Khảo sát các điều kiện sinh tổng hợp protease ngoại bào chịu nhiệt từ streptomyces sp cnxk100

Mặc dù cónhiều nghiên cứu về việc thu nhận protease có nguồn gốc từ vi khuẩn và nấm mốc, nhưng khả năng ứng dụng để sản xuất protease ở quy mô lớn còn nhiều hạn chédo tính ổn định về hoạ

Bộ CÔNG THƯƠNG

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐHỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐÈ TÀI KHOA HỌCKÉT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀTÀI

Tênđềtài:Khảosát các điều kiệnsinh tổng hợpprotease ngoại bào chịu nhiệttừ Streptomycessp CNXK100

Mã sốđề tài: 22/2SHTP01

Chủ nhiệm đềtài:Nguyễn Ngọc Ân

Đon vị thựchiện: Đạihọc CôngnghiệpTP Hồ ChíMinh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài nghiên cứu “Khảo sát các điều kiện sinh tổng hợp protease ngoại bào

chịu nhiệttừ Streptomyces sp CNXK100”, tôi xin gửi lời cảm on:

- Ban giám hiệu Trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh đã hỗ trợ kinh phí cho đề tài.

- Phòng quản lý Khoa học và Hợp tác Quốctế đãhỗ trợ hoàn thiện giấy tờ đề cưong cũng như các giấy tờnghiệm thu đề tài.

- Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm đãtạo điều kiện thuận lợi về cơ sở thiết bị.

- Phòng Công nghệ vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường Đại học Côngnghiệp TP HồChí Minh đã cungcấp giống xạkhuẩn cho nghiên cứu - Các bạn Học viên, Sinh viên đang nghiên cứu và học tập tại phòng Công nghệ Vi

sinh, Viện Công nghệ Sinhhọc và Thựcphẩm, trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh đã tham gia thực hiện thí nghiệm liên quan đến đề tài.

1

PHẦN I THÔNGTIN CHUNGI Thông tíntôngquát

1.1.Tên đề tài: Khảo sát các điều kiện sinh tổng hợp protease ngoại bào chịunhiệt từ

thích hợp cho protease chịu

nhiệt từ dịch nuôi cấy xạ sinh tổng hợp protease chịu nhiệt có hoạt tính cao

1.4.Đơn vị chủ trì: Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường ĐH Công nghiệp TP Hồ Chí Minh

1.5.Thòi gian thựchiện:

1.5.1 Theo hợp đồng: Từtháng 03 năm 2023 đến tháng 03 năm 2024

1.5.2 Gia hạn (nếu có): Không có

1.5.3 Thựchiện thực tế: Từ tháng 03 năm 2023 đến tháng 11 năm 2023

1.6.Những thayđỗi so với thuyết minh ban đầu(nếu có): Không có sự thay đổi so với thuyếtminh ban đầu

1.7.Tổng kinh phíđược phê duyệt củađề tài: 20 triệu đồng(Hai mươi triệu đồng chẵn).

II.Kếtquả nghiên cứu1.Đặt vấn đề

Các enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật được xem làchấtxúc tác sinh họctiềmnăng và an

toàn với nhiều ưu điểm Đặc biệt, protease từ vi sinh vật đã được chứng minh không chỉ có triển vọng trong ngành công nghiệp chất tẩy rửa và thuộc da, mà còn có triển vọng trong ngành tổng hợp peptide, thuốc thử chẩn đoán [1] Việc sử dụng các chất tẩy rửa dựa trên protease có nhiều ưu điểm hơn khi so với các chất tẩy rửa tổng hợp thông thường như: hiệu quả làm sạch cao hơn, điều kiện loại bỏ bụi bẩn an toàn hơn, và khả năng loại bỏ

protein có ái lực cao với sợi dệt tốt hơn [2] Trong khi đó, protease chịu nhiệtthể hiện hoạt tính xúc tác cao, độ đặc hiệu cơ chất cao, và mang lại nhiều lợi ích khác nhau so với quá

trình biến đổi và phân hủy bởi chất hóa học thông thường Mặc dù cónhiều nghiên cứu về việc thu nhận protease có nguồn gốc từ vi khuẩn và nấm mốc, nhưng khả năng ứng dụng để sản xuất protease ở quy mô lớn còn nhiều hạn chédo tính ổn định về hoạt tínhtrong các điều kiện nhiệt độ và pH khắc nhiệt Trong khi đó, protease có nguồn gốc xạ khuẩn được

chứng minh có khả năng hoạt động tốt trong nhiệt độ cao, khoảng pH rộng, chống chịu được với các dung môi hữu cơ, chất hoạt động bề mặt và các loại enzyme thủy phân Do đó, việc tìm rachủng xạkhuẩn có khảnăng sinh tổng hợp protease ngoại bào hoạt động tốt trong điều kiện nhiệt độ caocũng như các điều kiện môi trường bất lợi là điều cần thiết [1, 2] Vì vậy, đề tài “Khảo sát các điều kiện sinh tổng hợp proteasengoại bào chịu nhiệt từ

Streptomyces sp CNXK100” được thực hiện nhằm hướng đến mục đích thu nhận protease

với số lượng lớn, góp phần đáp ứng nhu cầu ngày càngtăng vềchất xúctác sinh học mạnh mẽ, dễ dàng và kinh tế.

- Xác định được nhiệt độ phản ứng thích hợp để protease chịu nhiệt từ Streptomyces sp CNXK100 thể hiện hoạt tính xúc tác thủy phân cơ chấtcao

- Xác định được sự ảnh hưởng củacác thành phần dinh dưỡng hiện diện trong môi trường

nuôi cấy đến khảnăng sinh tổng hợp proteasetừStreptomyces sp CNXK100

3

- Xác định được sự ảnh hưởng của thông số nhiệt độ và pH môi trường nuôi cấy đến khả

năng sinh tổng hợp proteasetừ chủng xạ khuẩn này

3 Phương pháp nghiên cứu3.1.Chủnggiống

Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp CNXK100 được lưu trữ trong Bộ sưu tập giống của

Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường

Đại học Công nghiệpThành phố Hồ Chí Minh.

3.2.Phương pháp

3.2.1 Khảosát nhiệt độ phảnúng của protease chịunhiệt hiệndiện trong dịchnuôicấy Streptomyces sp CNXK100

Mỗi loại protease có mộtkhoảng nhiệt độ tối ưu để hoạt động Để xác định nhiệt độ phản ứng thích hợp nhất, dịch protease thô được cho tác dụng với cơ chất ở các mốc nhiệt độ khác nhau Sau đó, hoạt tính của protease được xác định theo phương phápAnson cải tiến

Nhiệt độ phản ứng thích hợp sẽ đượcchọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo [3].

3.2.4.Khảo sát sự ảnh hưởng của các điều kiện môi trườngnuôi cấy lênkhả năng

sinhtổng hợp protease chịu nhiệtcủa Streptomyces sp CNXK1003.2.4.1 Sựảnh hưởngcủa chất cảmứng vànồng độ cơ chất cảm ứng

Để đánh giá sự ảnh hưởng của cơ chấtcảm ứng lên khảnăng sinh tổng hợp protease của xạ

khuẩn, các nguồn cơ chất cảm ứng khác nhau đượcbổ sung vào môi trường nuôi cấy với tỷ lệ 1,0% (w/v), trong đó đối chứng âm là môi trường không cóbổ sung cơ chất cảm ứng

[4, 5] Tại mỗi thời điểm khảo sát, hoạt tính protease củadịch nuôi cấy được xác định theo

phương pháp Anson cải tiến Cơ chất cảm ứng thích hợp nhất cho sự sinh tổng hợp

protease chịu nhiệt của Streptomyces sp CNXK100 được sử dụng để thực hiện các thí nghiệm về sự ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng với nồng độ khảo sát từ 0% đến 3,0% Nồng độ cơ chất cảm ứng thích hợp nhất cho sự sinh tổng hợp protease của xạ khuẩn được chọn để thựchiện các thí nghiệm tiếptheo.

