Đánh giá sự thay đổi tăng sinh và cấu trúc khung xương tế bào gốc trung mô cuống rốn người trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

Vaitròcủacácnghiêncứusinhhọctrongkhônggian

Nghiên cứu Sinh học không gian là một phần quan trọng các chương trình vũtrụ của các trung tâm vũ trụ trên thế giới như NASA (Cục Hàng không và khônggian quốc gia Mỹ), ESA (Cơ quan hàng không châu Âu), JAXA (Cơ quan thámhiểm không gian Nhật Bản). Sinh học không gian đã là một phần của chương trìnhKhoa học sự sống của NASA từ những năm 1960 NASA ngày càng tập trung vàoviệc ứng dụng các kỹ thuật tiên tiến hiện đại của công nghệ sinh học, sinh học phântử, sinh học tế bào để nghiên cứu, khám phá và đánh giá tác động của các chuyếnbay trong không gian lên quá trình sinh học Với các hệ thống công cụ nghiên cứumạnh của thế kỉ 21, các nhà khoa học sẽ nghiên cứu sâu hơn các cơ chế thích nghicủa vi khuẩn, thực vật và động vật đối với môi trường không trọng lực Điều này sẽgiúp chúng ta hiểu được những cách cơ bản mà các hệ thống sinh vật sử dụng trọnglực để điều hòa quá trình tăng trưởng, quá trình biến dưỡng, sinh sản và phát triển,cũng như hiểu được cách mà chúng sửa chữa các sai hỏng, bảo vệ chúng khỏi bệnhtật,truyềnnhiễm.

Trong các ngành khoa học được lựa chọn để nghiên cứu, Hội đồng nghiêncứu quốc gia của Mỹ đã đưa ra khuyến nghị nghiên cứu khoa học trongấn phẩm“Chiến lược Y-Sinh học không gian trong thế kỉ mới” (năm 1998) Ở đây, Hội đồngkêu gọi NASA tập trung nghiên cứu sinh học không gian ở tất cả các cấp độ tổ chứcsinh học, từ sinh học phân tử tế bào đến các mô, cơ quan cho đến toàn bộ hệ thốngcơ thể dựa trên tất cả các phương pháp nghiên cứu hiện đại Mục tiêu chính củachươngtrìnhnghiêncứusinhhọckhông giancủaNASAbaogồm:

- Sử dụng có hiệu quả các đặc tính môi trường vi trọng lực và không gian đểnâng cao hiểu biết của chúng ta về sự thích ứng và chức năng của các quá trình sinhhọccơbảntrongchuyếnbay

- Phát triển một nền tảng tri thức khoa học và công nghệ, sẽ góp phần đảmbảosự antoàn củaconngườitrongquátrìnhthămdòkhônggian

- Áp dụng kiến thức và công nghệ không gian để nâng cao khả năng cạnhtranh,giáodụcvàchấtlượngcuộc sốngtrêntráiđấtcủa ngườidân.

- Các thí nghiệm Sinh học không gian của NASA giúp khám phá cách thứccácchuyếnb a y tácđộnglên các visinh vật , t h ự c vật vàđộngvậtt r o n g suố tchu trìnhsốngcủachúng.Cácyếutốtrênkhônggianđãchothấychúngcóảnhhưởngđếncách ệthốngsinhhọcbaogồmcáctrườngtrọnglượngcựctiểu,phóngxạvàtừtrường,cũngnhưcáctươ ngtácvàstressgiữacácloàitrong môitrườngkhông gian. Chương trình Sinh học không gian đã được tập trung triển khai ở nhiều nướcphát triển mạnh lĩnh vực hàng không không gian Chương trình này tập trung vàocáchướngchínhnhư sau:

- Vi sinh vật: nghiên cứu tác động của các chuyến bay không gian lên sựsống,tiếntrìnhsinhhọc cũngnhư độnglựcpháttriêncủaquầnthểvisinhvật

- Sinh học phân tử tế bào: nghiên cứu tác động của các chuyến bay khônggianlênsự sốngmứcphântử vàtếbào

- Sinh học thực vật: Hiểu được cơ chế đáp ứng và tăng trưởng của thực vậttrongcác chuyếnbay

- Sinh học động vật: Xác định các cơ chế cơ bản mà động vật sử dụng đểthíchứngvớicác chuyếnbay,đặcbiệtlàkhitrọnglựcthayđổi

- Sinh học phát triển, sinh sản và tiến hóa: Xác định các tác động của khônggianlênsự pháttriển,sinhsảnvàtiếnhóa.

Từnhững ýnghĩavàmục tiêutrên,việc nghiên sinhhọc khônggianđón gvaitròrấtquantrọng t ro ng lĩnhvựchàngkhôngvũtrụ.ỞViệtNam, cácnghi êncứu về tác động của điều kiện không gian (môi trường không trọng lực và vi trọnglực) lên các hệ thống sinh vật sống còn hạn chế bởi nhiều nguyên nhân, trong đókinh phí thực hiện các thí nghiệm vẫn là nguyên nhân lớn nhất Đây không chỉ làkhók h ă n m à c h ú n g t a g ă p p h ả i , đ â y cũn gl à v ấ n đ ề k h ó k h ă n ở c ả c á c n ư ớ c c ó ngành hàng không không gian phát triển như Mỹ, Nhật, châu Âu…Do đó, việc xâydựng, thiết kế các mô hình mô phỏng trạng thái vi trọng lực trong không gian sẽkhông chỉ giải quyết vấn đề kinh phí thực hiện thí nghiệm, mà còn tiết kiệm, rútngắn thời gian nghiên cứu,đánh giá tác động của môi trường vi trọng lực trongkhônggianlêncáchệthốngsinhhọc.

Giớithiệuvềvitrọnglựcvàvitrọnglựcmô phỏng

Vitrọnglực

Trong vũ trụ, các phi hành gia không thể đi lại bình thường như ở Trái Đấtmàdichuyểnlơlửngtrongkhônggian.Điềunàylàdovitrọnglực(microgravity).

Theo định nghĩa của Cơ quan hàng không và vũ trụ Hoa Kỳ NASA, vi trọng lực làđiều kiện mà trong đó vật thể trở nên gần như mất trọng lực [1] Từ “vi” trong vitrọng lực có nghĩa là rất nhỏ Vi trọng lực xảy ra khi lực kéo của trọng lực trở nênyếu đi Trong môi trường vi trọng lực, rất dễ dàng để di chuyển các vật nặng. Phihành gia có thể dịch chuyển vật có khối lượng đến hàng chục kilogram với chỉ bằngmộtngóntay.

Lực hấp dẫn làm cho mọi vật thể kéo mọi vật thể khác về phía nó Một số ýkiến cho rằng không có trọng lực trong không gian Trên thực tế, một lượng nhỏtrọng lực có thể được tìm thấy ở mọi nơi trong không gian Lực hấp dẫn là thứ giữmặt trăng trên quỹ đạo quanh Trái Đất Lực hấp dẫn khiến Trái Đất quay quanh mặttrời Nó giữ cho mặt trời ở đúng vị trí trong thiên hà Milky Way Tuy nhiên, lực hấpdẫn trở nêny ế u h ơ n t h e o k h o ả n g c á c h M ộ t t à u v ũ t r ụ c ó t h ể đ i đ ủ x a s o v ớ i T r á i Đất để người bên trong chịu tác động bởi rất ít trọng lực Nhưng đây không phải làlý do tại sao mọi thứ lơ lửng trên tàu vũ trụ trong không gian Trạm vũ trụ quốc tếquay quanh Trái Đất ở độ cao từ 300 đến 400 km Ở độ cao đó, lực hấp dẫn của TráiĐất bằng khoảng 90% lực hấp dẫn của nó trên bề mặt hành tinh Nói cách khác, nếumột người nặng 50 kg trên bề mặt Trái Đất đi đến trạm vũ trụ, thì người đó sẽ nặng45kgkhiđếntrạm [1,2].

Tuy 90% trọng lực Trái Đất tác động đến trạm vũ trụ, trên thực tế các phihành gia và vật thể đều lơ lửng trong không gian ở đây, nguyên nhân là bởi sự rơi tựdo Trong chân không, trọng lực làm cho tất cả các vật thể rơi với tốc độ như nhau.Khốilượngcủa vậtkhôngquantrọng.Nếumộtngười đánhrơim ột chiếcb úavàmột chiếc lông vũ, không khí sẽ làm chiếc lông vũ rơi chậm hơn Nhưng nếu khôngcókhôngkhí,chúngsẽrơivớicùngmộtgiatốc Mộtsốcôngviêngiảitrícó tròchơi rơi tự do, trong đó một cabin được thả dọc theo một tháp cao Nếu lúc đầungười ta buông một vật thì người và vật sẽ rơi với gia tốc như nhau Do đó, vật thểsẽ lơ lửng trước mặt người đó Đó là những gì xảy ra trong trạm không gian vũ trụ.Trạm vũ trụ, phi hành đoàn của nó và bất kỳ vật thể nào trên trạm đều đang rơi vềphía xung quanh Trái Đất Vì tất cả chúng đều rơi cùng nhau, phi hành đoàn và cácvật thể dường như lơ lửng khi so sánh với trạm vũ trụ Và môi trường vi trọng lựctrêntrạmvũtrụcũngđược tạoratừ đó.

Lực hấp dẫncủaTráiĐất kéocác vật thểhướng xuốngmặtđấtv à t r ạ m không gian vũ trụ cũng không phải là ngoại lệ Thực tế, nó vẫn liên tục rơi xuống bềmặt Trái Đất Tuy nhiên, trạm vũ trụ di chuyển với tốc độ rất nhanh (khoảng 28000km/giờ), phù hợp với đường cong của bề mặt Trái Đất [1] Nếu một người ném quảbóng theo phương ngang so vớimặt đất, trọng lực sẽ làm quỹ đạo của quả bóngcong xuống và chạm đất khá nhanh. Trạm vũ trụ quay quanh Trái Đất có quỹ đạo dichuyển với tốc độ thích hợp nên đường cong rơi của nó khớp với đường cong củaTrái Đất Do đó, tàu vũ trụ tiếp tục rơi về phía mặt đất nhưng không bao giờ va vàonó Kết quả là chúng rơi xung quanh Trái Đất Mặt trăng vẫn quay quanh quỹ đạoTrái Đất cũng vì lý do này Do đó, điều kiện vi trọng lực vẫn luôn duy trì trên trạmvũ trụ do cả trạm và các vật thể, cũng như phi hành gia ở đây đều đang rơi về hướngTráiĐất.

