Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano nhằm tăng sinh khả dụng của curcumin dùng theo đường uống

CURCUMIN

Nguồngốc

Curcumin (CUR) cónguồn gốc tự nhiên hoặc tổnghợp.Trongtự nhiên,curcumin là thành phần chính của curcuminoid Curcuminoid là hỗn hợp gồm

Côngthức

- Tên khoa học: 1,7-bis (4–hydroxy– 3-methoxyphenyl) -1,6– heptadien-3,5- dion.

Tính chấtlýhóa

- Độ tan: curcumin ít tan trong nước (độ tan 11 ng/ml trong môi trường pH 5,5[75]), tan một phần trong methanol, tan tốt trong aceton, dimethylsulfoxyd, ethanolvàcloroform[89].

- Dạng thù hình: curcumin kết tinh ở ba dạng thù hình, dạng 1 tồn tại dạng cấutrúctinhthểđơntà,dạng2và3tồntạiởdạngcấutrúctinhthểtrụcthoi.Sựkhác nhau giữa dạng đơn tà (dạng 1) và dạng trục thoi (dạng 2 và 3) ở hình dạng phân tửcurcuminvà tươngtác do liênkết hydro với các phân tử curcumin bêncạnh.Curcumin dạng phân tử đơn tà có hình dạng phẳng, còn dạng trục thoi phân tử cóhình dạng cong và hơi xoắn Dạng trục thoi 2 và 3 khác nhau ở hướng ceto-enol củaphân tử curcumin Ở dạng 2, nhóm ceto-enol ở hai phân tử theo hướngcis,trong khiở dạng 3, nhóm ceto- enol ở dạngtrans Về hình thái tiểu phân, tiểu phân curcumindạng đơn tà có hình kim, còn dạng trục thoi có hình thái tiểu phân giống hạt gạohoặchìnhcầu.Ngoàira, curcumincòncóthểởdạngvôđịnhhình[97].

- Dung dịch curcumin trong methanol hấp thụ ánh sáng cực đại tại bước sóng430 nm và dung dịch curcumin trong aceton hấp thụ ánh sáng cực đại tại bước sóngkhoảng415-420nm.

- Xét trênphươngdiệnhóahọc,curcuminlàmộthợpchấtít tanchứahaivòng phenolic,mỗivòngcómộtnhómthếmethoxy etherởvịtríortho.Haiv ò n g phenolic kết hợp với nhau qua một liên kết hepten chưa bão hòa ở vị trí ortho cũngchứa nhóm α, β diceton ở carbon số 3 và 5 Nhóm diceton có thể bị chuyển dạngthuận nghịch giữa dạng enolic và cetonic (hình 1.2) Sự chuyển dạng phụ thuộc vàopH Dạng bis-ceto tồn tại chủy ế u t r o n g m ô i t r ư ờ n g a c i d v à t r u n g t í n h , c ò n d ạ n g enol chiếm ưu thế trong môi trường kiềm [89] Ở dạng bis-ceto, carbon vị trí số

4củal i ê n k ế t h e p t e n c ó c h ứ c n ă n g n h ư m ộ t c h ấ t c h o p r o t o n m ạ n h , c ò n d ạ n g e n o l đóng vai trò như một chất cho electron Điều này làm cho curcumin có đặc tínhchốngoxyhóa [89].

Độổnđịnh

Tại pH kiềm, curcumin kém ổn định Sản phẩm chính của quá trình phân hủynàylàtrans-6-(4’-hydroxy-3’-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5- hexanal,feruloylmethan, acid ferulic và vanillin Trong môi trường acid, sự phân hủy của curcuminchậmhơn,khoảngdưới20%curcuminphânhủytrong1giờ[89].

Khi tiếp xúc với ánh sáng, curcumin bị phân hủy và thoái hóa thành anillin,acidvanillic,aldehydferulicvàacidferulic[89].

Địnhtínhvàđịnhlượng

Theochuyênluận“Curcuminoids”củaDượcđiểnMỹUSP39,đểđịnhtín h,có thể dựa vào vị trí và màu sắc của các vết curcumin, desmethoxycurcumin vàbisdesmethoxycurcumin so với chuẩn trong phương pháp sắc ký lớp mỏng hoặc căncứ vào vị trí của các pic sắc ký trong phương pháp HPLC Hàm lượng các thànhphần curcumin, desmethoxycurcumin và bisdesmethoxycurcumin trong nguyên liệucurcuminoid và trong chế phẩm bào chế chứa curcuminoid có thể định lượng bằngphươngphápHPLC [96].

Riêng đối với curcumin, hàm lượng curcumin trong các chế phẩm bào chế vàtrongmôitrườngthửđộhòatancóthểđịnh lượngbằngphươngphápquangp hổhấpthụUV-Vis[47]hoặcHPLC[77].

Tácdụngdượclý

Một số nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng cho thấy: curcumin có tác dụngchống oxy hóa, chống viêm và chống ung bướu… Ngoài ra, curcumin còn có tácdụng tiềm năng với hầu hết các bệnh mạn tính bao gồm cả ung thư, thần kinh,timmạch,bệnhphổi [11],[83].

Sinhkhảdụng

Vấn đề khó khăn đối với việc sử dụng curcumin trên lâm sàng làs i n h k h ả dụng(SKD)thấp.NghiêncứudượcđộnghọccủacurcuminđượcbáocáobởiYang

K và cộng sự cho thấy: nồng độ tối đa curcumin trong huyết tương chuột cống saukhi uống liều 500 mg/kg là 0,06 ± 0,01g/ml, chứng tỏ SKD đường uống chỉkhoảng 1% [109] Tương tự, theo nghiên cứu của Shoba G và cộng sự, nồng độcurcumincaonhấttrong huyết tương là 1,35±0,23g/mlsau1giờdùngđườ ng

Tetrahydrocurcumin Tetrahydrocurcumin glucuronoid Dihydrocurcumin glucuronoid uống với liều 2 g/kg trên chuột cống, trong khi người tình nguyện khỏe mạnh (khốilượng 50-75 kg) uống liều đơn 2 g curcumin (4 viên nang 500 mg), nồng độ tronghuyết tươngrất thấp,c h ỉ k h o ả n g 0 , 0 0 6 ± 0 , 0 0 5 g/ml trong 1 giờ

[90] Trongnghiên cứu đánh giá SKD trên chuột cống của Allam A N và cộng sự, với liều 340mg/kg trên chuột cống, lượng curcumin không hấp thu trong nhung mao ruột vàlượng tìm thấy trong tế bào nhày khá lớn, trong khi lượng curcumin trong huyếttươngkhôngthểtìmthấy.Điềunàycònchứngtỏcurcumincótínhthấmkém quahệthốngdạdày-ruột[8].

Sauhấpthu, curcuminbịchuyểnhóaquagan(chuyểnhóalầnđầu).S ự chuyển hóa curcumin thông qua liên hợp glucuronid, sulfat và quá trình khử thôngquaalcoldehydrogenase,tạoranhiềuchấtchuyểnhóanhưdihydrocurcumin,tetrahyd rocurcumin, hexahydrocurcumin, hexahydrocurcuminol, acid ferulic, aciddihydroferulic,c u r c u m i n g l u c u r o n i d v à c u r c u m i n s u l f a t [ 9 ] S a u đ ó , c u r c u m i n b ị thải trừ nhanh ở dạng liên hợp với glucuronid và sulfat Khoảng 60-70% curcumindùngđườnguốngđượcthảitrừquaphân[9],[89].

Nhưvậy,hấpthucurcumintừruộtkémcóthểdođộtanthấp,tốcđộhòatanchậmn êndượcchấthòatankhônghoàntoàn.Ngoàira,curcumincònbịphânhủy trongmôitrường sinhlýcủahệthốngdạdàyruột,tốcđộchuyểnh óa vàthảitrừn hanh.SKDcủacurcuminthấp,dẫnđếnviệcsử dụngtrongđiềutrịhạnchế.

MỘTSỐBIỆNPHÁPCẢITHIỆNSINHKHẢDỤNGCỦACURCUMIND ÙNGĐƯỜNGUỐNG

Biện pháplàmtăngđộtanvàtốcđộhòatancủacurcumin

Để cải thiện độ tan và tốc độ hòa tan của curcumin, các công trình nghiên cứuđã đề cập đến các biện pháp làm thay đổi đặc tính vật lý của DC như giảm KTTPxuống kích cỡ nanomet (bào chế hệ nano tinh thể) và tạo dạng bào chế trung gianchứa curcumin như hệ phân tán rắn, hệ micel, vi nhũ tương, nhũ tương nano, hệ tựnhũhóahoặcdạngliênhợp.

Nano tinh thể dược chất là tinh thể với kích thước dưới 1000 nm, mang cả đặctínhcủatiểuphânnanovàtinhthể[5],[43].

Tiểu phân nano tinh thể có thể cải thiện độ tan, độ hòa tan và tăng SKD củaDCdonhữngđặcđiểmnổitrộinhưsau:

 Tăngđộtan Độ tan của dược chất (DC) phụ thuộc vào đặc tính lý hóa của DC, môi trườnghòa tan và nhiệt độ Tuy nhiên, điều này chỉ đúng với tiểu phân DC có KTTP cỡ vàimicromet Với các tiểu phân DC với kích thước nhỏ hơn 1-2m, độ tan phụ thuộcvào KTTP. Độ tan tăng lên khi KTTP giảm xuống dưới 1000 nm Điều này có thểgiảithíchtheophươngtrìnhKelvinvàOstwald-Freundlich [44].

Phương trình Kelvin (1) biểu thị mối quan hệ giữa KTTP và áp suất hòa tancủatiểuphân: p r

Trong đó: ρrlà áp suất hòa tan của tiểu phân bán kính r, ρ∞là áp suất hòa tancủa tiểu phân lớn ban đầu, γ là sức căng bề mặt, R là hằng số khí, T là nhiệt độ tuyệtđối,rlàbánkínhtiểuphân,Mrlàkhốilượngphântử,ρlàtỷtrọngcủatiểuphân. Ở trạng thái hòa tan bão hòa, phân tử hòa tan và phân tử tái kết tinh cân bằng.Khi giảm KTTP, áp suất hòa tan tăng Do đó, cân bằng chuyển dịch về phía hòa tannênđộtanbãohòatăng[44].

Phương trình Ostwald-Freundlich (2) biểu thị mối quan hệ giữa độ tan bão hòavàKTTP: log 𝐶 𝑠

Trong đó: Cslà độ tan bão hòa, Cαlà độ tan của tiểu phân lớn, σ là sức căng bềmặt,

V là thể tích mol, R là hằng số khí, T là nhiệt độ tuyệt đối, ρ là tỷ trọng tiểuphân,rlàbánkínhtiểuphân.

Theo phương trình trên, độ tan bão hòa của DC tăng khi giảm KTTP. Tuynhiên, điều này chỉ áp dụng với các tiểu phân có kích thước nhỏ hơn 1-2m, đặcbiệtlàtiểuphânkíchthướcnhỏhơn 200nm[43],[44].

Việc bào chế hệ nano tinh thể có thể làm cho đặc tính kết tinh của tiểu phânDC thay đổi, chuyển từ trạng thái kết tinh sang trạng thái vô định hình [69], [108].Tinh thể nano ở trạng thái vô định hình có độ tan cao hơn so với tinh thể nano ởtrạng thái tinh thể có kích thước tương đương Vì vậy, tinh thể nano ở trạng thái vôđịnhhìnhđượccoilàsự kếthợplýtưởnggiúptăngđộtancủaDC[43],[44].

Trong đó:dM/dt là tốc độ hòatan củaDC,D là hệ số khuếch tán,S l à d i ệ n tích bề mặt tiểu phân, Cslà độ tan bão hòa của DC, C là nồng độ DC xung quanhtiểuphân, hlàbề dàylớpkhuếchtán. ln

Như vậy, theo phương trình trên, tốc độ hòa tan của các tinh thể nano tăng cóthểdotăngdiệntíchbềmặt,giảmbềdàylớpkhuếchtánvàtăngđộtan[43],[44].

So với tiểu phân micro, DC nano tinh thể có đặc điểm nổi trội vì chúng có thểtăng khả năng kết dính vào bề mặt hoặc màng tế bào Sự tăng kết dính của nano dotăng diện tích tiếp xúc của các tiểu phân kích thước nhỏ Cơ chế kết dính của nanotinh thể có thể giải thích theo thuyết tĩnh điện (lực hút tĩnh điện giữa tiểu phân và bềmặt màng nhày) và thuyết hấp thụ (liên kết hydro và van der Waals giữa bề mặt tiểuphânvàmàngnhày)[27],[44].

Nano tinh thể có thể cải thiện hấp thu của DC theo hai cơ chế Thứ nhất, dướidạng nano tinh thể, DC có thể tăng độ tan và tốc độ hòa tan, do đó tăng chênh lệchnồng độ giữa nhung mao ruột và máu Vì vậy, DC được hấp thu bằng cách khuếchtán thụ động tăng [27], [44] Thứ hai, tiểu phân nano tinh thể có thể bám dính vàomàng nhày của hệ thống dạ dày ruột Do sự kết dính này, DC có chênh lệch nồng độcao hơn và kéo dài thời gian lưu, thời gian tiếp xúc trong hệ thống dạ dày ruột [27],[44].

Phươngphápbàochế hệnanotinhthể ĐểbàochếtiểuphânnanoDC,cóthểđitừtiểuphânlớnnghiềnmịnthànht iểu phân nano (phương pháp “top-down”) hoặc đi từ phân tử nhỏ kết tủa thành tiểuphân nano lớn hơn (phương pháp

“bottom-up”) Một số phương pháp bào chế nanotinhthểđượctrìnhbàyởbảng1.1. Onoue S và cộng sự bào chế hệ nano tinh thể curcumin bằng phương phápgiảm kích thước tiểu phân sử dụng kỹ thuật nghiền ướt với bi polystyren, sử dụng tádược hydroxypropyl cellulose và natri lauryl sulfat Hệ tiểu phân nano tinh thể thuđược có KTTP khoảng 250 nm, hệ số đa phân tán 0,3-0,4 Kết quả đánh giá đặc tínhkết tinh và giản đồ nhiệt vi sai cho thấy: hệ nano tinh thể vẫn tồn tại ở trạng thái kếttinh.Độhòatancủahệnanotinhthểcurcuminđượccảithiệnđángkểsovớitinht hể curcumin ban đầu Sinh khả dụng đường uống của hệ nano tinh thể trên chuộtcaohơn,vớigiátrịCmaxvàAUCcaogấp3-5lầnsovớicurcuminbanđầu.Đặcbiệt,

STT Phươngpháp Nguyêntắc Ưunhược điểm

Sử dụng lực phân chia là lực va chạm,nén ép, mài mòn và lực ma sát do tươngtácgiữatiểuphânvớithànhbuồngngh iền,g i ữ a c á c b i v ớ i n h a u v à g i ữ a tiểuphân-tiểuphân [64],[65],[71]. Đơn giản, áp dụng được cho cả DC có độ tan thấp hoặckhông tan Tuy nhiên, chi phí thiết bị đắt tiền, dễ nhiễmVSV, tạp từ thiết bị mài mòn và hạn chế về kích thướcbuồngnghiền[15].

Sự giảm KTTP trong quá trình nghiềnkhô do ma sát, sự cọ mòn, va chạm vàđứtgãyc ủ a tươngtáctiểuphân- tiểu phânhoặctiểuphânvớithiếtbị[64].

Thời gian nghiền kéo dài (có thể tới hàng ngày), nănglượng đầu vào cao gây nóng thiết bị và ảnh hưởng đến độổnđịnhcủaDCnhạycảmvớinhiệt,cácviênbicóthểbị màimòndovachạmvớithànhbuồngnghiềntạoratạp.

T P trongđ ó t i ể u p h â n r ắ n đ ư ợ c p h â n t á n vàomôitrườnglỏng[64]. Đượcsửdụngnhiềuhơnnghiềnkhôđểtránhtácđộngcủa nhiệtvàrútngắnthờigiannghiền,đồngthờitrựctiếptạora dạngbàochế.

TiểuphânDCđượcphânchiab ằ n g cách nén qua một khe hẹp dưới áp lựccao trong các thiết bị đồng nhất hóa.Lực phân chia tiểu phân chủ yếu là lựcnénépvàvađập[5].

Phương pháp này tạo ra ít tiểu phân kích thước micro, ítnhiễm tạp, khắc phục nhược điểm của hai phương phápnghiền và kết tủa, năng suất cao, áp dụng được với DCnhạy cảm với nhiệt, có thể thu được hỗn dịch nano ít có sựkhác nhau giữa những lô mẻ, dễ dàng tái sản xuất. Tuynhiên,đ ò i h ỏ i s ố v ò n g đ ồ n g n h ấ t h ó a c a o v à D C n ê n ở dạngsiêu mịn[15].

3 Đồng nhấthóa nhờ lựcphâncắtl ớn

Hai lực tác động chủ yếu của quá trìnhlà lực ly tâm gây va chạm cơ học vàophầnstatovà l ự c phâncắ t đượct ạ o ra trongvùnghỗnloạngiữarotovàstato.

Quytrìnhbàochếđơngiảnvàdễ ápdụngvớicácDCíttan trong nước và dầu Tuy nhiên, phương pháp này tốnthờigianvàkhónângcấplênquymôlớn,hệtiểuphânthu đượccònchứanhiềutiểuphânthô.

DC được hòa tan trong một dung môi,sau đó phối hợp với một dung môi kháckhông hòa tan DC hoặc phối hợp vớimột dung dịch DC bị kết tủa do phảnứnghóahọc[5]. Đơn giản, thiết bị không phức tạp, thu được kết tủa mịn,kết tủa tạo thành có thể ở dạng vô định hình, chi phí thấp,hiệu quả, không nhiễm tạp, tránh sử dụng năng lượng cao,không biến tính DC Tuy nhiên, khó lựa chọn dung môi,khó kiểmsoátKTTP,khó triểnkhaisảnxuấtlớn vàDCdễ bịkếttụtrởlại.

Hòa tan DC trong carbon dioxyd ở ápsuất cao trong bình khí nén, sau đó xảcarbon dioxyd để áp suất giảm đột ngộthoặc hòa tan DC trong dung môi, bơmcarbon dioxyd siêu tới hạn, dung môichuyểnsangcarbondioxydlàmkết tủa

Sử dụng dung môi carbon dioxyd siêu tới hạn là dung môikhông cháy, không độc, giá thành rẻ, nhiệt độ tới hạn trungbình Tuy nhiên, phương pháp này phần lớn tạo tiểu phânmicro[5].

11 hệ nano tinh thể ổn định về mặt quang hóa ở trạng thái rắn Như vậy, phương phápbàochếnanotinhthể được coilàphương pháphiệuquảtăngSKDcủacurc uminvớiđộổnđịnhquanghóacao [67].

Gao Y và cộng sự bào chế hỗn dịch nano curcumin 1% với chất diện hoạt D- alpha-tocopheryl poly (ethylen glycol) succinat 1000 (TPGS) 1%b ằ n g p h ư ơ n g pháp đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn với tốc độ 26000 vòng/phút trong 3 phút.Hỗn dịch nano tiếp tục được đồng nhất hóa áp suất cao và đông khô với chất mangmanitol 5% Hỗn dịch nano thu được có KTTP khoảng 210,2 nm với SKD được cảithiệnđángkể sovớihỗndịchcurcumin[30].

Biện pháp làm giảm chuyển hóa và thải trừ của curcumin qua đường tiêuhóa

Bên cạnh các biệnpháp cải thiệnSKD của curcumin bằng cáchl à m t ă n g đ ộ tan và tốc độ hòa tan, có thể sử dụng các biện pháp làm giảm chuyển hóa và thải trừcủa curcumin qua đường tiêu hóa Các biện pháp có thể áp dụng là bào chế dướidạng hệ nano chứa chất mang hoặc phối hợp với các chất ức chế quá trình chuyểnhóacủacurcumin.

Hệ nano chứa chất mang có nhiều ưu điểm nổi trội như bảo vệ DC, giải phóngDC kéo dài trong đường tiêu hóa, làm chậm sự chuyển hóa và thải trừ của

DC Mộtsố hệ nano chứa chất mang còn có khả năng kết dính sinh học, kéo dài thời gian tiếpxúc với bề mặt hấp thu đường tiêu hóa Do đó, hệ nano chứa chất mang có khả năngcảithiệnSKDcủacurcumin.

Polyme là nhóm nguyên liệu được sử dụng phổ biến nhất để cấu thành hệ chấtmang dựa trên tiểu phân nano Tiểu phân nano polyme có thể được tạo thành từpolyme tổng hợp như poly (acid lactic) và poly (acid lactic co-glycolic) hoặc từnguyên liệu tự nhiên như chitosan, collagen…[5] DC có thể giải phóng theo cáchkiểm soát qua bề mặt hoặc ăn mòn cốt, khuếch tán qua hệ polyme, trương nở hoặcthay đổi đáp ứng với môi trường cục bộ Tiểu phân nano polyme curcumin kéo dàithời gian lưu thông bằng cách kết dính niêm mạc đường tiêu hóa hoặc giải phóngkéo dài Hệ nano kết dính sinh học có thể tăng hấp thu qua đường uống bằng cáchkhư trú hệ đưa thuốc tại vùng hấp thu tối ưu của đường tiêu hóa, kéo dài thời giantiếp xúc với bề mặt hấp thu và sự lưu thông trong đường tiêu hóa, tăng nồng độDCtại vị trí hấp thu hoặc bảo vệ DC khỏi sự pha loãng và phân hủy bởi các chất bài tiếtcủađườngtiêuhóa [72].

Shaikh J và cộng sự đã bào chế siêu vi cầu poly (acid lactic co-glycolic) (PLGA) chứa curcumin bằng phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương sử dụngalcol polyvinic (PVA) Tiểu phân nano thu được có kích thước trung bình khoảng264 nm, hiệu suất tạo vi cầu khoảng 77% và hiệu suất nạp DC khoảng 15%. Kết quảthửgiảiphónginvitrochothấy:tiểuphânnanogiảiphóngDCtheomô hình haipha với 24% DC được giải phóng trong 24 giờ đầu và sau đó giải phóng chậm 20%DC trong 20 ngày tiếp theo. Kết quả đánh giá SKDin vivotrên chuột cho thấy: đốivới hỗn dịch curcumin và hỗn dịch curcumin phối hợp với piperin, không phát hiệnđược nồng độ curcumin trong

6 giờ Nồng độ curcumin trong huyết tương giảmnhanh,c h ứ n g t ỏ s ự c h u y ể n h ó a n h a n h c ủ a c u r c u m i n T r o n g k h i đ ó , đ ố i v ớ i t i ể u phân nano, nồng độ curcumin trong huyết tương tăng chậm và kéo dài trong thờigian dài SKD tương đối của tiểu phân nano curcumin tương ứng gấp 26 và 9,2 lầnsovớihỗndịchđơngiảnvàdạnghỗndịchchứa curcuminvàpiperin[87].

Hệ tiểu phân nano lipid là hệ đưa thuốc đường uống với nhiều đặc điểm nổitrội, kết hợp ưu điểm của cả ba dạng bào chế liposome, nhũ tương và tiểu phân nano[79] Dưới dạng tiểu phân nano, những tiểu phân lipid này có thể kết dính chất nhàydo KTTP nhỏ và tăng thời gian lưu trong đường tiêu hóa Hơn nữa, tiểu phân nanolipid cũng có thể bảo vệ DC khỏi phân hủy hóa học và enzym, đồng thời giải phóngtừ từ phân tử DC từ hệ lipid vào máu, dẫn đến tăng hiệu quả điều trị so với DC banđầu[74].

Tiểu phân nano lipid rắn có thể khắc phục được một số vấn đề khó khăn củaDC dùng đường uống như độ tan và tính thấm kém, không ổn định trong đường tiêuhóa và chịu chuyển hóa qua gan lần đầu Hệ nano lipid rắn dùng đường uống có thểcải thiện SKD của DC từ 2 đến 25 lần [37] SKD của dạng nano lipid rắn chứacurcumin được cải thiện có thể do hấp thu trực tiếp của tiểu phân nano qua hệ thốngdạ dày ruột, do kết dính của nano lipid với bề mặt chất nhày của ruột, tăng tính thấmdosựcómặtcủachấtdiệnhoạt,giảmphânhủyvàthảitrừ.