3.2.4.2 Sựảnh hưởng của nguồn carbonvà nồngđộ carbon

Ảnh hưởng của các nguồn carbon lên khả năng sinh tổng hợp protease của xạ khuẩn được khảo sát trên môi trường nuôi cấy có bổ sung các nguồn carbon khác nhau bao gồm D- glucose, sucrose, maltose, lactose, maltodextrin, tinh bột Môi trường nuôi cấy có chứa nồng độ cơ chất thích hợp từ thí nghiệm trước được bổ sung riêng lẽ các nguồn carbon

khảo sát với tỷ lệ 1,0% (w/v) [1] Sau khi xác định được nguồn carbon thích hợp cho sự sinh tổng hợp protease có hoạt tính cao từ xạ khuẩn, nguồn carbon này được sử dụng để thực hiện thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ carbon với các giá trị từ 0% đến

4,0% (w/v) Nồng độ carbon thích hợp cho sự sản sinh protease từ Streptomyces sp

CNXK100 được sử dụng đểthực hiện các thí nghiệm tiếp theo.

3.2.4.3 Sựảnh hưởng của nguồn nitrogenvà nồngđộnitrogen

Sự ảnh hưởng của nguồn nitrogen được đánh giá bằng cách bằng cách bổ sung nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ vào môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Môi trường nuôi cấy có nồng

độ cơchấtcảm ứngvà nồng độ carbonthích hợp từ thínghiệm trước được bổ sungriêng lẽ

các nguồn nitrogen như NaNCh, NH4CI, (NH2)2CO, NH4NO3, peptone và tryptone với tỷ lệ 1,0% (w/v) [3] Sau khi xác định được nguồn nitrogen thích hợp cho sự sinh tổng hợp

protease có hoạt tính cao từ xạ khuẩn, nguồn nitrogen này được sử dụng để thực hiện thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ nitrogen ở các giátrị khácnhau: 0,1%, 0,25%,

0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, và 3,0% (w/v) Nồng độ nitrogen thích hợp nhất cho sự sinh tổng hợp protease ngoại bàochịu nhiệt của Streptomyces sp CNXK100 được sử dụng để thực hiện các thí nghiệmtiếptheo.

3.2.4.4.Sự ảnh hưởng củapH môi trường ban đầu

Để đánh giá sự ảnh hưởng của giá trị pH môi trường nuôi cấy ban đầu lên khả năng sinh

tổng hợp proteasecủa xạ khuẩn, môi trường nuôi cấy với thành phần dinh dưỡng được xác

định từ các thí nghiệm trước được điều chỉnh các giá trị pH khác nhau: 4,0; 5,0; 6,0; 7,0;

8,0; 9,0 và 10,0 Sau khi xác định được giátrị pH môi trường nuôi cấy phù hợp cho sự sinh

tổng hợp proteasecó hoạt tính cao, giá trị pH này được chọn để tiến hành thực hiện các thí nghiệm tiếptheo [1, 6, 7].

3.2.4.5 Sựảnh hưởng của nhiệtđộ nuôi cấy

Để đánh giá sự ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease,

chủng xạkhuẩn được nuôi cấy trongmôi trường với các điều kiện thích hợp trong các mốc

nhiệt độ khác nhau: 25°c, 30°C, 35°c,40°C, 45°c và 50°C Sau khi xác định được nhiệt độ

nuôi cấy thích hợp cho sự sinh tổng hợp protease có hoạt tính cao, giá trị nhiệt độ này đượcchọn để tiến hành thực hiện các thí nghiệm tiếptheo [6, 7].

5

3.2.4.Ó.Sự ảnh hưởng củathòi gian nuôi cấy

Quá trình khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp

protease của Streptomyces sp CNXK100 được thực hiện bằng cách nuôi cấy chủng xạ khuẩn này trong điều kiện môi trường khảo sát ở các thời điểm khác nhau: 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ, 84 giờ, 96 giò và 108 giờ Thời gian thích hợp cho sự sinh

tổng hợp protease có hoạt tínhcao được sử dụng chocác thí nghiệm tiếp theo [1,6].

3.2.5.Phương pháp xử lýsố liệu

Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, số liệu thu thập được tính toán giá trị trungbình, độ lệch chuẩn và vẽ đồ thị bằng Microsoft Excel 2016 Phần mềm thống kê Statgraphics 19-X64 được sử dụng để đánh giá sự khác biệt giữa các yếu tố khảo sát thông qua phương pháp phân tích phương sai ANOVAmộtyếu tố với mứcý nghĩa 95% (Pvaiue< 0.05).

4 Tổng két vềkết quả nghiên cứu

Đề tài “Khảo sátcác điều kiện sinh tổng hợp protease ngoại bào chịu nhiệttừStreptomyces

sp CNXK100” đã đạtđược một số kết quả như sau:

+ Protease hiện diện trong dịch nuôi cấy Streptomyces sp CNXK100 có khả năng xúc tác thủy phân cơ chất ởnhiệt độ cao(60°C-90°C), và hoạt tính thể hiện cao nhất ở 75°c.

+ Skim milk với nồng độ 1,0% được xác định là nguồn cơ chất cảm ứng và nồng độ cơ chất cảm ứng thích hợp cho Streptomyces sp CNXK100 sinh tổng hợp protease có hoạt tính cao(2060,25±38,58Ư/ml).

+ Lactose với nồng độ 1,0% được lựa chọn là nguồn carbon và nồng độ carbon thích hợp cho chủng Streptomyces sp CNXK100 sinh tổng hợp protease chịu nhiệt có hoạt tính cao (2478,03±48,47 u/ml).

+ NaNOs với nồng độ 0,1% là nguồn nitrogen và nồng độ nitrogen thích hợp cho

Streptomyces sp. CNXK100 sinh tổng hợp protease chịu nhiệt thể hiện hoạt tính xúc tác thủy phân cơ chất cao nhất(2990,62±48,95 Ư/ml).

+ Trên môi trường nuôi cấy có giá trị pH ban đầu từ pH 7,0-8,0, trong khoảng nhiệt độ từ

30°C-35°C thìStreptomyces sp CNXK100 sinh tổng hợp protease có hoạt tính cao với giá trị hoạt tínhghi nhận là2943,21±12,18 Ư/ml.

+ Sau 72 giờ đến 96 giờ, dịch nuôi cấy Streptomyces sp CNXK100 thể hiện hoạt tính protease chịu nhiệt cao nhất.

+ Công bố 1 bài báo khoahọc trên Tạp chí Công nghệ IƯH

5 Đánh giácác két quảđạt được

+ Ý nghĩa khoa học: Đe tài được thực hiện sẽ góp phần hiểu thêm về sự ảnh hưởng của các thành phần môi trường nuôi cấy để Streptomyces sp CNXK100 sinh tổng hợp protease có hoạt tính cao Kết quả nghiên cứu được dùng để so sánh, đối chiếu với cácnghiên cứu liên

quan, từ đó mở rộng co sỏ dữ liệu về chủng xạ khuẩn nghiên cứu Đồng thời, nghiên cứu

này giúp bổ sung thông tin vào bộ sưu tập giống xạ khuẩn, làm tiền đề để phát triển các

ứng dụng có liên quan đến protease chịu nhiệt trong tưong lai Đồng thời, protease chịu

nhiệtcó nguồn gốc từ xạ khuẩn được sử dụng làm cơ sởkhoa học cho nghiên cứu và giảng

dạy tại các trường đại học, cung cấp dữ liệu khoahọc mới và nguồn tài liệu tham khảo hữu ích trongcác nghiên cứu về xạ khuẩn sau này.

+Ý nghĩa thực tiễn: Khai thác tiềm năng ứng dụng của Streptomyces sp CNXK100 có khả năng sinh tổng hợp protease chịu nhiệt trong các quy trình công nghiệp, giảm bớt chi

phí sản xuất, năng caohiệu suất thủy phân protein, đồng thời thay thế các hợp chấthóa học

gây hại môi trường sống nói chung cũng như sức khỏe con người nói riêng.

