trần Xuân Ngạch (2007), Công nghệ enzym, Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng Tài liệu tiếng anh (17) Boominadhan U., R Rajakumar, P K V Sivakumaar, M M Joe (2009) Optimization of protease enzyme production using Bacillus sp isolated from different wastes, Botany Research International 2: 83 (18) Chae S K, Itoh H and Nikkuni S (1989), “Effect of soy sauce Koji & commercial proteolytic enzyme on acceleration of fish sauce production”, Korean J Food Sci Tec., 21, p.639-648 (19) Dougan J.; Howard G E (1975), “Some flavouring constituents of fermented fish sauces J Sci Food Agric 26, p.887-894 (20) Folasade M O and Joshua O A (2005) Production dynamics of extracellular protease from Bacillus species African Journal of Biotechnology Vol 4: 776-779 (21) Fukami K., Funatsu Y., Kawasak K., & Watabe S (2004), “Improvement of fish sauce odor by treatment with bacteria isolated from the fish sauce mash (moromi) made from frigate mackerel”, J Food Sci., 69, p.45-49 (22) Fukami K., Ishiyama S., et al (2002) “Identification of distinctive volatile compounds in fish sauce”, J Agric Food Chem 50, p.5412- 5416 (23) Gildberg A & ThongThai C (2001), “The Effect of Reduced Salt Content and Addition of Halophilic Lactic Acid Bacteria on Quanlity and Composition of Fish Sauce made from Sprat”, J Aquatic Food P Tec, Vol.10, Issue 1, 2001 (24) Gitishree Das 1* and M.P Prasad (2010) Isolation, purification & mass production of protease enzyme from bacillus subtilis 37 (25) Hariono I., Yeap S E., Kok T N & Ang G T (2005), “ Use of Koji and protease in fish sauce fermentation”, Singapore J Pri Ind., 32, p 19-29 (26) Lopetcharat K., Choi Y J., Park J W., and Daeschel, M.A (2001), Fish sauce productions and manufacturing: review Food review international 17: p.65-88 (27) Sharmin S., M T Hossain and M N Anwar (2005) Isolation and characterization of a protease producing bacteria Bacillus amovivorus and optimization of some factors of culture conditions for protease production, Journal of Biological Sciences 5: 358 (28) Siviwan Nawong (2006), “Isolation, Selection and identification of proteinase-producing bacteria from fish sauce fermentation to be used as starter cultures”, Athesis submitted in Prartal fulfillment of the requirements for a Master’s Degree of Science in Food Technology, Suranaree University of Technology (29) Yongsawatdigul J., Rodtong S & Raksakulthai N (2007), “Acceleration of Thai fish sauce fermentation using proteinases and bacterial starter cultures”, J Food Sci.,Vol.72, No.9, p.382-390 Tài liệu Internet (30) https://www.123doc.net/document/2229642-phan-lap-tuyen-chon-cac-chungcua-bacillus-subtilis-co-kha-nang-sinh-protease-cao-lam-co-so-cho-viec-che-taoche-pham-sinh-hoc-dung-trong-chan-nuoi.htm (31) https://www.tailieudaihoc.com/3doc/3076920.html (32) https://tailieuso.net/threads/151689-phan-lap-tuyen-chon-cac-giong-vi-sinhvat-sinh-protease-va-gay-huong-mam-dac-trung-va-ung-dung-vao.html.html (33) https://xemtailieu.com/tai-lieu/phan-lap-tuyen-chon-cac-chung-vi-khuan-tuchuop-mam-co-kha-nang-sinh-tong-hop-ectoines-1465901.html (34) https://123doc.net/document/6786396-tuyen-chon-va-nghien-cuu-kha-nangsinh-tong-hop-protease-cua-ba-chung-bacillus-phan-lap-tu-mam-ca.htm 38 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn sinh protease phân lập STT Tên chủng CC2 CC3 CN2 Hình ảnh 39 CN6 CN7 CH3 40 CH6 Phụ lục Hình ảnh khả di động Phụ lục Hình ảnh phản ứng catalsae 41 Phụ lục Phản ứng MR chủng vi khuẩn Phụ lục Khả khử citrat chủng vi khuẩn 42 Phụ lục Hoạt tính cellulase amylase Amylase Cellulase Phụ lục Đường chuẩn Tyrosine 43