Vi trọng lực ảnh hưởng đến cơ thể con người theo nhiều cách [3] Cơ vàxươngcóthểtrởnênyếuhơn nếukhôngcótrọng lực[4].Cácphihànhgiasốn gtrên trạm vũ trụ trải qua hàng tháng trời trong môi trường vi trọng lực Các phi hànhgia du hành đến sao Hỏa cũng sẽ dành nhiều tháng trong môi trường vi trọng lực.Các nghiên cứu về tác động của vi trọng lực là cần thiết để giữ cho các phi hành giaan toàn và khỏe mạnh Ngoài ra, nhiều hiện tượng sẽ diễn ra khác đi trong môitrường vi trọng lực Không có lực hấp dẫn, ngọn lửa sẽ trở nên tròn hơn, tinh thểphát triển tốt hơn [5] Không có trọng lực, hình dạng của chúng hoàn hảo hơn Điềukiệnvitrọnglựcsẽgiúpthực hiệncácnghiên cứukhócóthểlàmđượcởTráiĐất.

Vitrọnglựcmôphỏng

Trong lĩnh vực sinh học trọng lực, cácn g h i ê n c ứ u v ề v i t r ọ n g l ự c t r o n g không gian đã tìm ra nhiều tác động của điều kiện trọng lực lên các quá trình sinhhọc, các cơ chế nhạy cảm với trọng lực, hay sự định hướng dựa vào trọng lực củacác sinh vật Tuy nhiên, việc nghiên cứu trong không gian đã và đang gặp phải mộtsố khó khăn nhất định, bao gồm chi phí đắt đỏ cho các phương tiện nghiên cứu vànhững ảnh hưởng tiêu cực từ môi trường vi trọng lực lên cơ thể phi hành gia Đểkhắc phục những khó khăn trên, các nhà khoa học đã cố gắng tạo ra các mô hình hệthốngs i n h h ọ c m ô p h ỏ n g đ i ề u k i ệ n t ư ơ n g t ự t r ạ n g t h á i v i t r ọ n g l ự c t r ê n m ặ t đ ấ t nhằm nghiên cứu sâu hơn các tác động của điều kiện vi trọng lực hay siêu trọng lựctrêncácsinhvậtsốnghayđốitượngsốngtrênTráiĐất.

Hiện nay có nhiều thiết bị được sử dụng có thể mô phỏng các trạng thái trọnglực khác nhau Đầu tiên là clinostat cổ điển (là một thiết bị sử dụng quá trình xoayvòng để chống lại tác động của trọng lực), thiết bị này được phát triển đầu tiên vàocuối thế kỉ 19 bởi nhà khoa học Julius von Sachs [6] Từ đó tới nay, nhiều thiết bịkhác đã được tạo ra nhằm mô phỏng trạng thái không trọng lực, chúng có thể phânngẫu nhiên sự định hướng của trọng lực Trái Đất của đối tượng nghiên cứu, mà đốitượng này không cảm nhận được sự gia tăng trọng lực (trong các hệ thống clinostat)hay sự bù đắp trọng lực (trong hệ thống nâng từ) [7] Ngoài ra, một hệ thống khácmô phỏng trạng thái không trọng lực là “tháp rơi” (drop- tower), hệ thống này cungcấp các điều kiện rơi tự do thật trên mặt đất, nhưng quá trình này chỉ diễn ra trongvài giây, nó phụ thuộc vào khối lượng và kích cỡ của đối tượng nghiên cứu [8] Tuynhiên các hệ thốngmô phỏng trên không thể cung cấp điều kiệnk h ô n g t r ọ n g l ự c thật bởi chúng luôn bị tác động bởi yếu tố khác liên quan đến kĩ thuật như sự tănggiatốclytâm,sự runglắc,haysự phântáncáclực.

MộthệthốngmôphỏngkhôngthểlàmgiảmvectortrọnglựcTráiĐất,nhưngnó có thể thay đổi ảnh hưởng của vector trọng lực lên một hệ thống sinh học [9] Dođó, một máy mô phỏng không thể tạo ra vi trọng lực thật sự, thay vào đó nó có khảnăngcungcấp“điềukiệnkhôngtrọnglựcchứcnăng”(functionalweightlessness).Đểtránh sự nhầm lẫm và cung cấp một nền tảng cơ bản về vi trọng lực, thuật ngữ “vitrọng lực mô phỏng” (simulated microgravity - SMG) được áp dụng đối với các thínghiệmsửdụnghệthốngmôphỏng,baogồmcácthôngsốtạorasựmôphỏng(kíchthước và hình dạng buồng chứa mẫu, chế độ hoạt động, tốc độ quay hay đường kínhống)[10].Ngoàira,thuậtngữ“vitrọnglực”cònđượcsửdụngtrongcácđiềukiệnvitrọng lực thực sự trên trạmISS (International Space Station) hay các chuyến bayparabol Hơn nữa, thuật ngữ “vi trọng lực” còn được sử dụng để chỉ các mức độ Gkhácnhau,từkhoảng10 -2 Gchotới10 -6 G[11].

Cáchệthống môphỏngvitrọnglực

Clinostat

Hệ thống clinostat là một trong những mô hình đầu tiên được phát minh vàocuốithếkỷ19[6].Đâylàcácthiếtbịquayvàchủyếuđượcsửdụngđểướctính ảnh hưởng của vi trọng lực mô phỏng lên thực vật Mô hình này đã được cải tiếnthành clinostat xoay nhanh, được áp dụng cho nghiên cứu nuôi cấy tế bào [17] Chođến nay, clinostat 3D và máy định vị ngẫu nhiên (RPM) là hệ thống phổ biến nhấtđượcsử dụngchonghiêncứutếbàođộngvật[18,19,20].

Tất cả các dạng clinostat đều có một dạng phổ biến là mẫu chứa trong hệthống nằm quay vuông góc với trường trọng lực để cản trở sự việc nhận biết vectorgia tốc trọng trường của một hệ thống sinh học (Hình 1.1) Clinostat với một trụcquay được gọi là clinostat 2D (Hình 1.2) Trong khi đó ở clinostat 3D, có một trụcthứ hai được lắp đặt vuông góc với trục đầutiên, vận hành vớim ộ t t ố c đ ộ v à s ự định hướngổn định (Hình 1.3) Nếu tốc độv à h ư ớ n g q u a y đ ư ợ c t h a y đ ổ i n g ẫ u nhiên trong quá trình vận hành, thì hệ thống mô phỏng đó được gọi là máy định vịngẫu nhiên Những clinostat đầu tiên có tốc độ quay chậm từ 1-10 vòng/phút.

Khái niệm về clinostat quay nhanh (fast rotating clinostat) được sử dụng vớimục đích nghiên cứu tế bào [9], hay các sinh vật nhỏ và thực vật, được WolfgangBriegleb giới thiệu vào những năm 1950 Sự quay nhanh và ổn định của hệ thống sẽngăn cản quá trình lắng của mẫu nghiên cứu Việc quan sát sự chuyển động của cácphầntửnằmởvùnglâncậntrongốngtrụchaybuồngquaychothấycácphầnt ửnày chịu một lực làm chúng di chuyển theo một con đường xoay vòng Đường kínhcác vòng này càng giảm thì tốc độ quay càng tăng, cuối cùng chúng sẽ tiến tới mộtgiai đoạn mà ở đó các chuyển động được cảm ứng bởi trọng lực có thể được loại bỏ.Do đó, một tế bào có thể quay quanh trục của nó và được bao quanh bởi một lớpchấtlỏng[18].Từnguyênlýcơbảnnày,nhiềuhệthốngclinostatđượcpháttri ểnvớinhiềuhệthốnghỗtrợnhưhệthốngkínhhiểnviquansát( C l i n o s t a t Microscope), hệ thống hỗ trợ đo động lực trực tuyến (Photomultiplier Clinostat), hệthốngc ố đ ị n h t r o n g q u á t r ì n h q u a y ( P i p e t t e C l i n o s t a t ) , h ệ t h ố n g n g h i ê n c ứ u đ i ề u kiệnngậpchìm(Submersedclinostat),hệthốngnuôitếbàobámdính… [7]

Hình 1.1.Nguyên lý cơ bản của hệ thống clinostat 2D [6] A: Các phần tử lắng dướitrọng lực g của Trái Đất B: Trong điều kiện vi trọng lực thực, các phần tử mất quátrình lắng C: Ở một tốc độ quay xác định, không có sự chuyển động nào của cácphần tử liên quan đến vector trọng lực, các phần tử này chỉ chuyển động quanh bảnthânchúng,dođócácphầntử nàyđangnằmtrongtrạngtháivitrọng lựcmôphỏng.

Hình 1.2.Mô hình clinostat 2D (Viện nghiên cứu Y học không gian, Cologne,Đức).

Các hệ thống clinostat thường được sử dụng với nhiều đối tượng, bao gồm tếbào động vật, thực vật hoặc vi khuẩn.H ệ t h ố n g c l i n o s t a t 2 D q u a y n h a n h c ó t h ể đượcs ử d ụ n g c h o v i ệ c n g h i ê n c ứ u v i t r ọ n g l ự c m ô p h ỏ n g t r ê n t r ự n g đ ế g i à y (Paramecium) và trựng roi (Euglena) với kớch thước từ 50àm đến 200àm [7] Năm2019, Touchstone và cộng sự đã sử dụng hệ thống clinostat 2D để nghiên cứu ảnhhưởng của vi trọng lực lên tế bào gốc trung mô [22] Wang và cộng sự năm 2016cũngs ử d ụ n g h ệ t h ố n g c l i n o s t a t 2 D t r ê n r ễ c â yA r a b i d o p s i s t h a l i a n a [ 2 3 ] M ộ t nghiên cứu trên tế bào động vật có vú là nghiên cứu của Yan và cộng sự năm 2015trên tế bào gốc trung mô tủy xương chuột [24] Các nghiên cứu ứng dụng hệ thốngclinostat 3D ngày càngđược sửd ụ n g n h i ề u h ơ n , đ i ể n h ì n h l à n g h i ê n c ứ u c ủ a K i m và cộng sự năm 2017 trên dòng tế bào lympho, các nghiên cứu của Furukawa vàcộng sự, Otsuka và cộng sự, Imura và cộng sự năm

2018 trên các dòng tế bàomyoblastchuộtvàtếbàogốctrung môtủyxương[25,26,27,28].