6 Tóm tắtkết quả

Tiếng việt: Protease chịu nhiệt được ứng dụng rộng rãi trong các quy trình công nghiệp

cũng như trong lĩnh vực y tế do thể hiện hoạt tính xúc tác và độ đặc hiệu cơ chất cao Các protease chịu nhiệt có nguồn gốc từ xạ khuẩn thường được chứng minh có nhiều đặc tính sinh học nổi bật Trong nghiên cứu này, dịch protease thô từ Streptomyces sp CNXK100 được thu nhận sau 5 ngày nuôi cấy có khả năng thủy phân cơ chat casein trong điều kiện nhiệt độ từ 60-90°C, và hoạt động tốt nhất ở 75°C Khi nuôi cấy Streptomyces sp

CNXK100 trên môi trường Gause I biến đổi có bổ sung 1,0% skim milk, 1,0% lactose,

0,1%NaNOs trong điều kiện lắc 150 vòng/phútở 30°C hoặc 35°c, pH môi trường ban đầu

7,0 hoặc 8,0 thì dịch protease thô thể hiện hoạt tính cao nhất (2943,21± 12,1 Ư/ml) Với khả năng chịu nhiệt cao, protease được sinh tổng hợp từ Streptomyces sp CNXK100 có nhiều tiềm năng ứng dụng trongnhiều lĩnh vực có liên quan, đặc biệt là trongngành công

nghiệp thuộc da và công nghiệp chất tểy rửa.

Từ khóa:Enzymengoạibào, proteasechịu nhiệt, xạkhuẩn, Streptomyces

Abstract: Thermostable proteases are widely used in industrial processes as well as in the medical field because oftheir high catalytic activity, high substrate specificity,and various benefits Thermostable proteases derived from actinomycetes have been shown to have

7

many outstandingbiological properties In this study, crude extract from Streptomyces sp CNXK100 obtained after days of culture was shown to have high activity at 60°C to 90°C, and optimum at 75°C When culturing Streptomyces sp CNXK100 on modified Gause I medium supplemented 1.0% skim milk, 1.0% lactose, and0.1%NaNOs in shaking conditions at 150 rpm at 30°C or 35°c, initial medium pH 7.0 or pH 8.0, crude protease extract showed the strongest proteolytic activity (2943.21±12.1 u/ml) With thermostability, protease from Streptomyces sp CNXK100 have shown their potential in related industries,especially in the tannery and detergent industries.

Key words: Extracellularenzyme, thermostableprotease, actinomycetes, Streptomyces

III Sảnphẩm đề tài, công bốvà kếtquảđào tạo

vẽ thiết kế; Quy trình công nghệ; Sơ đồ, bản đồ; số liệu, Cơ sở dữ liệu; Báo cáo phân tích; Tài liệu

dự báo (phươngpháp, quy trình, mô hình, )', đề án, qui hoạch; Luận chứng kinh tế-kỹ thuật, Báo

cáo nghiên cứu khả thi và các sản phẩm khác;

TTTên sảnphẩmSốlượngYêucầu cầnđạtGhichú

Quy trình nuôi cấy sinh tống hợp protease chịu nhiệt từ Streptomyces

Đã đượcchấp nhận đăngtrên tạo chí Khoahọc và Công

2 Nguyên, nhiên vật liệu, cây con 1,900,000

3 Thiếtbị, dụng cụ 4 Công tác phí

5 Dịch vụthuê ngoài

V Kiến nghị ( về phát triểncác kếtquả nghiên cứu của đề tài)

+ Tinh sạch và xác định các đặc điểm hóa sinh của protease chịu nhiệttừ Streptomyces sp.

+ Nghiên cứu lên quy mô pilot và quy mô công nghiệp để thu nhận protease vói số lượng

lớn Đồng thời định hướng ứng dụng chế phẩm protease vào các ứng dụng công nghiệp, đặc biệt là lĩnh vực bảo quản và chế biến thực phẩm.

VI Phụlụcsản phẩm (liệt kêminh chứng các sản phẩm nêu ởPhầnIII)

- Quytrình nuôi cấy sinh tổng hợp protease chịu nhiệttừStreptomyces sp CNXK100

- Bài báo đã được chấp nhận đăng trên Tạp chí Khoa học và Côngnghệ IUH (1 bài)

PHẰN II.BÁOCÁO CHI TIẾT ĐẺTÂI NGHIÊNcứu KHOA HỌC

CHƯƠNG 1 TỎNG QUAN

1.1 Đặcđiểmsinh học của Síreptomyces

1.1.1Đặcđiểm hình thái

Streptomyces là chi lớn nhắt của ngành Actinobacteria, họ Streptomycetaceae Streptomyces thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, sống hoại sinh, phân bố rộng rẫi trong môi trường tự nhiên và thường có tỷ lệ GC trong DHẢ cao hơn 55% Trong chu

trình sống, chúng thường sinhtrưởng dưới dạng sợi không có vách ngăn, ởđầu cuống sinh bào tử có thể hình thành bàotửriêng lẻ hoặc chuỗi bào tử [8, 9],

Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, khuẩn lạc Streptomycesrắn chắc, có nhiều hình dạng

khác nhau như dạng phóng xạ, dạng nhung, dạng vôi, bề mặt khuẩn lạc khô có thể chia thùy hoặc không chia thùy, một số khác có dạng hình tròn đồng tâm cách nhau một khoảng

nhất định Đồng thời, khuẩn lạc thường có nhiều màu sắc khác nhau như đỏ, cam, vàng,

nâu,tím với kích thước thay đổi tùy loài vàtùy điều kiện nuôi cấy [9, 10].

Theo sựkhác biệt về hình thái và chức năng, hệ sợi tơ của Streptomyces chia thành hệ sợi

cơ chắt và hệ SỢI khí smh với đường kính dao động từ 0,1-0,5 pm (Hình 1.1) Màu sắc,

hình dạng khuẩn lạc, sự phát triển của hệ sợi tơ, khả năng tiết sắc tố, vị trí, số lượng, cắu trúc bề mặt, hình dạng và khả năng di động của bào tử đều là những đặc điểm quan trọng

trong việc phân loại giữa các loài Streptomyces [9, 11],

Hình 1.1 Mặt cắt ngang của khuẫn lạc xạ khuẩncho thấy sợi cơ chắt và sợi khí sinh với chuỗi bào tử đính [9]

1.1.1.1Hệ sợi cơ chất

Vòng đời của Streptomyces khi nuôi cấy trên môi trường thạch bao gồm sự hình thành hai hệ sợi khác biệt là sợi cơ chắt và sợi khí sinh Sợi cơ chắt phát triển bên trong môi trường nuôi cấy Chức năng chính của sợi cơ chắt là hắp thu các chất dinh dưỡng để xạ khuẩn

phát triển Bên cạnh đó, sợi khí sinh phát triển bên trên bề mặt môi trường tạo thành bề

mặt khuẩn lạc và giải phóng các bào tử Đồng thời, sợi co chất có khả năng bám chặt với cơchất để có thể sử dụng đầy đủ các vậtchất dinh dưỡng trong đất [11, 12].

Dưới kính hiển vi quang học, sợi cơ chất mảnh, trong suốt và phân nhánh nhiều hơn sợi khí sinh, đồng thời không tạo vách ngăn Sợi cơ chất thường phân mảnh tại chổ, không di độngcho đến khi pháttriển đến một giai đoạn nhất định [12].

Sợi cơchất thường có nhiều màu sắc khác nhau và có thể tạo ra sẳc tố tan trong nước hoặc tan trong chất béo Các sắc tố tan thấm vào môi trường nuôi cấy tạo cho môi trường có

màu sắc tươngứng Ngược lại, các sắc tố tan trong chất béo tạo ra khuẩn lạc tương tự như

màu của sắc tố đó Màu sắc của sắc tốthường khác với màu sắc của sợi khí sinh Màu sắc của hệ sợi cơ chất và sắc tố cũng là một trongnhững đặc điểm quan trọng để xác định các loài Streptomycesmới [12].

