Nghiên cứu phân loại họ Chè Theaceae D Don ở tỉnh Lâm Đồng và đề xuất biện pháp bảo tồn một số loài bị đe dọa Nghiên cứu phân loại họ Chè Theaceae D Don ở tỉnh Lâm Đồng và đề xuất biện pháp bảo tồn một số loài bị đe dọa luận văn tốt nghiệp thạc sĩ
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ Cao Lệ Quyên NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀO GIỐNG LÚA Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ Cao Lệ Quyên NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀO GIỐNG LÚA Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Phạm Xuân Hội PGS.TS Đinh Đoàn Long Hà Nội – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án cơng trình nghiên cứu thực cá nhân, đƣợc thực dƣới hƣớng dẫn khoa học PGS.TS Phạm Xuân Hội PGS.TS Đinh Đoàn Long Các số liệu, kết luận án trung thực chƣa đƣợc tác giả công bố cơng trình khác Tơi xin chịu trách nhiệm nghiên cứu Hà Nội, ngày 20 tháng 09 năm 2017 Nghiên cứu sinh Cao Lệ Quyên LỜI CẢM ƠN NCS xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Phạm Xuân Hội (Viện Di truyền Nông nghiệp), PGS TS Đinh Đoàn Long (Khoa Y Dược, Trường Đại học Quốc Gia Hà Nội) TS Michel Nicole (Trung tâm Nghiên cứu Vì Sự Phát triển, Montpellier, Pháp) người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho NCS suốt thời gian học tập, thực hoàn thành luận án NCS xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Phòng Sau Đại học , Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học (Trường ĐH KHTN) Ban lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp tạo điều kiện thuận lợi q trình học tập, nghiên cứu hồn luận án NCS xin chân thành cảm ơn thầy,các cô Bộ môn Di truyền (Khoa Sinh học, Trường ĐH KHTN) giảng dạy NCS trình học tập tập thể cán nghiên cứu Bộ môn Bệnh học Phân tử (Viện DTNN) bạn bè, đồng nghiệp giúp đỡ, đóng góp ý kiến để NCS hồn thiện luận án Tơi xin cảm ơn gia đình người thân ln bên cạnh tôi, quan tâm, cảm thông giúp đỡ suốt thời gian học tập thực luận án Hà Nội ngày 20 tháng 09 năm 2017 NCS Cao Lệ Quyên MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG 12 MỞ ĐẦU 14 Chƣơng TỔNG QUAN 20 1.1 HÁN HẠN-YẾU TỐ KÌM HÃM TRONG SẢN XUẤT NƠNG NGHIỆP 20 1.1.1 Khái niện hạn hán 20 1.1.2 Tác động tiêu cực hạn hán đến sản xuất nông nghiệp 21 1.2 PHẢN ỨNG CỦA THỰC VẬT TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN 24 1.2.1 Ảnh hƣởng hạn hán thực vật 24 1.2.2 Đáp ứng chống, chịu hạn thực vật 26 1.2.3 Cơ sở phân tử đáp ứng chống chịu hạn thực vật 29 1.3 CÁC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT 34 1.3.1 Nhóm nhân tố phiên mã NAC 36 1.3.2 Nhóm nhân tố phiên mã MYB/MYC 37 1.3.3 Nhóm nhân tố phiên mã bZIP 38 1.3.4 Nhóm nhân tố phiên mã AP2/ERF 40 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG LÚA CHUYỂN GEN CHỊU HẠN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 41 1.4.1 Nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chịu hạn giới 44 1.4.2 Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen Việt Nam 50 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 53 2.1 VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 53 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 53 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 54 2.1.3 Thiết bị 57 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 57 2.2.1 Xƣ̉ lý lúa điều kiện hạn 57 2.2.2 Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA 58 2.2.3 Sinh tổng hợp DNA bổ sung hoàn chỉ nh (full-length cDNA) 60 2.2.4 Nhân đoạn DNA đặc hiệu kĩ thuật PCR 62 2.2.5 Thiết kế vector chuyển gen 65 2.2.6 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens 67 2.2.7 Đánh giá khả