Buồngquay

Buồng quay (Rotating wall vessel, viết tắt RWV) hay hệ thống bioreactorquay (được phát triển bởi NASA) được thiết kế để nuôi cấy tế bào [29] và các sinhvậtthủysinhn h ư tr ứn g hayphôicá [ 3 0 , 3 1] Các đ ố i tượngđược g i ữ t ro n gd ị c h nuôi cấy, trong khi chúng chuyển động rơi liên tục trong hệ thống Hệ thống nuôicấy ngập chìm phổ biến hiện nay được thiết kế bởi Trung tâm nghiên cứu khônggian của Đức [32], hệ thống này được sửdụng để nghiên cứu quát r ì n h p h á t t r i ể n của cá trong trạng thái vi trọng lực mô phỏng Hình 1.4 mô tả cấu trúc cơ bản củamộtbuồngquaytheonghiêncứucủaBeckervàSouzanăm2013 [33].

Hình 1.4.Mô hình buồng quay (rotating wall vessel-RWV) a: cấu tạo của buồngquay, b: cấu trúc quay 3D trong buồng quay, c: buồng quay thương mại

Buồng quay tế bào phù hợp với các nghiên cứu trên các sinh vật thủy sinhhoặc tế bào nuôi cấy huyền phù Các nghiên cứu trên động vật thủy sinh áp dụng hệthống này bao gồm nghiên cứu của Moorman và cộng sự năm 1999 [31], Li và cộngsự năm 2011 trên phôi cá ngựa vằn [30], nghiên cứu của Brungs và cộng sự năm2011t r ê n p h ô i cá k i ế m [32] B u ồ n g q u a y cũngđ ư ợ c s ử d ụ n g c h o v i k h u ẩ n, đ i ể n hình như nghiên cứu của Gilbert và cộng sự năm 2020 trên trực khuẩnSerratiamarcescens.Ứngdụngcủabuồngquaytrongnuôicấytếbàođộngvật íthơn,tuy nhiên vẫn có một số nghiên cứu được thực hiện như nghiên cứu của Granet và cộngsự năm 1998 trên tế bào xương, nghiên cứu của Radtke và cộng sự năm 2012 trên tếbàobiểumô [34,35].

Máyđịnhvịngẫunhiên

Có giả thiết cho rằng chất lượng của việc mô phỏng vi trọng lực đối với cácmẫu lớn hơn có thể được tăng cường bằng việc quay mẫu quanh hai trục Hệ thốngnày được phát triển đầu tiên ở Nhật Bản và Hà Lan [19] Hệ thống này có hai trụcquay độc lập nhau Trong trường hợp cả hai trục đều quay với một tốc độ và hướngổnđịnh,chúngđượcgọilàclinostat3D.Nếucảhaitrụcđượcvậnhànhvớitốc độvàhướngngẫunhiênthìchúngđượcgọilàmáyđịnhvịngẫunhiên,haymáyđịnhvị vịtríngẫunhiên(randompositioningmachine -RPM)(Hình1.5)[18,20].

Hệ thống máy RPM chủ yếu được sử dụng trên các đối tượng tế bào động vậtcó vú Năm 2013, Aleshcheva và cộng sự đã sử dụng hệ thống này để nghiên cứucác tác động của vi trọng lực lên nguyên bào xương [36] Trong năm 2014, cácnhómn g h i ê n c ứ u c ủ a S o k o l o v s k a y a v à B e n a v i d e s D a m m đ ã t ạ o m ô i t r ư ờ n g v i trọng lực mô phỏng bằng hệ thống RMP để nghiên cứu trên dòng tế bào nội môngườivànguyênbàocơvânchuột[37,38].Cazzanigavàcộngsựnăm2016cũng sửdụnghệthốngnàyđểthínghiệmlêntếbàogốcxương[39].Tuynhiên,hệthống

RMP vẫn chưa được ứng dụng nhiều do cơ chế vận hành, cũng như cách đặt mẫutrong hệ thống để cho các lực phân tán đồng đều vẫn cần được nghiên cứu và pháttriểnthêm.

Tếbàogốctrung mô cuốngrốn

Kháiniệm

Cuốngrốn(umbilicalcord)chứahaiđộngmạchrốnvàmộttĩnhmạchrốn, cả hai được bao phủ bởi một loại một mô liên kết niêm mạc đặc thù, được gọi làthạch Wharton Thạch Wharton này lại được bao phủ bởi một lớp biểu mô màng ối(Hình1.6).Tếbàogốctrungmôcuốngrốn(umbilicalcordmesenchymalstemcell

- ucMSC) được nhóm nghiên cứu của McElreavey phân lập lần đầu tiên từ thạchWharton năm 1991 [40] Các tế bào này thể hiện kiểu hình, độ bám dính và tính đatiềm năng tương tự như các tế bào gốc trung mô (mesenchymal stem cell, viết tắtMSC)từ cácnguồnkhác.

Tế bào gốc trung mô cuống rốn mang đặc điểm của tế bào gốc trung mô điểnhình Chúng cóhình thái giốngnhư nguyênbào sợivới kích thước tế bàon h ỏ , thuôn dài và mảnh[40] Tế bào chứa một nhân lớn, tròn với hạt nhân nổi bật, đượcbao quanh bởi các hạt nhiễm sắc phân tán mịn, tạo cho hạt nhân một hình ảnh rõràng khi quan sát dưới kính hiển vi Phần còn lại của tế bào chiếm một thể tích nhỏbao gồm bộ máy Golgi, lưới nội chất, ti thể và polyribosome Các tế bào phân tánrộng rãi trong quần thể và ma trận ngoại bào được tạo ra bởi một vài sợi liên võng(reticularfibril), khôngcó sựxuấthiệncủacác sợicollagenkhác[41,42]

Cuống rốn được coi là chất thải y tế và việc thu nhận ucMSC là phương phápkhông xâm lấn Hơn nữa, việc nghiên cứu trên ucMSC không bị vướng mắc bởi cácvấn đề đạo đức ucMSC, tương tự như MSC từ các nguồn khác, có khả năng tự làmmới trong khi vẫn duy trì tính đa tiềm năng, tức là chúng có khả năng biệt hóa thànhtế bào mỡ, tế bào xương, tế bào sụn, tế bào thần kinh và tế bào gan, mặc dù đối vớimộts ố l o ạ i t ế b à o đ ã b i ệ t h ó a , u c M S C v ẫ n c h ư a h ì n h t h à n h đ ư ợ c c ơ q u a n h o à n chỉnh [41, 42, 43] Hơn nữa, ucMSC cũng đã thu hút được sự quan tâm lớn vì cácđặc tính điều hòa miễn dịch của chúng Ngày nay, ucMSC được đề xuất như mộtcôngcụlinhhoạtchoyhọc tái tạovàliệuphápmiễndịch.

Lợiíchcủatếbàogốctrungmôcuốngrốn

Quần thể tế bào gốc có thể được phân lập từ các mô phôi thai, thai và môtrưởng thành Tế bào gốc phôi (embryonic stem cell) là một ứng viên hàng đầu chongành kỹ thuậtmô vì khả năng tự tái tạo và tính đa tiềm năng cao( k h ả n ă n g b i ệ t hóa thành tất cả các lớp mầm) cả trongin vitrovàin vivo Tuy nhiên, ngoài nhữnghạn chế về đạo đức, các ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc phôi bị giới hạn nghiêmtrọng bởi những khó khăn về mặt kỹ thuật khi sự thiếu hụt tế bào chưa trưởng thànhcóthểdẫnđếnhìnhthànhuquái(teratoma)[45].

Trái lại, các tế bào gốc trưởng thành, chẳng hạn như tế bào da, tủy xương vàmô mỡ, có thể ứng dụng lâm sàng rộng hơn Tế bào gốc trung mô tủy xương (bonemarrow mesenchymal stem cell - bmMSC) đã được sử dụng trong cấy ghép tự thânvà cấy ghép đồng loại Nhiều thành công trong việc ứng dụng bmMSC tự thân đãđược báo cáo gần đây trong nhiều lĩnh vực như nhồi máu cơ tim [46], bệnh ghépchống chủ (GVHD) [47, 48], bệnh Crohn [49] và kỹ thuật mô xương [50]. Tuynhiên, việc sử dụng kỹ thuật cấy ghép tự thân đôi khi bị giới hạn bởi số lượng tế bàovànhữngthayđổiliênquanđếntuổinhư khảnăngtăngtrưởngvàbiệthóa [51,52].

So với các tế bào gốc trung mô tủy xương (bmMSC) và tế bào gốc phôi,tếbàogốctrungmôcuống rốn(ucMSC) chothấycấu hìnhbiểu hiện gen tươngtựnhư của tế bào gốc phôi và khả năng tự làm mới nhanh hơn tế bào gốc trung mô tủyxương [43] Các tế bào ucMSC dễ dàng được thu nhận qua nuôi cấy tăng sinhinvitrohoặc nuôi cấyexvivo Hơn nữa, ưu điểm đáng giá nhất củau c M S C l à q u y trìnhthuthậpkhôngxâmlấnvàđượcchấpnhậnvềmặtđạođức.