1.1.1.2 Hệsọi khí sinh

Khi sợi cơ chất phát triển đến một giai đoạn nhất định và bắt đầu phát triển trong không khí thì được gọi là sợi khí sinh Đôi khi, sợi khí sinh và sợi cơ chất rất khó phân biệt Dưới kính hiển vi quang học, sợi khí sinh thô, khúc xạ và pha sáng Sự hình thành sợi khí sinh

phụ thuộc vào đặc điểm của loài, điều kiện dinh dưỡng hoặc yếu tố môi trường Sợi khí

sinh của một số chi xạkhuẩn phát triển đến một giai đoạn nhất định thì bắt đầu hình thành chuỗi bàotử ở đầu gọi là khuẩn ty sinh sản [11, 12].

Sự hình thành sợi khí sinh ở chủng Streptomyces coeỉicolor bị chi phối bởi gene bld (bald gene) Đột biến gene bld gây ra sự hình thành các khuẩn lạc mà chỉ có sợi cơ chất Một

loại protein nhỏ gọi là SapB (Spore-asociated protein B)có liên quan trực tiếp đến việc tạo

nên sợi khí sinh SapB đượctiết ra từ các khuẩn lạc khi bắt đầu phân hóa, có vai trò bao

bọc sợi tơ ở bề mặt khuẩn lạc xạ khuẩn, nhờ đó giúp sợi tơ thoát ra khỏi môi trường nước của khuẩn lạc và pháttriển trong không khí [13].

1.1.1.3 Bào tử vàchuỗi bào tử

Sợi khí sinh phát triển trực tiếp từ sợi cơ chất trên cùng, và bào tử bắt đầu xuất hiện bằng cách hình thành vách ngăn trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh hay còn gọi là

cuống sinhbào tử Mỗi chi xạ khuẩn khác nhau sẽ có hình dạng bào tử khác nhau [14] Ví dụ, chi Streptomycescó đến 4 loại bào tử khác nhau như: bào tử có bề mặt mịn, sần sùi, có gai hoặc có lông.

11

Cuống sinh bào tử chính là cơ quan sinh sản đặc trưng của xạ khuẩn với nhiều dạng khác

nhau Trên mỗi cuống sinh bào tử mang từ 30-100 bào tử, thậm chí lên đến 200 bào tử,

nhung cũng có khi chỉ mang từ 1-2 bào tử Kích thước bào tử xạ khuẩn thay đôi tùy loài,

tùy cáthê trong loài, vàthậm chí ngay trên cùngmột chuỗi bào tử [9, 10].

Chuỗi bào tửcủa mỗi loài xạkhuẩn đều có những đặc diêm riêng biệt Cuống sinh bào tử và cuống sinhnang bào tử cùa Streptomyces có thê riêng rẽ hoặc phânnhánh (Hình 1.2) Các đặc diêm hình thái này rấtquantrọngtrong quá trình định danh các loàiStreptomyces [15, 16].

Thắng Uốn khúc Bó, chùm Phân tầng,không xoắn

,4 ,5 Phân tầng,Lượn sóng, xoăn mờ Xoăn lò xo Xoăn đóng Xoắn lò XO

Phân nhánh 2 chiều, Phân nhánh 2 chiều,không xoắn xoắn lò xo

Hình 1.2 Đặc diêm hìnhthái chuỗi bào tử chiStreptomyces [15]

1.1.2Đặc điểm sinhlý-sinh hóa

Trong số các chi xạ khuân được biết đến, chi Streptomyces đã nhận được sự quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực y học và nông nghiệp vì ba lý do chính Đầu tiên, Streptomyces phân bố rộng rãi trong đất, nước, cơ chất hữu cơ , đóng vai trò rất

quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất của tựnhiên cũng nhu tạo độ phì nhiêu cho đất Streptomycescó khả năng thủyphân nhiều loại polysaccharide phức tạp như cellulose, chitin, xylan và các đại phân tử tự nhiên khác thông qua việc sinh tông hợp đa dạng các

loại enzyme ngoại bào như amylase, cellulase, và protease Thứ hai, Streptomycetes thê

hiện sự phát sinh loài khá rộng Thứ ba, Streptomyces được đánh giá là một trong những sinh vật tuyệt vời với khả năng sinhtổng họp đa dạng các họp chất chuyến hóa thứ cấp có

hoạt tính sinh học cao như kháng sinh, chất chống ung thư, chất chống giun sán, chất chống sốtrét vàchấtchống viêm [2, 6, 17].

Giốngnhư nhiều loài vi khuẩn có trong đất, hầu hết Streptomyces ưa nhiệt độtrung bình,với

sự tăng trưởng tối ưu ở mức nhiệt từ 25-30°C, có khả năng phát triển trong khoảng pH từ

5,0-9,0, nhưng chủ yếu phát triển tối ưu ở pH trung tính Bên cạnh đó, độ ẩm cũng là một

yếu tố tác động đến sự phân bố cũng như hoạt tính của xạ khuẩn, dao động trong khoảng

40-50% Đồngthời Streptomyces được chứng minh là sinh vật nhạy cảm với nồng độ CƠ2

cao vànồng độ O2 thấp [7, 11].

Hiện tại, các công bố khoa học về hợp chất chuyển hóa socấp của xạ khuẩn nói chung và

chi Streptomyces nói riêng vẫn rất ít Tuy nhiên, một so gene mã hóa chocác enzyme quan

trọng như fructose-1,6-bisphosphate aldolase và glucose-6-phosphate dehydrogenase đã được xác định Năm 2002, hai gene zwf mã hóa cho enzyme đồng phân của glucose-6-phosphate dehydrogenase (enzyme đầu tiên trong con đường pentose phosphate) và một

gen devB mã hóa 6-phosphogluconolactonase trong Streptomyceslividans đã được nghiên cứu Bên cạnh đó, khả năng hấp thu glucose của Streptomyces noursei (ATCC 11455T)

cũng đã đượcchứng minh có liên quan đến con đường pentose phosphate và chu trình acid tricarboxylic Tưong tự như vi khuẩn đường ruột, glutamine synthetase I trong

Streptomyces coeỉcoỉor A3(2) được kiểm soát sau dịch mã bởi adenylyltransferase Ngoài ra, chủng xạkhuẩn này cũng có thể sử dụng acid béo (C4 đến C18) làm nguồn carbon duy nhất [11].

Streptomycetes là nguồn kháng sinh quan trọng nhất kể từ khi Waksman và cộng sự phát hiện ra actinomycin D, streptothricin và streptomycin vào những năm 1940

Streptomycetes tổng hợp rấtnhiều hợp chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau về mặtcấu trúc

hóa học Do đó, các nghiên cứu về bộ gene của Streptomyces rất được quan tâm khi có lần

lượt 23 gene và 30 gene trong nhiễm sắc thể của Streptomyces coelcolor A3(2) và

Streptomyces avermỉtỉlis MA-4680T được chứng minh có liên quan đến khả năng sinh

tổng hợp các hợp chấtchuyển hóa thứ cấp [11].