Trong nghiên cứu của Ji H và cộng sự, tiểu phân nano lipid rắn được bào chếvớicáctá d ư ợ c TPGSvà Brij78 nhằmtăngđ ộ tanvàSKDcủacurcumin C ô ng thức tối ưu được lựa chọn với KTTP khoảng 135 ± 1,5 nm, giá trị thế zeta -24,7 ±2,1 mV và hiệu suất nạp DC 91,09 ± 1,23% Nghiên cứu dược động họcin vivochothấy: giá trị AUC0tđối với nano lipid rắn chứa curcumin gấp 12,27 lần so với hỗndịch curcumin và SKD tương đối khoảng 942,53% Trong khi đó, Tmaxvà t1/2củacurcumin trong nano lipid rắn đều kéo dài hơn khi so sánh với hỗn dịch curcumin.Nghiên cứu hấp thuin situruột cho thấy: giá trị tính thấm hiệu quả của curcumintrongnanolipidrắncảithiệnđángkểsovớidungdịch curcumin[42].

Phospholipid là chất mang quan trọng đối với một số phân tử DC yêu cầukiểm soát giải phóngin vivodo bị thải trừ nhanh trong cơ thể Bên cạnh đó,phospholipid an toàn và tương đồng với màng sinh học [3], [48] Một số nghiên cứuđãchứngminhrằngviệctạophứccủacurcuminvớiphospholipidsẽtăngSKD.

Gupta N K và cộng sự đã nghiên cứu biện pháp tăng SKD của curcumin bằngcáchtạophứcvớiphosphatidylcholin.Kếtquảđánhgiáexvivobằngkỹthuậtbộc lộ túi bao ruột cho thấy: phức hợp curcumin-phosphatidyl cholin tăng hấp thu đángkể so với curcumin khi sử dụng cùng mức liều Phức hợp cải thiện được dược độnghọc và tăng hoạt tính bảo vệ gan trên tế bào gan chuột cô lập khi so sánh vớicurcumin và hỗn hợp vật lý Dạng phức hợp curcumin-phosphatidyl cholin có nồngđộ trong huyết tương cao, thải trừ chậm và thời gian bán thải kéo dài hơn trên chuộtkhisosánhvớicurcuminhoặchỗnhợpvậtlý.Cụthể,Cmaxcủacurcuminvà hỗnhợp vật lý curcumin-phosphatidyl cholin là 258,64 và 297,32 ng/ml với Tmaxtươngứng 1,72 và 2,03 giờ. Trong khi đó, Cmaxcủa phức hợp curcumin-phosphatidylcholin là 803,86 ng/ml với

Tmax2,21 giờ Sự tăng SKD của phức hợp curcumin-phosphatidyl cholin có thể do tính thân nước của dạng phức dẫn đến tăng độ tan củacurcumin [35] Đồng thời, do là một hệ đưa thuốc bản chất lipid, sự hấp thu của DCthông qua sự kích thích vận chuyển bạch huyết và tương tác với tế bào ruột hoặc tạotiểuphânkeovớicácthànhphầnmuốimậtởdạngmicelhòatan[8]. ZhangJ v à c ộ n g s ự đ ã b à o c h ế v i c ầ u c h i t o s a n c h ứ a p h y t o s o m e c u r c u m i n bằng cách kết hợp hệ polyme và hệ lipid nhằm cải thiện SKD và kéo dài thời gianlưuc ủ a c u r c u m i n t r o n g c ơ t h ể V i c ầ u đ ư ợ c t ạ o r a b ằ n g c á c h đ ư a p h y t o s o m e curcumin vào vi cầu chitosan bằng kỹ thuật gel ion hóa Vi cầu tạo ra có hình cầu,KTTPTB 23,21 ± 6,72m và hiệu suất nạp DC khoảng 2,67 ± 0,23% Tốc độ giảiphóngin vitrocủa curcumin từ vi cầu chậm hơn từ vi cầu chitosan ở các môi trườngpH 1,0, 4,0, 6,8 và 7,4 Nghiên cứu dược động học trên chuột cho thấy: vi cầu chứaphytosome hấp thu tăng 1,67 và 1,07 lần so với phytosome curcumin và vi cầucurcumin- chitosan.T h ờ i gi an bá n t hả ic ủ a curcumin d ù n g đư ờn g u ố n g đố iv ớ i v icầu chứa phytosome là 3,16 giờ dài hơn phytosome (1,73 giờ) và vi cầu curcumin(2,34 giờ) Cmaxđối với phytosome curcumin, vi cầu curcumin và vi cầu chứaphytosome curcumin lần lượt là 142,61,

146,59 và 359,67 ng/ml, so với

Cmaxcủacurcuminlà86,55ng/ml.GiátrịAUC0∞củaphytosomecurcumin,vic ầ u curcu min và vi cầu chứa phytosome curcumin tương ứng gấp 2,80, 3,62 và 7,49 lầnso với curcumin Điều này cho thấy: hệ vi cầu chứa phytosome đã kết hợp các ưuđiểm của vicầu chitosan và phytosome, tăngS K D v à k é o d à i t h ờ i g i a n l ư u s o v ớ i hệphytosmecurcuminhoặcvicầucurcumin.Dođó,vicầuchứaphytosomecurcumin có thể được sử dụng như hệ giải phóng kéo dài đối với các DC ít tan vàSKDthấp[112].

TạiViệtNam,theonghiêncứucủaPhạmThịMinhHuệvàcộngsự,phytosomecurcu minđượcbàochếvớitádượcphosphatidylcholinđậunànhhydrogen hóa với kích thước dưới 500 nm. Bằng phương pháp DSC, bước đầunghiên cứu đã chứng minh được có phản ứng liên kết hóa học giữa curcumin vàphosphatidylcholinđậunànhhydrogenhóatrongphytosome[3].

Liposome được tạo thành từ các phospholipid tự nhiên tạo lớp lipid kép.DCtantrongnướccó thểđược nạpvàophầnlõinước củalớpphospholipid kép,cònDC thân dầu được nạp vào lớp vỏ lipid [5] Sự tăng SKD của liposome chứacurcumin có thể giải thích do hấp thu trực tiếp của tiểu phân qua hệ thống dạ dàyruột, tăng tính thấm do sự có mặt của chất diện hoạt, giảm phân hủy, giảm tiếp xúcvới enzym đường tiêu hóa và kéo dài thời gian tiếp xúc với thành ruột do đặc tínhkếtdính[94]. Để tăng hấp thu curcumin qua đường uống, liposome curcumin được bào chếsử dụng lecithin thương mại Curcumin, hỗn hợp curcumin với lecithin và liposomecurcumin được cho chuột uống với liều 100 mg/kg thể trọng Kết quả đánh giá cácthôngsốdượcđộnghọcđườnguốngchothấy:nhómchuộtuốngl i p o s o m e curcumi ncóCmaxkhoảng319,2±70,4g/ l,Tmaxkhoảng30phútvàAUC0120phútlà26502,8g.phút/ l,cònnhómchuộtuốngcurcumincóCmaxkhoảng64,6±10,7

g/l,Tmax120phútvàAUC0120phútlà5342,6g.phút/l.Điềuđóchot h ấ y : liposomechứa curcumincóthểtănghấpthucurcuminquadạdàyruột[94].

Một số chế phẩm nano chứa curcumin sử dụng biện pháp tăng sinh khảdụngthươngmạihóa

Hiện nay, các chế phẩm chứa curcumin đã được thương mại hóa có thể là dạngtiểu phân nano polyme, tiểu phân nano lipid rắn, liposome hoặc micel… Một số chếphẩmđ ư ợ c đ ư a r a t h ị t r ư ờ n g n g o à i n ư ớ c [ 6 1 ] v à t ạ i V i ệ t N a m đ ư ợ c t r ì n h b à y ở bảng1.4.

Bảng 1.4 Một số chế phẩm nano chứa curcumin sử dụng biện pháp tăng

STT Tênchế phẩmnano Côngty Đặctính

Tiểuphânn a n o c u r c u m i n vi nang trong liposomephospholipidlecithin

Nhũ tương nano chứa curcumin.

Tiểu phân nano polyme chứacurcumin

MỘTSỐMÔHÌNHNGHIÊNCỨUSINHKHẢDỤNGCỦACURCUMINDÙN GĐƯỜNGUỐNG

Nghiêncứuinvitro

Một số công trình nghiên cứu đã sử dụng phương phápin vitrođể khảo sát sơbộ xu hướng giải phóng curcumin từ hệ nano trước khi thửin vivo.Môi trường thửlà

900 ml dung dịch natri laurylsulfat 1% [8] hoặc Tween 80 0,05% [67] bằng thiếtbịcánhkhuấyvớitốcđộkhuấyvàthờigianthửthíchhợpởnhiệtđộ37±0,5 o C.Cá biệt, có nghiên cứu sử dụng một loạt môi trường thử độ hòa tan khác nhau như môitrường acid hydrocloric 0,1 M (pH 1,0), đệm phosphat pH 4,0, 6,8 và 7,4 chứa0,5% Tween 80 [112] Mẫu thử được đưa trực tiếp vào môi trường hoặc đưa vàoviên nang cứng gelatin và đặt vào môi trường thử độ hòa tan Mẫu lấy ra sau từngkhoảng thời gian xác định được ly tâm 15000 vòng/phút [67] Đánh giá lượng DCgiải phóng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis [8], quang phổ huỳnhquang với bước sóng kích thích và phát xạ lần lượt 430 và 550 nm [67] hoặc HPLC[106].

Ngoài ra, một số nghiên cứu sử dụng thiết bị thử là các ống Eppendorf chứamôi trường thử và mẫu thử [106], [112] Các ống được đặt vào thiết bị lắc và duy trìnhiệt độ 37 ± 0,5 o C với tốc độ phù hợp Sau từng khoảng thời gian xác định, lấy cácống ra và ly tâm Phân tán trở lại trong dung môi thích hợp để xác định lượngcurcumingiảiphóngbằngphươngphápHPLC[106].

Theo Xie X và cộng sự, sự giải phóngin vitrocủa hệ tiểu phân nano PLGAchứacurcuminđượctiếnhànhtronghaimôitrườngđệmphosphatpH2,0 và7,4,mô phỏng dịch dạ dày và ruột Kết quả đánh giá khả năng giải phóng cho thấy:curcumin giải phóng nhanh trong 8 giờ đầu và tiếp tục giải phóng kéo dài Tuynhiên, tốc độ giải phóng của curcumin từ tiểu phân nano trong dịch ruột cao hơndịch dạ dày nhân tạo do sự hấp thu chủ yếu của curcumin xảy ra ở ruột [106]. Sựgiảiphónginvitrocurcuminchậmvàkéodàidẫnđếnhấpthuinvivokéodài.

Một số nghiên cứu sử dụng túi thẩm tích với kích thước lỗ xốp cho tiểu phâncó khối lượng phân tử khoảng 3-14 kDa đi qua Do curcumin ít tan trong nước nênmôi trường khuếch tán có thể là ethanol [87] hoặc dịch dạ dày nhân tạo(dung dịchmuối đệm phosphat điều chỉnh về pH 2,0 bằng acid hydrocloric) và dịch ruột nhântạo (dung dịch muối đệm phosphat ở pH 7,4) chứa 0,1% Tween 80 (kl/tt) Vai tròcủa Tween 80 để làm tăng độ tan của curcumin trong dung dịch đệm và tránh bámdính curcumin vào thành ống [42] Một số nghiên cứu sử dụng môi trường khuếchtán là dung dịch PEG4 0 0 3 0 % [ 9 9 ] h o ặ c d u n g d ị c h n a t r i l a u r y l s u l f a t 2 0 %

[ 1 1 4 ] Túithẩmtíchđượcđặttrongmôitrườngởnhiệtđộ37±0,5 o Cvàsửdụngkhuấytừ với tốc độ khuấy thích hợp [42], [99] hoặc đặt trong giỏ quay của thiết bị hòa tanhoặc được rung lắc theo chiều ngang bằng thiết bị rung [76] Định lượng DC giảiphóng qua màng sau từng khoảng thời gian bằng phương pháp HPLC [42] hoặcquangphổUV-Visởbướcsóng423nm[52].

Theo Ji H và cộng sự, sự giải phóng curcumin từ hệ tiểu phân nano lipid rắnđược tiến hành bằng phương pháp sử dụng túi thẩm tích trong môi trường dịch dạdày nhân tạo (pH 1,2) và dịch ruột nhân tạo (pH 7,4) Kết quả cho thấy: tốc độ giảiphóng chậm trongcảhaimôi trường chứngt ỏ c u r c u m i n đ ư ợ c n ạ p b ê n t r o n g l õ i lipidvớitỷlệ cao[42].

Theo nghiên cứu của Yu H và Huang Q., màng tế bào Caco-2 mô phỏng biểumô ruột non được sử dụng để nghiên cứu cơ chế thấm của nhũ tương nano chứacurcumin Nhũ tương nano có thể thấm theo hai cơ chế: thứ nhất, nhũ tương nano bịtiêu hóa bởi lipase, đồng thời, curcumin được hòa tan bởi acid béo-muối mật tạomicel Do đó, curcumin hòa tan khuếch tán thụ động qua màng tế bào biểu mô Thứhai, hệnano nhũ tương vớikích thước giọtnhỏ cóthể khuếch tántrực tiếpq u a màng ruột Kết quả đánh giá tính thấm qua màng tế bào Caco-2 chỉ ra rằng: cơ chếthấm của nhũ tương nano chứa curcumin chủ yếu theo con đường khuếch tán-tiêuhóa [111].

Nghiên cứuin vitrocó ưu điểm đơn giản, ít tốn kém, dễ thiết lập, tính toán kếtquả nhanh và thường được dùng là công cụ xây dựng công thức hoặc để kiểm soátchất lượng, đảm bảo độ đồng nhất của sản phẩm, lô mẻ và nhà sản xuất. Nghiên cứuinvitrođểthămdò,sàng lọctrướckhichuyển sangnghiêncứuinvivovàcó thểthay thế choin vivonếu chứng minh được có sự tương quan đồng biến Mặc dù vậy,docur cu mi n cóđ ộ tant h ấ p , chu yể n h ó a vàt hả i t r ừ n h a n h t r o n g cơ t h ể sốn g nê n việcsửdụngmôhình đánhgiáinvitrođểdựđoáninvivothườngkhóchínhxác.

Trong số các phương pháp đánh giáin vitronêu trên, phương pháp đánh giágiải phóng trực tiếp từ môi trường là mô hình phù hợp để đánh giá độ hòa tan củanano tinh thể Phương pháp giải phóngin vitroqua túi thẩm tích do sử dụng màngthẩmtíchcóthểtạorahàngràođốivớiquátrìnhhòatan,dođólàmchậmtốcđ ộ hòa tan Vì vậy, phương pháp này không thích hợp trong đánh giá độ hòa tan mà chỉphù hợp với các tiểu phân nano kiểm soát giải phóng Ngoài ra, các nghiên cứuinvitrotrên màng tế bào Caco-2 có hữu ích trong việc đánh giá tính thấm và cơ chếthấm.

Mặc dù vậy, việc đánh giá độ hòa tan của nano tinh thể bằng phương pháp thửgiải phóng trực tiếp trong môi trường cũng gặp phải một số khó khăn nhất định.Curcumin là DC sơ nước, khó phân tán vàom ô i t r ư ờ n g n ư ớ c , c ó t h ể b ị k ế t t ụ v à bám dính thành cốc và cánh khuấy Khi chuyển sang dạng nano tinh thể, hiện tượngkết tụ vẫn có thể xảy ra do tác động của nhiều yếu tố của quá trình phun sấy Do đó,tốc độ hòa tan tại một số thời điểm ban đầu có thể chậm do tiểu phân nano chưathấm và nổi trên bề mặt môi trường hòa tan.Tại mỗi thời điểm sau khi lấy mẫu, mộtlượng tiểu phân trong môi trường thử có thể bị kéo theo Do đó, để xác định đượcphần trăm curcumin hòa tan cần sử dụng biện pháp thích hợp để loại các tiểu phânDCkíchcỡnanometkhôngtantừmẫu.

Nghiêncứuexvivo

Một số nghiên cứu về SKD của curcumin sử dụng phương pháp nghiên cứuexvivođể đánhgiáhấpthucủacurcumintrênruộtcôlập.

TheoKumarA.vàcộngsự,môhìnhtúiruộtlộnexvivocóthểđượcsửdụnglà công cụ để nghiên cứu cơ chế và động học của hấp thu thuốc Trong nghiên cứunày, chuột được cho nhịn đói 10-12 giờ, uống nước tự do và gây mê bằng ether.Rạch đường giữa bụng, toàn bộ phần ruột được lấy ra, đặt vào dung dịch

KrebsRinger(pH7,4)và đượccungcấpoxy Phầntátràngđượcsửdụngtrongn ghiêncứu tính thấm, thắt bằng chỉ nilon ở một đầu và lộn ra bởi một que thủy tinh. DungdịchK r e b s R i n g e r b ê n n g o à i t ú i r u ộ t đ ư ợ c c o i n h ư d ị c h n h à y v à d u n g d ị c h b ê n trong coi như dịch ruột Lượng curcumin thấm qua ruột sau từng khoảng thời gianxácđịnhđượcxácđịnhbằngphươngphápHPLC[52].

Theo nghiên cứu của Gupta N K và Dixit V K., phương pháp đánh giá hấpthuex vivocủa nhũ tương nano chứa curcumin được tiến hành trên ruột dê Kết quảcho thấy: hấp thuex vivocủa phức hợp curcumin và phospholipid cao hơn so vớicurcumintự do[35].

Nghiên cứuex vivocó ưu điểm đơn giản hơn so với nghiên cứuin vivo Môhình nghiên cứu này có thể sử dụng để nghiên cứu cơ chế và động học quá trình hấpthucủathuốctrướckhiđượcphânbốvàchuyểnhóatrongcơthể.Tuynhiên,đ ốivới DC chuyển hóa mạnh qua gan thành một số chất có hoạt tính như curcumin, môhình này chưa phản ánh đúng quá trình sinh dược học và dược động học của cơ thểsống.

Nghiêncứuinsitu

Bên cạnh các mô hình nghiên cứu trên, nghiên cứuin situđược đề cập đếntrongnhiềunghiêncứunhằmđánhgiáđặctínhhấpthucủacurcumin.

Trong nghiên cứu của Cui J và cộng sự, đặc tính hấp thu của hệ tự nhũ hóachứa curcumin được đánh giá bằng phương pháp truyền vào ruộtin situ Chuột thínghiệm được cho nhịn đói 12 giờ và gây mê Toàn bộ phần ruột non được bộc lộ,buộc dây truyền và đưa ống thông dò bằng plastic vào cơ thể Phần ống thông dòđượcrửabằngdungdịchnước muốisinhlý,gắnvàomôhìnhchứamộtcáibơ mnhu động và xi lanh chứa dung dịch mẫu Ruột non được giữ nhẹ nhàng để duy trìcung cấp máu, dung dịch thử được truyền qua ruột một cách tuần hoàn Sau từngkhoảng xác định, lấy ra dung dịch thử Mẫu được xử lý và phân tích bằng phươngphápHPLC[22].

Sự hấp thu qua ruột của hệ nano lipid rắn được Ji H và cộng sự đánh giá bằngphương pháp thử khuếch tánin situ Đồng thời, phương pháp này cũng đánh giáđược cơ chế tăng tính thấm thông qua ức chế P-gp của hệ nano lipid rắn sử dụng cácchất diện hoạt Brij 78 và TPGS [42] Tương tự, Xie X và cộng sự cũng sử dụngnghiên cứuin situđể đánh giá khả năng thấm của curcumin từ hệ tiểu phân nanoPLGA qua ruột và khả năng ức chế P-gp [106] Sự hấp thu của hỗn dịch nanocurcumin trong hệ thống dạ dày ruột của chuột cống cũng được nghiên cứu theo môhình nghiên cứuin situbởi Gao Y và cộng sự Hỗn dịch nano curcumin được hấpthu theo cơ chế khuếch tán thụ động với9,20% curcumin được hấp thu trong 2 giờ.Vùng hấp thu chủ yếu của curcumin trong đường tiêu hóa chuột cống là tá tràng vàhỗngtràng[30]

Mô hìnhin situdùng trong nghiên cứu cơ thế thấm hoặc khuếch tán qua màngtế bào ruột Giống như mô hìnhex vivo, mô hìnhin situchưa phản ánh các giai đoạnđầyđủcủaquátrìnhsinhdượchọcvàdượcđộnghọccủacơthểsống.

Nghiêncứuinvivo

Nghiêncứuinvivodựatrênviệcđánhgiánồngđộthuốc tronghuyếttươn gsau khi uống Một số nghiên cứu về SKD của curcumin còn định lượng cả curcumintrongmáuvàlượngcurcumincònlạitronghệthốngdạdàyruộtchưađượchấpthu [8]hoặcđịnhlượngcảphầncurcuminbàitiếtquaphân[22].

Do khả năng thấm kém, độ tan thấp, bị chuyển hóa và thải trừ nhanh trong cơthể nên các mẫu huyết tương thường có nồng độ curcumin rất thấp Vì vậy, trongnghiênc ứ u đ á n h g i á S K D c ủ a c á c d ạ n g t h u ố c c h ứ a c u r c u m i n c ầ n l ự a c h ọ n đ ố i tượng thử và phương pháp định lượng curcumin trong huyết tương cần có độ nhạycao.

Về đối tượng thử, nghiên cứu SKD đường uống của curcumin được tiến hànhtrên chuột cống [39], [42], [55], [87] hoặc chuột nhắt [30], [32], [76], [111]. Bêncạnh đó cũng có một số nghiên cứu được thực hiện trên người tình nguyện [82].Nghiên cứu trên chuột có ưu điểm là đơn giản hơn nghiên cứu trên người tìnhnguyện về khía cạnh đạo đức, pháp lý và kinh tế Chuột và người có nhiều điểmtương tự về hấp thu và mô hình biểu thị sự vận chuyển tương tự ở ruột non nhưngmức độ biểu thị và mô hình enzym chuyển hóa ở dạ dày ruột có thể khác nhau

[13].Bộgencủachuộtvàngườigiốngnhauđến99%.Chuột cũnglàmộtloàiđộngv ậtcó vú, dễ sinh sản và rẻ tiền hơn so với các loại động vật khác Đồng thời, chuột làđộng vật dễ nuôi nhốt và bắt giữ bằng tay và sự khác biệt về gen thấp, dẫn đến saikhác về phạm vi đáp ứng hẹp hơn so với các động vật thí nghiệm khác [93] Nhượcđiểm của việc sử dụng chuột trong nghiên cứuin vivolà sự khác nhau cơ bản giữangười và chuột về con đường và tốc độ chuyển hóa Việc cho chuột uống thuốc khókhănhơntrênngười,thểtíchdịchsinhhọcítvà lấymẫukhókhăn[93].

Các nghiên cứu đánh giá SKDin vivođều cho chuột uống mẫu tiểu phân nanocurcumin bằng ống thông vào dạ dày Các mẫu máu được lấy ra sau từng khoảngthời gian xác định từ tĩnh mạch đuôi chuột [39], hoặc lấy máu từ đám rối hốc mắtchuộtsaukhigâymêbằngether[52],

[115] Máu thu được trộn với thành phần chống đông (heparin [87] hoặc EDTA[52]) bằng cách lắc và ly tâm thu lấy phần huyết tương Trong một số trường hợpkhông thể lấy mẫu nhiều lần trên một cá thể, có thể lấy mẫu trên một nhóm cá thểhoặcsử dụngmôhìnhdượcđộnghọcquầnthể.

Về xử lý mẫu, mẫu huyết tương được chiết bằng dung môi ethyl acetat [115],methanol [42], ethanol [40] hoặc tert-butyl methyl ether [105] Ly tâm lấy dịchtrong Bốc hơi dung môi trong dòng khí nitrogen ở nhiệt độ thích hợp Phần cắn hòatanvàomethanolvàtiếnhànhphântích.

Mẫu huyết tương sau khi xử lý được định lượng curcumin bằng phương phápthích hợp [40], [52], [87] Cá biệt có một số nghiên cứu định lượng cả curcumin vàchất chuyển hóa của curcumin trong huyết tương [19], [55] Chất chuyển hóa củacurcumin có thể ở dưới dạng tự do hoặc liên hợp dạng glucuronid hoặc sulfat.

Khiđó,m ẫ u h u y ế t t ư ơ n g đ ư ợ c ủ v ớ i d u n g d ị c h e n z y m s u l f a t a s e v à g l u c u r o n i d a s e ở 37 o C trong 1 giờ để chuyển curcumin sulfat và glucuronid thành curcumin tự dotrướckhichiết[111].

