Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (panax sp ) phân bố tự nhiên tại lâm đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  LÊ NGỌC TRIỆU NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM (Panax sp.) PHÂN BỐ TỰ NHIÊN TẠI LÂM ĐỒNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP ĐÀ LẠT, 2017 A BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  LÊ NGỌC TRIỆU NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM (Panax sp.) PHÂN BỐ TỰ NHIÊN TẠI LÂM ĐỒNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN VĂN KẾT GS.TSKH TRẦN DUY QUÝ ĐÀ LẠT, 2017 B LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu đƣợc trình bày luận án trung thực, khách quan chƣa để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án đƣợc cám ơn, thơng tin trích dẫn luận án đƣợc rõ nguồn gốc Đà Lạt, ngày 21 tháng 12 năm 2017 Tác giả luận án Lê Ngọc Triệu i LỜI CÁM ƠN Để hồn thành luận án, tơi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Kết, GS.TSKH Trần Duy Quý, ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn, giúp đỡ tận tình để tơi tơi hồn thành luận án Xin đƣợc trân trọng cám ơn quý thầy cô thuộc Ban đào tạo sau đại học -Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam, Viện Di truyền Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Đà Lạt truyền đạt kiến thức, tạo điều kiện cho suốt q trình học tập, sinh hoạt chun mơn thực luận án Để có đƣợc kết nghiên cứu luận án này, xin chân thành cám ơn Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia đặc biệt TS Trần Văn Tiến tạo điều kiện cho tham gia, thực đề tài “Nghiên cứu phân loại đánh giá đa dạng di truyền chi sâm (Panax L.) Việt Nam” Xin đƣợc tri ân đến Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên nhƣ anh em, bạn bè đồng nghiệp gần xa, … chia sẻ, hỗ trợ tơi q trình thực luận án Sau cùng, từ tận đáy lịng, tơi xin tỏ lịng biết ơn đến cha mẹ tôi, ngƣời sinh thành, nuôi dƣỡng nên ngƣời vợ động viên chia sẻ để tơi phấn đấu hồn thành luận án Lê Ngọc Triệu ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cám ơn .ii Danh mục chữ viết tắt .vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài .1 Mục tiêu đề tài .2 Ý nghĩa khoa học thực tiễn .2 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu đề tài Những đóng góp luận án Chƣơng 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vai trò loại sâm đời sống 1.2 Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu phân loại, khảo sát quan hệ phát sinh chủng loại taxon đánh giá đa dạng di truyền quần thể thực vật .7 1.2.1 Các thị đặc điểm thực vật .7 1.2.1.1 Các phƣơng pháp dựa đặc điểm hình thái 1.2.1.2 Các phƣơng pháp dựa thị phân tử 1.2.2 Các phƣơng pháp dựa thị phân tử nghiên cứu hệ thống học quan hệ phát sinh chủng loại thực vật 10 1.2.2.1 Các phƣơng pháp xây dựng quan hệ phát sinh chủng loại 11 1.2.2.2 Cơ sở khoa học việc sử dụng trình tự DNA bảo thủ cao phân tích quan hệ phát sinh chủng loại thực vật 11 1.2.2.3 Phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền quần thể 14 1.3 Vị trí hệ thống học phân loại chi Panax, họ Araliaceae 16 1.3.1 Các nghiên cứu giới 16 1.3.2 Các nghiên cứu Việt Nam .22 1.4 Quan ̣phat́ sinh chi Panax L dƣa ṭ hống mƣ́ c đô ̣ phân tƣ̉ .23 hoc 1.4.1 Các nghiên cứu phân loại quan hệ phát sinh chủng loại taxon chi Panax khơng dựa vào giải trình tự DNA 25 1.4.1.1 Các nghiên cứu giới .25 1.4.1.2 Các nghiên cứu Việt Nam 26 ii 1.4.2 Các nghiên cứu dựa giải trình tự vùng DNA bảo thủ 27 1.4.2.1 Các nghiên cứu giới .27 1.4.2.2 Các nghiên cứu Việt Nam 32 1.4.3 Các nghiên cứu phân loại quan hệ phát sinh chủng loại taxon chi Panax sử dụng DNA fingerprint từ vùng DNA bảo thủ 33 1.5 Các nghiên cứu đánh giá đa daṇ g di truyền quần thể chi Panax .34 1.6 Nghiên cứu thành phần hoạt chất chi Panax 39 1.7 Nhận xét chung .41 Chƣơng VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Vật liệu nghiên cứu 44 2.1.1 Vật liệu cho nghiên cứu vị trí phân loại quan hệ phát sinh chủng loại sâm Lang Bian taxon Panax khác 44 2.1.2 Vật liệu cho nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể sâm Lang Bian 46 2.1.3 Vật liệu cho nghiên cứu sơ thành phần saponin sâm Lang Bian .46 2.2 Nội dung nghiên cứu 47 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 47 2.3.1.