Tương tự như bmMSC, ucMSC có thể được xem xét để ứng dụng trong cấyghép tự thân và cấy ghép đồng loại ucMSC tự thân có thể được sử dụng làm liệupháp gene cho các bệnh di truyền và là liệu pháp tái tạo hoặc kháng viêm trong chấnthương sơ sinh, chẳng hạn như bại não hoặc tổn thương não do thiếu oxy Mặt khác,các nguồn ucMSC thu thập được do hiến tặng có thể được nuôi cấy tăng sinh và trữđông trong ngân hàng tế bào cho bệnh nhân có nhu cầu [44]. Điều cần lưu ý là cácbác sĩ cần xác nhận sức khỏe của em bé là người hiến vì không thể xác định trướcliệu bé có phát triển bình thường mà không gặp vấn đề về sức khỏe hay không; dođó, các xét nghiệm về gene và nhiễm sắc thể cần phải được thực hiện Ngược lại,trong trường hợp người hiến tủy xương, bác sĩ có thể trực tiếp nhìn thấy và kiểm trangườihiến,từđóraquyếtđịnhthunhậntủyxương.Nhiềungânhàngmáucuố ngrốn theo dõi sức khỏe của bé sau khi sinh Do đó, mỗi ứng dụng lâm sàng trênucMSC cần phải được nghiên cứu kỹ những lợi thế và bất lợi của dòng tế bào này[44].

Sựtăngsinhtếbào

Địnhnghĩa

Sinh trưởng và phát triển là một quá trình tất yếu và liên tục của mọi sinh vậttrên Trái Đất Quá trình này diễn ra nhờ vào sự lớn lên và phân chia không ngừngcủa các tế bào trong cơ thể sống, còn gọi là sự phát triển và tăng sinh tế bào Tronggiai đoạn phát triển, tế bào gia tăng thể tích tế bào chất, các bào quan cũng như vậtliệu di truyền Trong khi đó, sự tăng sinh tế bào liên quan đến việc tế bào mẹ phânchia thành hai tế bào con

[53] Sự sinh trưởng của tế bào được chia thành các giaiđoạngọilàchukỳtếbào [54].

Chu kỳ tế bào, hay chu kỳ phân chia tế bào, là chuỗi các sự kiện diễn ra trongmột tế bào khiến nó phân chia thành hai tế bào con (Hình 1.7) Những sự kiện nàybao gồm sự tự sao chépDNA và một số bào quan, sau đó là phân vùng tế bào chấtvàcácthànhphầnkhácthànhhaitếbàocontrongmộtquátrìnhgọilàphânchiatế bào[54].Chukỳtếbàonhânchuẩnbaogồmbốngiaiđoạnriêngbiệt:phaG1,phaS (tổng hợp), pha G2 và pha M (bao gồm nguyên phân và phân bào) Pha M baogồm hai quá trình liênk ế t c h ặ t c h ẽ : n g u y ê n p h â n , t r o n g đ ó n h â n c ủ a t ế b à o p h â n chia và cytokinesis, trong đó tế bào chất của tế bào phân chia tạo thành hai tế bàocon. Quá trình phân chia tế bào này chỉ chiếm khoảng 5% vòng đời của mỗi tế bào,95% còn lại là giai đoạn trung gian (interphase), bao gồm các pha G1, pha S và phaG2.Ngoàira,mộtsốtếbàođặcthùsẽđivàotrạngtháikhônghoạtđộngđượcgọilà phaG0,ởđócáctếbàosẽngừngphânchiatạmthờihoặcvĩnhviễn[54].

Hình1.7.Chukỳtếbào Ở vi khuẩn, sự tăng trưởng của tế bào và sự sao chép DNA diễn ra liên tụctrong hầu hết chu kỳ tế bào và các nhiễm sắc thể đã nhân đôiđược phân phối chocáctếbàoconliênkếtvớimàngplasma.Tuynhiên,ởsinhvậtnhânchuẩn,chukỳtế bàophứctạphơnvàbaogồmbốngiaiđoạnriêngbiệt.Mặcdùsựpháttriểncủatế bào thường là một quá trình liên tục, DNA được tổng hợp chỉ trong một giai đoạncủa chu kỳ tế bào và sau đó các nhiễm sắc thể được sao chép sẽ được phân phối chonhân mới hình thành bằng một chuỗi các sự kiện phức tạp trước khi phân chia tếbào Quá trình chuyển giao giữa các giai đoạn của chu kỳ tế bào được kiểm soát bởimột bộ máy điều hòa được bảo tồn, nó không chỉ điều phối các sự kiện khác nhaucủa chu kỳ tế bào mà còn liên kết chu kỳ tế bào với các tín hiệu ngoại bào kiểm soátsựtăngsinhtếbào [54].

Cácyếutốđiều hòachukỳtế bào

Mỗig i a i đ o ạ n c ủ a c h u t r ì n h t ế b à o đ ư ợ c q u y đ ị n h c h ặ t c h ẽ , v ớ i c á c đ i ể m kiểm tra được đặt ở gần cuối pha G1, ở giai đoạn chuyển tiếp G2/M và gần cuối giaiđoạn metaphase của quá trình nguyên phân (pha M) Các điểm kiểm tra này là cáccơ chế giám sát có chức năng đảm bảo rằngc á c t ế b à o c o n đ ư ợ c t ạ o r a l à c á c b ả n sao của tế bào mẹ với số lượng nhiễm sắc thể chính xác và không bị đột biến Trongđiểm kiểm tra G1, các điều kiện cần thiết cho sự tiến triển trong chu kỳ tế bào đượcđánh giá Một tế bào thường vượt qua điểm kiểm tra G1 nếu nó có kích thước phùhợp, sở hữu năng lượng đầy đủ và không có DNA bị hỏng Chức năng chính củađiểm kiểm tra G2 là đảm bảo rằng sự sao chép của tất cả các nhiễm sắc thể đã hoàntất và không có các đột biến hoặc tổn thương DNA chưa được sửa chữa. Ngoài ra,kích thước tế bào và khả năng dự trữ protein thích hợp cũng được đánh giá trongđiểm kiểm tra này Điểm kiểm tra thoi vô sắc/M đảm bảo rằng tất cả các nhiễm sắcthể chị em được gắn chính xác vào các thoi vô sắc và mỗi tế bào có số lượng nhiễmsắcthểchínhxác [55].

Các chất điều chỉnh chính của chu trình tế bào ở sinh vật nhân chuẩn là cácphức hợp enzyme dị loại, bao gồm các cyclin và kinase phụ thuộc cyclin (Cdks)

[56] Sự biểu hiện của cyclins tăng hoặc giảm trong các giai đoạn riêng biệt của chukỳ tế bào và chúng được chia thành các nhóm dựa trên giai đoạn chu kỳ tế bào màchúng điều chỉnh [56] Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, nồng độ củaCdksvẫn tương đối ổn định Mỗi tiểu đơn vị Cdk có thể liên kết với các cyclin khác nhauvà cyclin liên quan sẽ xác định cơ chất protein nào được phosphoryl hóa bởi phứchợp Cdk-cyclin [57] Hơn nữa, Cdks không có hoạt động kinase trừ khi ràng buộccyclin Ngoài sự ràng buộc của cyclins, việc kích hoạt phức hợp cũng đòi hỏi sựphosphoryl hóacácdưlượngchínhtrongvòng kíchhoạtcủatiểuđơn vịCdk[58].

Các nghiên cứu vềảnhhưởngcủavitrọnglựclênsựtăng sinhtếbào

Tế bào sinh vật cần phân chia để phát triển Sự phân chia tế bào là cần thiếtcho sự tăng sinh tế bào Vi trọng lực mô phỏng có thể ảnh hưởng đến sự tăng sinh tếbào theo những cáchkhác nhau, tùy thuộcvào các hệ thốngmôp h ỏ n g đ ư ợ c s ử dụng và dòng tế bào Sự tăng sinh đã được quan sát thấy trong các tế bào gốc trungmô tủy xương người trong môi trường vi trọng lực tạo ra bằng hệ thống clinostat

3DtrongnghiêncứucủaYugevàcộngsự[59].NghiêncứugầnđâycủaRatushnyyvà cộng sự báo cáo rằng không có sự khác biệt về sự tăng sinh của các tế bào trung môcó nguồn gốc từ mô mỡ giữa nhóm đối chứng (1G) và nhóm vi trọng lực gây ra bởimáy định vị ngẫu nhiên (RPM)[ 6 0 ] B ê n c ạ n h đ ó , m ộ t s ố n g h i ê n c ứ u k h á c đ ã chứng minh rằng vi trọng lực gây ra sự ức chế tăng sinh của nhiều dòng tế bào.Nghiên cứu của Touchstone và cộng sự năm 2019 đã cho thấy rằng các tế bào gốctrung mô chuột có sự giảm tăng sinh trong điều kiện vi trọng lực tạo ra bằng hệthống clinostat 1D [22] Các tế bào gốc tạo máu ở người cũng cho thấy giảm sự tăngsinh trong điều kiện vi trọng lực tạo ra từ buồng xoay tế bào trong nghiên cứu củaPlett và cộng sự [61] Môi trường vi trọng lực mô phỏng tạo ra từ trục quay trọnglực cũng ức chế sự tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc trung mô tủy xương [24] Bêncạnh đó, môi trường vi trọng lực tạo ra từ hệ thống clinostat 2D đã ức chế sự tăngsinh và di chuyển của tế bào gốc trung mô chuột [62] Sự ức chế tăng sinh đã đượcghi lại trong tế bào ung thư hắc tố melanoma nuôi trong môi trường vi trọng lực môphỏng tạo ra bởi máy định vị ngẫu nhiên (RPM) [63] Các nghiên cứu này tiết lộrằng môi trường vi trọng lực mô phỏng có thể tạo ra một loạt các thay đổi về pháttriển,tăngsinhhoặcdi chuyểncáctếbàoởđộngvậtcóvú.

Những thay đổi của tế bào gốc trung mô trong hệ thống clinostat3 D v ẫ n chưa được chứng minh rõ ràng Sự thay đổi mật độ, diễn tiến của chu kỳ tế bào vàcác yếu tố điều hòa chu kỳ vẫn chưa được làm rõ Do đó, nghiên cứu hiện tại đánhgiá ảnh hưởng của môi trường vi trọng lực mô phỏng đối với sự tăng sinh tế bào gốctrung mô cuống rốn người (hucMSC), đặc biệt là trong quá trình phát triển chu kỳ tếbàovàbiểuhiệncủacácproteinđiềuhòachukỳtếbào.