Về phương pháp định lượng, hầu hết các nghiên cứu sử dụng phương phápHPLCvới ưuđiểm nhanh, đơn giản, cóđộnhạy cao.Điềukiệntiến hànhđ ị n h lượng curcumin trong dịch sinh học bằng phương pháp HPLC trong các nghiên cứuvề cơ bản là sử dụng cột C18 ở nhiệt độ thích hợp Thành phần pha động thường làcác dung môi phân cực như acetonitril, methanol phối hợp với nước Tốc độ dòngthường từ 1 đến 2 ml/phút.Phần lớn các nghiên cứu sử dụng detector tử ngoại bướcsóng từ 420-430 nm hoặc detector huỳnh quang với bước sóng kích thích và phát xạlần lượt 426 và

536 nm hoặc detector khối phổ Một số nghiên cứu sử dụng chấtchuẩn nội như β-17-estradiol acetat [87],

[103], benzocain [67] hoặc emodin [112].Bên cạnh đó, một số nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp với khốiphổLC-MShoặcLC-MS/MS[67].

So với các mô hình nghiên cứu SKD khác, nghiên cứuin vivocung cấp đượccác yếu tố thể hiện sự phản ứng của cơ thể sống với thuốc Từ đó có thể dự đoánđược các tác dụng, lựa chọn đường dùng, liều dùng trên người Đánh giáSKDinvivolà cơ sở lựa chọn thuốc điều trị thay thế Tuy nhiên, nghiên cứuin vivocó hạnchếgiáthànhcao,tốnthờigianvàhạnchếvềmặtđạođứcsinhhọc.

Gao Y và cộng sự đã đánh giá SKD của hỗn dịch nano curcumin trên chuộtnhắt với liều 250 mg/kg Các thông số dược động học tính toán không dựa trên môhình ngăn trên hai nhóm cá thể, mỗi nhóm gồm 27 chuột Giá trị AUC0∞của hỗndịch nano khoảng 617,82 ± 70,92g/ml.giờ, gấp 6,80 lần so với hỗn dịch curcumin(90,12 ± 16,85g/l.giờ) Cmaxđối với hỗn dịch nano curcumin khoảng 174,75 ±49,05n g / m l , c a o h ơ n s o v ớ i h ỗ n d ị c h c u r c u m i n ( 1 2 , 5 8 ± 4 , 2 8 n g / m l ) ( p < 0 , 0 1 ) [30].

Dựa trên cơ sở phân tích trên, để giải quyết vấn đề tăng SKD của curcumin,nghiên cứu lựa chọn bào chế dưới dạng hệ tiểu phân nano bằng phương pháp giảmkích thước tiểu phân sử dụng kỹ thuật nghiền bi siêu mịn kết hợp với đồng nhất hóanhờ lực phân cắt lớn Trong điều kiện tiến hành thực nghiệm, nghiên cứu lựa chọncác điều kiện thửin vitrovới thiết bị thử kiểu cánh khuấy và mẫu thử được đưa trựctiếp vào môi trường hòa tan Phương pháp đánh giá SKDin vivodựa trên việc xácđịnh nồng độ curcumin trong huyết tương chuột nhắt Do curcumin bị chuyển hóamạnh thành nhiều chất chuyển hóa, trong đó có tetrahydrocurcumin và nồng độ cácchất này đều thấp nên cácphươngpháp định lượng nồng độ thuốct r o n g h u y ế t tương được lựa chọn cần đáp ứng được cả yêu cầu độ nhạy, độ chính xác cao Dođó,phươngphápLC-MS/MSđượclựachọn.

NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU

NGUYÊNVẬTLIỆU,TRANGTHIẾT BỊNGHIÊNCỨU

19 Acidformic Fluka Tinhkhiết LC-MS

MáynghiềnbiRetsch MM200 Đức TrườngĐH DượcHN

Máykhuấytừ IkaRHB1,415W Đức TrườngĐH DượcHN

NhậtBản ViệnvệsinhdịchtễTrung ương Máyđokíchthướctiểuphânvàxácđịnhp hânbốkíchthướctiểuphân

Máy đo kích thước tiểu phân vàkhoảngphânbốkíchthướctiểuphân

Thiết bị đánh giá diện tích bề mặt,thểtíchlỗxốpvàđườngkínhlỗxốp

Máyđothểtíchbiểukiếncủahạtvà bộtErweka SVM10 Đức TrườngĐH DượcHN

Advance,Brukeraxs Đức TrườngĐH Quốcgia HN

Thiếtbịđophổhồngngoại Nhật TrườngĐH Quốcgia HN

ThiếtbịthửđộhòatanErweka-DT Đức TrườngĐH DượcHN

Máylytâmlạnh Universal320 R Đức TrườngĐH DượcHN

Mỹ Viện kiểm nghiệm thuốcTrungương

Máy sắc ký lỏng Acquity UPLC H-

Mỹ Viện kiểm nghiệm thuốcTrungương

2.1.3 Độngvậtthínghiệm Động vật thí nghiệm được lựa chọn là chuột nhắt trắng khỏe mạnh, khối lượngkhoảng 20-35 g, khoảng 7 tuần tuổi, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, được cung cấp từViện vệ sinh dịch tễ Trung ương Chuột được cho thích nghi với điều kiện phòng thínghiệm ít nhất một tuần và cho nhịn đói 12 giờ, chỉ uống nước trước khi tiến hànhthínghiệm.

NỘIDUNG NGHIÊNCỨU

- Nghiênc ứu ản h h ư ở n g k h i nân gq u y môb à o c hế đ ế n đ ặc t í n h c ủ a hệ t i ể u phânnanocurcumin.

PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU

- Dung môi pha loãng (dung dịch Tween 80 0,2%): cân 2,0 g Tween 80 vàocốc có mỏ, thêm nước cất và đun nóng đến khi tan hoàn toàn Để nguội và thêmnướcvừađủ1000ml.

- Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 10,0 mg curcumin chuẩn hòa tantrong 10 ml methanol, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung môi pha loãngtới vạch, lắc kỹ được dung dịch A (nồng độ 100g/ml) Hút chính xác 2 ml dungdịch Achosangbìnhđịnh mức50ml,thêmdung môiphaloãngtớivạchvàlắckỹ. Quét phổ dung dịch curcumin có nồng độ 5g/ml trong khoảng bước sóng từ200 đến 600 nm, lựa chọn bước sóng tại đó curcumin đạt cực đại hấp thụ Từ dungdịchAphaloãngthànhcácdungdịchcurcuminchuẩncónồngđộ1;2;2,5;4;4,5;5 và 7,5g/ml Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn tại bước sóng đã lựa chọnvới mẫu trắng là dung môi pha loãng và xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối tươngquangiữađộhấpthụvànồngđộcurcumin.

2.3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằng sắc ký lỏng hiệunăngcao

- Dung môi phaloãng:hỗnhợpmethanol: acid aceticbăng(99:1,tt/tt).

- Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 10,0 mg curcumin chuẩn, hòa tantrong dung môi pha loãng, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung môi phaloãng tới vạch và lắc kỹ được dung dịch B Hút chính xác một lượng dung dịch B,thờmdungmụiphaloóngtạothànhdungdịchcúnồngđộ5àg/ml,lọcquamàn glọckớchthướclỗlọc0,45àm.

- Dung dịch thử được chuẩn bị tương tự như dung dịch chuẩn nhưng thaycurcumin chuẩn bằng một lượng bột phun sấy chứa nano curcumin tương ứng với10,0mgcurcumin.

Qua tham khảo tài liệu [22], [39], [42], [50], [80] kết hợp với khảo sát sơ bộ,dựa trên điều kiện trang thiết bị hiện có, các điều kiện chạy sắc ký được lựa chọntrên hệ thống sắc ký Agilent Infinity 1260 như sau: cột sắc ký AQ – C18 250 x 4,6mm, hạt nhồi 5 àm Pha động: acetonitril : dung dịch acid acetic 2% (kl/tt) (58:42),được lọc qua màng lọc kớch thước lỗ lọc 0,45 àm Tốc độ dũng: 1,5 ml/phỳt Thểtớchtiờmmẫu:20àl.DetectorUV-Visphỏthiệnởbướcsúng430nm.

- Tínhthíchhợpcủahệthống:tiêmmẫuchuẩncónồngđộ5g/mllặplại6lần qua hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn Yêu cầu độ lặp lại về diện tíchpic, thời gian lưu giữa mỗi lần tiêm có giá trị RSD không quá 2% và hệ số bất đốixứngtrongkhoảng0,8-1,5.

- Tính chọnlọc- độ đặc hiệu: chuẩn bịmẫu trắng bằngc á c h h ò a t a n

T w e e n 80, PVP và manitol theo tỷ lệ sử dụng trong công thức trong dung môi pha loóng,mẫu curcumin chuẩn (5 àg/ml) và mẫu thử chứa nano curcumin bào chế theo quytrỡnh (5 àg/ml) Tiến hành tiờm mẫu vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã lựachọn và ghi lại các sắc ký đồ Yêu cầu pic của curcumin được nhận diện rõ trên sắcký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử và không xuất hiện pic lạ tại thời điểm trùng với thờigianlưucủa curcumintrênsắckýđồcủamẫutrắng.

- Khoảng tuyến tính: chuẩn bị một dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ từ2,5đến15àg/ml.Tiờmlầnlượtcỏcdungdịchvàohệthốngsắckýtheochươngtrỡn h đã chọn Xác định mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ curcumin. Khoảngtuyếntínhphảicóhệ sốtươngquanr0,98.

- Độ đúng: chuẩn bị các dung dịch chuẩn và thử chứa nano curcumin ở 3 mứcnồng độ 5, 10 và 15 àg/ml Lấy 10 ml dung dịch thử, thờm một lượng dung dịchchuẩn tương ứng khoảng 10, 20 và 30% so với lượng DC có sẵn trong mẫu thử.Thờm dung mụi vừa đủ 20 ml và lọc qua màng lọc kớch thước lỗ lọc 0,45 àm. Tiêmmẫu vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn Yêu cầu phần trăm tìm lại củacácmẫuở3mứcnồngđộnằmtrongkhoảngtừ 98-102%.

- Độ chính xác: chuẩn bị 6 mẫu dung dịch thử chứa nano curcumin có nồng độ5 àg/ml và chạy sắc ký theo chương trỡnh đó lựa chọn ở mục 2.3.1.2 Xỏc định nồngđộ dung dịch từ phương trỡnh hồi quy tuyến tớnh. Yêu cầu độ lặp lại về hàm lượngcurcumintrongcácmẫucógiátrịRSDkhôngvượtquá2%.

2.3.1.3 Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời curcumin và chất chuyểnhóatetrahydrocurcumintrong huyếttươngchuột

Cân chính xác khoảng 5,0 mg curcumin (CUR), hòa tan trong bình định mức50 ml với dung môi methanol Cân chính xác khoảng 10,0 mg tetrahydrocurcumin(THC), hòa tan trong bình định mức 50 ml với dung môi methanol Hút 1 ml dungdịch CUR và 0,5 ml dung dịch THC, pha loãng trong bình định mức 20 ml bằngdung môi methanol Hút 1 ml, cô bốc hơi dung môi, hòa tan cắn trong 10 ml huyếttương chuột được dung dịch chứa CUR và THC trong huyết tương có cùng nồng độ500n g / m l Từ d u n g d ị c h nà y , p h a l o ã n g bằ n g h u y ế t t ư ơ n g c h u ộ t t h à n h c á c d u n g dịchcónồngđộthíchhợp.

Cân chính xác khoảng 25 mg glibenclamid (IS), hòa tan trong bình định mức100 ml với dung môi methanol Hút 500l dung dịch, pha loãng thành 25 ml vớihỗnhợpdungmôimethanol-nước(50:50).

Quy trình xử lý mẫu được tiến hành bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng vớidungmôichiếtlàtert-butylmethylether(TBME)[105].Cụthểnhưsau:

Thêm 10l dung dịch chuẩn nội vào ống nghiệm chứa 100l huyết tươngchuột Lắc xoáy 5 giây Thêm 3 ml dung môi tert-butyl methyl ether (TBME) Lắccơ học ngang 5 phút Ly tâm 3000 vòng trong 5 phút Hút lấy 2,5 ml lớp dịch trongphía trên Cô bay hơi dung môi bằng thiết bị cô dung môi áp suất giảm ở nhiệt độ40 o C.Hòatancắntrong100lphađộngbằngcáchlắcxoáy30giâytrênthiếtbị lắccơhọc.

Mẫu huyết tương sau khi xử lý được định lượng đồng thời CUR và THC bằngphương pháp LC-MS/MS với các điều kiện sắc ký được xây dựng dựa trên thamkhảo tài liệu [105] kết hợp với khảo sát như sau: cột sắc ký Kinetex C18, kích thướccột 100 x 2,1 mm, kích thước hạt nhồi 1,7m Nhiệt độ cột 40 o C Pha động:acetonitril: dung dịch acid formic 0,05% (60:40) Tốc độ dòng 0,3 ml/phút Thể tíchmẫutiêm10l.Điềukiệnkhốiphổđượctrìnhbàyởbảng2.3.

Bảng 2.3 Điều kiện khối phổ của phương pháp LC-MS/MS định lượng curcumin vàtetrahydrocurcumintronghuyếttương

Chếđộionhóa ESI(+) ESI(+) ESI(+) Điệnthế đầuphun(kV) 3,0 3,0 3,0 Điệnthếbộphậnthumẫu(V) 36 18 28

Ionbanđầu(ionmẹ) m/z 69,03 m/z 73,05 m/z I4,20 Iontạothành(ioncon) m/z 6,98 m/z 6,96 m/z 69,12 Quy trình thẩm định phương pháp định lượng đồng thời CUR và THC tronghuyết tương được thực hiện theo hướng dẫn của US-FDA và EMA bao gồm các chỉtiêusau [26],[100]:

Tiến hành xửlý mẫuh u y ế t t ư ơ n g c h ứ a C U R v à T H C v ớ i c ù n g n ồ n g đ ộ khoảng 250 ng/ml và chạy sắc ký lặp lại 6 lần theo các điều kiện sắc ký đã lựa chọnởtrên.Xácđịnhthờigianlưu,diệntíchpicvàtínhtỷlệdiệntíchgiữacácpicCUR vàTHCsovớipicchuẩnnội.YêucầuđộlặplạivềthờigianlưucủacácpicCURvà THC và giá trị tỷ lệ diện tích giữa các pic CUR và THC với chuẩn nội có RSDnhỏhơn5%.

So sánh sắc ký đồ của 6 mẫu huyết tương chuột với mẫu huyết tương chuột cópha chuẩn CUR ở nồng độ LLOQ (0,5 ng/ml) và THC ở nồng độ LLOQ (0,5 ng/ ml)được xử lý theo quy trình ở trên Yêu cầu pic của CUR và THC phải đảm bảo đượcnhận diện rõ ràng, tách khỏi hoàn toàn các pic tạp Tỷ lệ tín hiệu đo của mẫu LLOQso với mẫu trắng lớn hơn ít nhất 5 lần tại thời điểm trùng với thời gian lưu của CURvà THC và lớnhơn ítnhất 20 lần tại thời điểm trùngvới thời gianl ư u c ủ a c h u ẩ n nội.

Xây dựng đường chuẩn trong huyết tương chuột và hàm đáp ứng, xác địnhkhoảngtuyếntính

Chuẩn bị 8 nồng độ của chất chuẩn CUR và THC pha trong huyết tương trắngcó nồng độ 0,5; 2,5; 5; 50; 100; 200; 350 và 500 ng/ml, mỗi nồng độ 2 mẫu độc lập.Xử lý các mẫu theo quy trình ở trên Phân tích các mẫu bằng phương pháp LC-MS/MS Xác định sự tương quan giữa giá trị tỷ lệ diện tích pic CUR/IS và nồng độCUR, giá trị tỷ lệ diện tích pic THC/IS vàn ồ n g đ ộ T H C c ó t r o n g m ẫ u T í n h l ạ i nồng độ CUR và THC có trong mẫu chuẩn theo phương trình hồi quy đã xây dựng.Xác định độ đúng bằng cách so sánh với giá trị thực tương ứng của từng nồng độ.Yêu cầu trong khoảng nồng độ khảo sát, độ đúng so với giá trị thực của các nồng độphải đạt từ 85% đến 115% Độ đúng của điểm có nồng độ thấp nhất của đườngchuẩnđượcphéptừ80%đến120%.Ítnhất 75%sốđiểmtrongdãyđườngch uẩnđạtđượctiêuchuẩntrên.Khoảngtuyếntínhcóhệsốtươngquanr0,98.

KẾTQUẢTHẨMĐỊNHPHƯƠNGPHÁPĐỊNH LƯỢNG

Để có cơ sở cho việc nghiên cứu bào chế, đề tài đã tiến hành khảo sát và thẩmđịnh phương pháp định lượng curcumin bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-

Vis,HPLCvàthẩmđịnhphươngphápđịnhlượngđồngthờicurcuminvàtetrahydrocurcum intronghuyếttươngchuộtbằngphươngphápLC-MS/MS.

3.1.1 Kết quả khảo sát phương pháp định lượng curcumin bằng quang phổhấpthụUV-Vis

Quét phổ dung dịch curcumin chuẩn có nồng độ 5g/ml trong dung môi nướcchứa0,2%Tween80vớikhoảngbướcsóngtừ200đến600nm.Kếtquảởphụlục 1.1 cho thấy curcumin trong dung dịch nước chứa 0,2% Tween 80 có một đỉnh hấpthụcựcđạitạib ướ c sóng4 2 7 nm.T ại bư ớc só n g n à y , độhấp th ục ủ a dungd ịchchứa Tween80,PVP vàmanitolvớitỷlệsửdụngtrongcôngthứcchỉkhoảng0,004 ± 0,001 Do đó, bước sóng 427 nm được lựa chọn để tiến hành xác định hàm lượngcurcumintrongcácmẫunghiêncứubằngphươngphápquangphổhấpthụUV-Vis.

Chuẩnbịdãydungdịchcurcuminchuẩntheophương pháptrình bàyởmục 2.3.1.1 Đo độ hấp thụ của các dung dịch trên ở bước sóng 427 nm Kết quả đượctrìnhbàyởphụlục1.1và hình3.1.

Kết quả trên cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độcurcumin trong khoảng nồng độ đã khảo sát với hệ số tương quan r ≈ 1 Như vậy,trong trường hợp nhằm định lượng curcumin trong nguyên liệu, trong chế phẩm bàochế hoặc xác định độ hòa tan, có thể sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis.

3.1.2 Kết quả khảo sát thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằngphươngphápsắckýlỏnghiệunăngcao

So với phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis, HPLC là phương pháp có độtin cậy, phát hiện được chính xác nồng độ DC và các pic tạp chất (nếu có) Để đảmbảo phương pháp định lượng chính xác trong khoảng giới hạn nồng độ DC đượckhảo sát, quy trình thẩm định phương pháp được tiến hành dựa theo các chỉ tiêu cơbảnsau:

Chuẩn bị dung dịch chuẩn có nồng độ 5g/ml và tiến hành đánh giá độ thíchhợp theo phương pháp ghi ở mục 2.3.1.2 Kết quả xác định diện tích pic, thời gianlưuvàhệsốbấtđốixứngđượctrìnhbàyởbảng3.1.

STT Thời gian lưut R (phút )

Diệntíchpic( mAU.giây) Hệsốbất đốixứng

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy: độ lệch chuẩn tương đối của các giá trị thời gianlưu nhỏ hơn 1% và diện tích pic nhỏ hơn 2% Các giá trị hệ số bất đối xứng nằmtrong khoảng từ 0,8 đến 1,5 Số đĩa lý thuyết trung bình khoảng 9635 Như vậy,chương trình sắc ký đã chọn phù hợp để định lượng curcumin trong các mẫu nghiêncứu. y = 88.41x + 33.78 R² = 0.998

Chuẩn bị mẫu trắng, mẫu curcumin chuẩn (5 àg/ml), mẫu thử chứa nanocurcumin như mục 2.3.1.2 Tiến hành tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký theo chươngtrình đã lựa chọn Kết quả sắc ký đồ được thể hiện ở phụ lục 1.2 cho thấy: trongkhoảng thời gian 9 phút, trên sắc ký đồ của mẫu dung dịch curcumin chuẩn và mẫuthử chứa nano curcumin đều có một pic có thời gian lưu 6,27 phút Trên sắc ký đồcủa mẫu trắng không xuất hiện pic lạ tại thời điểm trùng với thời gian lưu củacurcumin (6,27 phút) Điều đó chứng tỏ pic trên sắc kí đồ là của curcumin, phươngphápđịnhlượng cóđộđặchiệucao.

Xác định mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ curcumin trong mẫu,kếtquảđượcthểhiệnở phụlục1.2vàbiểudiễnởhình3.2.

Hình 3.2 Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độcurcumin

Kết quả ở hình 3.2 cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồngđộ dung dịch chuẩn trong khoảng nồng độ đã khảo sát với hệ số tương quan r =0,9989.

Chuẩnb ị c á c d u n g d ị c h c h u ẩ n v à t h ử c h ứ a n a n o c u r c u m i n n h ư t r o n g m ụ c 2.3.1.2 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp HPLC định lượng curcuminđượctrìnhbàytrongbảng 3.2.

D iệ n tí ch p ic (m A U g iâ y)

Nồng độchuẩnthê mvào(g/ml) chuẩnthê% mvào

Diệntíchpic( mAU.giây) Nồng độ tìmlại(g/m l)

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy: các mẫu đều có phần trăm tìm lại nằm trongkhoảngt ừ 9 8 , 0 % đ ế n 1 0 2 , 0 % , c h ứ n g t ỏ p h ư ơ n g p h á p c ó đ ộ đ ú n g c a o , đ ả m b ả o phépphântíchtốtkhixácđịnhhàmlượngcurcumintrongchếphẩm.

Pha 6 mẫu dung dịch thử chứa nano curcumin cú nồng độ 5 àg/ml Kết quảđánh giá độ chính xác theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.1.2 được thể hiện ởbảng3.3.

STT Khốilượng mẫuthử Diệntíchpic( mAU.giây) Hàmlượng

Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy: mẫu thử có hàm lượng trung bình 42,0%, độchính xác của các dung dịch nằm trong khoảng 98,1-101,1% với độ lệch chuẩntươngđốinhỏhơn2%.Phươngphápcóđộchínhxácđạtyêucầu.

Như vậy, phương pháp HPLC đạt yêu cầu về thẩm định và có thể sử dụngtrong phân tích hàm lượng curcumin và nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm chứacurcumin.

3.1.3 Kết quả thẩm định phương pháp định lượng đồng thời curcumin và chấtchuyểnhóatetrahydrocurcumintronghuyếttươngchuột

Curcuminsaukhihấpthutheođường uốngsẽ bịchuyểnhóamạnhquagan tạo thành một số sản phẩm chuyển hóa trong đó có tetrahydrocurcumin Vì vậy,phương pháp được lựa chọn phải định lượng đồng thời được cả CUR và THC tronghuyếttươngvớiđộnhạytốt.PhươngphápđượclựachọnlàLC-MS/MS.

Tiến hành chạy sắc ký lặp lại 6 lần mẫu huyết tương chứa CUR và THC vớicùng nồng độ 250 ng/ml sau khi xử lý, xác định các thông số đặc trưng của mỗi picvà tỷ lệ diện tích giữa các pic DC so với pic chuẩn nội Kết quả đánh giá tính thíchhợpcủahệthốngsắckýđượctrìnhbàyởbảng3.4.

CUR THC IS Tỷl ệ diệntích tR

Diện tích CUR/IS THC/IS

Thời gian lưu (tR) của các pic CUR và THC và giá trị tỷ lệ diện tích giữa cácpicC U R v à T H C v ớ i c h u ẩ n n ộ i đ ề u c ó đ ộ l ặ p l ạ i t ố t ( R S D < 5 % ) , c h ứ n g t ỏ h ệ thống LC-MS/MS ổn định và phù hợp để định lượng đồng thời CUR và THC tronghuyếttương.

Chuẩn bị 6 mẫu huyết tương trắng và 6 mẫu chứa hỗn hợp CUR 0,5 ng/ml vàTHC 0,5 ng/ml trong huyết tương có chứa chuẩn nội glibenclamid (mẫu LLOQ), xửlý theo quy trình ghi ở mục 2.3.1.3 và tiến hành định lượng bằng phương pháp

LC-MS/MS.Kếtquảđượctrìnhbàyởđồthịphụlục 1.3vàbảng3.5.