hình thành callus tái sinh lúa 68 2.2.8 Chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium 69 2.2.9 Đánh giá số lƣợng bản của gen chuyển 71 2.2.10 Đánh giá sinh trƣởng, phát triển, khả chịu hạn lúa chuyển gen 74 2.2.11 Đánh giá biểu gen OsDREB1A phƣơng pháp PCR định lƣợng 75 2.2.12 Đánh giá biểu gen phƣơng pháp PCR bán định lƣợng76 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 77 3.1 PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN OsDREB1A/OsDREB2A 77 3.1.1 Phân lập trình tự mã hóa OsDREB1A/OsDREB2A 77 3.1.2 Thiết kế vector chuyển gen OsDREB1A/OsDREB2A 92 3.1.3 Biến nạp vector biểu vào A tumefaciens chủng LBA4404 94 3.2 NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO GIỐNG LÚA Ở VIỆT NAM 95 3.2.1 Khả hình thành callus tập đồn giống lúa Việt Nam 95 3.2.2 Khả tái sinh tập đoàn giống lúa Việt Nam 99 3.2.3 Khảo sát khả tiếp nhận gen giống lúa Việt Nam 103 3.3 TẠO GIỐNG LÚA CHÀNH TRỤI CHUYỂN GEN 108 3.3.1 Biến nạp trình tự mã hóa OsDREB1A/OsDREB2A vào lúa Chành trụi 108 3.3.2 Sàng lọc dòng Chành Trụi chuyển gen 108 3.4 ĐÁNH GIÁ KIỂU HÌ NH CÂY CHUYỂN GEN 118 3.4.1 Đánh giá sinh trƣởng phát triển dòng lúa chuyển gen T2 118 3.4.2 Đánh giá khả giữ nƣớc phục hồi dòng lúa chuyển gen T2 120 3.4.3 Đánh giá khả chịu hạn và tạo hạt của các dòng chuyển gen T3 124 3.4.4 Đánh giá biểu OsDREB1A gen liên quan chịu hạn khác chuyển gen hệ T3 127 KẾT LUẬN 130 KIẾN NGHỊ 132 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 133 TÀI LIỆU THAM KHẢO 134 PHỤ LỤC 151 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 3-AT 3-Amino-1, 2, 4-triazole A thaliana Arabidopsis thaliana A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens ABA Abscisic acid ABRE Yếu tố đáp ứng acid abscisic chứa trình tự ACGT (ACGT-containing abscisic acid response element) AD Vùng tác động (acting domain) ADB Ngân hàng phát triển châu Á (Asian Development Bank) AMP Adenosine monophosphate ADP Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphosphate BAP 6-Benzylaminopurine BD Vùng liên kết (binding domain) BĐKH Biến đổi khí hậu bp Cặp bazơ (base pair) CBB Coomassie Brilliant Blue cDNA DNA bổ sung (complementary deoxyribonucleic acid) CDBK protein kinase phụ thuộc canxi (calciumdependent protein kinase) Ct Chu kỳ ngƣỡng (threshold cycle) dCTP Deoxycytidine triphosphate DEPC Diethylpyrocarbonate DMSO Dimethyl sulfoxide dNTP Deoxyribonucleoside Triphosphate DRE Yếu tố đáp ứng hạn (dehydration responsive element) DREB Protein liên kết với yếu tố đáp ứng hạn DRE (dehydration responsive element-binding protein) E coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium bromide FAO Tổ chức lƣơng thực Nông nghiệp Liên Hợp quốc (Food and Agriculture Organization of United Nations) GMP Guanosine monophate HSP Protein sốc nhiệt (Heat shock protein) HK Histidine Kinase IPCC Ủy ban liên phủ Biến đổi khí hậu (Intergovernmental Panel on Climate Change) IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside ... DEPC Diethylpyrocarbonate DMSO Dimethyl sulfoxide dNTP Deoxyribonucleoside Triphosphate DRE Yếu tố đáp ứng hạn (dehydration responsive element) DREB Protein liên kết với yếu tố đáp ứng hạn DRE (dehydration... Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 53 2.1 VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 53 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 53 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 54 2.1.3 Thiết bị 57... cDNA DNA bổ sung (complementary deoxyribonucleic acid) CDBK protein kinase phụ thuộc canxi (calciumdependent protein kinase) Ct Chu kỳ ngƣỡng (threshold cycle) dCTP Deoxycytidine triphosphate DEPC