Điều tra, thu thập mẫu 47 2.3.1.1 Thu thập, xử lý mẫu để nghiên cứu hình thái thực vật học, lƣu trữ nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loại 50 2.3.1.2 Thu thập mẫu nhằm nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể .50 2.3.1.3 Thu thập mẫu nhằm nghiên cứu sơ thành phần saponin 51 2.3.2 Nghiên cứu hình thái nhằm bổ sung liệu cho xác định vị trí phân loại sâm Lang Bian 51 2.3.3 Tách chiết DNA kiểm tra chất lƣợng, hàm lƣợng DNA mẫu 52 2.3.4 Phân loại, phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trình tự bảo thủ 52 2.3.4.1 Phân lập khuếch đại vùng DNA bảo thủ .52 2.3.4.2 Phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trình tự DNA bảo thủ cao 55 2.3.5 Phân tích đa dạng biến động di truyền quần thể dựa DNA fingerprint nảy sinh kỹ thuật ISSR .55 2.3.5.1 Sử dụng kỹ thuâṭ ISSR để hình thành DNA fingerprint 56 2.3.5.2 Phân tích đa dạng biến động di truyền dựa DNA fingerprint thu nhận đƣợc .57 2.3.6 Sơ phân tích, so sánh thành phần saponin 59 i Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 61 3.1 Vị trí phân loại, quan hệ phát sinh chủng loại sâm Lang Bian số loài khác chi dựa đặc điểm hình thái trình tự DNA bảo thủ 61 3.1.1 Vị trí phân loại thực vật sâm Lang Bian dựa đặc điểm hình thái 61 3.1.2 Quan hệ phát sinh chủng loại sâm Lang Bian taxon chi dựa trình tự bảo thủ 66 3.1.2.1 Quan hệ phát sinh chủng loại sâm Lang Bian taxon chi dựa vùng gene matK 66 3.1.2.2 Quan hệ phát sinh chủng loại sâm Lang Bian taxon chi dựa vùng trình tự ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 75 3.1.2.3 Quan hệ phát sinh chủng loại sâm Lang Bian taxon chi khác dựa trình tự vùng gene 18S rRNA 84 3.1.2.4 Khảo sát quan hệ phát sinh chủng loại dựa vào việc phối hợp vùng trình tự 18S rRNA, ITS1-5,8S rRNA-ITS2 phần gene matK 90 3.1.3 Vị trí phân loại sâm Lang Bian dựa quan hệ phát sinh chủng loại với taxon Panax khác mức độ phân tử đặc điểm hình thái 102 3.2 Đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm Lang Bian 104 3.2.1 Kết thu thập, chuẩn bị mẫu chọn lọc mồi phục vụ cho đánh giá đa dạng di truyền quần thể .104 3.2.2 Kết đánh giá đa dạng di truyền quần thể LD 110 3.2.3 Kết đánh giá đa dạng di truyền quần thể DR 116 3.2.4 Kết đánh giá đa dạng di truyền tổng thể taxon nghiên cứu 122 3.3 Kết nghiên cứu phân tích, so sánh sơ thành phần saponin sâm Lang Bian số taxon chi khác 129 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .132 Kết luận 132 Kiến nghị 132 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .134 TÀI LIỆU THAM KHẢO 135 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: PHỔ ĐỒ TRÌNH TỰ CÁC VÙNG DNA BẢO TỒN CỦA CÁC TAXON ĐƢỢC THU THẬP TRONG NGHIÊN CỨU PHỤ LỤC 2: SO SÁNH TRÌNH TỰ VÙNG BẢO TỒN GIỮA CÁC TAXON KHẢO SÁT PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ ĐIỆN DI DNA KHUẾCH ĐẠI BẰNG CÁC MỒI ISSR v AFLP: DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Amplified Fragment Length Polymorphism CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence DDBJ: DR: DNA Data Bank of Janan Đam Rông G-Rb1: Ginsenoside Rb1 G-Rd: Ginsenoside Rd G-Re: Ginsenoside Re G-Rg1: Ginsenoside Rg1 He: expected heterozygosity ISSR: Inter Simple Sequence Repeats ITS: Internal transcribed spacer IUCN: International Union for Conservation of Nature LD: Lạc Dƣơng M-R2: Majonoside R2 NCBI: N-R1: National Centre for Biotechnology Information Notoginsenosid R1 PPB: PS: percentage of polymorphic bands Panax stipuleanatus (lá chét nguyên) PSDL: Panax stipuleanatus (lá chét xẻ) PV: Panax vietnamensis PVF: Panax vietnamensis var fuscidiscus PVL: Panax vietnamensis var langbianensis RAPD: Random Amplified Polymorphic RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism rRNA: ribosomal RNA SCAR: Sequence Characterized Amplified Region SNP: Single Nucleotide Polymorphism SSR: Simple sequence Repeat - Microsatellites VNTR: Variable Number of Tandem Repeats - Minisatellites v DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 1.1 Đặc điểm hình thái tƣơng đồng khác biệt chi Aralia chi Panax 18 1.2 Phân loại taxon Panax châu Á theo quan điểm nhà nghiên cứu hệ thống học thực vật giai đoạn 1970-1975 19 1.3 Phân loại taxon Panax châu Á theo quan điểm nhà nghiên cứu hệ thống học thực vật giai đoạn 1996-2014 20 1.4 Số lƣợng nhiễm sắc thể theo Yang (1981) 21 2.1 Các mẫu sử dụng để tách chiết DNA cho phân tích quan hệ phát sinh chủng loại 44 2.2 Mã truy cập trình tự 18S rRNA; vùng ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 phần gene matK mẫu thu thập Việt Nam sử dụng nghiên cứu phân loại quan hệ phát sinh chủng loại 45 2.3 Các trình tự 18S rRNA, ITS1-5,8SrRNA-ITS2 gen matK đƣợc lấy từ Genbank sử dụng nghiên cứu phân tích quan hệ phát sinh chủng loại .45 3.1 So sánh đặc điểm hình thái sâm Lang Bian, P vietnamensis P vietnamensis var fuscidiscus 62 3.2 Thành phần số lƣợng nucleotide trình tự phần gene matK taxon đƣợc khảo sát 68 3.3 Những vị trí khác biệt trình tự phần gene matK đối tƣợng nghiên cứu so với taxon khác chi 69 3.4 Khoảng cách di truyền taxon đƣợc khảo sát dựa trình tự phần vùng gene matK 70 3.5 Sự khác biệt trình tự gene matK Panax sp., P vietnamensis P vietnamensis var fuscidiscus 72 3.6 So sánh trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 mẫu thuộc taxon Panax vietnamensis từ nguồn khác 77 3.7 Thành phần, số lƣợng nucleotide trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 khảo sát 78 3.8 Những vị trí khác biệt trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 đối tƣợng nghiên cứu so với taxon chi 79 3.9 Khoảng cách di truyền taxon khảo sát dự trình tự vùng ITS1– 5,8SrRNA–ITS2 81 3.10 Sai khác sâm Lang Bian với Panax vietnamensis P vietnamensis var fuscidiscus dựa trình tự vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 84 v 3.11 Phành phần số lƣợng nucleotide trình tự vùng 18S rRNA taxon đƣợc khảo sát 86 3.12 Các vị trí khác biệt taxon Panax khảo sát dựa trình tự vùng gene 18S rRNA 87 3.13 Khoảng cách di truyền taxon khảo sát dựa trình tự 18S rRNA .88 3.14 Đặc điểm thành phần số lƣợng nucleotide trình tự phối hợp taxon khảo sát .94 3.15 Khoảng cách di truyền taxon Panax đƣợc khảo sát dựa phối hợp ba trình tự DNA bảo thủ 18S rRNA, ITS1-5,8S rRNA-ITS2 phần gene matK 95 3.16 Ký hiệu, độ tuổi phân nhóm tuổi cá thể thuộc quần thể LD 105 3.17 Ký hiệu, độ tuổi phân nhóm tuổi cá thể thuộc quần thể DR 106 3.18 Đặc điểm mồi ISSR đƣợc chọn lọc sử dụng để làm nảy sinh DNA fingerprint làm sở đánh giá đa dạng di truyền .107 3.19 Tỷ lệ band đa hình mức độ tổng thể mẫu nghiên cứu, quần thể nhóm tuổi quần thể 109 3.20 Hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu thuộc nhóm tuổi lớn quần thể LD .111 3.21 Hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu thuộc nhóm tuổi nhỏ quần thể LD .112 3.22 Hệ số tƣơng đồng di truyền cặp mẫu từ hai nhóm tuổi lớn nhỏ quần thể LD 113 3.23 Hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu thuộc nhóm tuổi lớn quần thể DR .117 3.24 Hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu thuộc nhóm tuổi nhỏ quần thể DR .118 3.25 Hệ số tƣơng đồng di truyền cặp mẫu từ hai nhóm tuổi lớn nhỏ quần thể DR 119 3.26a Hệ số tƣơng đồng di truyền cặp mẫu từ nhóm tuổi lớn thuộc quần thể LD tất mẫu thuộc quần thể DR 123 3.26b Hệ số tƣơng đồng di truyền cặp mẫu từ nhóm tuổi nhỏ thuộc quần thể LD tất mẫu thuộc quần thể DR 124 3.27 Thành phần saponin theo chất chuẩn mẫu khảo sát .130 v