Bảng3.5.Kếtquảđánhgiátínhđặchiệu-chọnlọccủaphươngphápLC-MS/MS(n

T Đápứng pic mẫu trắng Đápứngpic mẫu

Tỷ lệđápứngpic LLOQ/mẫutrắng tạitRcủa

CUR tạitRcủa THC tạitR củaIS CUR THC IS CUR THC IS

Trên sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng ở phụ lục 1.3, các sắc ký đồ tổng cácion,s ắ c k ý đ ồ c h ọ n l ọ c i o n C U R ( m / z 3 6 9 , 0 3176,98),s ắ c k ý đ ồ c h ọ n l ọ c i o n THC( m / z 3 7 3 , 0 51 3 6 , 9 6 ) v à s ắ c k ý đ ồ c h ọ n l ọ c i o n g l i b e n c l a m i d ( m / z 4 9 4 , 2

176,98), sắc ký đồc h ọ n l ọ c i o n T H C ( m / z 3 7 3 , 0 5 136,96) của mẫu huyếttương trắng thêm chuẩn CUR, THC nồng độ 0,5 ng/ml và chuẩn nội glibenclamidxuất hiện các pic có thời gian lưu lần lượt là 1,27, 1,17 và 1,48 phút tương ứng vớiCUR,THCvà glibenclamid(GBC).

Kết quả phân tích ở bảng 3.5 cũng cho thấy: tín hiệu đo của mẫu chứa CUR vàTHC ở nồng độ 0,5 ng/ml cao hơn 5 lần tín hiệu đo của mẫu trắng tại thời điểmtrùng với thời gian lưucủa CURvà THC (tương ứng1,27v à 1 , 1 8 p h ú t ) T í n h i ệ u đo của chuẩn nội cao hơn 20 lần tín hiệu đo của mẫu trắng tại thời điểm trùng vớithời gian lưu của chuẩn nội (1,48 phút) Như vậy, phương pháp định lượng lựa chọncótínhđặchiệu,chọnlọcđốivớiCURvà THC.

Xâydựng đ ư ờ n g c h u ẩ n b i ể u t h ị m ố i q u a n h ệ g iữ a g i á t r ị tỷ lệd i ệ n tí ch p i c CUR/IS( y1)vớ in ồn g đ ộ C U R (x1)và gi át rị tỷ lệd i ệ n t íc hp i c T HC /

I S( y2)v ớ i nồngđộTHC(x2)tronghuyếttươngchuộtbằngphươngpháphồiquytu yếntính,sử dụng hệ số tỷ trọng (1/nồng độ 2 ) Kết quả được trình bày ở bảng 3.6 và bảng

3.7.Bảng 3.6 Tương quan giữa tỷ lệ diện tích pic CUR/IS và nồng độ CUR trong huyếttương(n= 8)

(ng/ml) Đườngchuẩn1 Đườngchuẩn2 Đườngchuẩn3

Bảng 3.7 Tương quan giữa tỷ lệ diện tích pic THC/IS và nồng độ THC trong huyếttương(n= 8)

Nồng độ(ng/ ml) Đườngchuẩn1 Đườngchuẩn2 Đườngchuẩn3

NGHIÊNCỨU TIỀNCÔNG THỨC

Việc đánh giá các đặc tính vật lý, hóa học và cơ học của DC cũng như một sốtương tác dược chất-tá dược có thể xảy ra trong quy trình bào chế được coi là bướcđầu tiên, làm cơ sở để xây dựng công thức, lựa chọn tá dược và phương pháp bàochếthíchhợp.

Hình ảnh tiểuphân curcumin được đánh giáb ằ n g k í n h h i ể n v i đ i ệ n t ử q u é t theophươngpháp ghiởmục 2.3.2.1.avàđượctrìnhbàyởhình3.3.

Hình 3.3 Hình ảnh tiểu phân curcumin quan sát qua kính hiển vi điện tử quét vớiđộphóngđại5000lần

Về mặt hình thái học, tiểu phân curcumin ở dạng hình kim với các cạnh sắc vàrõ Mặc dù hình ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử quét không phản ánh được kíchthước của tiểu phân của toàn bộ mẫu, nhưng kết quả này cũng phần nào dự đoánđược kích thước và hình thái của tiểu phân ban đầu Với hình thái học như vậy, tiểuphâncurcumin dễdàngbịphânchiathànhcáctiểuphânkíchthướcnhỏhơn.

Hìnhả n h p h ổ n h i ễ u x ạ t i a X c ủ a c u r c u m i n đ ư ợ c t h ể h i ệ n ở p h ụ l ụ c 2 1 c ó nhiều pic với cường độ lớn Điều đó chứng tỏ curcumin tồn tại chủ yếu ở dạng kếttinh. Đồng thời, nhằm nhận biết các nhóm chức đặc trưng của chất, curcumin đượcchụp phổ hồng ngoại theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.2.1.f Hình ảnh phổ hồngngoạicủacurcuminđượcthể hiệnởphụlục2.2.

3.2.1.3 Cácđặctínhvềkíchthướctiểuphân,diệntíchbềmặtvàđộxốp,giảnđồnhiệtvis ai,hàmlượngvàđộtan

Diệntíchbềmặt1,348m 2 /g,thể tíchlỗxốptrungbình0,005 cm 3 /g,kíchthướclỗxốptrungbình123,9 Å(phụlục2.4) Giảnđồnhiệtvi sai

Hòa tan là bước hạn chế quá trình hấp thu của một số DC ít tan thuộc nhóm IIvà IV theo hệ thống phân loại sinh dược học Curcumin thuộc nhóm IV trong hệthống phân loại sinh dược học [104], khó phân tán và bị kết tụ trong nước nên trongnghiên cứu thử độ hòa tan, chất diện hoạt Tween 80 với nồng độ 0,2% được lựachọn để thêm vào môi trường thử Chất diện hoạt có vai trò đảm bảo điều kiện“sink”và tránh bám dính tiểu phân vào thành cốc và cánh khuấy Mặt khác, chấtdiện hoạt còn gây thấm cho tiểu phân curcumin ở giai đoạn đầu của thử nghiệm hòatan,gi ảm thiểusa isố g â y rad ot iể up hânc hư a p hâ n t án vào mô it rư ờn gh ò a t a n giữa các lần thử nghiệm Độ hòa tan của curcumin trong môi trường dung dịch HCl0,1 N, nước và đệm phosphat pH 6,8 chứa 0,2% Tween 80 được thể hiện ở hình 3.4vàphụlục2.7.

Trong môi trường HCl 0,1 N chứa 0,2% Tween 80, curcumin có độ hòa tanthấphơnsovớitrongmôitrườngnướcvàđệmphosphatpH6,8chứa0,2%Tween

80.Dựavàokếtquảnày,môitrườngnướcchứa0,2%Tween80đượcchọntrongn ghiêncứuthử độhòatancủacurcumin.

Môi trường HCl 0,1 Nchứa0,2%Tween80

Môi trường nước chứa0,2%Tween80

Môi trường đệmphosphat pH 6,8 chứa0,2%Tween80

(cácthờiđiểm10và20phút,phầntrămcurcuminhòatankhôngxácđịnhđượcvìquáthấp) Hình 3.4. Độ hòa tan của curcumin trong môi trường dung dịch HCl 0,1 N, nước vàdungdịchđệmphosphatpH6,8chứa0,2%Tween80

Như vậy, curcumin có KTTPTB ban đầu khá lớn, khoảng phân bố KTTP rộng,tồn tại ở trạng thái kết tinh, ít tan trong nước và độ hòa tan kém Do đó, để cải thiệnSKD của curcumin có thể sử dụng biện pháp cải thiện độ tan và độ hòa tan bằng kỹthuậtbàochếhệtiểuphânnano.

3.2.2 Kếtquảnghiêncứuđộổnđịnhhóahọccủadượcchấtởtrạngtháirắn Độ ổn định của nguyên liệu sẽ ảnh hưởng đến độ ổn định và tuổi thọ của dạngbào chế chứa DC đó Việc theo dõi độ ổn định của nguyên liệu ở trạng thái rắn cóthể định hướng được tá dược sử dụng trong dạng bào chế, bao bì đóng gói cũng nhưđiều kiện bảo quản Curcumin được theo dõi độ ổn định ở các điều kiện khắc nghiệtnhư trong mục 2.3.2.2 Đánh giá sự thay đổi hình thức bằng cảm quan, hàm lượngcònlạivàtạpphânhủybằngphươngphápHPLC,kếtquảđượctrìnhbàyở bảng

Bảng 3.22 Kết quả theo dõi độ ổn định của curcumin trong một số điều kiện khắcnghiệt(n=3) Điềukiệnkhắcnghiệt Thayđổi hìnhthức

Nhiệtkhô, 6 0 o Ctr on g 7 ngày, lọ kín - 108,1± 2,5 -

(dungdịchkalinitratbãohòa),nhi ệtđộ phòng,7 ngày

Kết quả được thể hiệnở bảng 3.22 cho thấy:t r o n g c á c đ i ề u k i ệ n k h ắ c n g h i ệ t về nhiệt khô và tác động cơ học bằng cách nghiền bi inox, hình thức và hàm lượngcurcumincònlạisauthờigiantheodõikhôngcósựthayđổiđángkể.Trênsắck ýđồ không có tạp phân hủy khác xuất hiện so với nguyên liệu ban đầu (phụ lục 2.8).Điều đó chứng tỏ curcumin có thể chịu được các điều kiện nhiệt khô ở 60 o C và tácđộng cơ học trong thời gian theo dõi Trong môi trường có độ ẩm cao (khoảng 75%và 90%), mặc dù chưa có sự thay đổi về màu sắc nhưng curcumin dễ bị hút ẩm dẫnđến hiện tượng vón cục Điều này có ý nghĩa khi lựa chọn thông số trong quá trìnhbàochế,lựachọnbaobìvàđiềukiệnbảoquảnchế phẩm.

Khi xây dựng công thức, curcumin được phối hợp với một số tá dược theo quytrình bào chế thích hợp Nhằm sàng lọc và lựa chọn một số tá dược trước khi tiếnhành xây dựng công thức, một số nghiên cứu về tương tác giữa curcumin và tá dượcđược tiến hành theo phương pháp ghi ở mục 2.3.2.3 Kết quả đánh giá sự thay đổihình thức và hàm lượng còn lại sau 1 tháng bảo quản trong tủ vi khí hậu được trìnhbàyởbảng3.23.

Bảng 3.23 Kết quả đánh giá tương tác dược chất-tá dược sau 1 tháng ở điều kiệnlãohóacấptốc(n= 3)

Thayđổihình thức Hàmlư ợng(%) Tạp phânhủy(

Khảnă n g t ươ ng t á c, t ươ ng kỵ củatá dư ợc v ớ i DCc ót h ể b i ể u hi ện t ứ c t hì , cũng có thể xảy ra chậm hơn trong quá trình bảo quản Trong điều kiện khảo sát,curcumin không tương tác với tá dược Tween 80, Tween 60, Poloxame 188, CMC,manitol, Trehalose và lactose. Riêng đối với Cremophor RH40, mặc dù có sự thayđổi về hình thức ở lọ trạng thái mở nắp nhưng kết quả định lượng ở lọ trạng tháiđóng nắp lại cho thấy không có sự thay đổi về hàm lượng curcumin và không xuấthiện tạp phân hủy Khi phối hợp curcumin với PVA, mặc dù trong điều kiện lọ mởnắp có sự thay đổi về hình thức bên ngoài, nhưng ở trạng thái lọ đóng nắp hiệntượng này không xảy ra Như vậy, trong điều kiện tiến hành thực nghiệm, không cótươngkỵnàogiữaDCvàtádượckhảosát.

Dựa trên cơ sở nghiên cứu tính chất của DC và tương tác dược chất-tá dược,với mục tiêu cải thiện SKD của curcumin bằng cách tăng độ tan và tốc độ hòa tan,nghiên cứu lựa chọn một số nhóm tá dược và phương pháp bào chế để bào chế hệtiểuphân nano.

NGHIÊNCỨUBÀOCHẾHỆTIỂUPHÂNNANO

Hỗn dịchnano curcumin được bàochếmộtsố nhóm chất đượcl ự a c h ọ n đ ể xâydựngcôngthứccơbảnnhưởbảng2.4.

Chất diện hoạt có khả năng định hướng trên bề mặt phân cách giữa hai pharắn- lỏng tạo thành một lớp đơn, đa phân tử hoặc các ion bao xung quanh các tiểuphân

DC rắn, đồng thời làm giảm sức căng bề mặt, cải thiện tính thấm của các tiểuphânDCrắnvớimôitrườngphântán.

Hỗn dịch nano curcumin được bào chế sử dụng các chất diện hoạt khác nhauvới thành phần theo bảng 3.24 bằng phương pháp mô tả ở mục 2.3.3.1 (quy trình A)Bảng3.24.Thànhphầncácmẫuhỗndịchnanosửdụngchấtdiệnhoạtkhácnhau

Kết quả xác định kích thước tiểu phân trung bình (KTTPTB) và hệ số đa phântán (PDI) theo phươngpháp trình bày ởm ụ c 2 3 3 3 b đ ư ợ c t r ì n h b à y t r o n g h ì n h 3.5.

Hình 3.5 KTTPTB và PDI của các mẫu hỗn dịch nano curcumin sử dụng chất diệnhoạtkhácnhau(n= 3)

CUR(g) Tw80(g) Tw60(g) Cre(g) Pol(g) Nước(ml)

Kết quả ở hình 3.5 cho thấy có sự khác biệt về KTTPTB giữa các mẫu sử dụngchất diện hoạt khác nhau (p< 0,05) Phân tích post-hoc (kiểm định LSD) cho thấy sựkhác nhau đáng kể về KTTPTB giữa mẫu DH1 và các mẫu DH2, DH3, DH4 (p 0,05) Với tỷ lệ Tween

K T T P T B (n m ) P D I tỏkhoảngphânbốkíchthướctiểuphânhẹphơn.Mặcdùvậy,tỷlệTween80/curcumin trên 20% có thể gây khó khăn cho quá trình phun sấy do nhiệt độ nóngchảythấp.Đồngthời,khitỷlệTween80cao,hỗndịchtạothànhnhiềubọt, điềunày gây khó khăn trong quá trình khuấy trộn ở tốc độ cao Vì vậy, tỷ lệ Tween80/curcuminđượckhảosáttrongkhoảngtừ5-15%.

Hỗn dịch nano được tạo thành kém ổn định về mặt nhiệt động học Hệ tiểuphân nano sẽ giảm năng lượng bề mặt bằng cách kết tụ hoặc hòa tan và kết tinh trởlại của tiểu phân nhỏ hơn thành tiểu phân lớn hơn (kết tụ Ostwald) [12], [71]. MặcdùhỗndịchnàyđãsửdụngchấtdiệnhoạtnhưngdoTween80làphântửnhỏ,tạora lớp hấp phụ mỏng trên bề mặt tiểu phân và tạo ra sự ổn định không gian giữa cáctiểu phân kém hiệu quả hơn so với các polyme khối lượng phân tử lớn [85] Vì vậy,nghiên cứu tiếp tục tiến hành phối hợp Tween 80 với các polyme thân nước Sự cómặt của các polyme này trong hỗn dịch nano có thể làm giảm năng lượng bề mặttiểu phân bằng cách hấp phụ trên bề mặt tạo thành lớp áo thân nước ngăn chặn quátrình kết tụ hoặc tạo sự cồng kềnh về mặt không gian và tích điện cho bề mặt tiểuphân [5].

Hỗnd ị c h n a n o c u r c u m i n đ ư ợ c t i ế n h à n h b à o c h ế t h e o c ô n g t h ứ c D H 1 p h ố i hợp với các polyme thân nước PVP, Na CMC hoặc PVA Thành phần các mẫu hỗndịchnanođược thểhiệnởbảng3.25.

CUR(g) Tw(g) PVP(g) NaCMC(g) PVA(g) Nước(ml)

Các mẫu hỗn dịch nano được đánh giá KTTPTB, PDI theo phương pháp trìnhbàyởm ục 2.3 3.3 bvàthếzeta theophươngpháptrình bàyởm ụ c 2.3 3.3.c.Kết quảđánhgiáKTTPTB,PDIvàthếzetacủacácmẫuhỗndịchnanođượcthểhiệnởhình3.7v àbảng3.26.

Hình 3.7 KTTPTB và PDI của hỗn dịch nano sử dụng các polyme thân nước khácnhau(n= 3) Bảng3.26.Thếzetacủacácmẫuhỗndịchnanosửdụngcácpolymekhácnhau

Giátrịthếzeta(mV) Trongmôitrườngnước Trong môitrường phântángốc

Kết quả ở hình 3.7 và bảng 3.26 cho thấy mối liên hệ giữa giá trị thế zeta vàKTTPTB của tiểu phân nano thu được Hỗn dịch nano bào chế sử dụng polyme ổnđịnh Na CMC có giá trị thế zeta trong môi trường nước và môi trường phân tán gốccaohơnsovớimẫuhỗndịchsửdụngPVPhoặc PVAmặcdùtỷlệsửdụngthấ pnhất (tỷ lệ Na CMC/curcumin là 0,05%) Kết quả đánh giá KTTPTB cho thấy: hỗndịch nano sử dụng Na CMC có KTTPTB cao hơn so với hai mẫu sử dụng PVP vàPVA Điều này có thể do khối lượng phân tử của polyme Na CMC khá lớn, có thểhình thành cầu nối polyme làm tăng sự kết tụ tiểu phân Kết quả này cũng phù hợpvớik ế t q u ả n g h i ê n c ứ u b à o c h ế h ỗ n d ị c h n a n o c u r c u m i n c ủ a R a c h m a w a t i H v à cộngsự [75].

Khi pha loãng trongmôi trườngphân tángốc, giá trị thế zeta củah ỗ n d ị c h nanob à o c h ế v ớ i p o l y m e N a C M C l ạ i t ă n g l ê n S ự t ă n g t h ế z e t a n à y c ủ a l ớ p

Helmholtz do tăng hấp phụ nhóm carboxylic tích điện âm (COO - ) lên bề mặt tiểuphân hơn so với sự chuyển lớp hấp phụ của chuỗi polyme Thêm vào đó, nhóm tíchđiện âm của Na CMC ở trong và trên bề mặt polyme, dẫn đến tăng điện thế Stern vàtăngthế zeta.

Giá trị thế zeta có thể được sử dụng để dự đoán độ ổn định vật lý của hỗn dịchvì điện tích bề mặt tiểu phân là một trong nhữngy ế u t ố q u y ế t đ ị n h đ ộ ổ n đ ị n h v ề mặtvật lý của hệ phân tán Căn cứ vàokếtquả xác địnhthế zeta,có thể kết luậnrằng các polyme sử dụng đều thích hợp để làm tăng độ ổn định của hỗn dịch nanocurcumin Tuy nhiên, Na CMC không phải là một lựa chọn thích hợp do có thể dẫnđến sự mất ổn định do tương tác hình thành cầu nối polyme làm tăng KTTP [75].Dựa vào kết quả này, PVP được lựa chọn là chất ổn định cho hỗn dịch nanocurcumin.

Hỗn dịch nano được bào chế theo công thức DH1 phối hợp với polyme PVPvới tỷ lệ khối lượng PVP/curcumin thay đổi Hỗn dịch nano được phun sấy theophương pháp mô tả ở mục 2.3.3.1 (quy trình A) với các thông số nhiệt độ khí vào85 o C và tốc độ phun dịch 5 ml/phút Kết quả đánh giá KTTPTB và PDI của mẫu bộtphun sấy chứa nano curcumin với tỷ lệ PVP khác nhau được trình bày ở bảng 3.27và3.28.

Bảng 3.27 KTTPTB và PDI của bột phun sấy chứa nano curcumin sử dụng tỷ lệPVP/curcuminkhácnhau

Mẫu TỷlệPVP/CUR KTTPTB(nm) PDI

Bảng 3.28 Độ hòa tan của các mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin sử dụng tỷ lệPVP/curcuminkhácnhau

PS1 PS2 PS3 PS4 PS5

Kết quả ở bảng 3.27 và 3.28 cho thấy: tỷ lệ PVP/curcumin ảnh hưởng khôngđángkểđếnKTTPTB và PDIcủa tiểuphânnanocurcumin nhưngl ại ảnh hưởng đến độ hòa tan của curcumin trong bột phun sấy Tỷ lệ này càng cao, tốc độ hòa tancurcumin từ bột phun sấy càng nhanh Tuy nhiên, nếu tỷ lệ PVP/curcumin quá caocó thể ảnh hưởng đến thể chất của khối bột trong quá trình bảo quản do đặc tính củaPVP dễ hút ẩm Do đó, tỷ lệ PVP/curcumin được lựa chọn trong khoảng 10% đến100%.

Các hỗndịch nano được bào chế theocôngthức OD2 với tốcđ ộ đ ồ n g n h ấ t hóa thay đổi 10000, 15000, 18000 và 22000 vòng/phút trong 15 phút theo phươngpháp mô tả ở mục 2.3.3.1 (quy trình A) Xác định KTTP và PDI theo phương phápmôtảởmục2.3.3.3.b.Kếtquảđượctrìnhbàytrong hình3.8.

Kết quả ở hình 3.8 cho thấy: khi tăng tốc độ đồng nhất hóa, KTTPTB và PDIcủa hỗn dịch nano giảm Tuy nhiên, nếu khuấy ở tốc độ 22000 vòng/phút, hỗn dịchnhiều bọt ảnh hưởng đến quá trình khuấy trộn Do đó, các mẫu hỗn dịch nano đượckhuấyvớitốcđộ15000hoặc18000vòng/phút.

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn kích thước tiểu phân trung bình và hệ số đa phân tán củacácmẫuhỗndịchnanokhuấyvớitốcđộkhácnhau(n=3) 3.3.2.2.Lựachọnthờigianđồngnhất

CácmẫuhỗndịchnanođượctiếnhànhbàochếtheocôngthứcOD2vớitốcđộ đồng nhất hóa 15000 hoặc 18000 vòng/phút và thời gian đồng nhất hóa thay đổi5, 15, 30 và 45 phút theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3.1 (quy trình A) Xác địnhKTTP và PDI theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3.3.b Kết quả được trình bàytronghình3.9.

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn KTTPTB của hỗn dịch nano curcumin khuấy với tốc độ15000và18000vòng/phúttrongthờigiankhácnhau(n=3)

Với tốc độ đồng nhấthóa 15000 vòng/phút, sau khoảng 30 phút,h ỗ n d ị c h nano có KTTPTB nhỏ hơn 300 nm Khi tăng tốc độ đồng nhất hóa lên 18000vòng/phút, sự khác nhau về KTTPTB có ý nghĩa thống kê giữa các mẫu hỗn dịchnano khuấy ở các thời điểm khác nhau (p< 0,05) Phân tích post-hoc (kiểm địnhLSD) chothấy:sựkhác nhau giữamẫukhuấy với thời gian 15phút có ýn g h ĩ a thống kê so với các mẫu ban đầu, sau 5 và 30 phút (p< 0,05) Mẫu khuấy tốc độ cao18000 vòng/phút trong 15 phút có KTTPTB nhỏ nhất Do vậy, các mẫu hỗn dịchnano có thể được khuấy với tốc độ 18000 vòng/phút trong 15 phút hoặc 15000vòng/phút trong 30 phút Tuy nhiên, để rút ngắn thời gian khuấy tốc độ cao, tốc độkhuấy 18000 vòng/phút trong 15 phút được lựa chọn để tiến hành các thí nghiệmtiếptheo.

3.3.3 Xác định một số thông số trong quy trình bào chế bột phun sấy chứanano

NGHIÊNCỨUNÂNGQUYMÔBÀOCHẾVÀDỰKIẾNTIÊUCHUẨNCHẤ TLƯỢNG

Với mong muốn nâng cấp quy mô bào chế nhằm tạo điều kiện thuận lợi hơncho việc đưa tiểu phân nano vào các dạng bào chế thích hợp, hệ tiểu phân nanocurcumin tiếp tục được nghiên cứu bào chế ở quy mô 5 g/mẻ Vấn đề khó khăn đầutiên khi nâng cấp lênq u y m ô 5 g / m ẻ l à t h ể t í c h b u ồ n g n g h i ề n h ạ n c h ế , c h ỉ c ó t h ể đưa một lượng nguyên liệu chiếm khoảng 60% dung tích buồng nghiền Vì vậy, mỗimẻ nghiền khô chỉ tiến hành ở quy mô tối đa 5 g/mẻ Một vấn đề khó khăn khác làlựa chọn thiết bị nghiền ướt thích hợp để tiểu phân nano thu được có KTTP phù hợpvà khoảng phân bố KTTP hẹp Dựa trên khảo sát sơ bộ, thiết bị nghiền bi với buồngnghiềnchứa bizirconioxydđượclựachọntronggiaiđoạnnghiềnướt.