1.1.3 ứng dụng Streptomycestrong sảnxuấtenzymengoại bào

Trong số các loài vi sinh vật, xạ khuẩn được chứng minh có tính đa dạng cao và có khả

năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme ngoại bào (Hình 1.3) Bộ gene của Streptomyces mã

13

hóa cho khoảng 800 protein ngoại bào Streptomyces coelicolor A3(2) đã được chứng minh có khảnăng sinh tổng hợp 147 hydrolase, trong đó có 7 cellulase và 5 chitinase [11]

Các enzyme có nguồn gốc từ xạ khuẩn có khả năng hoạt động tốt ở nhiệt độ cao Nếu amylase thể hiện chức năng thủy phân tinh bột, có vai trò quan trọng trong ngành công

nghiệp thực phẩm thì cellulase có tầm quan trọng trong một số ngành công nghiệp sản xuất giấy Amylase được sản xuất từ Streptomyces sp Al-Dhabi-46 có khả năng hoạt động tốt

nhấtở 40°Cvà pH 8.0 cho thấytìm năng ứng dụng trong hóa học lâm sàng, dược phẩm, và

phân tích [18] Bên cạnh đó, cellulase có nguồn gốc từ chi Streptomyces được ứng dụng trong quá trình phân hủy cellulose, hemicellulose và lignin, enzyme này có khả năng hoạt động ở 50°C trong 1 giò [19].

Các enzyme tham gia vào quá trình phân hủy polymer tự nhiên chiếm 75% thị trường

enzyme trên thế giói Trong đó, pectinase chiếm khoảng 45% lượng enzyme sử dụng và là

một trong những loại enzyme hiệu quả nhất trong việc phân hủy chất thải trái cây [20] Nhiều chủng xạ khuẩn có khảnăng sinh tổng hợp pectinaseđã được chứng minh qua nhiều công trình nghiên cứu bao gồm Streptomyces spp., Streptomyces sp RCK-SC và

Streptomyces ỉydicus Trong nghiên cứu về quá trình phân lập, tinh sạch và xác định đặc

điểm của pectinase từ Streptomyces thermocarboxydus, pectinase tinh sạch một phần thể

hiện họat tính tốt nhất ở 70°C trong khoảng pH trung tính đến kiềm, có tiềm năng ứng

dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm chếbiến trái cây, rau củ quả, sản xuất rượu, trà và cà phê [21].

Tính đến năm 2010, keratinase chủ yếu được thu nhận từ xạ khuẩn, vi khuẩn và vi nấm Tuy nhiên, các nghiên cứu về phân lập, xác định đặc tính keratinase có nguồn gốc từ vi

sinh vật có giátrị kinh tế nhưng vẫn chưa đượckhai thác triệt để [20] Các chủngxạ khuẩn có khảnăng sinh tổng họp keratinase như Streptomyces ureofaciensK13, Streptomyces sp

SCƯT-3 Cho đến thời điểm hiện tại, keratinase cónguồn gốc từStreptomyces đóng vai trò quan trọng trong dược phẩm, và vật liệu tổng hợp phân hủy sinh học Trong nghiên cứu

“Sản xuất, tinh sạch, và xác định đặc điểm của enzyme có khả năng phân giải protein từ

Streptomyces sp 2M21”, keratinase tinh sạch thể hiện hoạt tính tối ưu ở pH 9,0 và 30°C, có khả năng phân hủy các loại cơ chất phức tạp như lông gà, len và móng tay Chủng xạ khuẩn này được nhận định có tiềm năng trong sản xuất keratinase để phân hủy các chất

thải chứa keratin, các quátrình làm sạch nhằm nâng cao giátrị sản phẩm [22].

Bên cạnh đó, sự quan tâm đến các enzyme có khả năng phân hủy xỵlan và ứng dụng xylanase trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy đã tăng lên đáng kể trong vài năm qua

Nhiều xylanase được sinh tổng hợp từ các chủng vi sinh vật ưa kiềm đã được báo cáo từ các công trình nghiên cứu khác nhau Hầu hết các nghiên cứu về xỵlanase tập trung vào

đặc tính của enzymevà ứng dụng củanó nhưmột tác nhân tiền tẩy trắng, nhưng córất ít

nghiên cứu tập trung đến việc tối ưu hóa sảnxuấtxỵlanase Tronghiện tại, có nhiều nỗ lực

được thực hiện để nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện liên quan đến sản xuất xylanase từ xạ khuẩn [20] Các chủng Streptomyces sp AMT-3, Streptomyces sp CSỐ24 và Streptomyces megasporus DSM 41476 được ứng dụng để sản xuấtxylanase ở quy mô công nghiệp với các ứng dụng tiềm năng trong ngành sản xuất bia, phân hủy sinh học các sản phẩm phụ nông-công nghiệp và phế thải nông nghiệp [23].

Hình 1.3 Enzyme ngoại bào từ Streptomyces spp [24]

Trongmôi trường đất, các loài vi khuẩn chiếm ưu thế tiếp đến là xạ khuẩn và vi nấm Tuy nghiên, khả năng sinh tổng hợp lipase của vi khuẩn, xạ khuẩn và vi nấm lần lượt là 8,5%, 55,9% và 23,3% Dođó, xạ khuẩn được xem làvi sinh vậttuyệt vời với khảnăng sản sinh lipase [20] Lipase được sản xuất từ nhiều loại xạkhuẩn có ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp chất tẩy rửa, thực phẩm, hóa dầu, chẩn đoánvà trong các ngành công nghiệp dược phẩm [25, 26] Trong nghiên cứu của Boran và cộng sự (2019), lipase được

15

sinh tổng hợp từ Streptomyces vioỉascens oc 125-8 thể hiện hoạt tính xúc tác tối ưu ở 40°C và pH 8,0, ổn định ở 30-40°C với hơn 86% hoạt tính còn lại sau 1 giờ xử lý, ổn định trong phạm vi pH 7,0-11,0 với hoạt tính ghi nhận từ 83,3-100%, có khả năng chống chịu với chất tẩy rửa thương mại như Tursil, Pril và Fairy với các giá trị hoạt tính còn lại lần lượt là 88%, 97%, và 98,5% Với các kết quả nghiên cứu, lipase từ Streptomycesvioỉascens oc 125-8 là lựa chọn lý tưởng để quản lý nước thải dầu mỡ [27] Ngoài ra,

Streptomycesgriseus, Streptomyces kamatakensis, vàStreptomycesalbidoflavus có khả

năng sản xuất L-asparaginase-một enzyme quan trọng được sử dụng trong điều trị một số bệnh ung thư ở người, chủ yếu là điều trị bệnh bạch cầu lymphoblasticcấp tính [28].

1.2Protease từxạ khuẩn

Protease là một trong ba nhóm enzyme công nghiệp lớn nhất, chiếm khoảng 60% tổng

lượng enzyme thương mại trên toàn thế giới Protease được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh

vực khác nhau như dệt may, chất tẩy rửa, da, thức ăn chăn nuôi, chất thải và các lĩnh vực khác [29] Gần hai phần ba protease thương mại được sản xuất từ nấm mốc, nấm men và xạ khuẩn Trong đó, xạkhuẩn là một trongnhững nguồn quan trọng nhất được sử dụng để sản xuất protease với các đặc tính đáng chú ý như ổn định ở nhiệt độ cao, bền pH, bền trong dung môi hữu cơ, chất tẳy rửa và các hợp chất oxy hóa Việc tìm kiếm các nguồn

protease mới đã và đang không ngừng nhận được sự quan tâm của các nhà nghiên cứu do tính ứng dụng rộng rãi của chúng Với lợi thế về dữ liệu trình tự bộ gene và protein, xạ khuẩn liên tục được sử dụng để sản xuấtprotease [30]

Hầu hết cácprotease được báo cáo từStreptomyces spp đều thể hiện tínhưakiềm, hoặc ưa mặn, và có khả năng phân hủy chất thải giàu chất sừng như lông, tóc, móng tay trong các

quy trình công nghiệp đã được báo cáo [30] Trong nghiên cứu của Sarkar và cộng sự

(2020),protease từ Streptomyces sp GS-1 thể hiện hoạt tính xúctác cao nhất ở 45°c và có

khả năng hoạt động tốt ở pH kiềm (8,0-10,0), đặc biệt protease này còn được chứng minh

có hiệu quả tẳy lôngtrong quá trình sản xuất da [31].

