Đánh giá đa dạng di truyền và phát triển kỹ thuật chẩn đoán virus lúa lùn sọc đen phương nam ở việt nam

BỘGIÁO DỤCVÀĐÀOTẠOB Ộ N Ô N G NGHIỆPVÀPTNTVIỆNKHOAHỌCNÔNGNGHIỆ PVIỆTNAM ĐỖTHỊHẠNH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀPHÁTTRIỂNKỸTHUẬTCHẨNĐOÁNVIRUS LÚALÙNSỌCĐENPHƢƠNGNAMỞVIỆTNAM Chuyên ngành: Cơng nghệ sinh họcMãsố 6242 02 01 TĨMTẮTLUẬNÁNTIẾNSĨ NƠNGNGHIỆP Hà Nội–2017 Cơngtrìnhđƣợchồnthànhtại: VIỆNKHOAHỌCNƠNG NGHIỆPVIỆT NAM Ngƣờihƣớngdẫnkhoahọc: Thầyhƣớngdẫn1:PGS.TS.PhạmXnHội Thầyhƣớngdẫn2:PGS.TS.HàViếtCƣờng Phảnbiện1:…………………………… Phảnbiện2:…………………………… Phảnbiện3:…………………………… LuậnánsẽđƣợcbảovệtrƣớcHộiđồngchấmluậnáncấpnhànƣớchọpt ại:ViệnkhoahọcnôngnghiệpViệtNam Vàohồi ngày tháng năm2017 - Cóthểtìmhiểuluậnántạithƣviện: ThƣviệnQuốcgiaViệtNam ThƣviệnViệnKhoahọcNơngnghiệpViệtNam MỞ ĐẦU Tínhcấpthiếtcủatềtài Việt Nam quốc gia trồng lúa nƣớc xuấtkhẩu lúa hàng đầu giới Sản xuất lúa có vai trị quan trọngđối với khoảng 70% dân số nông nghiệp an ninh lƣơng thực củađất nƣớc Virus tác nhân gây bệnh nguy hiểmnhất nguyên nhân làm cho sản lƣợng lúa khơng ổn địnhvà tình trạng an ninh lƣơng thực Dịch bệnh vius xảy rathƣờng để lại hậu nghiêm trọng, xảy luân phiên táibùngphát dịchsau mộtkhoảngthờigian nhấtđịnh Virus lúa lùn sọc đen Phƣơng Nam (Southern rice blackstreakeddwarf virus-SRBSDV)gây bệnh lúa lùn sọc đen đƣợc phát lầnđầu tiênvàonăm 2001 tạicácvùng trồng lúat h u ộ c t ỉ n h Q u ả n g Đơng, phía Nam Trung Quốc Virus thành viên thuộcnhómFijivirus-2, họReoviridae.Triệu chứng chủ yếu lúanhiễm bệnh thƣờng thấy lúa tƣơng đối thấp lùn, xanh đậm,lábịxoănởđầuláhoặctồnbộlá,ráchméplávàđặcbiệtcónhữngusáp màutrắngđếnđenchạydọccácđƣờnggânởmặtsaulá,bẹláhoặc đốt thân Bệnh chủ yếu nhiễm thuộc dạng thựcvật thân cỏ nhƣ: lúa, ngô, cỏ Môi giới truyền bệnh SRBSDV làrầylƣngtrắngvàrầynâunhỏnhƣngchỉcórầylƣngtrắngmớicókhảnăng truyền SRBSDVtừlúasangngơ.Hệgenviruscóchiềudài29124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đơi có kích thƣớc từ 1,8 đến4,5 kb đƣợc đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 nhƣnghầu hết đềuchƣa đƣợc xác định chức Dựa vào mức độ bảo thủ protein,phânđoạnS9vàS10cómứcđộbảothủcao,mãhóachoproteinv ỏ virus, thích hợp để nghiên cứu chẩn đốn Phân đoạn S7cũng có mức bảo thủ cao vàm ã h ó a p r o t e i n P c ó v a i t r ò q u a n trọng tiến hóa, thích hợp để nghiên cứu mức độ biếnđộngtrongquầnthể virus Ở Việt Nam, dịch bệnh lúa lùn sọc đen đƣợc phát thấy lầnđầu tiên lúa mùa năm 2009 20 tỉnh miền Bắc miền