Khi nâng cấptừquy môbào chế 1 glên 5g / m ẻ , c á c t h à n h p h ầ n , t ỷ l ệ c á c thành phần trong công thức và một số thông số trong quy trình bào chế có thể đượcthayđổichophùhợp.

3.4.1 Xâydựng công thứcbào chế tiểu phânnano curcumin ởquymô 5gam/mẻ

Hỗn dịch nano được bào chế với các thành phần và tỷ lệ các thành phần tươngtự mẻ 1 g Tuy nhiên, với công thức này, khi chuyển dạng hỗn dịch nano sang bộtphun sấy, bột thu được có hàm ẩm tương đối cao và hiệu suất thấp do bám dínhnhiều vào cyclon Vì vậy, để nâng cao hiệu suất, có thể thay đổi polyme thân nướchoặc kếthợpthêm một số chấtmang Thànhphần hệ tiểuphânn a n o c u r c u m i n ở quymô5g/mẻđượctrìnhbàyởbảng3.34.

Bảng 3.34 Thành phần của bột phun sấy chứa nano curcumin sử dụng các chấtmangkhácnhau

Kết quả xác định KTTPTB, PDI và mất khối lượng do làm khô theo phươngphápmôtảởmục2.3.3.3đượctrìnhbàyởbảng3.35.

Bảng 3.35 Kết quả đánh giá KTTPTB, PDI và mất khối lượng do làm khô của bộtphunsấychứananocurcuminsửdụngcácchấtmangkhácnhau(n=3)

CT KTTPTB(nm) PDI Mất khối lượngdolàmkhô (%)

Khi nâng quy mô bào chế từ 1 lên 5 g/mẻ, KTTPTB và PDI của hệ nano tăng.Đối với mẻ 5 g, khi thay đổi polyme thân nước hoặc thêm chất mang thân nước, hệtiểuphânnanothuđượccóKTTPTBvàPDIhầunhưkhôngthayđổi,chứngtỏsựcó mặtcủacácthànhphầnnàykhôngảnhhưởngđếnKTTPcủahệ tiểuphânnano.

Khi phối hợp với PVA, mặc dù mẫu bột phun sấy có hàm ẩm thấp nhưng saukhoảng 1 tháng bảo quản trong lọ kín, bột dễ bết và hút ẩm nhanh hơn so với nhữngmẫu còn lại Khi kết hợp với manitol, Trehalose hoặc lactose, hàm ẩm và hiệu suấtcủakhốibộtsauphunsấytănglên.Riêngđốivớimẫucóchứamanitol,khố ibộtkhá tơi xốp, thuận lợi cho việc bảo quản và nghiên cứu chuyển dược chất vào cácdạng bào chế thích hợp Do vậy, mẫu nghiên cứu sử dụng chất mang manitol đượclựachọnđểtiếptụckhảosátcácthôngsốtrongquytrìnhbàochếởquymô5g/mẻ.

3.4.2 Khảo sát các thông số trọng yếu, giai đoạn trọng yếu trong quy trình bàochếhệ tiểuphânnanocurcuminquymô5g/mẻ

Trong quá trình nâng cấp từ quy mô bào chế nhỏ lên quy mô bào chế lớn hơn,các giaiđoạn trọngyếu và cácthôngsố kỹ thuật trọngyếutrongt ừ n g g i a i đ o ạ n trìnhbàyởmục2.3.3.2cầnđượckhảosát.

3.4.2.1 Giaiđoạn nghiềnkhô Ở quy mô bào chế nhỏ, curcumin được nghiền khô trong buồng nghiền với biinox kích thước 20 mm Khi nâng cấp lên quy mô bào chế lớn hơn, thiết bị này vẫnđược lựa chọn trong quá trình nghiền khô Tuy nhiên, các thông số của thiết bị baogồmthờigianvàtầnsốnghiềnkhôcầnđượckhảosátcụthể.

Các mẫu curcumin được khảo sát thời gian nghiền khô ở tần số 30Hz tại cácthờiđ i ể m 1 , 2 , 3 , 4 , 5 v à 6 g i ờ K ế t q u ả đ á n h g i á K T T P T B v à k h o ả n g p h â n b ố KTTP bằng thiết bị Mastersizer 3000E như mục 2.3.3.3.b được trình bày ở hình3.15.

Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn KTTPTB và Span của curcumin mẻ 5 gam nghiền khôvớitầnsố30Hztrongthờigiankhácnhau(n=3) Đồ thị ở hình 3.15 cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về KTTPTB giữacác mẫu nghiền khô với thời gian khác nhau (p< 0,05) Sau 6 giờ nghiền, KTTPTBcó sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với các mẫu nghiền khô ở các thời điểm trước 4giờ (p< 0,05) (phân tích

K T T P T B (  m ) Sp an post-hoc-kiểm định LSD) Kết quả chụp hình thái tiểu phânvàxácđịnhKTTPTBsaunghiềnkhô6giờđượctrìnhbàyởphụlục4.1và4.2.

Tần số nghiền là một trong những thông số có thể ảnh hưởng đến kích thướctiểu phân sau khi nghiền Do vậy, quá trình nghiền khô curcumin bằng bi inox đượctiến hành khảo sát trong 6 giờ ở 2 tần số 15 và 30 Hz theo phương pháp bào chế môtả ở mục 2.3.3.1 (quy trình B) Kết quả đánh giá KTTPTB được trình bày ở hình3.16.

Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn KTTPTB và Span của mẫu nghiền khô mẻ 5 gam ở haitầnsố30và15Hztrong6giờ(n= 3)

Kết quả ở hình 3.16 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về KTTPTBgiữa2tầnsốnghiền15và30Hz(p 0,05) Sau khi đồng nhấthóa, cả 2 mẫu đều có KTTPTB nhỏ hơn 500 nm và PDI đều nhỏ hơn 0,55 Do vậy,sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê về KTTPTB khi sử dụng hai loại bi kíchthướckhácnhau.

Nghiền ướt curcumin sử dụng buồng nghiền chứa bi zirconi oxyd trong cáckhoảng thời gian khác nhau với các điều kiện chưa được nghiền khô bằng bi inoxtrước đó và có nghiền khô bằng bi inox 6 giờ Hỗn dịch nano được đồng nhất hóavới tốc độ 18000 vòng/phút trong 60 phút theo phương pháp ghi ở mục 2.3.3.1 (quytrình B) Kết quả đánh giá KTTPTB và PDI sau khi nghiền ướt bằng thiết bịMastersizer3000EvàsauđồngnhấthóabằngthiếtbịZetasizerNanoZ S 9 0 Malvernđ ư ợ c trìnhbàytrongbảng 3.38.

Bảng 3.38 Kết quả đánh giá KTTP của mẫu curcumin mẻ 5 gam ở giai đoạnnghiềnướttầnsố30Hztrongthờigiankhácnhau(n= 3)

6 3,26±0,06 1,90±0,11Kết quả ở bảng 3.38 cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê vềKTTPTBgiữa mẫu có nghiền khô và không nghiền khô (p< 0,05) Đồng thời, ở các mẫu cónghiền khô 6 giờ, sau 4 giờ nghiền ướt, KTTPTB có sự khác biệt có ý nghĩa thốngkê so với các mẫu nghiền ướt với thời gian 1, 2, 3, 5 và 6 giờ (p< 0,05) (phân tớchpost-hoc-kiểm định LSD) KTTPTB giảm xuống 0,96 ± 0,11àm sau 4 giờ nghiềnướt,tuynhiênnếutiếptụcnghiềnKTTPTB lạitănglên.Điềuđócóthểd otrongquá trình nghiền, tiểu phân được phân chia đến một mức độ nào đó nhưng khi nănglượng tự do bề mặt quá lớn, sự kết tụ tiểu phân sẽ diễn ra Kết quả đánh giáKTTPTBvàSpancủamẫunghiềnướtsau4giờđượcthểhiệnởphụlục4.4.

Do vậy, curcumin được nghiền khô trong 6 giờ với thiết bị nghiền bi inox vàtiếptụcnghiềnướttrong4giờvớibizirconioxyd.

Cácmẫucurcuminsaukhinghiềnkhô6giờđượcnghiềnướttrong4giờvớibi zirconi oxyd kích thước 0,8 mm tại 2 tần số 15 và 30Hz theo phương pháp ghi ởmục2.3.3.1(quytrìnhB).KếtquảđánhgiáKTTPTBđượctrìnhbàyởhình3.17.

Hình 3.17.Đồ thị biểu diễn kích thước tiểu phân curcumin mẻ 5 gam trong giaiđoạnnghiềnướtở haitầnsốnghiền15và30Hz(n=3)

Kết quả ở hình 3.17 cho thấy có sự khác biệt về KTTPTB có ý nghĩa thống kêgiữa 2 tần số nghiền 15 và 30 Hz (p< 0,05) Bắt đầu từ thời điểm 2 giờ trở đi,KTTPTB ở tần số 30Hz luôn nhỏ hơn tần số 15Hz Do vậy, tần số 30Hz được lựachọnđểtiếptục khảosát cácthôngsốtiếptheo.

Từcácnghiêncứutiếptheo,curcuminđượcnghiềnkhôvớibiinox,thờigian6 giờ ở tần số 30 Hz và tiếp tục nghiền ướt với bi zirconi oxyd, thời gian 4 giờ ở tầnsố30Hz.

Mẫu sau khi nghiền ướt được pha loãng tạo hỗn dịch và tiến hành đồng nhấthóa theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3.1 (quy trình B) Khảo sát ảnh hưởng củatốcđộvàthờigianđồngnhấthóa.

Khảo sát giai đoạn đồng nhất hóa hỗn dịch nano curcumin trong 60 phút vớitốcđộ18000và22000vòng/phút,nhậnthấysựkhácbiệtkhôngcóýnghĩathố ng

THEO DÕIĐỘỔNĐỊNH

Độ ổn định của hệ tiểu phân nano được nghiên cứu ở hai điều kiện đã mô tả ởmục2.3.4.

Sau 9 tháng bảo quản ở điều kiện thực và 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc,hệ tiểu phân nano curcumin được chụp hình ảnh bằng kính hiển vi điện tử quét. Kếtquảthểhiệnởhình3.24.

Hình 3.24 Hình ảnh chụp SEM của mẫu bột phun sấy chứa nano curcumin và nanocurcumin được rửa loại tá dược sau 9 tháng ở điều kiện thực và 6 tháng ở điều kiệnlãohóacấptốc

Chú thích: (a): bột phun sấy chứa nano curcumin sau 9 tháng ở điều kiện thực; (b):bột phun sấychứanano curcuminsau 6tháng ở điều kiện lãohóa cấptốc; ( c ) : nano curcumin sau 9 tháng ở điều kiện thực; (d): nano curcumin sau 6 tháng ở điềukiệnlãohóacấptốc

Sau mỗi 3 tháng, phân tán hệ nano phun sấy vào nước và xác định KTTP bằngphươngphápghiởmục2.3.3.3.b.Kếtquảthuđượctrìnhbàyởbảng3.46và3.47.

Bảng 3.46 Kích thước tiểu phân nano curcumin sau 9 tháng bảo quản ở điều kiệnthực(n = 3)

Bảng 3.47 Kích thước tiểu phân nano curcumin sau 6 tháng bảo quản ở điều kiệnlãohóacấptốc(n= 3)

PDI 0,354± 0,026 0,362± 0,032 0,352± 0,019Kết quả cho thấy: ở điều kiện thực, sự khác nhau về KTTPTB của tiểu phânnano sau phun sấy và sau 3, 6 và 9 tháng có ý nghĩa thống kê (p< 0,05) Phân tíchpost-hoc (kiểm định LSD) cho thấy: KTTPTB của mẻ 2 và 3 có thay đổi trong9thángởđiềukiệnthựcsovớibanđầu(p0,05).Tươngtự,ởđiềukiệnlãohóacấptốc,sựkhácnhauvề KTTPTB của tiểu phân nano sau phun sấy và sau thời gian theo dõi 3, 6 tháng cóý nghĩa thống kê (p< 0,05) Phân tích post-hoc (kiểm định LSD) cho thấy: KTTPTBcủa mẫu nano sau 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc có sự khác biệt có ý nghĩathốngkêsovớibanđầu(p 80 o C) làm cho bột trơn chảy tốt Bột phun sấy chứa lactosethường có hàm ẩm cao hơn so với bột phun sấy chứa manitol do sự chuyển lactosetừd ạ n g k h a n s a n g d ạ n g m o n o h y d r a t [ 1 7 ] Đ i ề u n à y c ũ n g p h ù h ợ p v ớ i k ế t q u ả nghiêncứuởmục3.4.1.

Bêncạnhcácchấtmangthânnước,cáctádượctrơn(chẳnghạnAerosil)có thể được sử dụng trong giai đoạn phun sấy để làm giảm sự bám dính của bột phunsấy vào bề mặt thiết bị Mặc dù vậy, việc đưa thêm thành phần tá dược chống dínhcó thể làm ảnh hưởng đến kết quả đo KTTP của hệ tiểu phân nano do không táchloạiđượchoàntoànAerosil.

Trong nghiên cứu của luận án, khi thêm manitol vào công thức hỗn dịch trướcphun sấy, bột phun sấy chứa nano thu được có hình thức bên ngoài khá tơi xốp, ít bịbám dính vào cyclon, thuận lợi cho việc đưa vào các dạng bào chế hơn so với hỗndịch không sử dụng manitol Kết quả lựa chọn chất mang này cũng phù hợp với kếtquả nghiên cứu bào chế bột phun sấy chứa nano curcumin trong một số nghiên cứucủa Donsi F và cộng sự [24] hoặc Gao Y và cộng sự [28] hoặc bột phun sấy chứananoitraconazol[17].

Do độ tan của curcumin trong hầu hết các dung môi đều rất thấp, khó có thểlựa chọn dung môi để bào chế hệ tiểu phân nano bằng phương pháp “bottom- up”.Hơnnữ a, d o h ạ n chế c ủ a p h ư ơ n g p h á p nà y khinâ ng cấ p l ên q u y mô5 g /m ẻ , k ỹ thuật “top-down” được lựa chọn Đây cũng là kỹ thuật có triển vọng với nhiều chếphẩm thương mại hóa với ưu điểm tỷ lệ DC cao (tỷ lệ tá dược thấp) [34], [43], [65],[102].

4.2.2.2 Về thiếtbịbàochế Ở quy mô bào chế nhỏ (1 g/mẻ), curcumin được nghiền khô bằng buồngnghiền với bi inox và nghiền ướt thủ công bằng chày cối Với các thiết bị được lựachọn này, tiểu phân nano tạo thành có KTTPTB khoảng 200-300 nm và PDI daođộng rất lớn (từ 0,2 đến 0,6) Để khắc phục nhược điểm của phương pháp này,buồng nghiền với bi zirconi oxyd được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu về bào chếhệ tiểu phân nano Dựa trên cơ sở này, nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano đượctiếnhành theoquytrìnhBtrênquymô 5g/mẻ. Để nâng lên quy mô bào chế lớn hơn, trong giai đoạn nghiền khô, có thể sửdụng thiết bị nghiền chuyên dụng năng lượng cao Tốc độ và hiệu suất nghiền phụthuộc vào tốc độ quay của buồng nghiền, khối lượng và số lượngb i D o đ ó , c á c thiết bị nghiền có tốc độ quay lớn, cự ly thanh nam châm gia tốc lớn sẽ có hiệu quảhơn trong việc nghiền mịn tiểu phân [5] Trong giai đoạn nghiền ướt, có thể sử dụngmột số thiết bị nghiền ướt đặc biệt như thiết bị nghiền ướt gắn rotor-stato Thiết bịnày có thể tạo ra tiểu phân có KTTPTB nhỏ hơn so với các thiết bị nghiền ướt thôngthường [12] Để tăng hiệu suất nghiền và tạo hỗn dịch nano có phân bố KTTP tươngđối đồng nhất, môi trường nghiền thường được bơm tuần hoàn liên tục Đồng thời,việc sử dụng một lượng bi có kích thước khác nhau (không đồng nhất) hoặc quátrình nghiền ở tốc độ cao cũng có thể làm tăng hiệu suất nghiền Trong giai đoạnđồngnhấthóa, cóthểsửdụngphương phápđồngnhấthóaápsuấtcao Để t ránhsinhnhiệt,thiếtbịnghiềnthườngđượctrangbịlớpáolàmmátởngoài[5].Ngoà i ra, để kết hợp phân chia và đồng nhất hóa, hiện nay người ta hay dùng đồng nhất vihóalỏng[5].

VỀĐẶCTÍNHCỦAHỆTIỂUPHÂNNANO

Hệ tiểu phân nano sau khi bào chế có cấu trúc gần hình cầu trong đó curcuminđược phân tán vào bên trong cấu trúc của polyme thân nước PVP PVP nóng chảy,sau đó gel hóa và đông tụ lại tạo cấu trúc hình cầu, “nhốt” tiểu phân curcumin vàotrong Với cấu trúc này, không thể dựa vào sự hấp phụ khí nitrogen lên bề mặt tiểuphân theo thuyết BET để xác định KTTP giống như curcumin nguyên liệu vàcurcumin sau giai đoạn nghiền khô Do có sự tạo phức với PVP, một phần hệ tiểuphân chuyển sang dạng vô định hình Cấu trúc này của hệ tiểu phân nano tương tựnhư cấu trúc của tiểu phân nano raloxifen trong nghiên cứu của Hiep

V P b ằ n g phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao của Rachmawati H và cộng sự, tiểu phânnano tồn tại dưới dạng các đám kết tụ xốp hình cầu, giống như bọt với kích thướckhoảng 400 nm [75] Sự khác nhau này có thể do bản thân nguyên liệu ban đầu cócác đặc tính về kết tinh, hình dạng và kích thước tinh thể khác nhau Trong nghiêncứu của Rachmawati H. và cộng sự, curcumin ở dạng phiến hình dạng không xácđịnh, kích thước không đồng nhất và phân bố kích thước rộng Khi chuyển sangdạng nano, tiểu phân nano có kích thước đồng nhất hơn, phân bố kích thước hẹp.Còn trong nghiên cứu này, curcumin ở dạng tinh thể hình kim, các cạnh sắc và rõ,vớik í c h t h ư ớ c k h á l ớ n K h i b à o c h ế d ư ớ i d ạ n g h ệ t i ể u p h â n n a n o , t r ê n h ì n h ả n h chụp sau khi rửa loại tá dược, không còn thấy sự xuất hiện của các tinh thể hình kimmà chỉ có các tiểu phân có hình dạng gần hình cầu (mục 3.4.3.1) Tuy nhiên, khôngloạitrừkhảnăngsaukhirửaloạitádượcbằngnước,tiểuphânnanocurcumin cóthể bị kết tinh trởlại.Điều này có thể làm cho KTTP tănglênsov ớ i K T T P t r ư ớ c khirửaloạitádược.

Một trong những đặc tính quan trọng của tiểu phân nano là kích thước tiểuphânDC.Kíchthướctiểuphâncủahỗndịchnanocóthểđượcxácđịnhbằngnhiều kỹ thuật phân tích khác nhau như nhiễu xạ laze, phổ tương quan photon (tán xạlaze),đếmtiểuphânvàkínhhiểnviđiệntử quét.

KTTP của hỗn dịch nano thu được bằng phương pháp nhiễu xạ laze và phổtương quan photon không giống nhau vì KTTP đo bằng phương pháp nhiễu xạ lazedựa trên thể tích và đường kính trung bình, còn phổ tương quan photon biểu diễndướid ạ n g k í c h t h ư ớ c t h e o c ư ờ n g đ ộ á n h s á n g K í c h t h ư ớ c t i ể u p h â n đ o b ằ n g phương pháp nhiễu xạ laze thường cao hơn so với phương pháp tương quan photon.Theo nhận định của Sepassi S và cộng sự, nếu sử dụng kỹ thuật nhiễu xạ laze,KTTP xác định được cao gấp đôi so với kết quả thu được nếu sử dụng phương phápphổ tương quan photon [85] Phương pháp đếm tiểu phân cho số lượng chính xáctiểup h â n t r ê n m ộ t đ ơ n v ị t h ể t í c h đ ố i v ớ i t ừ n g n h ó m t i ể u p h â n k í c h t h ư ớ c k h á c nhau, kỹ thuật này hiệu quả và thích hợp hơn so với phân tích nhiễu xạ laze trongviệc xác định số lượng tiểu phân kích thước micro trong hỗn dịch nano [70] Tuynhiên, phương pháp nhiễu xạ laze có thể xác định khoảng KTTP rộng với giá trịtrung bình trong khoảng nano, thao tác nhanh, dễ thực hiện, chính xác và giá trịtrung bình thu được từ phương pháp nhiễu xạ laze thường chính xác trong khoảngnano.

Căn cứ vào một số ưu, nhược điểm nhất định của các phương pháp xác địnhKTTP kết hợp với điều kiện trang thiết bị hiện có, nghiên cứu của luận án lựa chọnphương pháp xác định KTTP trong giai đoạn nghiền khô và nghiền ướt bằng nhiễuxạ laze Còn trong giai đoạn đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn, KTTP được xácđịnhbằngphươngpháptánxạ laze. Để chuẩn bịmẫu, trong phương phápnhiễuxạ laze,mẫu thử cầnđ ư ợ c p h â n tán trong môi trường đến mức độ che mờ chấp nhận được để xác định KTTP. Trongphươngpháptá nxạ laze, mẫ ut hử đ ư ợ c p ha l o ã n g saocho tố c độđ ế m tiểup h ân nằm trong khoảng 150-250 kcps Nếu tốc độ đếm tiểu phân quá thấp, độ tin cậy củakết quả đo KTTP thấp, còn nếu tốc độ đếm tiểu phân cao, có thể xảy ra hiện tượngđa tán xạ, ảnh hưởng đến kết quả đo Để tránh kết tụ tiểu phân, mẫu thử trong quátrình nghiền khô được phân tán trong nước chứa Tween 80 với nồng độ thấp 0,1%.Đốivớim ẫ u t h ử t r o n g gi ai đ o ạ n n g h i ề n ư ớ t , g ia iđ o ạ n đ ồ n g n h ấ t h ó a v àb ột t h u được sau phun sấy chứa nano curcumin, thực nghiệm cho thấy: nano curcumin phântán nhanh và không bị kết tụ trong môi trường nước khi phân tán Do đó, mẫu thửđược chuẩn bị bằng cách pha loãng hỗn dịch hoặc phân tán bột phun sấy chứa nanocurcumin trong môi trường nước Một số nghiên cứu còn tiến hành pha loãng mẫuthử trong môi trường bão hòa hoàn toàn hoặc bão hòa một phần để xác định KTTP[102] Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, KTTP của nano curcumin không bị ảnhhưởng bởi môi trường pha loãng nên nghiên cứu lựa chọn môi trường phân tán lànước.

KếtquảxácđịnhKTTP cóthểbiểudiễndưới dạngphânbốKTTPtheothể tích hoặc theo khối lượng Từ các thông số về KTTP, trung bình momen thể tíchđược lựa chọn vì đặc tính nhạy với sự có mặt của các tiểu phân kích thước lớn trongmẫu và cho biết có bất kỳ tiểu phân có kích thước lớn nào tồn tại trong hỗn dịchnano thậm chí khi số lượng tiểu phân nhỏ, nhưng khối lượng của các tiểu phân cũngtươngđốilớn.

Việcsosánh vềKTTPgiữa cácnghiêncứukhácnhaukhôngchỉphụthuộ cvào phương pháp sử dụng để xác định KTTP mà còn phụ thuộc vào thông số quanghọc lựa chọn Khi thay đổi thông số quang học, KTTP và PDI có thay đổi Đồngthời, nếu mẫu có mặt tiểu phân kích thước nhỏ và kỹ thuật phân tích tiến hành trongchếđ ộ đ o K T T P c h ỉ t h í c h h ợ p v ớ i t i ể u p h â n k í c h t h ư ớ c n h ỏ , s ự c ó m ặ t c ủ a t i ể u phân có kích thước lớn hơn không thể phát hiện được Vì vậy, giữa các nghiên cứukhác nhau hoặc thậm chí giữa những lần thực nghiệm khác nhau, KTTP và PDI cóthểkhácnhaudonhiềunguyênnhânchưarõràng[49].