Môi trường biển được chứng minh là một nguồn Streptomyces tốtvới hoạt tính phân giải protein Protease ưa kiềm chịu nhiệt được sản xuất bởi Streptomyces mushroomcidicus

MML1614 có khảnăng loại bỏ vết máu hiệu quả hơn khi kết hợp với các chấttẩy rửa khác nhau Ngoài ra, Streptomyces koyangensis TN650 được phân lập từ mỏ dầu ngoài khơi Tunisia có khảnăng sản xuấtprotease ưa kiềm, bền trong dung môi và ổn định với chất tẩy

rửa Protease này được chứng minh là một ứngcử viên tiềm năng trong các công thức chất

tẩy rửa và trongcác ứng dụng công nghiệp quan trọng Streptomyces sp MAB18 có nguồn gốc từ trầm tích biển Cuddalore, Ân Độ có khả năng sản xuất protease thể hiện hoạt tính phân hủy chất thải giacầm, cótiềm năm ứng dụng trongcông thứcthức ăn chăn nuôi [24].

1.2.1 Phân loạivàcơ chế hoạt động

Protease (EC 3.4) thuộc lớp enzyme hydrolase Việc phân loại protease vẫn còn nhiều

thách thức do cơ chế hoạt động và đa dạng cấu trúc Hiện tại, protease được phân loại dựa

trên cáctiêu chí như vị trí phân cắt liên kết, vị trí của các acid amin trong trung tâm hoạt động và pH hoạt động tối ưu của enzyme Theo vị trí phân cắt liên kết peptide và chức năng của chúng, các protease được chia thành hai loại là exopeptidase (E.c.3.4.11-3.4.19) và endopeptidase (E.C.3.4.21-3.4.24, 3.4.99) (Hình 1.4) [32, 33].

1.2.1.1 Exopeptidase

Exopeptidase thể hiện hoạt tính bằng cách thủy phân acid amin tận cùng ở đầu amino hoặc

đầu carboxyl của chuỗi polypeptide Bên cạnh đó, exopeptidase còn được phân loại dựa trên tính đặc hiệu với trình tự acid amin và chiều dài chuỗi polypeptide được giải phóng sau quá trình phân cat Exopeptidase hoạt động ở hai dạng là aminopeptidase và carboxypeptidase [32].

- Aminopeptidase tác động lên đầu amino tự do củachuỗi polypeptide Ket quảcủa quá

trình phân cắt sẽ giải phóng một acid amin, dipeptide hoặc tripeptide Aminopeptidase

tồn tại ở dạng nộibào hoặcngoại bào [29, 34].

- Đầu carboxyl của chuỗi polypeptide sẽ bị tác động bởi carboxypeptidase Tùy thuộc

vào vị trí của các gốc acid amin tại vị trí của trung tâm hoạt động, carboxylpeptidase được chia thành 3 loại là serine carboxypeptidase, cysteine carboxypeptide và

metallocarboxypeptidase [32].

1.2.1.2 Endopeptidase

Trong khi các exopeptidase phá vỡ các liên kết peptide đầu amino hoặc đầu carboxyl của cơ chất thì các endopeptidase phá vỡ các liên kết peptide bên trong chuỗi polypeptide

Theo cách tương tự, các endopeptidase cũng được phân loại dựa trên các acid amin hoạt động hiện diện bên trong trung tâm hoạt động của enzyme bao gồm serine protease,

cysteine protease, aspartic protease và metalloprotease [29, 34].

17

Serine protease là những protease có nhóm -OH của serinetrong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Các serine protease thuờnghoạt động ở khoảngpH kiềm, thểhiệntính đặchiệu cochất tuong đối rộng và có trọngluợng phân tửtừ 19 kDa-110 kDa [33],

Cysteine protease là các protease chứa nhóm -SH của cysteine trong trung tâm hoạt

động Có khoảng 20 họ cysteine protease đuợc công nhận với tính đặc hiệu co chất rộng, hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 50-70°C, pH6,0-8,0 [33],

Aspartic protease là các protease có chứa một hoặc nhiều nhóm carboxyl của aspartic

trong trung tâm hoạt động Protease này có hoạt tính tối ưu ở pH thấp với các điểm

đẳng điện trong khoảng pH 3,0-4,5, khối lượng phân tử trong khoảng 30-45 kDa,

thường bị ức chếbởi pepstatin [33],

Metalloprotease là các protease chỉ hoạt động khi có sự hiện diện của ion kim loại Các metalloprotease thường hoạt động tốt ở pH 5,0-9,0 và hoạt tính enzyme bị ảnh hường đáng kể dướitác dụng của EDTA [33],

Bên cạnh đó, các endoprotease được phân loại dựa trên khả năng hoạt động của chúng

trong khoảng pH nhất định:

- Protease ưa acid là protease hoạt động trong khoảng pH từ 2,0-6,0.

- Proteasetrung tính là các protease hoạt động ở pH trung tính, kiềm yếuhoặc acid yếu - Protease ưa kiềm là protease hoạt động trong khoảng pH kiềm(8,0-13,0).

Hình 1.4 So đồ phânloại protease(T A Hamza, 2017) [34]

1.2.2 Protease chịunhiệt

Protease chịu nhiệt là những protease không bị biến tính ở nhiệt độ cao (> 60°C), có thể được sử dụng trong một số quy trình công nghiệp để thay thể chất hóa học, cũng như các protease chỉ có thể hoạt động trong điều kiện nhiệt độ trung bình Protease chịu nhiệt có

những đặc tính riêng biệt như khả năng ổn định với nhiệt độ, hóachất, pH, hoạt động được

khi có sự hiện diện của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa, có khả năng chống lại sự tấn

công của các enzyme thủy phân Ngoài ra, việc áp dụng protease chịu nhiệt sẽ làm giảm

nguy cơ tạp nhiễm vi sinh vật trong một số quy trình sản xuất thực phẩm, giảm độ nhớt của chất lỏng trong quá trình sản xuất, giảm chi phí cho quá trình bơm, lọc vàly tâm, cải thiện được quá trình truyền nhiệt, truyền khối, và thúc đẩy khảnăng hòatan cơchất [35].

Protease chịu nhiệt thể hiện hoạt tính phân giải keratin và elastin có tiềm năng ứng dụng trong ngành công nghiệp thuộc da, đặc biệt được ứng dụng tốt ở điều kiện acid (pH 2,5- 5,0) và kiềm (pH 12,0-13,0) Các ứng dụng tiềm năng khác cho protease chịu nhiệt được

tìm thấy trong quá trình làm mềm thịt Mặc dù đã góp phần cải thiện độ ổn định của sản

phẩm, nhưng các protease chịu nhiệt vẫn chưa được sản xuất với số lượng đủ để có thể cạnh tranh về chi phí [35].

Một số nghiên cứu đã cho rang, protease từ chi Streptomyces có khả năng chống chịu lại các yếu tố phi sinh học khác nhau như pH, nhiệt độ và độ mặn cao Protease từ

Streptomyces spp có thể được sử dụng để xử lý các chất thải nông nghiệp như lông, móng tay, tóc và chất thải thực vật Bên cạnh đó, protease từ Streptomyces còn được ứng dụng rộng rãi trong làm bánh, dệt, chất tẩy rửa, sản xuất bia, pho mát và ngành công nghiệp

thuộc da Hơn 48 chủngxạkhuẩn đấtđã được báo cáo về khảnăng sản xuấtprotease cùng

với tác dụng gây độc với tế bào ung thư Bên cạnh đó, xylanase ngoại bào từStreptomyces

spp có khảnăng hoạt động ổn định từ 50-85°C trong khoảng pH 3,0-13,0 [36].

1.2.2.1 Đặc điểm sinh học

Một đặctính chung của tất cả các enzyme chịu nhiệt là có khả năng hoạt động và ổn định

hoạt tính trong nhiệt độ cao Các protein lớn được gọi là chaperones cho phép gấp cuộn

các enzyme vềtrạng thái tự nhiên của chúng, do đó giúp cácenzyme nàyduy trì chức năng của chúng ởnhiệt độ cao [29].