Trungvới diện tích lúa nhiễm bệnh lên tới 42.000 Vì virus lầnđầu tiên xuất Việt Nam nên cơng tác chẩn đốn gặp nhiềukhó khăn Hai kỹ thuật chẩn đoán bệnh virus đại phổ biếnnhấthiệnnay làk ỹ t h u ậ t R T - P C R v E I S T r o n g k h i k ỹ t h u ậ t chẩn đoán RT-PCR cho kết có độ xác cao kỹ thuậtchẩnđốnbằng ELISA chokếtquảtƣơng đối xác,k ỹ t h u ậ t đơngiản,giáthànhrẻnênrấtphùhợpvớiđiềukiệnViệtNam.Tuynhiên, chƣa có kháng thể đặc hiệu nên việc chẩn đoán bịnhiễm SRBSDV đƣợc thực phƣơng pháp RT-PCR sửdụng cặp mồi từ Trung Quốc tự thiết kế dựa trình tự phânđoạn S10 số mẫu bệnh Ngoài ra, virus thực vật vốn cótốc độ đột biến cao đặc tính mắc lỗi mã enzyme RdRP(RNA dependent RNA polymerase) virus, thay đổi nhanhchóng lực tiến hóa nhƣ ký chủ vector nhƣ chất bộgen phân đoạn nên khả hình thành chủng/lồi virus rấtcao Cho đến nay, chƣa có nghiên cứu đánhgiá đa dạng di truyền SRBSDV gây bệnh vùng sinh thái trồnglúa khác Việt Nam nhƣ nghiên cứu chuẩn hóa quy trìnhchẩn đốn SRBSDV Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành đềtài:“Đánh giá đa dạng di truyền phát triển kỹ thuật chẩn đoánviruslúalùnsọcđen Phương NamởViệtNam” Mụctiêu nghiêncứu - Đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV vùng sinh thái trồnglúa khác Việt Nam dựa kết giải trình tự phânđoạn S7, S9 S10 - Pháttriểnkỹ thuậtchẩn đoánSRBSDVởViệtN a m k ỹ thuật RT-PCRvà ELISA Đốitƣợngvàphạmvinghiêncứu Đốitượng - CácmẫuviruslúalùnsọcđenPhƣơngNamởViệtNam - Các mẫu lúa nhiễm bệnh, bệnh mẫu rầy nhiễm, sạchviruslúalùnsọc đenPhƣơngNam Nộidung - Phân lập, giải trình tự ba phân đoạn S7, S9, S10 13 mẫuSRBSDVđ i d i ệ n c ho c c v ùn gs i nh t h i V i ệ t N a m v đ n h giáđadạngditruyền - Phát triển kỹ thuật chẩn đoán đặc hiệu SRBSDV Việt NambằngkỹthuậtRT-PCR - Phát triển kỹ thuật chẩn đoán đặc hiệu SRBSDV Việt NambằngELISA Tínhmớicủaluậnán Luận án cơng trình Việt Nam nghiênc ứ u c h u y ê n sâu có hệ thống đa dạng di truyền virus lúa lùn sọc đen phƣơngNam bƣớc đầu chứng minh chủng SRBSDV Việt Nam có quan hệdi truyền gầngũihơn vớimẫu SRBSDVQuảngĐông Luận án phát triển thành cơng kỹ thuật chẩn đốn SRBSDVbằng RT-PCR cho kết xác 100% với mẫu lúa nhiễmbệnh biểu rõ triệu chứng phát sớm mẫu lúanhiễmbệnhchƣabiểu hiệnrõtriệu chứng Luận án cơng trình nghiên cứu tạo thành cơngkháng thể đa dòng kháng virus lúa lùn sọc đen Phƣơng Nam bằngprotein/peptide tái tổ hợp; kháng thể đa dịng có tính đặc hiệu cao, cóthểpháthiện virusởcả mẫu lúavà rầynhiễmvirus Ý nghĩakhoa họcvàthựctiễncủa đềtài