Kếtquảnghiêncứucủaluậnánchothấy:hệtiểuphânnanothuđượcởquym ô bào chế 5 gam/mẻ có đặc tính về KTTPTB và PDI trước phun sấy và sau phântánkhoảng300-500nm,PDI0,30- 0,55,caohơnsovớimẫubàochếởquymônhỏ

1gam/mẻ(mục3.4.3.2).Sovớikếtquảnghiêncứubàochếhỗndịchn a n o curcumin củaGao Y và cộng sự, tiểu phân nano thu được có kích thước tiểu phânxác định bằng phương pháp phổ tương quan photon khoảng 210,2 nm [29] Trongnghiên cứu củaRachmawati H và cộng sự, tiểu phân nano curcumin có kích thướctiểuphânkhálớn(500-700nm)xácđịnhbằngphươngphápphổtươngquanphoton với thông số quang học khác với nghiên cứu này (hệ số phản xạ 1,5) [75]. Trongnghiên cứu của Shaikh J và cộng sự, KTTPTB của nano curcumin khoảng

Qua phân tích ở trên có thể thấy phương pháp tán xạ laze không thích hợp khiphân tích mẫu chứa cả các tiểu phân kích thước lớn và nhỏ Khi xác định KTTP củamẫu chứa tiểu phân kích thước lớn hơn ở giới hạn micro, có thể sử dụng thiết bịMastersizer 3000E hoặc kỹ thuật SEM Thực tế, các tiểu phân có kích thước tươngđốilớnhơnđượcquansátbằngkỹ thuậtSEM.Dođó,KTTPđượcphântí chkếthợpbằngcả haikỹthuậttánxạlazevà chụpSEM.

Khi đưa giá trị KTTP, một thông số quan trọng đi kèm là hệ số đa phân tánPDI Giá trị PDI cho biết độ ổn định vật lý của hỗn dịch nano và hệ số này càngthấp, hỗn dịch nano càng ổn định Trong nghiên cứu này, tiểu phân nano bào chếđược có khoảng phân bố kích thước tiểu phân khá lớn Đây cũng là nhược điểm củaphương pháp phân chia tiểu phân đến kích thước nano đi từ tiểu phân kích thướclớn.

4.3.3 Phổnhiễuxạtia Xvàgiảnđồnhiệtvi saicủahệtiểuphân nano Đối với một số DC, quá trình chuyển sang dạng tiểu phân kích thước nano cóthể làm thay đổi trạng thái kết tinh hoặc tạo dạng đa hình Kết quả của nghiên cứu ởmục 3.4.3.4 cho thấy: khi chuyển sang dạng nano, curcumin vẫn tồn tại ở trạng tháikếttinhnhưngtỷlệ kếttinhđãgiảmđisovớibanđầu.

Nhằm xác định rõ hơn các đặc tính kết tinh của curcumin như đặc tính chuyểnphasangtrạngtháithủytinh,điểmkếttinhvàđiểmnóngchảy,phươngphá pgiảnđồ nhiệt vi sai được lựa chọn Bên cạnh việc xác định trạng thái vật lý của DC,phương pháp này cũng có thể sử dụng để xác định tương tác dược chất-tá dược cóthể xảy ra trong quá trình bào chế Sự xuất hiện các pic lạ hoặc sự dịch chuyển picthu nhiệt của curcumin trên giản đồ nhiệt vi sai có thể xảy ra khi có mặt các tá dượckháctrongcôngthứcbàochế Theokếtquảg i ả n đồnhiệtvi saitrìnhbàyở m ục

3.4.3.4 có thể thấy sự dịch chuyển pic thu nhiệt và sự giảm enthalpy nóng chảy.Điều này xảy ra có thể do hiệu ứng dung môi của PVP trong quá trình cung cấpnhiệt.Picthunhiệttươngứngđiểmnóngchảylàpictạobởiphầncurcuminkhông tạo phức, chứng tỏ dạng kết tinh của curcumin vẫn còn tồn tại trong hệ tiểu phân.Kếtquảnàyphùhợpvớinhậnđịnhcủamộtsốtácgiảkhinghiêncứuvềhệphâ ntán rắn chứa PVP [45] và cũng phù hợp với kết luận rút ra từ hình ảnh phổ nhiễu xạtia X ở trên Ngoài pic thu nhiệt, trên giản đồ nhiệt vi sai của hệ tiểu phân nanocurcumincòn có m ộ t p i c ở nhiệtđộ 57, 4 o Cd o sự c ó mặtcủ an ướ c trong hệ t i ể u phânvàmộtpicở128,2 o Cdohiệuứngchuyểnpha.

Nguyên tắc của phương pháp dựa trên sự hấp phụ chất khí lên bề mặt hoặc vàotrong cấu trúc của tiểu phân rắn bằng hấp phụ vật lý hoặc hóa học Khi tiểu phâncurcumin được phân chia đến kích thước nhỏ nhất định, tổng diện tích bề mặt tăng,dođódiệntíchbềmặttheothuyếtBETtăng.

Sau giai đoạn nghiền khô, tiểu phân curcumin có KTTP giảm và diện tích bềmặt tăng Kết quả đánh giá diện tích bề mặt theo thuyết BET ở mục 3.4.2.1 cho thấydiện tích bề mặt tăng lên khoảng gấp 5 lần Thực tế, quá trình phân chia tiểu phântrong giai đoạn nghiền khô thành các tiểu phân kích thước nhỏ hơn làm tăng nănglượng tự do bề mặt tiểu phân. Các tiểu phân có xu hướng bị kết tụ với nhau ở trạngtháirắn,dovậy,diệntíchbềmặtxácđịnhđượccóthểkhôngcònchínhxác.

VỀĐỘỔNĐỊNH

Bàochếđượchệtiểuphânnanovớicácđặctínhmongmuốn đãkhónhưngg iữ được ổn định những đặc tính ấy trong thời gian bảo quản còn khó hơn nhiều.Trong nghiên cứu của luận án, độ ổn định của hỗn dịch nano chỉ được theo dõi sau24 giờ sau khi bào chếvì hỗn dịch được chuyểns a n g d ạ n g b ộ t p h u n s ấ y n g a y s a u đó.D ođ ó , n g h i ê n c ứ u c h ỉ đá n h g iá đ ộ ổ n đ ị n h của b ộ t p h u n sấ ychứat i ể u p h â n nanodướitácđộngcủacácyếutốmôitrường(nhiệtđộ,độẩm)cũngnhưcácyếu tốt h u ộ c v ề c h ế p h ẩ m t h u ố c ( t í n h c h ấ t h ó a l ý c ủ a D C v à t á d ư ợ c , d ạ n g b à o c h ế , thành phần, quy trình bào chế,mức độ kínv à b ả n c h ấ t c ủ a b a o b ì đ ó n g g ó i t r ự c tiếp).

Về bao bì đóng gói, nếu lựa chọn lọ thủy tinh kín và tránh ánh sáng, hệ tiểuphân nano sẽ ổn định Tuy nhiên, với mục đích đánh giá độ ổn định dưới tác độngcủa các yếu tố trên, hệ tiểu phân nano được đóng trong vỏ nang cứng, ép vỉ nhôm-nhôm,đựngtronghộpgiấyvàtheodõiởhaiđiềukiệnlãohóacấptốc(nhiệtđộ40 ± 2 o C, độ ẩm 75 ± 5%) trong 6 tháng và điều kiện thực (nhiệt độ 15-35 o C, độ ẩm60-90%)trongthờigian9tháng.

Về hàm lượng curcumin, mỗi viên nang chứa khoảng 40 mg curcumin, tươngứng với khối lượng bột phun sấy chứa hệ tiểu phân nano curcumin khoảng 94,8 mg.So với một số chế phẩm chứa nano curcumin trên thị trường, hàm lượng curcumintrong mỗi viên nang trong nghiên cứu của luận án cao hơn Chế phẩm Curma Goldchứa 150 mg nano curcuminoid, trong đó curcuminoid chiếm khoảng 20%. HàmlượngcurcuminthựctếtrongviênnangmềmCumarGoldchỉkhoảng23mg.

Kết quả của nghiên cứu ở mục 3.5 cho thấy: bột phun sấy chứa tiểu phân nanoổn định về mặt hình thái, KTTP, đặc tính kết tinh, mất khối lượng do làm khô,hàmlượng curcumin và độ hòa tan trong thời gian theo dõi Như vậy, bột phun sấy chứatiểu phân nano curcumin có thể được đóng trong viên nang cứng và đựng trong baobìvỉnhôm-nhômvàhộpgiấy.

VỀĐÁNH GIÁSINHKHẢDỤNGCỦAHỆ TIỂUPHÂNNANO CURC UMIN

Một số nghiên cứu SKD đường uống của curcumin được tiến hành trên chuộtcống[39],[42],[55],[87]hoặcchuộtnhắt[30],[32],[76],[111].

Tại Việt Nam, chuột cống thí nghiệm thường có sự sai khác giữa các cá thể rấtlớn về khối lượng, chế độ nuôi dưỡng, tình trạng sức khỏe và tuổi Do đó, mặc dùenzym chuyển hóa trên chuột cống giống với người nhưng kết quả khảo sát tiếnhành xác định nồng độ curcumin sau khi uống trên một số chuột cống cho thấy sựhấpthucurcumin khác nhaukhá lớngiữa cáccáthểvàgiữa các lầnthửnghiệ m.Mặt khác, chuột nhắt là đối tượng có sự đồng nhất về cá thể rất lớn về tuổi, chế độnuôi dưỡng và tình trạng sức khỏe Chuột nhắt có khối lượng cơ thể nhỏ hơn nhiềuso với chuột cống Trong điều kiện thực nghiệm, nghiên cứu lựa chọn đối tượng thửlàchuộtnhắt.

Về thời điểm lấy mẫu, nghiên cứu của luận đã khảo sát các thời điểm lấy mẫuthích hợp tại 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 60, 120, 240 và 360 (hoặc 420 phút).Dochuộtnhắtkhánhỏnênkhôngthểlấy máunhiềulầntrêncùngmộtcáthể.Đồng thời,sau kh ilấ y máu, s ứ c kh ỏec hu ột kh ôn gcò nt ốt Do đó, m ỗ i c h u ộ t đư ợc lấ y máumộtlầntạimộtthờiđiểm.

Về mô hình ngăn, một số nghiên cứu dược động học của curcumin không dựatrên mô hình ngăn tiến hành trên chuột cống [46], [52], [91] hoặc chuột nhắt [30],[76], hoặc dựa trên mô hình một ngăn trên chuột cống [110] hoặc chuột nhắt [32],[111] Trong nghiên cứu này, do mỗi chuột được lấy máu tại một thời điểm và mỗithời điểm 6 chuột nên có thể xử lý số liệu trên một nhóm cá thể Việc tính toán cácthông số dược động học trên nhóm chuột uống hỗn dịch quy ước và hỗn dịch nanokhông dựa trên mô hình ngăn với một nhóm các cá thể, tương tự như nghiên cứudánhgiáSKDcủahỗndịchnanođượctiếnhànhbởiGaoY.vàcộngsự [30]. Đểtínhtoáncácthông sốdượcđộnghọcliên quanđếnchuyểnhóa,nghi êncứu sử dụng mô hình một ngăn có chuyển hóa trên quần thể So với mô hình cá thể,mô hình dược động học quần thể có nhiều ưu điểm nổi trội do chỉ cần lấy một sốlượngítmẫutrênmỗicá thể,cóthểphânbiệt đượcsựsaikháctrongmộtcá th ểhoặc giữa các cá thể Tuy nhiên, mô hình này cũng có nhược điểm cần số lượng lớncá thể (thường lớn hơn 40), phân tích thống kê dược động học phức tạp [16] Do sốlượngcáthểtrongmỗinhómtươngđốiítnênsốliệuthuđượckhôngđủđểđánh giá các thông số dược động học dựa trên mô hình dược động học quần thể hai ngănvà ba ngăn Vì vậy, nghiên cứu chỉ xác định các thông số dược động học dựa trênmôhìnhmộtngăncóchuyểnhóa. Đối với DC ít tan, thức ăn cùng với môi trường sinh lý tạo ra ở trạng thái nocộng với thời gian lưu trung bình trong đường tiêu hóa tăng thường làm tăng SKDcủa thuốc Ngược lại, SKD ở trạng thái đói thường thấp do sự vắng mặt của các tácnhân làm tăng độ tan có mặt trong thức ăn và dịch mật Tuy nhiên, khi DC ít tanđượcthiếtkếdướidạnghệphântánđồngnhấtcủacáctiểuphânkíchthướcnano, sự sai khác về SKD do trạng thái no hoặc đói có thể được giảm đến mức tối thiểu[17].Vìvậy,nghiêncứunàytiếnhànhthửtrênchuộtởtrạngtháiđói.

Y và cộng sự, liều dùng trên chuột nhắt khoảng 250 mg/kg cân nặng [30]. Trongnghiêncứ uc ủaZ ho ng fa L vàc ộn gsự , n hũ tương nan oc u r c u m i n đ ư ợ c đá nh gi á

SKD trên chuột nhắt với liều khá cao 1,8 g/kg [115] Trong nghiên cứu của luận án,mứcliềuđượclựachọnlà500mg/kg.

Theo tài liệu tham khảo kết hợp với thực nghiệm, vị trí lấy máu trên chuột cóthể ở tĩnh mạch đuôi, hốc mắt hoặc tĩnh mạch cổ Máu lấy tại tĩnh mạch đuôi hơi ít(nhỏ hơn 250l) thường không đủ để xử lým ẫ u v à k h ô n g t h ể l ấ y n h i ề u l ầ n t r ê n một cá thể Tại hốc mắt, có thể lấy mẫu qua ống vi mao quản đặt vào phía dưới vàtrong củam ắ t v à n h ẹ n h à n g t r ư ợ t n h ẹ d ọ c t h e o n h ã n c ầ u đ ế n v ù n g đ á m r ố i t ĩ n h mạch thẳng hàng với ổ mắt Phương pháp này có ưu điểm hơn so với phương pháplấy máu tại tĩnh mạch đuôi vì dễ thực hiện và có thể lấy được thể tích máu lớn trongthời gian ngắn (10-20 giây), thao tác nhanh, phù hợp với các thời điểm lấy mẫu củanghiên cứu Ngoài ra, việc lấy mẫu có thể thực hiện qua một kim nhỏ gắn với ốngđặtvàotĩnhmạchcổ[93].Máulấytạivịtrínàythườngchứanhiềuhuyếtcầu.

Dựa trên cơ sở phân tích trên, vị trí lấy máu tại vùng tĩnh mạch hốc mắt phùhợp hơn cả do các thời điểm lấy mẫu của nghiên cứu khá gần nhau Tuy nhiên, saukhi mắt bị thương, nếu tiếp tục lấy máu lần tiếp theo để định lượng nồng độ DCtrong huyết tương thường kết quả không còn chính xác vì sau khi bị tổn thương, cơchế sinh lý của cơ thể rất phức tạp, không dự đoán được Đồng thời, nếu lấy máutrên cùng cá thể, khoảng cách giữa hai lần lấy mẫu cần được khảo sát để vừa đảmbảo đánh giá được xu hướng hấp thu của DC vừa đảm bảo đủ thời gian để máu bồihoàn Hơn nữa, sức khỏe của chuột sau một lần lấy máu với lượng máu mỗi lầnkhoảng 500-600l không còn tốt Vì vậy, trong nghiên cứu của luận án, máu đượclấytạichỉmộtthờiđiểmtrênmỗichuột.

Quá trình chiết DC từ dịch sinh học có thể thực hiện bằng phương pháp chiếtlỏng-lỏng, chiết pha rắn hoặc tủa protein trong huyết tương Tuy nhiên, nếu chiếtpha rắn cần phải có các cột chứa chất mang tương đối đắt tiền Thể tích huyết tươngmỗil ầ n p h â n t í c h k h á n h ỏ ( 1 0 0l)v à h à m l ư ợ n g c u r c u m i n v à c h ấ t c h u y ể n h ó a THC thấp Nếu dùng phương pháp tủa protein, protein huyết tương có thể kéo theoDC làmgiảmnồngđộDCtrongmẫu.Đồngthời,nếutủa protein,nềnmẫucònchứa nhiều tácnhân gây hiệu ứng nền khi đồng rửa giải, làm cản trở khảnăng ionh ó a của chất cần phân tích ở nguồn ion hóa, ảnh hưởng đến tín hiệu thu được.

Vì vậy,trong trường hợp này, mẫu huyết tương được xử lý bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng và lựa chọn dung môi chiết sao cho quá trình chiết đạt hiệu suất cao nhất. Sovới kỹ thuật chiết pharắn, kỹ thuật chiết lỏng –lỏng bằngdungm ô i h ữ u c ơ đ ơ n giản, không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt, dễ dàng triển khai tại nhiều phòng thínghiệm, mang lại hiệu quả kinh tế cao khi áp dụng trong các nghiên cứu phải phântích một số lượng lớn các mẫu huyết tương Dịch chiết với nồng độ chất cần phântích khá thấp được cô bốc hơi dung môi và hòa tan trở lại trong một thể tích nhỏdung môi pha động (100l) để cô đặc mẫu, làm tăng nồng độ DC trong mẫu địnhlượng, thuận lợi cho việc phân tích So với các dung môi chiết đã khảo sát là ethylacetat, hỗn hợp diethylether-cloroform, việc xử lý mẫu bằng phương pháp chiếtlỏng-lỏng với dung môi tert-butyl methyl ether cho nền mẫu sạch, tỷ lệ thu hồi CURvà THC trong huyết tương cao và ổn định Tuy nhiên, hiệu suất chiết chất chuẩn nộicònhơithấp.

Trên người tình nguyện và chuột thí nghiệm, curcumin sau khi hấp thu quađường uống sẽ bị chuyển hóa mạnh qua gan tạo thành nhiều sản phẩm chuyển hóanhư tetrahydrocurcumin, curcumin glucuronid, tetrahydrocurcumin glucuronid. Vìvậy,việc xác định nồng độ chất chuyển hóa của curcumin có ý nghĩa trong việcđánhgiáhiệuquảđiềutrịcủa DCtrênlâmsàng.

Thực tế, phần lớn các nghiên cứu đánh giá SKD của curcumin trên thế giới chỉtiến hành định lượng curcumin trong huyết tương [40], [52], [87] Một số ít nghiêncứu định lượng cả curcumin và chất chuyển hóa trong huyết tương Trong nghiêncứu của Zhongfa L và cộng sự, nhũ tương nano curcumin được đánh giá SKD trênchuộtn h ắ t S a u k h i u ố n g l i ề u 1 , 8 g / k g c h u ộ t , c á c c h ấ t c h u y ể n h ó a c h í n h c ủ a curcumin là curcumin-O- glucuronid, THC và curcumin-O-sulfat có thể phát hiệntrong huyết tương chuột nhắt [115] Để định lượng được các sản phẩm chuyển hóadạngliênhợpphảicóchấtchuẩnhoặcphảidùngenzymβ- glucuronidasevàsulfataseđểchuyểndạngliênhợpvềdạngtựdo[19],[55],

[105].Việcphảithực hiện phản ứng thủy phân trước khi phân tích không những phức tạp, tốn thời gianmà còn có thể ảnh hưởng đến độ đúng, độ chính xác của phương pháp phân tích dohiệu suất của phản ứng phụ thuộc vào nhiều yếu tố Trong điều kiện hiện có, nghiêncứu của luận án đã tiến hành định lượng đồng thời curcumin và sản phẩm chuyểnhóa THC, chưa định lượng được một số dạng liên hợp của curcumin trong huyếttương Đây cũng là một trong những nguyên nhân dẫn đến kết quả định lượngcurcumintronghuyếttươngkháthấp.

4.5.1.5 Phương pháp phân tích curcumin trong huyết tương bằng phương phápLC-MS/MS

Curcumin có SKDthấp, bị chuyển hóamạnh thành THC. Mặtkhác,m ẫ u huyếttươnglạicónhiềuthànhphầntạpchấtnênviệcphântích,địnhlượngc urcumin và chất chuyển hóa THC trong huyết tương chuột gặp khó khăn hơn nhiềuso với phương pháp phân tích trong chế phẩm thuốc. Thể tích huyết tương mỗi lầnxử lý mẫu chỉ khoảng 100l Nồng độ DC lại khá thấp nên phương pháp phân tíchđòi hỏi độ nhạy cao Vì vậy, kết hợp nguyên lý tách các DC bằng cột UPLC với cácưu điểm nổi bật của phương pháp phân tích phổ khối như độ đặc hiệu-chọn lọc, độnhạy tốt, phương pháp LC-MS/MS nghiêncứu trong luận án đãp h â n t í c h đ ư ợ c đồng thời CUR và THC trong huyết tương ở nồng độ rất thấp (tới 0,5 ng/ml) với độđúng, độ chính xác cao Phương pháp định lượng này cũng có ưu điểm phát hiệnđồng thời CUR và THC trong huyết tương mà không cần yêu cầu hai pic phải táchkhỏi nhau So với phương pháp HPLC của Ji H, và cộng sự [42], Shaikh J và cộngsự [87], phương pháp LC-MS/MS củaWangX M v à c ộ n g s ự [ 1 0 5 ] , C a o Y v à cộng sự[14], giới hạn định lượng dưới của phương pháp này thấp hơn nhiều (0,5ng/ml), cho phép xác định được nồng độ DC trong các mẫu huyết tương chuột ở xathời điểm dùng thuốc, ứng dụng phù hợp trong các nghiên cứu SKD Ngoài ra,phương pháp phân tích trong luận án sử dụngUPLC kết nối với đầu dò khối phổ cóthời gian phân tích ngắn, thích hợp cho việc phân tích mẫu có thể tích nhỏ (100l)vàsốlượngmẫulớntrongcácnghiêncứuSKD.Bên cạnh các ưu điểm trên, việc sử dụng chuẩn nội còn làm giảm thiểu sai sốtrongquátrìnhphântích,đảmbảotínhchínhxácvàđộtincậy.Thựctế,việcphân tích DC trong dịch sinh học không trực tiếp xác định được chất phân tích trong mẫumà chỉ có thể xác định được DC sau khi đã xử lý mẫu, chiết tách DC khỏi mẫu dịchsinh học Quá trình chiết tách này gồm nhiều giai đoạn và độ thu hồi DC phụ thuộcvào nhiềuyếu tố Dovậy, việc sử dụng chuẩn nội trong phươngp h á p p h â n t í c h trong dịch sinh học là cần thiết Chuẩn nội được pha loãng trong hỗn hợp dung môimethanol: nước (1:1) nhằm giảm tỷ lệ methanol, tránh làm kết tủa huyết tương khiphốihợp.

Kết quả thẩm định cho thấy: phương pháp phân tích CUR và THC trong huyếttương có tính thích hợp, tính đặc hiệu, độ tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, ảnhhưởng của nền mẫu, nhiễm chéo, độ đúng, độ lặp lại trong ngày và khác ngày và độổn định đáp ứng được các yêu cầu chung của FDA về thẩm định phương pháp phântíchtrongdịchsinhhọc.

Hiện nay trên thị trường, phần lớn các chế phẩm “nano curcumin” chứa thànhphần hoạt chính là curcuminoid phối hợp với piperin Curcuminoid là hỗn hợp bathành phần trong đó curcumin chiếm khoảng 77% Mặt khác, do sự có mặt củapiperin nên SKD đượcc ả i t h i ệ n D o đ ó , n h ữ n g c h ế p h ẩ m n à y k h ô n g t h ể s ử d ụ n g làm chế phẩm đối chiếu Một số chế phẩm bột phun sấy nano curcumin chứa DCchính là curcumin Tuy nhiên, khi đánh giá KTTP trên thiết bị đo Zetasizer NanoZS90 Malvern và hình ảnh chụp SEM, KTTPTB của cácm ẫ u n à y k h á l ớ n ( t r ê n 1000 nm) Vì vậy, trong nghiên cứu này, hỗn dịch quy ước bào chế từ nguyên liệucurcuminbanđầuđượclựachọnlàchếphẩmđốichiếu.