Cáctương tác kỵ nước là một trong những yếu tố góp phần tạo nên tính ổn định nhiệt của enzyme Lực tương tác kỵ nước giúp ổn định các enzyme chịu nhiệt bắt nguồn từ tương tác

19

Van der Waals giữacác acid amin kỵ nước bên trong trungtâm hoạt động của của enzyme.

Việc tăng cường gấp cuộn của enzyme nhờ vào các acid amin kỵ nước có thể dẫn đến tưong tác Van der Waals tốt hon, từ đó tăng cường khả năng chịu nhiệt của enzyme Các nghiên cứu cũng chứng minh rằng số lượng alanine, proline, hoặc isoleucine tăng lên sẽ

thúc đẩy enzyme gấp cuộn chặt chẽ hon trong vùng kỵ nước Đồng thời, khả năng gấp

cuộn của các enzyme chịu nhiệt được tăng cường bằng cách rút ngắn các loop protein, từ đó tối ưu hóaviệc gấpcuộn củaenzyme [37, 38].

Neu cầu nối -SH là một trong những yếu tố góp phần ổn định enzyme bằng cách tăng cường sự ổn định về cấu trúc, thì các liên kết hydro ổn định enzyme bằng cách hình thành các tưong tác nội phân tử Tác dụng của các cầu nối -SH trong việc ổn định enzyme được xác nhận bởi nhiều nghiên cứu về đột biến để ra các liên két -SH trong enzyme [37, 38], Đồng thời, các tưong tác tĩnh điện đã góp phần giúp ổn định enzyme Das và Gerstein (2000) đã chứng minh rằng các cặp ion tổ chức thành mạng lớn trên bề mặt enzyme chịu

nhiệt nhiều hon khi so sánh với các enzyme chỉ có khả năng hoạt động trong điều kiện nhiệt độ trung bình Do đó, tưong tác ion có tầm quan trọng đối với việc tăng cường tính ổn định của enzyme [37, 38].

Sự ổn định của cấu trúc xoắn a cũng là trong một các yếu tố giúp ổn định enzyme ở nhiệt

độ cao Sự ổn định của enzyme liên quan đến cấu trúc xoắn a được chứng minh thông qua

việc thay thế các gốc acid amin có xu hướng tạo xoắn (X thấp bằng các acid amin có xu hướngtạo xoắn a cao [37, 38].

Các enzyme chịu nhiệt có sự khác biệt lớn vói enzyme ưa nhiệt độ trung bình về thành

phần acid amin trong cấu trúc củachúng Trong các enzyme không có khảnăng hoạt động ỏ nhiệt độ cao, tỷ lệ acid amin kém bền nhiệt như cysteine và serine giảm đáng kể Trong khi đó tỷ lệ các acid amin có khả năng tích điện hay acid amin có chứa vòng thom như arginine và tyrosine chiếm số lượngnhiều trong các enzyme chịu nhiệt Cácacid amin như asparagine, glutamine, methionine và cysteine là những chất không bền với nhiệt nên dễ dàng bị bất hoạt ở nhiệt độ cao do tác động của quá trình khử amin (asparagine và

glutamine) và quá trình oxy hóa (methionine và cysteine) Các enzyme chịu nhiệt sở hữu

các acid amin thay thế như lysine thành arginine; serine và glycine thành alanine; serine thành threonine được coi là lý do quan trọng nhất quyết định khả năng ổn định nhiệt của

enzyme Ngoài ra, một lý do khác cho sự ổn định của enzyme chịu nhiệt là sự hiện diện của các ion kim loại để tăng cường sựổn định của phân tử [29, 38].

í.2.2.2 ứngdụng của proteasechịu nhiệt

Lợi ích của việc sử dụngcác enzyme chịu nhiệtbao gồm giảm tổn thất trong quá trình tinh sạch, chuẩn bị, bảo quản và vận chuyển Các yếu tốnày có thể ảnh hưởng đến tính kinh tế

của các quá trình sản xuất và các ứng dụng trong công nghiệp.

Hoạt động tối ưu củacácprotease phổbiến làtừ 25-40°C, nhiệt độ này không phù hợp vói một số quy trình công nghiệp Để giải quyết vấn đề này, các nhà nghiên cứu vẫn đangtìm

kiếm một loại enzyme có khảnăng hoạt động ở nhiệt độ cao trong một thời gian dài, ví dụ

như protease chịu nhiệt Lợi ích chính của các protease chịu nhiệt là chúng có thể duy trì hoạt động trong 1 giờ ở 60°C và khoảng 10 phút ở 75°c Chúng chủ yếu được sử dụng

trong công nghiệp để thủy phân protein, điều chế các hợp chất hữu cơ và trong lĩnh vực thực phẩm, chất tẩy rửa, thu hồi bạc, dượcphẩm, da và dệt may [29].

Tiềm năng ứng dụng của protease trong bột giặt chiếm khoảng 25% tổng doanh số bán

enzyme trên toàn thế giới Việc sử dụng enzyme trongcác công thứcchất tẩy rửa giúp tăng cường khả năng loại bỏ các vết bẩn cứng đầu, do đó làm cho chất tẩy rửa trở nên thân thiện với môi trường Bổ sung protease vào bột giặt tạo điều kiện giải phóng chất bẩn có bản chất là protein khỏi vật liệu Các protease chịunhiệt có thể kếthợp trongcông thức tẩy

rửa khi chúng đáp ứng được các đặc tính cần thiết như sự ổn định hoạt tính trong phạm vi pH rộng và nhiệt độ cao, đồngthời thể hiện khả năng tương thích với các thành phần tẩy rửa, và khảnăng chống oxy hóa [38].

Hiện tại, chỉ có một số protease chịu nhiệt có ý nghĩa thương mại có thể tiếp cận được là

alcalase, một loại serine protease được phân lập từ Bacillus licheniformis, hoạt động ở 60°C, pH 8,5 Alcalase thường được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, chế biến bột đậu nành, sản xuất thức uống tăng cường protein Một ứng dụng khác của protease chịu nhiệt trong công nghiệp thực phẩm là làm mềm thịt do có khả năng hoạt động trong điều

kiện nhiệt độcao(trên 60°C) [29].

Bên cạnh đó, protease có thể được áp dụng để nâng cao chất lượng củacác sản phẩm thủy

phân protein Ví dụ, thermolysin là một protease ổn định nhiệt được phân lập từ Bacillus thermoproteolyticus và tham gia vào quá trình tổng hợp aspartame sử dụng làm chất làm

ngọt trong thực phẩm và đồ uống dành chongười ăn kiêng Ngoài ra, mộtsố proteasechịu

21

nhiệt hiện đang được ứng dụng trong sinh học phân tử vàcác quá trình hóa sinh [29] Một số ứng dụng của protease chịu nhiệt được trình trong Bảng 2.1.

Bảng 2.1 Một số ứng dụng của protease chịu nhiệt [29, 36]

Chủng vi sinh vậtứng dụng

Streptomyces fungicidicus Công nghiệp chất tẩy rửa

Streptomyces pactum Công nghiệp thuộc da

Streptomyces thermovỉoỉaceus Công nghiệp thực phẩm

Actinomadura keratinilytica Công nghiệp thuộc da

bàotrước khi PCR

Aureobacidium pulỉuỉans HN2-3 Sảnxuấtpeptide có hoạt tính sinh học

1.2.2.3 Cácyếu tốảnh hưởng đến khả năng sản xuấtprotease chịu nhiệt

Điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sinh trưởng, phát triển của xạ khuẩn cũng như khả năng sản xuất enzyme ngoại bào của chúng Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease chịu nhiệt từ xạ khuẩn bao gồm thành phần

dinh dưỡnghiện diện trong môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy Nhiều công trình khoa học đã công bố rằng việc thay đổi các điều kiện nuôi cấy như nguồn

carbon vànồng độ carbon, nguồn nitrogen và nồng độ nitrogen, cơchất cảm ứng và nồng

độ cơ chất cảm ứng, nhiệt độ và pH môi trường ban đầu có ảnh hưởng đáng kể đến khả

năng sinh tổng hợp proteasengoại bào chịu nhiệttừStreptomyces.