Quátrình apoptosis

Kháiniệm

Quá trình apoptosis, còn gọi là sự chết theo chương trình, là một dạng chết tếbào được lập trình [64] Quá trình này khác với hoại tử, trong đó các tế bào chết dochấn thương Apoptosis là một quá trình có trật tự, trong đó các thành phần của tếbào được tách nhỏ ra trước khi được xử lý bởi các tế bào miễn dịch Apoptosis xảyra bình thường trong quá trình phát triển và lão hóa và như một cơ chế cân bằng nộimôi để duy trì quần thể tế bào trong các mô [64] Apoptosis cũng xảy ra như một cơchếbảovệnhưtrongcácphảnứngmiễndịchhoặckhicáctếbàobịtổnthươngdo bệnh hoặc các tác nhân độc hại [65] Mặc dù có rất nhiều kích thích và điều kiện, cảvề sinh lý và bệnh lý, có thể kích hoạt quá trình tự hủy, không phải tất cả các tế bàosẽ nhất thiết phải chết khi đáp ứng với cùng một kích thích Chiếu xạ hoặc thuốcđược sử dụng cho hóa trị ung thư dẫn đến tổn thương DNA ở một số tế bào, có thểdẫn đến tử vong do apoptosis thông qua con đường phụ thuộc p53 Một số hormone,chẳng hạn như corticosteroid, có thể dẫn đến quá trình apoptosis ở một số tế bào (vídụ, tuyến ức) mặc dù các tế bào khác không bị ảnh hưởng hoặc thậm chí bị kíchthích[65].

Kính hiển vi quang học và điện tử đã xác định những thay đổi hình thái khácnhau xảy ra trong quá trình apoptosis [66] Trong quá trình đầu tiên của apoptosis,có thể nhìn thấy sự co rút của tế bào và pyknosis bằng kính hiển vi quang học [67].Với sự co rút của tế bào, các tế bào có kích thước nhỏ hơn, tế bào chất dày đặc vàcác bào quan được đóng gói chặt chẽ hơn Pyknosis là kết quả của sự ngưng tụchromatin và đây là biểu hiện đặc trưng nhất của apoptosis Khi quan sát bằngphương pháp nhuộm với hematoxylinvà eosin, apoptosis biểu hiệnt r o n g q u ầ n t h ể tế bào ở các tế bào đơn hoặc cụm tế bào nhỏ Tế bào apoptotic xuất hiện dưới dạngkhối tròn hoặc hình bầu dục với tế bào chất bạch cầu ái toan sẫm màu và các mảnhnhiễm sắc thể hạt nhân màu tím dày đặc (Hình 1.8) Kính hiển vi điện tử có thể xácđịnh tốt hơn các thay đổi bên trong tế bào apoptosis Trong giai đoạn đầu của quátrình ngưng tụ chromatin, các mảnh vỡ của nhân cô đặc lại và tập trung xung quanhmàng nhân mặc dù cũng có thể có một số nhân mà các mảnh vỡ này phân bố đồngđều(Hình1.9).

Hình 1.8 Hình ảnh tế bào chuột biểu hiện apoptosis dưới kính hiển vi quang học[68].Tếbàoapoptosisđượcđánh dấubằngmũitênđen.

Hình 1.9.Hình ảnh tế bào tuyến ức dưới kính hiển vi điện tử [69] A: tế bào tuyếnức bình thường B: tế bào tuyến ức biểu hiện apoptosis Tế bào apoptosis được đánhdấubằngmũitênđen.

Các yếutốảnhhưởngđếnapoptosis

Apoptosis xảy ra thường xuyên trong quá trình phát triển và lão hóa và là cơchế cân bằng nội môi để duy trì quần thể tế bào trong các mô Quá trình này cũngxảy ra như một cơ chế bảo vệ trong các phản ứng miễn dịch hoặc khi các tế bào bịtổn thương do bệnh hoặc các tác nhân độc hại [65] Bcl-2 (B-cell lymphoma

2) làprotein điều hòa quá trình apoptosis của tế bào [69] Protein này nằm ở màng ngoàiti thể, nơi nó đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự sống của tế bào và ứcchế hoạt động của các protein tiền apoptosis Các protein tiền apoptosis trong họBcl-2, bao gồm Bax và Bak, thường hoạt động trên màng ti thể để thúc đẩy sự thẩmthấu và giải phóng cytochrom C và ROS, đó là những tín hiệu quan trọng trong conđường apoptosis Các protein tiền apoptosis này lần lượt được kích hoạt bởi cácprotein BH3 và bị ức chế bởi Bcl-2 và Bcl-Xl [70] Bax là một thành viên của họBcl-2 Các thành viên họ Bcl-2 hình thành các đồng nguyên hoặc dị nguyên và hoạtđộng như protein điều hòa chống lại hoặc mở đầu quá trình apoptosis Bax gắn kếtvới Bcl-2 và hoạt động như một chất kích hoạt apoptosis Protein này được báo cáolà tương tác và tăng độ mở của kênh anion phụ thuộc điện thế ti thể, dẫn đến mấttiềm năng màng và giải phóng cytochrom c Sự biểu hiện của gen này được điềuchỉnh bởi chất ức chế khối u p53 và đã được chứng minh là có liên quan đến quátrìnha p o p t o s i s q u a t r u n g g i a n p 5 3 [ 6 9 ] T r o n g c á c t ế b à o đ ộ n g v ậ t c ó v ú k h ỏ e mạnh,phầnlớnBaxđượctìmthấytrongcytosol,nhưngkhibắtđầutruyềntí nhiệu apoptosis,proteinBaxthayđổicấutrúcvàtrởthànhproteinbámmàngtithểtrongquátrì nhapoptosis [71,72].

Phương phápđánhgiáapoptosis

Quá trình apoptosis được nhận biết thông qua các đặc điểm hình thái nhấtđịnh, bao gồm mất sự gắn kết và bất đối xứng của màng sinh chất, sự cô đặc của tếbào chất và nhân và phân mảnh DNA Nhiều phương pháp đã được sử dụng để pháthiện và đếm các tế bào đi vào con đường apoptosis Tuy nhiên, quá trình này có thểbị nhầm lẫn với hoại tử (necrosis) do có một số biểu hiện tương đồng, do đó cầnthiết phải sử dụng các xét nghiệm đặc thù để xác nhận rằng tế bào chết thông quaquá trình apoptosis Các phương pháp đánh giá apoptosis thường được phân thànhcácnhómchính:

- Pháthi ện vàđ ịn hl ượ ng các p r o t e i n li ên q ua n đế na po pt osis :cas pase, chấ tnềnbịphâncắt,chấtđiềuhòavàchấtức chế

- Sựthayđổi phospholipidphosphatidylserine(PS) Đánh giá sự thay đổi hình thái tế bào là phương pháp trực quan nhất để xemxét quá trình apoptosis diễn ra trong quần thể tế bào đó Tế bào có thể được nhuộmvới hematoxylin hoặc eosin và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang Tuy nhiênphương pháp này chỉ nhận biết được các tế bào apoptosis trong giai đoạn trễ. Để cảithiện phương pháp này, hệ thống kính hiển vi truyền qua (transmission electronmicroscopy, viết tắt TEM) đã được ứng dụng Nhờ vào hệ thống này, các điểm đặctrưng của tế bào apoptosis đã được xác định [73] Những đặc điểm này là: (1) hạtnhân dày đặc electron (giai đoạn đầu); (2) sự phân mảnh hạt nhân; (3) màng tế bàocòn nguyên vẹn kể cả ở cuối giai đoạn phân hủy tế bào; (4) các bào quan trong tếbào chất vô tổ chức; (5) không bào lớn rõ ràng; và (6) bong ra ở bề mặt tế bào.Những nhược điểm chính của TEM là chi phí, thời gian và khả năng chỉ khảonghiệm một vùng nhỏ tại một thời điểm. Những bất lợi khác bao gồm khó khăntrong việc phát hiện các tế bào apoptosis do tính chất thoáng qua của chúng vàkhôngcókhảnăngpháthiệncáctếbàoapoptosisởgiaiđoạnsớmnhất.

[74] hoặc phương pháp TUNEL (Terminal dUTP Nick End-Labeling) [75]. Trongphương pháp thang DNA, tế bào được ly giải và điện di trên gel agarose. Mẫu chứanhiều tế bào apoptosis sẽ biểu hiện thành một thang DNA do sự phân mảnh DNAcủa chúng Phương pháp này hữu ích khi đánh giá số lượng lớn tế bào, tuy nhiênkhôngphùhợpvớimẫucósốlượngtếbàoapoptosisthấpvàkhôngthểphân biệtvới quá trình hoại tử Phương pháp TUNEL được sử dụng để kiểm tra các sản phẩmphâncắtendonuclease bằngcáchđánhdấuđầucuốibằngenzymchocácđứt gãysợi DNA [75] Các tế bào apoptosis được phát hiện bằng kính hiển vi ánh sáng, kínhhiển vi huỳnh quangh o ặ c p h ư ơ n g p h á p f l o w c y t o m e t r y X é t n g h i ệ m n à y r ấ t n h ạ y và cũng là một kỹ thuật nhanh có thể hoàn thành trong vòng 3 giờ Nhược điểm làchi phí và thông số không xác định về số lượng đứt gãy sợi DNA cần thiết để pháthiện bằng phương pháp này Phương pháp này cũng có thể xảy ra hiện tượng dươngtính giả từ các tếb à o b ị h o ạ i t ử v à c á c t ế b à o t r o n g q u á t r ì n h s ử a c h ữ a D N A v à phiên mãgen.Vìnhữnglýdonày, nónênđượckếthợpvớimộtxét nghiệmkhác.

Các xét nghiệm ty thể và giải phóng cytochrome c cho phép phát hiện nhữngthayđổitronggiaiđoạnđầucủaapoptosistheoconđườngnộitại(intrinsictpathway) Kính hiển vi quét laser đồng tiêu (Laser scanning confocal microscopy,viết tắt LSCM) tạo rac á c l á t q u a n g h ọ c m ỏ n g x u y ê n q u a c á c t ế b à o s ố n g c ó t h ể được sử dụng để theo dõi một số sự kiện của ty thể trong các tế bào đơn nguyên vẹntheo thời gian [76, 77] Quá trình chuyển đổi tính thấm của ty thể, sự khử cực củamàng trong ty thể, dòng ion Ca 2+ , tình trạng oxy hóa khử của ty thể và các loại oxyphản ứng đều có thể được theo dõi bằng phương pháp này Bấtl ợ i c h í n h l à c á c thông số ty thểmà phương phápnày theodõi cũngcóthể xảy rat r o n g q u á t r ì n h hoạitử.