Do curcumin làmộtDC ít tan trong nước,khi dùng đường uống,c u r c u m i n khó phân tán vào trong lớp dịch nhày và có thể bị kết tụ thành mảng lớn trong môitrường nước, do đó SKD thấp [92] Trong nghiên cứu này,curcumin được phân tántạo hỗn dịch quy ước trong môi trường phân tán chứaCMC 0,2% để đảm bảo cáctiểu phân đều được gây thấm và phân tánđồng đều trongm ô i t r ư ờ n g p h â n t á n Đồngthời,hỗndịchđượckhuấytừ liêntụctrongthờigianchochuộtuống.

Nghiên cứu SKD của hỗn dịch nano curcumin đã được tiến hành trên chuộtnhắt bởi Gao Y và cộng sự dựa trên hai nhóm chuột, mỗi nhóm gồm 27 chuột [30].So sánh với nghiên cứu của Gao Y và cộng sự, trong nghiên cứu này, số lượngchuột,sốthờiđiểmlấymẫuvàsốmẫulấytạimộtthờiđiểmnhiềuhơn.

ĐÓNGGÓP MỚI CỦALUẬNÁN

- Đã nghiên cứu xây dựng được công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phânnano curcumin bằng phương pháp giảm kích thước tiểu phân sử dụng kỹ thuậtnghiền bi siêu mịn kết hợp với đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn Phương phápbào chế đơn giản, dễ dàng áp dụng, có thể ứng dụng trong điều kiện thực tiễn ở ViệtNam.

- ĐãxâydựngđượcmôhìnhđánhgiáSKDcủabộtphunsấychứahệtiểuphânnanocurcumi ndùngđườnguốngtrênchuộtthínghiệm.Môhìnhđánhgiánàykhảthivà có thể áp dụng cho các nghiên cứu đánh giá SKD đường uống của hệ tiểu phânnano Phương pháp đánh giá SKD dựa trên việc định lượng đồng thời chất gốccurcumin và chất chuyển hóa tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột bằng kỹthuật LC-MS/MS lần đầu tiên được xây dựng và thẩm định tại Việt Nam Đây làphươngphápphântích đủđộnhạy,đặchiệuđểxácđịnhnồngđộcácchấttrongdịchsinhhọcvớinồngđộthấp(cỡng/ ml).Kếtquảcủaphươngphápphântíchcóthểứng dụng trong các nghiên cứu dược động học của curcumin trên động vật thínghiệm,tạotiềnđềchocácnghiêncứudượcđộnghọccủacurcumintrênngười.Dựatrênkếtquảt hựcnghiệmcủamôhìnhnày,cóthểkếtluậnhệtiểuphânnanobào chếđược đã cải thiện sinh khả dụng đường uống của curcumin do làm tăng độ tan, tốcđộ hòa tan và tính thấm của curcumin Đồng thời, dựa trên cơ sở đó, nghiên cứu đãxác định được hằng số tốc độ chuyển hóa của chất gốc curcumin sang chất chuyểnhóat e t r a h y d r o c u r c u m i n t r ê n c h u ộ t t h í n g h i ệ m d ự a t r ê n m ô h ì n h d ư ợ c đ ộ n g h ọ c quầnthểmộtngăncóchuyểnhóa.

Trong nội dung thực nghiệm của đề tài, đã bào chế được hệ tiểu phân nanocurcumin 5 g/mẻ với công thức bào chế: curcumin 5,00 g, Tween 80 0,60 g, PVPK303,75g,manitol2,50gvànướctinhkhiết125ml.

Hỗn dịch nano được bào chế bằng phương pháp giảm kích thước tiểu phân sửdụngkỹthuậtnghiềnbisiêumịnkếthợpvớiđồngnhấthóanhờlựcphâncắtlớn với các thông số: thời gian nghiền khô 6 giờ, tần số nghiền khô 30 Hz sử dụngbuồng nghiền bi inox, thời gian nghiền ướt 4 giờ, tần số nghiền ướt 30 Hz sử dụngbuồngnghiềnbizirconioxyd,kíchthướcbi0,8mm,đồngnhấthóa18000vòng/ phúttrong 60phút Hỗn dịch nano được phun sấy với nhiệtđ ộ k h í v à o

Hệ tiểu phân được duy trì ở dạng bột phun sấy với KTTPTB khoảng 336,7 ±18,6 và PDI 0,387 ± 0,032, trong đó curcumin phân tán trong chất mang PVP. Tiểuphân nano tồn tại một phần ở dạng kết tinh với tốc độ hòa tan cải thiện đáng kể sovới nguyên liệu ban đầu Dạng bột phun sấy có tỷ lệ mất khối lượng do làm khôkhoảng 9,35% và khối lượng riêng biểu kiến khoảng 0,329 ± 0,024 g/ml Hệ tiểuphân nano nghiên cứu ổn định về hình thái, KTTP, đặc tính kết tinh, mất khối lượngdo làm khô, hàm lượng curcumin và độ hòa tan curcumin trong 9 tháng ở điều kiệnthựcvà 6thángởđiềukiệnlãohóacấptốc.

Việc đánh giá SKD của thuốc nghiên cứu trên chuột thí nghiệm đã chứng tỏ hệtiểu phân nano có khả năng cải thiện SKD của curcumin Kết quả nghiên cứu bướcđầu này cũng chứng minh được có sự chuyển hóa từ chất gốc curcumin sang chấtchuyểnhóatetrahydrocurcumintrênchuộtdùngđườnguống. ĐỀXUẤT

- Hoànthiệnquytrìnhbàochếhệtiểuphânnanocurcumin,nângquymôlô mẻ, hướngtớisảnxuất nguyênliệunanoứngdụngtrongcácdạngbàochế.

1 Dương Thị Hồng Ánh, Nguyễn Đình Hà, Nguyễn Trần Linh (2015), “Tối ưuhóa công thức và một số thông số trong quy trình bào chế tiểu phân nanocurcumin”, Tạp chí Nghiên cứu Dược và thông tin thuốc, tập 6, số 2, trang 2-5.

2 Dương Thị Hồng Ánh, Thái Thị Hồng Anh, Nguyễn Văn Long, Nguyễn TrầnLinh (2016), “Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano curcumin quy mô 5gam/mẻ”, Tạp chí Nghiên cứu Dược và thông tin thuốc, tập 7, số 6, trang 28-33.

3 Dương Thị Hồng Ánh, Hoàng Văn Đức, Lê Thị Thu Huyền, NguyễnVănLong, Nguyễn Trần Linh (2017), “Nghiên cứu xây dựng và thẩm định phươngphápLC-MS/MSđịnhlượngđồngthờicurcuminvàchấtchuyểnhóatetrahy drocurcumin trong huyết tương chuột”, Tạp chí Dược học, tập 57,số492,trang50-52và73.

2 Phạm Ngọc Bùng, Lê Thị Thu Trang (2014), "Hấp phụ và chất hoạt động bềmặt",HóalýDược,tr.257-260.

3 Phạm Thị Minh Huệ, Bùi Văn Thuấn, Đặng Việt Hùng (2015), "Nghiên cứubàochếphytosomecurcumin",TạpchíDượchọc,55(3),tr.14-18.

4 Đào Minh Huy, Phạm Thị Minh Huệ (2016), "Pha cubic và cubosome:

5 Võ Xuân Minh, Phạm Thị Minh Huệ (2013),Kĩ thuật nano và liposome ứngdụng trong dược phẩm và mỹ phẩm, Trường Đại Học Dược Hà Nội, Hà

6 Nguyễn Phúc Nghĩa (2015), "Kỹ thuật xay-nghiền-rây-trộn",Quá trình vàthiếtbịtrongcôngnghệDượcphẩm,tr.1-20.

(2008),"Effectofargininehydrochlorideandhydroxypropyl cellulose as stabilizers on the physical stability of high drugloadingnanosuspensionsofapoorlysolublecompound.",InternationalJour nalofPharmaceutics,351(1-2),pp.282-288.

8 AllamA.N.,KomeilI.A.,FoudaM.A.,etal.(2015),"Preparation,characterization andin vivoevaluation of curcumin self-nano phospholipiddispersionasanapproachtoenhanceoralbioavailability",Internati onalJournalofPharmaceutics,489,pp.117-123.

(2007),"Bioavailabilityofcurcumin:problemsandpromises",Molecularpharmace utics,4(6),pp.807-818.

11 Beevers C S., Huang S (2011), "Pharmacological and clinical properties ofcurcumin",Botanics:TargetsandTherapy,1,pp.5-18.

12 Bhakay A., Merwade M., Bilgili E., et al.(2011), "Novel aspects of wetmillingfortheproductionofmicrosuspensionsandnanosuspensionsofpoorly water-soluble drugs",Drug Development and Industrial

13 Cao X., Gibbs S T., Fang L., et al.(2006), "Why is it challenging to predictintestinal drug absorption and oral bioavailability in human using rat model",PharmaceuticalResearch,23(8),pp.1675-1686.

14 Cao Y., Xu R X., Liu Z (2014), "A high-throughput quantification methodofcurcuminoidsandcurcuminmetabolitesinhumanplasmaviahigh- performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry",Journal ofChromatographyB,949-950,pp.70-78.

15 Chang T L., Zhan H., Liang D., et al.(2015), "Nanocrystal technology fordrugformulationanddelivery",FrontiersofChemicalScienceandEngineering,9( 1),pp.1-14.

16 Charles B (2014), "Population pharmacokinetics: an overview",AustralianPrescriber,37(6),pp.210-213.

17 Chaubal M V., Popescu C (2008), "Conversion of nanosuspensions into drypowders by spray drying: a case study",Pharmaceutical Research, 25(10),pp.2302-2308.

18 Chen H., Khemtong C., Yang X., et al.(2011), "Nanonization strategies forpoorlywater-solubledrugs",DrugDiscoveryToday,16(7/8),pp.354-360.

19 ChenW.,Fan-HavardP.,YeeL.D.,etal.(2012),"Aliquidchromatography– tandemmassspectrometricmethodforquantificationofcurcumin-O- glucuronideandcurcumininhumanplasma",JournalofChromatographyB,900,pp.8 9-93.

20 Costa P., Lobo J M S (2001), "Modeling and comparison of dissolutionprofiles",EuropeanJournalofPharmaceuticalSciences, 13(2),pp. 123-133.

21 Crisp M P., Tucker C J., Rogers T L (2007), "Turbidimetric measurementandpredictionofdissolutionratesofpoorlysolubledrugnanocrystal s",JournalofControlledRelease,117,pp.351-359.

22 Cui J., Yu B., Zhao Y., et al.(2009), "Enhancement of oral absorption ofcurcuminbyself- microemulsifyingdrugdeliverysystems",InternationalJournalofPharmaceutics, 371,pp.148-155.

23 Deng Z., Xu S., Li S (2008), "Understandingarelaxationbehavior in ananoparticlesuspensionfordrugdeliveryapplications",I n t e r n a t i o n a l J ournalofPharmaceutics,351,pp.236-243.

24 Donsi F., Wang Y.,Li J., et al.(2010), "Preparation of Curcumin Sub- micrometerDispersionsbyHigh-

25 Douroumis D., Fahr A (2013),Drug delivery strategies for poorly watersolubledrugs,JohnWiley&Sons,Chichester,pp.1-600.

(2008),"Drugnanocrystalsfortheformulationofpoorlysolubledrugsand itsapplicationasapotentialdrugdeliverysystem",JournalofNanoparticleResear ch,10(5),pp.845-862.

28 Gao Y., Li Z., Sun M., et al.(2011), "Preparation and characterization ofintravenously injectable curcumin nanosuspension",Drug Delivery, 18(2),pp.131-142.

(2010),"Preparation,characterization,pharmacokinetics, and tissue distribution of curcumin nanosuspension withTPGS as stabilizer",D r u g

30 Gao Y., Wang C., Sun M., et al.(2012), "In vivoevaluation of curcuminloadednanosuspensionsbyoraladministration",JournalofBiomedical

31 Garg G., Saraf S., Saraf S (2007), "Cubosomes: An

32 Ghosh A., Banerjee T., Bhandary S., et al.(2014), "Formulation of nanotizedcurcuminanddemonstrationofitsantimalarialefficacy",InternationalJo urnalofNanomedicine,9(1),pp.5373-5387.

(2007),"Curcuminas"Curecumin": from kitchen to clinic",Biochemical

34 Gỹlsỹn T., Gỹrsoy R N., ệner L (2009), "Nanocrystal technology for oraldelivery of poorly water-soluble drugs",FABAD Journal of

35 Gupta N K., Dixit V K (2011), "Bioavailability enhancement of curcuminbycomplexationwithphosphatidylcholine",JournalofPharmaceutic alSciences,100,pp.1987-1995.

37 HardeH.,DasM.,JainS.(2011),"Solidlipidnanoparticles:anoralbioavailability enhancer vehicle",Expert opinion on drug delivery, 8(11), pp.1407-1424.

38 HiepT.T.,PoudelB.K.,MarasiniN.,etal.(2013),"Prepartionandevaluation of raloxifene-loaded solid dispersion nanoparticle by spray- dryingtechniquewithoutanorganicsolvent",InternationalJournalofPharmaceutic s,443,pp.50-57.

39 Hu L., Jia Y., Niu F., et al.(2012), "Preparation and enhancement of oralbioavailabilityofcurcuminusingmicroemulsionsvehicle",JournalofAgricu lturalandFoodChemistry,60,pp.7137-7141.

(2015),"EnhancementofOralBioavailabilityof Curcumin by a Novel Solid Dispersion

41 HuangQ.,YuH.,RuQ.(2011),"Bioavailabilityanddeliveryofnutraceuticals using nanotechnology",Journal of Food Science, 75, pp 50-57.

42 JiH.,TangJ.,RenJ.,etal.(2015),"Curcumin- loadedsolidlipidnanoparticlesw i t h B r i j 7 8 a n d T P G S i m p r o v e di n v i v o o r a lb i o a v a i l a b i l i t y andinsituintestinalabsorptionofcurcumin",Drug

43 Junghanns J A H., Muller R H (2008), "Nanocrystal technology, drugdelivery and clinical applications",International Journal of

44 Junyaprasert V B., Morakul B (2015), "Nanocrystals for enhancement oforalbioavailabilityofpoorlywater- solubledrugs",Asianjournalofpharmaceuticalsciences,10,pp.13-23.

30SolidDispersions",InternationalJournalofMedical,Health,Biomedical,Bio engineeringandPharmaceuticalEngineering3(7),pp.137-142.

(2011),"Exploringsolidlipidnanoparticles toenhancetheoralbioavaila bilityofcurcumin",MolecularNutrition& FoodResearch,55,pp.495-503.

47 KakranM.,SahooN.G.,TanI.-L.,etal.(2012),"Preparationofnanoparticles of poorly water-soluble antioxidant curcumin by antisolventprecipitation methods",Journalof NanoparticleResearch, 14(3), pp 1-11.

48 KarimiN.,GhanbarzadehB.,HamishehkarH.(2015),"Phytosomeandliposome: the beneficial encapsulation systems in drug delivery and foodapplication",Appliedfoodbiotechnology,2(3),pp.17-27.

49 Keck C M., Muller R H (2008), "Size analysis of submicron particles bylaserdiffractometry-

50 KhatikR.,DwivediP.,ShuklaA.,etal.(2016),"Development,characterization and toxicological evaluations of phospholipids complexes ofcurcuminforeffectivedrugdeliveryincancerchemotherapy",DrugDelivery,23(3 ),pp.1067-1078.

51 Kiet T A., Toi V V., Thanh T V (2015), "Investigation of Solid

DispersionMethods to Improve the Dissolution Rate of Curcumin",5 th InternationalConferenceonBiomedicalEngineering inVietnam,pp.293-297.

52 KumarA.,AhujaA.,AliJ.,etal.(2014)," C u r c u m i n - l o a d e d l i p i d nanocarrier for improving bioavailability, stability and cytotoxicity againstmalignantgliomacells",DrugDelivery,23(1),pp.214-229.

53 Lee J., Choi J Y., Park C H (2008), "Characteristics of polymers enablingnano-comminutionofwater- insolubledrugs",InternationalJournalofPharmaceutics,355,pp.328-336.

54 Li J., Shin G H., Chen X (2015), "Modified curcumin with hyaluronic acid:Combination of pro-drug and nano-micelle strategy to address the curcuminchallenge",FoodResearchInternational,69,pp.202-208.

55 Liu A., Lou H., Zhao L., et al.(2006), "Validated LC/MS/MS assay forcurcuminandtetrahydrocurcumininratplasmaandapplicationtopharmacoki netic study of phospholipid complex of curcumin",Journal ofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis,40,pp.720-727.

56 Liu P., Rong X., Laru J (2011), "Nanosuspensions of poorly soluble drugs:Preparationanddevelopmentbywetmilling",InternationalJournalofPha rmaceutics,411,pp.215-222.

57 Liu W., Zhai Y., Heng X., et al.(2016), "Oral bioavailability of curcumin:problems and advancements",Journal of Drug Targeting, 24(8), pp 694-702.

58 Loh Z H., Samanta A K., Heng P W S (2015), "Overview of millingtechniques for improving the solubility of poorly water-soluble drugs",AsianJournalofPharmaceuticalSciences,10,pp.255-274.

"Polymericmicellesandalternativenanonizeddeliveryvehiclesforpoorly solubledrugs",International Journal ofPharmaceutics,453,pp.198-214.

60 Madgulkar A., Bandivadekar M., Shid T (2016), "Sugars as solid dispersioncarriertoimprovesolubilityanddissolutionoftheBCSclassIIdrug:clot rimazole",Drug Development and Industrial Pharmacy, 42(1), pp 28-38.

61 Mahajan Y R (2011), "Nanotechnology-enhanced curcumin: symbiosis ofancient wisdom of east with modern medical science",Nanotech

62 Marczylo T H., Verschoyle R D., Cooke D N., et al.(2007), "Comparisonof systemic availability of curcumin with that of curcumin formulated withphosphatidylcholine",CancerChemotherPharmacol,60(2),pp.171-177.

63 Mohanty C., Das M., Sahoo S K (2012), "Emerging role of nanocarriers toincrease the solubility and bioavailability of curcumin",Expert opinion ondrugdelivery,9(11),pp.1347-1364.

SizeReductionTechniques ",Formulating poorly water soluble drugs,

66 MunjalB.,PawarY.B.,PatelS.B.,etal.(2011),"Comparativeoralbioavailability advantage from curcumin formulations",Drug delivery andtranslationalresearch,1(4),pp.322-331.

(2010),"Formulationdesignandphotochemicalstudiesonnanocrystalsoliddispersion ofcurcuminwithimproved oral bioavaibility",Journal of Pharmaceutical

68 ParvathyK.S.,NegiP.S.,SrinivasP.(2010),"Curcumin- aminoacidconjugates:s y n t h e s i s , a n t i o x i d a n t a n d a n t i m u t a g e n i c a t t r i b u t e s " ,F o o d Chemistry,120,pp.523-530.

69 Patel M M., Shah A., Patel N M., et al.(2011), "Nanosuspension: a novelapproach for drug delivery system",Journal of Pharmaceutical Science andBioscientificResearch,1(1),pp.1-10.

70 Patravale V B., Date A A., Kulkarni R M (2004), "Nanosuspensions: apromising drug delivery strategy",Journal of Pharmacy and

71 PeltonenL.,HirvonenJ.(2010),"Pharmaceuticalnanocrystalsbynanomilling: critical process parameters, particle fracturing and stabilizationmethods",The Journal of pharmacy and pharmacology, 62(11), pp 1569-1579.

72 Pridgen E M., Alexis F., Farokhzad O C (2015), "Polymeric nanoparticledrug delivery technologies for oral delivery applications",Expert opinion ondrugdelivery,12(9),pp.1459-1473.

(2017),MechanicalHomogenizers,updated201716/03/2017,availablefrom:http:// www.proscientific.com/the-field-of- homogenizing

74 Rachmawati H (2013), "Curcumin nanoforms promise better therapeutic",International Journal of Research in Pharmaceutical Sciences, 4(2), pp 211-220.

75 Rachmawati H., Shaal L A., Müller R H., et al.(2013), "Development ofcurcuminnanocrystal:Physicalaspects",JournalofPharmaceuticalSciences, 102(1),pp.204-214.

76 Ramalingam P., Ko Y T (2015), "Enhanced oral delivery of curcumin fromN-trimethylchitosansurface- modifiedsolidlipidnanoparticles:pharmacokineticandbraindistributionevaluat ions",PharmaceuticalResearch,32,pp.389-402.

77 RavichandranR.(2013),"Studiesondissolutionbehaviouro f nanoparticulate curcumin formulation",Advances in Nanoparticles, 2, pp.51-59.

Nanotechnology in Engineering anh Medicine, 3,pp.1-7.

79 Rodriguez-AllerM.,GuillarmeD.,VeutheyJ.L.(2015),"Strategiesforformulating and delivering poorly water-soluble drugs",Journal of DrugDeliveryScienceandTechnology,30,pp.342-351.

80 Sareen R., Jain N., Rajkumari A (2016), "pH triggered delivery of curcuminfrom Eudragit-coated chitosan microspheres for inflammatory bowel disease:characterizationandpharmacodynamicevaluation",Drugd e l i v e r y,2 3 ( 1 ) , pp.55-62.

81 Sarpal K., Pawar Y B., Bansal A K (2010), "Self-emulsifying drug deliverysystems: a strategy to improve oral bioavaillability",Current research andinformationonpharmaceuticalssciences,11(3),pp.42-49.

(2014),"Theoralbioavailabilityof curcumin from micronized powder and liquid micelles is significantlyincreased in healthy humans and differs between sexes",Molecular Nutrition&FoodResearch,58,pp.516-527.

83 Sebastià N., Soriano J M., Maủes J., et al.(2012), "Medicinal Properties andHealth Benefits of Curcumin",Curcumin: Biosynthesis, Medicinal Uses andHealthBenefits,pp.235-248.

84 Seo S W., Han H K., Chun M K (2012), "Preparation and pharmacokineticevaluation of curcumin solid dispersion using Solutol (R) HS15 as a carrier",InternationalJournalofPharmaceutics,424,pp.18-25.

85 Sepassi S., Goodwin D J., Drake A F., et al.(2007), "Effect of polymermolecularweightontheproductionofdrugnanoparticles",JournalofPh armaceuticalSciences,96(10),pp.2655-2666.

(2010),"Developmentandevaluationofself- microemulsifyingliquidandpelletformulations of curcumin, and absorption studies in rats",European

87 ShaikhJ.,AnkolaD.D.,Beniwal.V.,etal.(2009),"Nanoparticleencapsulation improves oral bioavailability of curcumin by at least 9- foldwhencomparedtocurcuminadministeredwithpiperineasabsorptionenhanc er",EuropeanJournalofPharmaceuticalSciences, 37,pp.223-230.

88 Sharma P., Denny W A., Garg S (2009), "Effect of wet milling process onthe solid state of indomethacin and simvastatin",International Journal ofPharmaceutics,380,pp.40-48.

89 Sharma R A., Gescher A J., Steward W P (2005), "Curcumin: The story sofar",EuropeanJournalofCancer,41(13),pp.1955-1968.

90 Shoba G., Joy D., Joseph T., et al.(1998), "Influence of piperine on thepharmacokinetics of curcumin in animals and human volunteers",PlantaMedica,64(4),pp.353-356.

91 Sun M., Zhao L., Guo C., et al.(2012), "Evaluation of an oral carrier systemin rats: bioavailability and gastrointestinal absorption properties of curcuminencapsulated PBCA nanoparticles",Journal of Nanoparticle

92 SuwannateepN.,BanlunaraW.(2011),"Mucoadhesivecurcuminnanospheres: biological activity, adhesion to stomach mucosa and release ofcurcumin into the circulation",Journal of Controlled Release, 151, pp 176-182.

93 Swarbrick J (1991),Preclinical drug disposition, Marcel Dekker, Inc.,

94 Takahashi M., Uechi S., Takara K., et al.(2009), "Evaluation of an

95 Tanaka Y., Inkyo M., Yumoto R (2009), "Nanoparticulation of poorly watersoluble drugs using a wet-mill processandphysicochemicalp r o p e r t i e s o f thenanopowders",Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 57, pp 1050–1057.

97 Thorat A A., Dalvi S V (2015), "Solid-state phase transformations andstorage stability of curcumin polymorphs",Crystal Growth & Design15, pp.1757-1770.

98 Tứnnesen H H., Mỏsson M., Loftsson T (2002), "Studies of curcumin andcurcuminoids XXVII Cyclodextrin complexation: solubility, chemical andphotochemical stability",International Journal of Pharmaceutics,2 4 4 ( 1 ) , pp.127-135.