Trong nghiên cứu “Tối ưu hóa quá trình lên men và khảo sát đặc tính của protease kiềm

chịu nhiệt được sản xuất bởi Streptomyces sp Al-Dhabi-82 từ môi trường Saudi Arrabian cho các ứng dụng côngnghiệp và thân thiện môi trường” của Al-Dhabi và cộng sự (2019), hoạt tính protease đạt cao nhất (212±14,8 Ư/ml) khi chủng xạ khuẩn này nuôi cấy trên môi

trường có bổ sung nguồn carbon là maltose Ngược lại, giátrị hoạt tính protease được ghi

nhận thấp hơn 200 Ư/ml khi môi trường nuôi cấykhông bổ sung hay có bổ sung các nguồn

carbon khác như glucose, lactose, fructose, tinh bột [39] Mặt khác, trong nghiên cứu của

Phạm Thị Tuyết Ngân và cộng sự (2021) về “Tối ưu các điều kiện sinh enzyme protease

ngoại bào của Streptomyces DH3.4” cho thấy nguồn nitrogen có ảnh hưởng đáng kể đến

hoạt tính của protease Khi nuôi cấyStreptomyces DH3.4 trên môi trường có bổ sung các nguồn nitrogen khác nhau như là casein, malt extract, peptone, KNƠ3, NH4NO3,

(NH4)2SƠ4 thì nhận thấy chủng xạ khuẩn này thể hiện hoạt tính protease khác nhau, và

hoạt tính đạt cao nhất khi môi trường nuôi cấy có bổ sung malt extract và (NH4)2SƠ4 vói giátrị ghi nhận lần lượt là 64,2±2,6 Ư/mg và 66,2±9,0 ư/mg [1].

Mỗi chủng xạ khuẩn khácnhau có thời gian sinh trưởng, pháttriển cũng nhưthời gian sinh

tổng hợp protease ngoại bào khác nhau Trong nghiên cứu Abdelvvahed và cộng sự (2014), hoạt tính protease ưa kiềm từ Streptomycesambofaciens thu nhận tại mỗi thời điểm khảo

sát có sự khác biệt về hoạt tính, và hoạt tính protease đạt cao nhất tại thời điểm sau 96 giờ nuôi cấy [40].

Mặt khác, pH và nhiệt độ là hai thông số có ảnh hưởng lớn đến khảnăng sinh trưởng, phát

triển cũng như khảnăng sinh tổng hợp protease ngoại bào của xạ khuẩn Trong nghiên cứu “Phân lập và sàng lọc chủng xạ khuẩn Streptomyces sp Al-Dhabi-49 từ môi trường của Saudi Arabia có khả năng sản sinh lipase và protease trong điều kiện lên men mẻ”,

Streptomyces sp Al-Dhabi-49 có khả năng sinh tổng hợp protease trong khoảng nhiệt độ từ 20-50°C, và giá trị hoạt tính được ghi nhận cao nhất ở 40°C Đồng thời, với pH môi

trường nuôi cấy ban đầu từ pH 6,0-11,0, thì chủng xạ khuẩn này sinh tổng hợp protease thể

hiện hoạt tínhcao nhất ở pH 9,0 [25].

1.2.3Tình hình nghiêncứuvề proteasengoạibào chịu nhiệt từ Streptomyces

1.2.3.1 Tình hình nghiêncứu trong nước

Cho đến nay, Việt Nam đã córấtnhiều công trình nghiên cứu về hệ enzyme ngoại bào của

vi sinh vật nói chung và protease ngoại bào nói riêng, đặc biệt là trên đối tượng vi khuẩn

và nấm mốc Tuy nhiên, xạ khuẩn là một trong những nhóm vi sinh vật đa dạng nhất và được công nhận về tính linh hoạt trong trao đổi chất của chúng, nhưng có rất ítnghiên về

hệ enzyme của xạ khuẩn, đặc biệt là nghiên cứu về protease chịu nhiệt.

Trong nghiên cứu của Tô Đình Phúc và cộng sự (2021), 5/26 chủng xạ khuẩn được phân

lập từ các ao nuôi tôm thẻ chân trắng ở huyện Thạnh Phú, tỉnh Ben Tre có khả năng sinh

tổng hợp tốt 3 loại enzyme protease, amylase và cellulase Kết quảgiải trình tự vùng gene 16S rRNA cho thấycả 5 chủng xạkhuẩn này đều thuộc chi Streptomyces [41].

Trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Diệu Hạnh và cộng sự (2021) về “Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn có khả năng sinh các hợp chất có hoạt tính cao”, 40 chủng xạ khuẩn được phân lập và làm thuần từ 20 mẫu đất được thu nhận ỏ tỉnh Ben Tre và Long An Hon 50% chủng xạ khuẩn thử nghiệm có khả năng sản sinh ít nhất 1 trong 4 loại enzyme ngoại bào

23

như amylase, cellulase, chitinase và protease Đặc biệt có 21/40 chủng xạ khuẩn thể hiện khảnăng sinh tổng hợp protease [42].

í.2.3.2 Tình hình nghiêncứu trêntrênthế giói

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về protease chịunhiệt có nguồn gốc từ các chi xạ khuẩn khác nhau đã được công bố và ứngdụng.

Trong nghiên cứu của Okpukpara và cộng sự (2016) về “Sự sản xuất protease ưa kiềm

chịu nhiệt từ Streptomyces sp A54” cho thấy chủng xạ khuẩn này sinh tổng hợp protease cho hoạt tính tốt nhất trong điều kiện nuôi cấy lắc với tỷ lệ giống cấy là 0,4% sau 72 giờ Tất cả các nguồn carbon và nitrogen thử nghiệm đều thúc đẩy khả năng sản sinh protease

chịu nhiệt, tuy nhiên hoạt tính enzyme đạt cao nhất trên môi trường có bổ sung 1,0%

glucose và 1,0% bột đậu nành [43].

Trongnghiên cứu của Parthasarathy và cộng sự (2018) về “Thiết lập công thức môi trường nuôi cấy và tốiưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy để thúc đẩy sự sản suất protease từ

Streptomyces sp LCJ12A được phân lập từ rừng ngập mặn” cho thấy các nguồn carbon,

nitrogen và co chất cảm ứng khác nhau có tác động khácnhau đến khảnăng sinh tổng hợp protease của chủng xạ khuẩn này Trong đó, fructose 0,2%, NaNCh 0,2% và vỏ red gram

husk 0,2% đãthúc đẩy chủng xạ khuẩn này sản sinh protease với với hoạt tính ghi nhận từ 120,08±2,2 Ư/mL đến 194,16±2,2U/mL [44].

Trong nghiên cứu của Duraikannu và cộng sự (2018), tinh bột, chiết xuất peptic (peptic

extract) và nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản sinh protease từ chủng

Streptomycesradiopugnans VITSD8 Nhiệt độ thích hợp nhất để VITSD8 sinh tổng hợp

protease có hoạt tính cao là 33°c Đồng thời, tỷ lệ carbon và nitrogen có ảnh hưởng đáng kể đến khảnăng sản sinh enzyme củachủng xạ khuẩn này [45].

Trong nghiên cứu của Dhabi và cộng sự (2020), chủng Streptomyces sp Al-Dhabi-49 thể hiện khảnăng sinh tổng hợp proteasecó hoạt tínhcao sau 5 ngày nuôi cấy, pH môi trường 9,0 trong điều kiện nuôi lắc 150 vòng/phút ở 40°C Đồng thời, trong số các nguồn carbon và nitrogen được khảo sát thì maltose vàpeptone với nồng độ 1,0% có ảnh hưởng đáng kể

đến khảnăng sinh tổng hợp proteasecó hoạt tính cao [25].