Ngoài ra, để so sánh mức độ apoptosis giữa hai mẫu tế bào, người ta còn cóthể sử dụng cách đo biểu hiện các protein tham gia vào quá trình apoptosis nhưCaspase, Bax, Bcl-2, Bid… [78] Phương pháp Realtime qRT-PCR thường được sửdụngđểđánhgiámứcđộbiểuhiệncácgenenàytrongtếbào.

Mất màng sinh chất là một trong những đặc điểm xảy ra sớm nhất trong quátrìnha p o p t o s i s ở t ế b à o T r o n g t ế b à o a p o p t o s i s , p h o s p h o l i p i d p h o s p h a t i d y l s e r i n e

(PS) dịch chuyển vị trí từ trong ra ngoài màng sinh chất, tiếp xúc với môi trường tếbào bên ngoài [79] Annexin V là một protein liên kết phospholipid phụ thuộc

Ca 2+ có ái lực cao với PS, do đó có thể liên kết với các tế bào có biểu hiện PS ra ngoài tếbào[ 8 0 ] An nex in Vc ót hể đ ư ợ c l iê nk ế t v ớicá c p h â n tử p h á t h uỳ nh qua ng ba o gồm FITC Phức hợp này vẫn giữ được ái lực cao đối với PS và do đó được sử dụngnhư một đầu dò nhạy cảm để phân tích các tế bào đang trải qua quá trình apoptosisbằng phương pháp flow cytometry [81] Vì sự di chuyển ra ngoài của PS xảy ratrong giai đoạn sớm trong quá trình apoptosis, phương pháp nhuộm FITC AnnexinV có thể xác định quá trình apoptosis ở giai đoạn sớm hơn so với các xét nghiệmdựatrên nhữngthayđổivềnhânnhư phânmảnhDNA[80].

Phương pháp nhuộm FITC Annexin V cho biết sự mất tính toàn vẹn củamàng đi kèm với sự chết tế bào ở giai đoạn cuối do apoptosis hoặc hoại tử Do đó,nhuộm FITC Annexin V thường được sử dụng kết hợp với một loại thuốc nhuộmkhácđánhgiásựsốngtếbàonhưpropidiumiodide(PI)hoặc7-Amino-

Actinomycin (7-AAD) để xác định các tế bào apoptosis sớm [82].P I c h ỉ c ó t h ể thấm qua màng của tế bào đã chết hoặc tế bào đang ở giai đoạn cuối của apotosis(tính thấm của màng những tế bào này đã tăng lên) Chính vì vậy tế bào chết hoặc đivào giai đoạn cuối trong chu trình apotosis sẽ có nhân được nhuộm bởi PI Ví dụ,các tế bào được coi là sống khi cùng âm tính với FITC Annexin V và PI; các tế bàođang trong giai đoạn apoptosis sớm sẽ dương tính với FITC Annexin V và âm tínhvới PI; các tế bào đang trong giai đoạn apoptosis muộn hoặc đã chết đều dương tínhvới FITC Annexin V và PI Xét nghiệm này không phân biệt giữa các tế bào đã chếtkhi bước vào giai đoạn cuối của apoptosis với những tế bào đã chết do hoại tử vìtrong cả hai trường hợp, các tế bào chết sẽ được nhuộm cả FITC Annexin V và PI.Tuy nhiên, khi quá trình apoptosis được đo theo thời gian, các tế bào có thể đượctheo dõi thường xuyên từ âm tính với cả FITC Annexin V và PI (tế bào sống, hoặcchưa biểu hiện apoptosis), đến dương tính với FITC Annexin V và âm tính với PI(apoptosis sớm, màng tế bào vẫn bảo toàn) và cuối cùng là dương tính với

FITCAnnexinVvàPI(apoptosisgiai đoạncuốivàchết) Sựdichuyển của cáct ếbàoqua ba giai đoạn này cho thấy quá trình apoptosis Ngược lại, các tế bào chỉ trải quamột giai đoạn dương tính vớiFITC Annexin V và PI không được coi là tế bàoapoptosis[83,84].

Nhânvàtế bàochất

Địnhnghĩavàvaitròcủanhânvàtếbàochất

Nhân tế bào một cấu trúc chuyên biệt xuất hiện trong hầu hết các tế bào (trừvi khuẩn và tảo lam) và được ngăn cách với phần còn lại của tế bào bởi màng nhân.Màng này kết nối với lưới nội chất của tế bào và có các lỗ rỗng, có thể cho phép cácphân tử lớn xâm nhập [54] Nhân kiểm soát và điều chỉnh các hoạt động của tế bào(ví dụ tăng trưởng và trao đổi chất) và mang các gene, cấu trúc chứa thông tin ditruyền Nhân duy trì tính toàn vẹn của các gene và kiểm soát các hoạt động của tếbào bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của gene Do đó, chúng là trung tâm điềukhiểncủa tếbào[54].

Tế bào chất là chất bán lỏng của tế bào nằm bên ngoài màng nhân và bêntrong màng tế bào Ở sinh vật nhân thực, tế bào chất là nơi chứa các bào quan, baogồmtythể,lànơisảnxuấtnănglượngthôngquatổnghợpATP(adenosinetriphosphate); lưới nội chất, nơi tổng hợp lipid và protein; bộ máy Golgi, vị trí nơicácp r o t e i n đ ư ợ c b i ế n đ ổ i , đ ó n g g ó i v à s ắ p x ế p đ ể c h u ẩ n b ị v ậ n c h u y ể n đ ế n c á c điểm đến tếbào của chúng; lysosome vàp e r o x i s o m e , n h ữ n g t ú i c h ứ a c á c e n z y m tiêu hóa thực hiện quá trình tiêu hóa nội bào của cácđại phân tửnhưl i p i d v à protein; khung xương tế bào, một mạng lưới các sợi protein tạo hình dạng và hỗ trợcho tế bào; và cytosol, khối chất lỏng bao quanh các bào quan Tế bào chất là nơidiễn ra hầu hết các hoạt động của tế bào, chẳng hạn như các con đường trao đổi chấtbaogồmđườngphânvàcácquátrìnhnhư phânchiatếbào[54].

Các yếutốảnhhưởngđếnhình tháinhânvàtếbàochất

Hình thái nhân chịu ảnh hưởng bởi khá nhiều yếu tố, bao gồm màng ngoạibiên nhân, màng lưới nội chất, nhiễm sắc thể và sự tổng hợp lipid [85] Đã có nhiềunghiên cứu cho thấy sự thiếu hụt lamin, thành phần chính của màng ngoại biên nhânđã làm thay đổi hình dạng nhân trên nhiều tế bào [86] Màng nhân có thể được xemnhưmột thành phần của lưới nộichất, do đó nó cũng gópp h ầ n d u y t r ì h ì n h d ạ n g của nhân. Những sự thay đổi trên màng lưới nội chất như quá trình vận chuyển lipidvà protein giữa lưới nội chất ngoại vi và màng nhân được ghi nhận là đã làm thayđổi kích thích và hình dạng nhân ở tế bào

[85] Số lượng nhiễm sắc thể cũng là mộtyếut ố ả n h h ư ở n g đ ế n k í c h t h ư ớ c c ủ a n h â n [ 8 7 ] N g o à i r a , p h o s p h o l i p i d l à m ộ t thành phần chính của màng nhân, sự tổng hợp lipid có thể đóng vai trò quan trọngtrong việc xác định hình dạng và kích thước nhân Bằng chứng trực tiếp về vai tròcủa tổng hợp lipid trong việc xác định hình dạng nhân đã được cung cấp trong cácnghiên cứu về nấm men bị thay đổi chuyển hóa lipid của Siniossoglou và cs năm2009vàSantos-Rosavàcs.năm2005[88,89].

Mặc dù có vẻ như không có cấu trúc chuyên biệt, nhưng tế bào chất thực sựđượctổchứctheomộtcấutrúcnhấtđịnh.Mộttậphợpmạnglướiproteinđượcgọilà khung xương tế bào cung cấp cấu trúc cho tế bào chất và tế bào Khung xương tếbào bao gồm các sợi và ống giống như sợi chỉ đan chéo nhau qua tế bào chất [54].Như tên gọi của nó, khung xương tế bào giống như bộ xương của tế bào Nó giúp tếbào duy trì hình dạng và cố định các bào quan trong tế bào chất Do đó, các ảnhhưởng lên khung xương tế bào sẽ tác động trực tiếp đến hình dạng cũng như kíchthướccủa tếbàochất[54].

Bộkhungxươngtếbào

Kháiniệm

Khung xương tế bào là một mạng lưới phức tạp, năng động của các sợiprotein liên kết có trong tế bào chất của tất cả các tế bào, bao gồm cả vi khuẩn và vikhuẩn cổ [90] Khung xương tế bào kéo dài từ nhân tế bào đến màng tế bào Ở sinhvật nhân chuẩn, khung xương tế bào bao gồm ba thành phần chính là vi sợi actin, visợi trung gian và vi ống Tất cả các thành phần này đều có khả năng tăng trưởngnhanhhoặctháogỡtùythuộcvàoyêucầucủatếbào[91].

Khung xương tế bào nắm giữ ba chức năng lớn: là không gian tổ chức tế bào,kết nối tếbào vềvật chất và sinh hóavớimôi trường bên ngoàivàt ạ o r a c á c l ự c phối hợp cho phép tế bào di chuyển và thay đổi hình dạng Để đạt được các chứcnăng này, bộ khung tế bào kết hợp hoạt động của vô số các protein tế bào chất(cytoplasmic proteins) và các cơ quan Khác với ý nghĩa của từ “bộ xương”,bộkhung xương tế bào không phải là một cấu trúc cố định trong đó chức năng của nócó thể được hiểu một cách riêng biệt Thay vào đó, nó là một cấu trúc năng động vàthích nghi, trong đó các chuỗi polymer thành phần và các protein điều hòa luôn hiệndiệnvớimộtlưulượngổnđịnh[54].