Luận án cung cấp sở liệu, thông tin khoa học đadạngditruyềnSRBSDVởViệtNam,cungcấptƣliệukhoahọcmớivề sở khoa học khả áp dụng kỹ thuật sinh học phân tửtrongchẩn đoánSRBSDVởViệtNam Kết đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV Việt Nam làm cơsở cho nghiên cứu chẩn đoán, diễn biến phát dịch đề xuất biệnpháp phòng trừ hiệu giúp giảm thiểu tổn thất mùa màng chongƣời nơngdân Kỹ thuậtchẩnđốnSRBSDVbằng RT-PCR cóđ ộ c h í n h x c cao, phát đƣợc có mặt virus lúa chƣabiểu rõ triệu chứng chẩn đốn virus ELISA phát hiệnnhanh có mặt virus mẫu lúa mẫu rầy nhiễm virus rấtcó ý nghĩa cơng tác chẩn đốn sớm xác tác nhân gâybệnh Cấu trúccủa luận án Luận án dày 152 trang đánh máy vi tính khổ A4 với bảng sốliệu, 49 hình Luận án gồm phần: Mở đầu trang; Tổng quan tàiliệu3 t r a n g ; V ậ t l i ệ u , n ộ i d u n g v p h ƣ n g p h p n g h i ê n c ứ u 2 trang;Kết nghiên cứu thảo luận 71 trang;Kết luận kiếnnghị 02 trang Đã tham khảo 125 tài liệu bao gồm 23 tài liệu tiếngViệt 102tàiliệutiếngAnh Chƣơng1.T Ổ N G QUANTÀILIỆU 1.1 CÁCVIRUSHẠILÚA Virus hại lúa có từ lâu đƣợc xem bệnh hại nguy hiểmhàngđầ u c â y l úa t r ê n t h ế g i i n ó i c h u n g V i ệ t Na m n ói r i ê n g Tuy nhiênphảiđến năm 1895cácnhàkhoahọc NhậtBảnm i nghiên cứu lần virus gây bệnh lúa vàng lùn (Rice dwarfvirusRDV)đƣợcpháthiện.Tiếptheo,viruslúalùnsọcđen(RBSDV) đƣợc phát nhiều virus hại lúa khác đƣợc xácđịnh nhƣ virus gây bệnh Tungro (Tungro baccili-form virus-RTBVvà Tungro spherical virus-RTSV), vàng di động (RTYV- Ricetransitory yellow-ing virus), khảm đốm chết (RNMV-Rice necrosismosaicvirus), lùn xoắn (RRSV-Rice ragged stunt virus), vàng lùn(RGSV- Ricegrassystuntvirus),trắnglálúa(RHBV-Ricehojablanca virus)… Cho tới nay, đãcó16loạivirusgâyhạitrênlúađƣợcpháthiện Các virus phát (vàng lùn, lùn xoắn lá, tungro, lùn sọc đenphƣơng Nam ) Việt Nam có tầm quan trọng kinh tế lantruyền qua rầy Việc chẩn đốn virus lúa thƣờng khó triệuchứngcóthểbịnhầmlẫndosửdụngthuốctrừcỏhoặccácngunnhân sinh lý Phát virus rầy buộc phải sử dụng kỹ thuậtchẩnđoánnhƣ EISh o ặ c PCR 1.2 ĐẶCĐIỂMCÁCFIJIVIRUSTHUỘCHỌREOVIRIDAE CácvirusthuộchọReoviridaeđƣợcđặctrƣngbởibộgenRNsợi kép (dsRN ), phân đoạn, bao gồm đến 12 phân tử RNA sợi képmạch thẳng ChiFijiviruscó hệ gen phân đoạn gồm 10 phân tử RNAsợi kép, mạch thẳng (S1-S10) Các phân tử RNn y k í c h t h ƣ c dao độngtừ1,4 kb đến 4,5kb có 1.3 VIRUSLÚALÙNSỌCĐENPHƢƠNGNM Bệnh lúa lùn sọc đen phƣơng nam lần xuất tỉnhQuảngĐ ô n g , T r u n g Q u ố c ( 0 ) v đ ƣ ợ c x