99 Tu Y S., Wu J W., Zhang J J., et al.(2014), "Preparation, characterisationand evaluation of curcumin with piperine-loaded cubosome nanoparticles",Journalofmicroencapsulation,31(6),pp.551-559.

Center for Drug Evaluation and Research (2013), "GuidanceforIndustry- Bioanalyticalmethodvalidation",Draftguidance.

101 Van Eerdenbrugh B., Van Den Mooter G., Augustijns P (2008), "Top- downproductionofdrugnanocrystals:Nanosuspensionstabilization,miniaturiza tionandtransformationintosolidproducts",I n t e r n a t i o n a l JournalofPharm aceutics,364,pp.64-75.

(2009),"Ascreeningstudyof surface stabilization during the production of drug nanocrystals",JournalofPharmaceuticalScience,98,pp.2091-2103.

103 Vareed S K., Kakarala M., Ruffin M T., et al.(2008), "Pharmacokinetics ofcurcuminconjugatemetabolitesinhealthyhumansubjects",CancerEpidemiol ogyBiomarkers&Prevention,17(6),pp.1411-1417.

104 WahlangB.,PawarY.B.,BansalA.K.(2011),"Identificationofpermeability- related hurdles in oral delivery of curcumin using the Caco-2cell model",European Journal of Pharmaceutical and Biopharmaceutics,77(2),pp.275-282.

105 Wang X M., Zhang Q Z., Yang Q Z., et al.(2012), "Validated HPLC–MS/

MS method for simultaneous determination of curcumin and piperine inhuman plasma",Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 11(4), pp.621-629.

106 Xie X., Tao Q., Zou Y., et al.(2011), "PLGA nanoparticles improve the oralbioavailabilityofcurcumininrats:characterizationsandmechanisms",Journ alofAgriculturalandFoodChemistry,59,pp.9280-9289.

107 Xu W., Ling P., Zhang T (2013), "Polymeric micelles, a promising drugdelivery system to enhance bioavailability of poorly water-soluble drugs",JournalofDrugDelivery,2013,pp.1-15.

(2012),"Nanosuspension:apromisingdrugdeliverysystem",AnInternationalRes earchJournal,3(5),pp.217-243.

109 Yang K Y., Lin L., Tseng T., et al.(2007), "Oral bioavailability of curcuminin rat and the herbal analysis from Curcuma longa by LC-MS/MS",JournalofChromatographyB,853,pp.183-189.

(2011),"Comparativestudyonpharmacokineticsofcurcuminextractofrhizomac urcumaelongaeandrhizomawenyujinconcisuminrats",JournalofChineseM e d i c i n a l Materials,34(1),pp.88-91.

111 Yu H., Huang Q (2012), "Improving the oral bioavailability of curcuminusing novel organogel-based nanoemulsions",Journal of

112 Zhang J., Tang Q., Xu X., et al.(2013),

"Developmentandevaluationofanovelphytosome- loadedchitosanmicrospheresystemforc u r c u m i n delivery",InternationalJo urnalofPharmaceutics,448,pp.168-174.

113 Zhang L., Chai G., Zeng X (2010), "Preparation of fenofibrate immediate- release tablets involving wet grinding for improved bioavailability",DrugDevelopmentandIndustrialPharmacy,36,pp.1054-1063.

114 Zhao L., Du J., Duan Y., et al.(2012), "Curcumin loaded mixed micellescomposed of Pluronic P123 and F68: Preparation, optimization and in vitrocharacterization",ColloidsandSurfacesB:Biointerfaces,97,pp.101-108.

( 2 0 1 2 ) ," E n h a n c e m e n t o f c u r c u m i n oralabsorptionandpharmacokineti csofcurcuminoidsandcurcuminmetabolites in mice",Cancer Chemotherapy

PHỤ LỤC 1 Kết quả thẩm định phương pháp định lượngPHỤLỤC2.Mộtsốkếtquảnghiêncứutiềncôngthức

PHỤ LỤC 5 Quy trình bào chế hệ tiểu phân nano curcuminPHỤLỤC6.Dự thảotiêuchuẩncơsở

Phụ lục 1.1 Kết quả thẩm định phương pháp định lượng curcumin bằngquangphổhấpthụUV-Vis

PhổUV-Viscủacurcumintrongmôitrườngnướcchứa0,2%Tween80 Độ hấp thụ của curcumin trong môi trường nước chứa 0,2% Tween 80 với nồng độkhácnhauở bướcsóng427nm

Xét tính có nghĩa của phương trình hồi quy ở hình 3.1 bằng toán thống kêBảngphântíchANOVA

Diện tích pic của các dung dịch curcumin có nồng độ khác nhau khi phân tích bằngsắckýlỏnghiệunăngcao

Xét tính có nghĩa của phương trình hồi quy ở hình 3.2 bằng toán thống kêBảngphântíchANOVA

- Thửgiátrịb=0,tstatistic=1,96,P=0,1>0,05.Vậygiátrịb≠0khôngcóýnghĩathống kê.

Phụ lục 1.3 Một số kết quả thẩm định phương pháp định lượng curcumin vàtetrahydrocurcumintronghuyếttươngchuột

SKĐ chọn lọc ion tetrahydrocurcumin (MRM, m/z: 373,05 136,96): Cửa sổ thứ haiSKĐchọnlọcion chuẩnnội(MRM,m/z:494,2369,12):Cửasổthứba

SKĐ chọn lọc ion tetrahydrocurcumin (MRM, m/z: 373,05 136,96): Cửa sổ thứ haiSKĐchọnlọcion chuẩnnội(MRM,m/z:494,2369,12):Cửasổthứba

Sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng chứa curcumin, tetrahydrocurcumin vàchuẩnnội

SKĐ chọn lọc ion tetrahydrocurcumin (MRM, m/z: 373,05 136,96): Cửa sổ thứ haiSKĐchọnlọcion chuẩnnội(MRM,m/z:494,2369,12):Cửasổthứba

File: Nguyenlieu Curcumin.raw - Type: 2Th/Th locked - Start: 1.000° -End: 64.930° - Step: 0.030 °- Steptime: 0.3s - Temp.: 25 °C (Room) -TimeStarted: 14 s - 2-Theta: 1.000 ° -Theta: 0.500 ° - Chi: 0.00 ° - Phi: 0.00° -00-009-0816 (Q)- Curcumin- C21 H20 O6 -Y:36.77%- dx by:1.-WL:1.5406 -

FacultyofChemistry,HUS,VNU,D8ADVANCE-Bruker- NguyenlieuCurcumin

Tỷ lệ áp suất (p/po))

Phụ lục 2.4 Đồ thị đường hấp phụ đẳng nhiệt theo) thuyết BET của mẫu nguyên liệu

Figure:Experiment: Curcumin Crucible:Al 100 àl DSC131

Onset Point :193.2065 °C Enthalpy /J/g : 126.9053 (Endothermic effect)

Dungdịch HCl0,1Nchứa0,2%Tw een80

Dungdịchđệm phosphat pH 6,8 chứa0,2%Tween80

Sắc ký đồ mẫu curcumin để ở điều kiện nhiệt độ nhiệt độ 40 o C và độ ẩm

PHỤ LỤC 3 MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TIỂU

CT TWE/CUR PVP/CUR T V

Phụlục3.2.Kếtquảđánhgiá hiệusuất,KTTPTBvàPDI củabộtphunsấychứananocurcumintheo26côngthức đãthiếtkế thínghiệm

CT Hiệusuất (Y 1 )(%) KTTPTB(Y 2 )(nm) PDI(Y 3 )

Phụ lục 3.3 Kết quả đánh giá độ hòa tan của bột phun sấy nano curcumin bàochếtheo26côngthứcthiếtkếthínghiệm

Cácluật nhân quảcho biến phụthuộcY 1

NếuX 3 thấp vàX 1 thấp(mức 1(4))và X 2 thấpvà X 4 thấp thì Y 1 thấp(1,00)hoặccao (0,00)

Nếu X 3 thấp và X 1 thấp (mức 1(4)) và X 2 thấp và X 4 trung gian thì Y 1 thấp (1,00) hoặc cao

(0,00)NếuX 3 thấp vàX 1 thấp (mức 1(4))vàX 2 thấp và X 4 caothì Y 1 thấp (0,84)hoặccao (0,16)

Nếu X 3 thấp và X 1 thấp (mức 1(4)) và X 2 trung gian và X 4 thấp thì Y 1 thấp (1,00) hoặc cao

(0,00)NếuX 3 thấpvàX 1 thấp(mức1(4))vàX 2 trunggianvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(1,00)hoặccao( 0,00)

Nếu X 3 thấp và X 1 thấp (mức 1(4)) và X 2 trung gian và X 4 cao thì Y 1 thấp (0,79) hoặc cao

(0,21)NếuX 3 thấpvàX 1 thấp(mức 1(4))vàX 2 cao vàX 4 thấp thìY 1 thấp (0,68)hoặccao (0,32)

Nếu X 3 thấp và X 1 thấp (mức 1(4)) và X 2 cao và X 4 trung gian thì Y 1 thấp (1,00) hoặc cao

(0,00)NếuX 3 thấp vàX 1 thấp (mức 1(4))vàX 2 cao vàX 4 cao thì Y 1 thấp (0,74)hoặccao(0,26)

Nếu X 3 thấp và X 1 trung gian (mức 2(4)) và X 2 thấp và X 4 thấp thì Y 1 thấp (1,00) hoặc cao

(0,00)NếuX 3 thấpvàX 1 trunggian(mức2(4))vàX 2 thấpvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(1,00)hoặccao( 0,00)

Nếu X 3 thấp và X 1 trung gian (mức 2(4)) và X 2 thấp và X 4 cao thì Y 1 thấp (0,60) hoặc cao

(0,40)NếuX 3 thấpvàX 1 trunggian(mức2(4))vàX 2 trunggianvàX 4 thấpthìY 1 thấp(0,98)hoặccao( 0,02)

NếuX 3 thấpvàX 1 trunggian(mức2(4))vàX 2 trunggianvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(0,81)hoặccao (0,19) NếuX 3 thấpvàX 1 trunggian(mức2(4))vàX 2 trunggianvàX 4 caothìY 1 thấp(0,97)hoặccao(0,03) Nếu X 3 thấp và X 1 trung gian (mức 2(4)) và X 2 cao và X 4 thấp thì Y 1 thấp (0,86) hoặc cao

(0,14)NếuX 3 thấpvàX 1 trunggian(mức2(4))vàX 2 caovàX 4 trunggianthìY 1 thấp(0,85)hoặcca o(0,15)

NếuX 3 thấpvà X 1 trunggian(mức2(4))và X 2 caovà X 4 cao thìY 1 thấp(1,00) hoặccao (0,00)NếuX 3 thấp và X 1 trung gian (mức 3(4)) và X 2 thấp và X 4 thấp thì Y 1 thấp (1,00) hoặc cao

(0,00)NếuX 3 thấpvàX 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 thấpvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(0,75)hoặccao( 0,25)

Nếu X 3 thấp và X1 trung gian (mức 3(4)) và X 2 thấp và X 4 cao thì Y 1 thấp (0,98) hoặc cao

(0,02)NếuX 3 thấpvà X 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 trunggianvàX 4 thấpthìY 1 thấp(0,95)hoặcca o(0,05)

NếuX 3 thấpvàX 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 trunggianvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(1,00)hoặccao (0,00) NếuX 3 thấpvàX 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 trunggianvàX 4 caothìY 1 thấp(1,00)hoặccao(0,00) Nếu X 3 thấp và X 1 trung gian (mức 3(4)) và X 2 cao và X 4 thấp thì Y 1 thấp (1,00) hoặc cao

(0,00)NếuX 3 thấpvàX 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 caovàX 4 trunggianthìY 1 thấp(1,00)hoặcca o(0,00)

Nếu X 3 thấp và X 1 trung gian (mức 3(4)) và X 2 cao và X 4 cao thì Y 1 thấp (1,00) hoặc cao

(0,00)NếuX 3 thấp vàX 1 cao(mức 4(4))vàX 2 thấpvà X 4 thấp thì Y 1 thấp(0,64) hoặc cao (0,36)

Nếu X 3 thấp và X 1 cao (mức 4(4)) và X 2 thấp và X 4 trung gian thì Y 1 thấp (1,00) hoặc cao

(0,00)NếuX 3 thấp vàX 1 cao(mức 4(4))vàX 2 thấp và X 4 cao thì Y 1 thấp(1,00) hoặc cao (0,00)

Nếu X 3 thấp và X 1 cao (mức 4(4)) và X 2 trung gian và X 4 thấp thì Y 1 thấp (1,00) hoặc cao

(0,00)NếuX 3 thấpvàX 1 cao(mức4(4))vàX 2 trunggianvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(1,00)hoặccao (0,00)

Nếu X 3 thấp và X 1 cao (mức 4(4)) và X 2 trung gian và X 4 cao thì Y 1 thấp (0,92) hoặc cao

(0,08)NếuX 3 thấp vàX 1 cao(mức 4(4))vàX 2 cao vàX 4 thấpthì Y 1 thấp(1,00) hoặccao (0,00)

Nếu X 3 thấp và X 1 cao (mức 4(4)) và X 2 cao và X 4 trung gian thì Y 1 thấp (1,00) hoặc cao (0,00)Nếu

X 3 thấp vàX 1 cao(mức 4(4))vàX 2 cao vàX 4 caothìY 1 thấp(0,64) hoặc cao(0,36)

Nếu X 3 trunggian và X 1 thấp (mức 1(4)) và X 2 thấp và X 4 thấp thì Y 1 thấp (0,88) hoặc cao

(0,12)NếuX 3 trunggianvàX 1 thấp(mức1(4))vàX 2 thấpvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(0,99)hoặccao( 0,01)

Nếu X 3 trung gian và X 1 thấp (mức 1(4)) và X 2 thấp và X 4 cao thì Y 1 thấp (0,69) hoặc cao

(0,31)NếuX 3 trunggianvàX 1 thấp(mức1(4))vàX 2 trunggianvàX 4 thấpthìY 1 thấp(1,00)hoặccao( 0,00)

NếuX 3 trunggianvàX 1 thấp(mức1(4))vàX 2 trunggianvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(0,73)hoặccao (0,27) NếuX 3 trunggianvàX 1 thấp(mức1(4))vàX 2 trunggianvàX 4 caothìY1thấp(1,00)hoặccao(0,00) Nếu X 3 trung gian và X 1 thấp (mức 1(4)) và X 2 cao và X 4 thấp thì Y 1 thấp (1,00) hoặc cao

(0,00)NếuX 3 trunggianvàX 1 thấp(mức1(4))vàX 2 caovàX 4 trunggianthìY 1 thấp(0,60)hoặcca o(0,40)

NếuX 3 trunggianvàX 1 thấp(mức1(4))vàX 2 caovàX 4 caothìY 1 thấp(0,50) hoặccao

(0,50)NếuX 3 trunggianvàX 1 trunggian(mức2(4))vàX 2 thấpvàX 4 thấpthìY 1 thấp(0,70)hoặccao( 0,30)

NếuX 3 trunggianvàX 1 trunggian(mức2(4))vàX 2 thấpvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(0,74)hoặccao (0,26)NếuX 3 trunggianvàX 1 trunggian(mức2(4))vàX 2 thấpvàX 4 caothìY 1 thấp(1,00)hoặccao(0,00)NếuX 3 trunggianvàX 1 trunggian(mức2(4))vàX 2 trunggianvàX 4 thấpthìY 1 thấp(0,73)hoặccao (0,27)NếuX 3 trunggianvàX 1 trunggian(mức2(4))vàX 2 trunggianvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(0,44)hoặc cao (0,56)NếuX 3 trunggianvàX 1 trunggian(mức2(4))vàX 2 trunggianvàX 4 caothìY 1 thấp(0,48)hoặccao (0,52)NếuX 3 trunggianvàX 1 trunggian(mức2(4))vàX 2 caovàX 4 thấpthìY 1 thấp(1,00)hoặccao(0,00)NếuX 3 trunggianvàX 1 trunggian(mức2(4))vàX 2 caovàX 4 trunggianthìY 1 thấp(0,50)hoặccao (0,50)NếuX 3 trunggianvàX 1 trunggian(mức2(4))vàX 2 caovàX 4 caothìY 1 thấp(1,00)hoặccao(0,00)NếuX 3 trunggianvàX 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 thấpvàX 4 thấpthìY 1 thấp(1,00)hoặccao(0,00)

NếuX 3 trunggianvàX 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 thấpvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(0,60)hoặccao (0,40) NếuX 3 trunggianvàX 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 thấpvàX 4 caothìY 1 thấp(1,00)hoặccao(0,00) NếuX 3 trunggianvàX 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 trunggianvàX 4 thấpthìY 1 thấp(1,00)hoặccao (0,00) NếuX 3 trunggianvàX 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 trunggianvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(0,90)hoặc cao (0,10) NếuX 3 trunggianvàX 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 trunggianvàX 4 caothìY 1 thấp(0,71)hoặccao (0,29) NếuX 3 trunggianvàX 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 caovàX 4 thấpthìY 1 thấp(1,00)hoặccao(0,00) NếuX 3 trunggianvàX 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 caovàX 4 trunggianthìY 1 thấp(1,00)hoặccao (0,00) NếuX 3 trunggianvàX 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 caovàX 4 caothìY 1 thấp(1,00)hoặccao(0,00) Nếu X 3 trung gian và X 1 cao (mức 4(4)) và X 2 thấp và X 4 thấp thì Y 1 thấp (0,51) hoặc cao

(0,49)NếuX 3 trunggianvàX 1 cao(mức4(4))vàX 2 thấpvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(1,00)hoặcca o(0,00)

NếuX 3 trunggianvàX 1 cao(mức4(4))vàX 2 thấpvà X 4 cao thìY 1 thấp(1,00) hoặccao

(0,00)NếuX 3 trunggianvàX 1 cao(mức4(4))vàX 2 trunggianvàX 4 thấpthìY 1 thấp(1,00)hoặcca o(0,00)

NếuX 3 trunggianvàX 1 cao(mức4(4))vàX 2 trunggianvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(0,45)hoặccao (0,55) NếuX 3 trunggianvàX 1 cao(mức4(4))vàX 2 trunggianvàX 4 caothìY 1 thấp(1,00)hoặccao(0,00) NếuX 3 trunggianvàX 1 cao(mức4(4))vàX 2 caovà

X 4 thấpthìY 1 thấp(1,00)hoặccao(0,00)NếuX 3 trunggianvàX 1 cao(mức4(4))vàX 2 caovàX 4 trung gianthìY 1 thấp(1,00)hoặccao(0,00)

Nếu X 3 trung gian và X 1 cao (mức 4(4)) và X 2 cao và X 4 cao thì Y 1 thấp (0,94) hoặc cao

(0,06)NếuX 3 cao và X 1 thấp(mức 1(4))vàX 2 thấp và X 4 thấpthì Y 1 thấp(0,62)hoặc cao (0,38)

Nếu X 3 cao và X 1 thấp (mức 1(4)) và X 2 thấp và X 4 trung gian thì Y 1 thấp (1,00) hoặc cao

(0,00)NếuX 3 cao vàX 1 thấp(mức 1(4)) vàX 2 thấp vàX 4 cao thìY 1 thấp(0,47) hoặccao (0,53)

Nếu X 3 cao và X 1 thấp (mức 1(4)) và X 2 trung gian và X 4 thấp thì Y 1 thấp (0,62) hoặc cao

(0,38)NếuX 3 caovàX 1 thấp(mức1(4))vàX 2 trunggianvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(1,00)hoặcca o(0,00)

Nếu X 3 cao và X 1 thấp (mức 1(4)) và X 2 trung gian và X 4 cao thì Y 1 thấp (1,00) hoặc cao

(0,00)NếuX 3 cao vàX 1 thấp(mức 1(4))vàX 2 cao vàX 4 thấp thì Y 1 thấp(0,49) hoặc cao (0,51)

Nếu X 3 cao và X 1 thấp (mức 1(4)) và X 2 cao và X 4 trung gian thì Y 1 thấp (1,00) hoặc cao

(0,00)NếuX 3 cao và X 1 thấp(mức 1(4))vàX 2 cao vàX 4 caothìY 1 thấp(0,90) hoặc cao(0,10)

Nếu X 3 cao và X 1 trung gian (mức 2(4)) và X 2 thấp và X 4 thấp thì Y 1 thấp (1,00) hoặc cao

(0,00)NếuX 3 caovàX 1 trunggian(mức2(4))vàX 2 thấpvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(0,57)hoặcca o(0,43)

NếuX 3 cao và X 1 trunggian (mức 2(4)) vàX 2 thấp vàX 4 caothì Y 1 thấp (0,84)hoặc cao(0,16) cao(0,00)

NếuX 3 caovàX 1 trunggian(mức2(4))vàX 2 trunggianvàX 4 thấpthìY 1 thấp(0,99)hoặccao(0,01) NếuX 3 caovàX 1 trunggian(mức2(4))vàX 2 trunggianvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(0,00)hoặccao (1,00) NếuX 3 caovàX 1 trunggian(mức2(4)) vàX 2 trunggianvàX 4 caothìY 1 thấp(1,00)hoặccao(0,00) NếuX 3 caovàX 1 trung gian(mức2(4))vàX 2 caovà X 4 thấpthìY 1 thấp

(0,94)hoặccao(0,06)NếuX 3 caovàX 1 trunggian(mức2(4))và X 2 caovàX 4 trunggianthìY 1 thấp( 0,59)hoặccao(0,41)

Nếu X 3 caovà X 1 trung gian (mức 2(4)) và X 2 cao và X 4 cao thì Y 1 thấp (0,53) hoặc cao

(0,47)NếuX 3 cao và X 1 trunggian(mức 3(4)) và X 2 thấp vàX 4 thấp thì Y 1 thấp(0,60)hoặc cao (0,40) NếuX3caovàX 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 thấpvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(1,00)hoặccao(0,00) NếuX 3 caovàX 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 thấpvà X 4 cao thìY 1 thấp(1,00) hoặccao

(0,00)NếuX 3 caovàX 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 trunggianvàX 4 thấpthìY 1 thấp(1,00)hoặcca o(0,00)

NếuX 3 caovàX 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 trunggianvàX 4 trunggianthìY 1 thấp(1,00)hoặccao (0,00) NếuX 3 caovàX 1 trunggian(mức3(4)) vàX 2 trunggianvàX 4 caothìY 1 thấp(0,66)hoặccao(0,34) NếuX 3 caovàX 1 trunggian(mức3(4))vàX 2 caovà

X 4 thấpthìY 1 thấp(0,59)hoặccao(0,41)NếuX 3 caovàX 1 trunggian(mức3(4))và X 2 caovàX 4 trung gianthìY 1 thấp(0,57)hoặccao(0,43)

Nếu X 3 cao và X 1 trung gian (mức 3(4)) và X 2 cao và X 4 cao thì Y 1 thấp (0,73) hoặc cao

(0,27)NếuX 3 cao và X 1 cao(mức 4(4)) và X 2 thấp vàX 4 thấpthìY 1 thấp(0,58) hoặc cao(0,42)

Nếu X 3 cao và X 1 cao (mức 4(4)) và X 2 thấp và X 4 trung gian thì Y 1 thấp (0,90) hoặc cao (0,10)Nếu

X 3 cao và X 1 cao(mức 4(4)) và X 2 thấp vàX 4 caothìY 1 thấp(0,45) hoặc cao(0,55)

NếuX 3 caovàX 1 cao(mức4(4))vàX 2 trunggianvà

X 4 thấpthìY 1 thấp(1,00)hoặccao(0,00)NếuX 3 caovàX 1 cao(mức4(4))và X 2 trunggianvàX 4 trung gianthìY 1 thấp(1,00)hoặccao(0,00)

Nếu X 3 cao và X 1 cao (mức 4(4)) và X 2 trung gian và X 4 cao thì Y 1 thấp (0,65) hoặc cao

(0,35)NếuX 3 cao và X 1 cao(mức 4(4)) và X 2 cao và X 4 thấpthìY 1 thấp(0,35) hoặc cao(0,65)

Nếu X 3 cao và X 1 cao (mức 4(4)) và X 2 cao và X 4 trung gian thì Y 1 thấp (0,69) hoặc cao

(0,31)NếuX 3 cao và X 1 cao(mức4(4)) và X 2 cao và X 4 caothì Y 1 thấp (0,68) hoặccao(0,32)

Cácluật nhân quảcho biến phụthuộcY 2