Cấu trúckhungxươngtếbào

Có ba loại polyme chính cấu thành nên cấu trúc khung xương tế bào: vi sợi,vi ống và một nhóm các polyme được gọi chung là các sợi trung gian Cùng nhau,các polyme này kiểm soát hình dạng và cơ học của các tế bào nhân chuẩn (Hình1.10) Cả ba đều được tổ chức thành các mạng lưới chống lại sự biến dạng nhưng cóthể tổ chức lại để đáp ứng với các ứng lực bên ngoài và chúng có vai trò quan trọngtrongviệc sắpxếpvàduytrìtínhtoànvẹncủacáckhoangnộibào[92].

Viố n g c ó k í c h t h ư ớ c l ớ n n h ấ t t r o n g b a l o ạ i s ợ i t ế b à o , v ớ i đ ư ờ n g k í n h khoảng 25nm, được tạo thành từ các protein tubulin (α-tubulin và β-tubulin) sắp xếpxen kẽ nhau để tạo thành một ống rỗng. Trong quá trình phân bào,m ộ t p h ầ n c ủ a chu trình tế bào, trong đó các tế bào phân tách các nhiễm sắc thể thành hai bộ giốnghệt nhau, các vi ống trong bộ khung xương tế bào sắp xếp lại chính nó thành một bộmáy phân tách DNA có độ chính xác cao được gọi là thoi vô sắc Khả năng của thoivô sắc để tìm và căn chỉnh các nhiễm sắc thể phụ thuộc phần nào vào các động lựclắp ráp của các vi ống

[94] Ở các sinh vật đơn bào, vi ống là thành phần chính củatiên mao(flagella)vàtiêmmao(cilia)giúpchocácsinhvậtnàydi chuyển[54].

Vi sợi (vi sợi actin) có đường kính nhỏ nhất trong 3 thành phần khung xươngtế bào (7 nm), được tạo nên bởi sự trùng hợp các monomer của protein actin tạothành chuỗi xoắn kép [54].

Vi sợi mềm dẻo hơn hơn so với vi ống Tuy nhiên, sựhiện diện của nồng độ cao liên kết chéo bám vào vi sợi thúc đẩy việc lắp ráp các cấutrúc cứng, tổ chức cao, bao gồm các mạng đẳng hướng (isotropic networks), cácmạnggói(bundlednetworks)vàcácmạngnhánh(branchednetworks).Vis ợikết hợp với protein vận động myosin hỗ trợ các chuyển động của tế bào, từ đó đóng vaitrò chính trong quá trình phân tách tế bào chất (cytokinesis) Các bó vi sợi hỗ trợchân giả của tế bào trong quá trình chemotaxis (chuyển động trực tiếp theo gradienthoá học) và giao lưu thông tin tế bào Ngược lại, các mạng lưới vi sợ đa nhánh hỗtrợ mép dẫn hướng (leading edge) của hầu hết các tế bào di chuyển và tạo ra các lựcliên quan đến những thay đổi trong hình dạng tế bào, ví dụ như những thay đổi xảyratrong quátrình thực bào[54].

Sợi trung gian có đường kính từ 8-12 nm, được tạo nên bởi nhiều loại proteinnhư keratin, vimentin, desmin và lamin Chúng chống lại lực căng có hiệu quả hơnnhiều so với lực nén.K h ô n g g i ố n g v i ố n g v à v i s ợ i a c t i n , c á c v i s ợ i t r u n g g i a n không phân cực và không thể hỗ trợ chuyển động theo hướng của động cơ phân tử.Cấu trúc của vi sợi trung gian khá ổn định Chúng giúp tế bào chống lại các lực kéogiãn, đóng vaitrò duy trì hìnhdạngcủa tếbào và neogiữ nhân vàcác bàoq u a n khác [54].

Các nghiên cứuvềảnhhưởngcủavitrọnglựclênkhungxươngtếbào

Các sinh vật sống luôn chịu ảnh hưởng của trọng lực [95] Những thay đổicủa trọng lực có thể gây ra các rối loạn trong quá trình chuyển hóa các cơ quan vàthay đổi cấu trúc của xương và da [96] Tiếp xúc với môi trường vi trọng lực sẽ làmphát sinh những tác động tiêu cực đến cơ thể con người, bao gồm loãng xương, thayđổi cấu trúc tim mạch và các cơ quan thần kinh [97] Trọng lực có thể ảnh hưởngđến cả hình thái và cấu trúc khung xương tế bào [98] Tác động của vi trọng lực lênchức năng và cấu trúc của tế bào động vật có vú đã được nghiên cứu bằng cách sửdụng các hệ thống mô phỏng khác nhau như buồng quay tế bào [35], clinostat 2D[23], clinostat 3D [24,

25, 26] hoặc máy định vị ngẫu nhiên (RPM) [99, 100]. Điềukiệnvitrọnglựcgâyrasựsắpxếplạitếbàocủacáctếbàonộimôbằngcáchsửađổ i biểu hiện gelsolin và α-tubulin [101] Tế bào myoblast chuột C2C12 được nuôitrong điều kiện vi trọng lực mô phỏng cho thấy sự giảm tăng sinh và giảm biểu hiệncủat hụ t h ể t iề m năngc a n o n i c a l l o ạ i 1( TR PC 1) và c ác y ế u tố t ă n g tr ưở ng gi ốn g như insulin 1 (IGF-1) [28, 38] Sự tăng cường quá trình tạo xương đã được xác địnhtrong các tế bào tủy xương chuột trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng bằngphương pháp xác định các dấu hiệu tự thực bào [102] Những thay đổi của hệ thốngmiễndịchcũngđượcmôtảtrongđiềukiệnvitrọnglực.Vitrọnglựccóthểsửađổi sự tải nạp tín hiệu tế bào lympho T, dẫn đến làm suy yếu hệ thống miễn dịch [103].Vi trọng lực mô phỏng (SMG) đã được chứng minh là có liên quan đến suy giảmmiễn dịch bằng cách thay đổi biểu hiện của arginase và trong cytokine gây viêm ởđạithực bào[104].

Khung xương tế bào là mạng lưới các vi sợi và vi ống kéo dài khắp tế bào.Khung xương tế bào hỗ trợ tế bào, tạo cho nó hình dạng, tổ chức và sắp xếp các bàoquan và có vai trò trong vận chuyển phân tử, phân chia tế bào và tín hiệu tế bào.Nhiều nghiên cứu cho thấy trong điều kiện vi trọng lực, khung xương tế bào được tổchức lại sau một thời gian từ 20 đến 72 giờ, nhưng không phải lúc nào cũng có cùngcấu hình giống như trước đây [105-109] Trong tế bào ung thư vú, mạng lưới khungkeratin quanh nhân (perinuclear cytokeratin network) và cấu trúc nhiễm sắc thể trởnên lỏng lẻo hơn dưới điều kiện vi trọng lực [107] Năm 1999, một thí nghiệm trêntếbà o t hậ nn g ư ờ i tr on gm ôi t r ư ờ n g vi t r ọ n g l ự c đ ượ c t h ự c hi ện để t h e o d õ ib iể u hiện gene Người ta phát hiện ra rằng hơn 1.632 gene đã thay đổi biểu hiện bao gồmnhững thay đổi lớn trong các yếu tố phiên mã

[110] Một trong những tế bào độngvậtcóvúphổbiếnnhấtđãđượcsửdụngchocácnghiêncứuvềvitrọnglựclàtế bào gốc trung mô Việc sắp xếp lại F-actin và tăng độ cứng của tế bào thực hiện trêncác tế bào gốc trung mô tủy xương ở chuột đã được chứng minh rằng gây ức chế dichuyển tế bào [62] Trong nghiên cứu này, các tế bào gốc trung mô cuống rốn ởngười (hucMSC) đã được sử dụng để đánh giá tác động của môi trường vi trọng lựcmô phỏngđốivớibộkhungxươngtếbào.

Vậtliệu

Thiếtbị vàdụngcụcầnthiết

3 Tủấm37 o Cnuôi tếbào Sanyo Nhật

16 MáyBDAccuriC6flow cytometer BDBiosciences Mỹ

Bảng2.2.Mộtsố dụng cụchínhsửdụngtrong đềtài

1 Beaker(50 ml,100ml) Schott Đức

2 Erlen(100ml,250ml) Schott Đức

3 Ốnglytâm15ml Corning Hoa Kỳ

Môi trườngvàhóachấtsửdụng

1 Khángsinh(penicillin/ streptomycin) GibcoBRL Mỹ

12 PCRBIO1-StepRT-PCRKit PCRBiosystems Mỹ

25 AUTOMATICX-RAY kit Fujifilm NhậtBản

Tếbàogốctrungmô

Tế bào gốc trung mô cuống rốn người (hucMSC) được cung cấp bởi ViệnSinh học Nhiệt đới Đây làdòng tếbào đông lạnh đã đượcp h â n l ậ p t ừ m ô c u ố n g rốnvàđược sử dụngtrongnghiêncứutừ lầncấychuyềnthứ hai.

Hệthốngvitrọnglựcmôphỏng(clinostat 3D)

Hệ thống máy clinostat 3D tạo môi trường vi trọng lực mô phỏng được thiếtkếv à c h ế t ạ o t r o n g đ ề t à i : “ N g h i ê n c ứ u đ á n h g i á s ự t h a y đ ổ i t r o n g c ấ u t r ú c b ộ khungtếbàocơthểsốngtrongđiềukiệnmôphỏngtrạngtháivitrọngl ự c (simulat ed microgravity)”, thuộc Chương trình Khoa học công nghệ vũ trụ, mã số:VT- CB.15/18-20(Hình2.1).

Hình 2.1 Cấu trúc hệ thống máy clinostat 3D tạo môi trường vi trọng lực mô phỏngHệthốngbaogồmkhungtrongvàkhungngoàiđượcnốivới2motorcóth ể điềuchỉnhtốcđộriêngbiệt.Khunggiáđỡđượcdùngđểcốđịnh2khungnày vàlànơiđặtbộđiềukhiểntốcđộcủamotor.Mẫuthínghiệmđượcđặtvàokhunggiữđĩa gắn với khung trong Trong nghiên cứu này, hệ thống clinostat 3D tạo ra một môitrườngtươngtựnhưmôitrườngbênngoàikhônggianvớigiatốctrọngtrường1,3 × 10 -3 G bằng cách quay hai khung trong vào ngoài với vận tốc 1 vòng/phút. Điềunày dẫn đến sự phân tán đồng đều của vectơ trọng lực trong một thể tích hình cầuvới vận tốc góc không đổi Các điều kiện này đã tạo ra một môi trường vi trọng lựcvới gia tốc 1,3 × 10 -3 G và nó được định nghĩa là môi trường vi trọng lực mô phỏng.Điềukiệnvậnhành

- Máy clinostat 3D có thể được đặt trong tủ nuôi tế bào động vật có dung tíchtừ160ltrở lên.