e m l m ộ t b i ế n c h ủ n g củaRBSDV.CâylúabịnhiễmSRBSDVsinhtrƣởngcịicọc,láxanhđ ậm,xoăntrắngởlá,ráchméplávàđặcbiệtcónhữngusápmàutrắng đen chạy dọc đƣờng gân mặt sau lá, bẹ cácđốt thân.Rầy lƣng trắng vàmộttỷ lệnhỏ rầy nâu nhỏlàv e c t o r truyền SRBSDV Hệ gen SRBSDV có chiều dài 29124 bp, gồm10 phân đoạn RNA sợi đơi, có kích thƣớc từ 1,8 đến 4,5 kb Trongđó, phânđoạn S7 dài2176 bp, chứahaiORF mãhóahaip r o t e i n (40,5k Da v 6, k D a ) ; p hâ n đ o n S d i 18 9 b p , chứah a i O R F mã hóa hai protein (39,9 kDa 24,2 kDa); phân đoạn S10 dài 1797bp,c h ứ a m ộ t O R F m ã h ó a p r o t e i n ( k D a ) h ì n h t h n h l p v ỏ ngồi phân tử virus SRBSDV có tƣơng đồng triệu chứng,phổký chủ, hình tháihọc phântửvirus,huyếtthanh họcvớic c thành viên khác chiFijivius,đặc biệt RBSDV Hai kỹ thuậtchẩn đoán SRBSDV phổ biến thử nghiệm miễn dịch liên kếtmen(EIS)và phản ứngtrùnghợpchuỗi(RT-PCR) 1.4 VIRUSLÚALÙNSỌCĐENPHƢƠNGNMỞVIỆTNAM SRBSDV lần xuất vào tháng 2009, Nghệ An,sau lan 20 tỉnh miền Bắc Bắc Trung Bộ với diện tích bịhại tới 42.000 Do tính chất nghiêm trọng SRBSDV, ngồiviệcxác định tác nhângây bệnh,nhiều nghiên cứu vềb ả n c h ấ t h ệ gen đa dạng di truyền SRBSDV Việt Nam đƣợc nghiên cứutrong thời gian qua Năm 2010 2011, bệnh có xu hƣớng mở rộngra nhiều địa bàn trồng lúa khác có tới 34 tỉnh có diện tíchtrồnglúa bịbệnh Chƣơng2.VẬTLIỆU,NỘIDUNGVÀPHƢƠNGPHÁPNGHIÊ NCỨU 2.1 VẬTLIỆU 2.1.1 Vậtliệuthựcvật 13 mẫu lúa nhiễm bệnh lúa lùn sọc đen đặc trƣng đƣợc xác địnhbằng RT-PCR ELISA mẫu lúa nghi nhiễm bệnh thu thậpvào vụ xuân vụ mùa năm 2009-2012 tỉnh: Thái Bình,NamĐịnh,NinhBình,SơnLa,LàoCai,NghệAn,QuảngTrị, HuếdophịngBệnh họcphântử-Viện ditruyềnNơngnghiệpcungcấp Cácmẫurầykhỏe,rầynhiễmSRBSDV;cáccâylúanhiễmSRBSDV, RRSV lây nhiễm nhân tạo đƣợc cung cấp Trung tâmbệnhcâynhiệtđới, Học viện Nôngnghiệp ViệtNam Bảng2 M ẫ u l ú a nhiễmSRBSDVdùng trongnghiên cứu STT Tênmẫu Giốnglúa Thờivụ 10 11 12 13 SonLa-1 SonLa-2 LaoCai-1 NinhBinh-1 NinhBinh-2 ThaiBinh-1 ThaiBinh-2 NamDinh-1 NgheAn-1 QuangTri-1 QuangTri-2 Hue-1 Hue-2 Xén cù Xén cù Nhịƣu838 BT7 BT7 BT7 BT7 BT7 Xi23 Nhịƣu986 Xi23 Nhịƣu986 Nhịƣu986 Vụxuân2010 Vụxuân2010 Vụxuân2009 Vụmùa2009 Vụmùa 2010 Vụmùa2009 Vụmùa2010 Vụmùa2009 Vụmùa2009 Vụxuân2010 Vụxuân2010 Vụxuân2010 Vụxuân2010 Địa điểmthu mẫu Sơn La Sơn La LàoCai Ninh Bình Ninh Bình TháiBình TháiBình NamĐịnh NghệAn QuảngTrị QuảngTrị Huế Huế 2.1.2 Chủngvisinhvật Chủngv i k h u ẩ n E c o l i D H 5α α m u a c ủ a h ã n gI n vi t r oge n, E c ol i