- Cần kiểm tra kích thước 3 hướng của tủ nuôi và kích thước của máy clinostat3D.

- Trongđiềukiệntủnuôi,2dây nguồncủahệthốngclinostat3Dsẽđượcluồnqualỗbêntrêncủa tủnuôiđirangoàibộcấpnguồnđiện.

- Cầnk iể mtra c á c n g ă n , k h a y chứadụ ng cụ n u ô i t ế b à o n h ư b ì n h n u ô i, đ ĩ a nuôi,đĩa96giếng.Kiểmtrakhảnăngchứa,nângđỡcủakhaynuôi(>15kg).

- Máy clinostat 3D là máy vận hành quay, 2 khung có thể quay độc lập, nhưngđãđược cố địnhvớicácmotor.

- Máy clinostat 3Dcó được sửd ụ n g c h o c á c n g h i ê n c ứ u v ừ a m ô p h ỏ n g 2 D (2D simulation) và mô phỏng 3D (3D simulation) Các đối tượng nghiên cứulà tế bào, phôi của các loài động vật khác nhau, điều kiện nhiệt độ nuôi cấy,nồngđộCO2khácnhau.

- Kiểmtrasựvậnhành của cáckhungtrongvà khungngoài b ằ n g cách tha yđổitốc độở bộđiềukhiển.

- Đốivớicácmẫutếbào,chỉnhtốcđộ quay2khunglà1vòng/phút.

Nộidungvàphươngphápnghiêncứu

Nuôicấy tếbào

Trong nội dung này, tế bào gốc trung mô cuống rốn người (hucMSC) đượcgiải đông và cấy chuyền để tăng sinh khối nhằm cung cấp đủ lượng tế bào cần thiếtcho các thí nghiệm tiếp theo Tế bào được giải đông thuộc lần cấy chuyền thứ

1, cáctế bào được sử dụng trong nghiên cứu thuộc lần cấy chuyền từ thứ 2 đến thứ 5 Tếbàosaukhicấychuyềnđược lấyramộtphầnđểđônglạnhvàlưutrữ.

2.2.1.1 Phươngpháp giảiđông Ống đông lạnh chứa tế bào được lấy ra khỏi bình chứa nitơ lỏng và nhanhchóng đưa vào bể ổn nhiệt 37°C trong 2 phút 1 ml môi trường nuôi cấy được chovào ống và trộn đều Hỗn dịch tế bào được ly tâm ở 1500 vòng/phút trong 5 phút ởnhiệt độ phòng Tủa tế bào được thu nhận sau khi loại bỏ huyền phù Tủa tế bàođược tái huyền phù hóa và chuyển sang bình nuôi T25 chứa 4 ml môi trường nuôicấy Các bình nuôi tế bào được cho vào tủ nuôi ở nhiệt độ 37°C, 5% CO2. MôitrườngsửdụngđểnuôicấytếbàolàDMEM/Ham’sF-12withL-Glutamine(DMEM- 12-A,CapricornScientific,Đức)bổsung15%FBS(FBS-HI-

22B,CapricornScientific,Đức) và1% Pen/Strep(15140-122, Gibco,Mỹ).

Tế bào phát triển đến khoảng 90% diện tích nuôi cấy được cấy chuyền với tỉlệ1:2.Saukhilấyrakhỏitủnuôi,bìnhnuôitếbàođượcloạibỏmôitrườngvàrửa3 lần với PBS (PBS-10XA, Capricorn Scientific, Đức) Mỗi bình nuôi tế bào đượcxử lý với 1 ml dung dịch Trypsin 0,25% (TRY-2B, Capricorn Scientific, Đức) trong5 phút ở 37ºC để tách khỏi bề mặt nuôi cấy Môi trường nuôi cấy với thể tích tươngứng được bổ sung vào để bất hoạt Trypsin Tế bào được thu hoạch và ly tâm với tốcđộ1500vòng/phúttrong5phútởnhiệtđộphòngđểthutủatếbào.Tủatếbào ởmỗi bình nuôi được tái huyền phù hóa và được chia ra 2 bình nuôi T25 chứa 4 mlmôi trườngnuôi cấy.Môi trườngsử dụngđể nuôi tếbào làDMEM/Ham’sF - 1 2 with L-Glutamine (DMEM-12-A, Capricorn

FBS(FBS-HI-22B,CapricornScientific,Đức)và1%Pen/Strep(15140-

122,G i b c o , Mỹ).Cácbìnhnuôi tếbàođượcchovàotủ nuôi ởnhiệtđộ37°C,5%CO2.

Tủa tế bào sau khi thu hoạch được huyền phù hóa với 500 μl,l DMEM/Ham’sF-12 with L-Glutamine (DMEM-12-A, Capricorn Scientific, Đức) và 500 μl,l môitrường đông lạnh HyCryo-STEM (SR30002.02, GE Healthcare LifeSciences, Mỹ).Huyền phù tế bào được chuyển vào ống đông lạnh (430663,Corning, Mỹ) và trữ ở -20°C trong 1 giờ, sau đó trữ ở -80°C qua đêm và cuối cùng chuyển vào nitơ lỏng đểlưutrữ.

Đánhgiácácchỉthịmarkercủatếbàogốc trung mô

Sau thời gian lưu trữ đông lạnh, các tế bào gốc có thể mất đi khả năng phânchia và biệt hóa, do đó, việc đánh giá tính gốc giúp bảo đảm dòng tế bào đượcnghiên cứu vẫn giữ nguyên các tính chất của tế bào gốc ban đầu Các tiêu chuẩn xácđịnh tế bào gốc trung mô được đanh giá theo đề xuất của Hiệp hội liệu pháp tế bàoquốc tế (International Society for Cellular Therapy – ISCT) Tế bào gốc trung môcuống rốn (hucMSC) sau giải đông và cấy chuyền được thu hoạch và đánh giá tínhgốcbằngphươngphápFlowcytometry sửdụngkitHumanMSCanalysiskit(562245, BDBiosciences, Mỹ).Bộkitđánhgiábaogồm:

- PerCP-Cy™5.5Mouse Anti-HumanCD105

- PEhMSCNegativeIsotype ControlCocktail(mIgG1,κPE;PE;mIgG2 a, κPE;PE)

T C ; m I g G 1 , κPE; APC;mIgG1, κPE;PerCP-Cy5.5)

- PE hMSC NegativeCocktail(CD34 PE, CD11bPE, CD19

PE,CD45PE,HLA-DR PE)

- hMSCPositive Cocktail(CD90FITC,CD73 APC,CD105PerCP-Cy5) hucMSCđượctáchbằngTrypsin0,25%(TRY-2B,CapricornScientific,Đức) và thu hoạch như ở phương pháp cấy chuyền Các tế bào này được huyền phùhóa trong PBS 1X và chia đều vào các ống eppendorf với mật độ 10 5 tế bào/ống.Mỗiốngtếbàođượcủlầnlượtvới1àlkhỏngthểđóliệtkờởtrờntrong30phỳtở nhiệtđộphòng,tránhánhsáng.MẫutếbàođượcphântíchbằnghệthốngmáyBDAccuriC6flowcytometer(BDBiosciences,Mỹ).

Thửnghiệmvitrọnglực

Đối với bình nuôi T25: Tế bào hucMSC được nuôi trong bình nuôi T- 25(160430, Thermo Scientific, Mỹ) với mật độ 10 5 tế bào/bình nuôi ở 37ºC, 5%

CO2.MôitrườngsửdụngđểnuôitếbàolàDMEM/Ham’sF-12withL-Glutamine(DMEM-12- A,CapricornScientific,Đức)bổsung15%FBS(FBS-HI-22B,Capricorn Scientific, Đức) và 0,5% Pen/Strep (15140-122, Gibco, Mỹ) Sau khi cáctế bào đã bám vào bề mặt bình nuôi, bình nuôi chứa tế bào được đổ đầy môi trườngnuôicấy(Hình2.3).

Hình2.3.BìnhnuôitếbàohucMSCtrongthửnghiệmvi trọnglực Đối với đĩa 96 giếng: Tế bào hucMSC được cấy vào đĩa 96 giếng (161093,Thermo Scientific, Mỹ) với mật độ 2 × 10 3 tế bào/giếng và nuôi ở 37°C, 5% CO2đến khi các tế bào đều đã bám lên bề mặt đĩa nuôi Môi trường sử dụng nuôi tế bàotương tự như đối với bình nuôi T25 Mỗi giếng tế bào sau đó được đổ đầy môitrườngvàphủparafilmtrước khi đậynắp(Hình2.4).

Hình2.4 Đĩa96giếng chứa tếbàohucMSCtrongthửnghiệmvitrọnglực

Tế bào sau đó được chia làm 2 nhóm: nhóm SMG (môi trường vi trọng lực)và nhóm đối chứng (môi trường bình thường) Đối với nhóm SMG, đĩa/bình nuôi tếbào được đặt cố định vào khung giữ mẫu của máy clinostat 3D (được đặt trong tủnuôi) và quay ở chế độ 1,3 × 10 -3 G Tế bào ở nhóm đối chứng được nuôi ở điềukiện trọng lực bình thường (1 G) Thử nghiệm vi trọng lực được tiến hành trongvòng 72 giờ Các mẫu tế bào đều được nuôi trong tủ nuôi ở 37°C có bổ sung5%CO2.Cácthínghiệmđượclặplạiítnhấtbalần.

Đánhgiásựtăngsinhtếbào

Phương pháp WST-1 được dùng để đánh giá mức độ tăng sinh của tế bào gốctrung mô cuống rốn (hucMSC) khi nuôi cấy trong môi trường vi trọng lực Phươngpháp dựa trên phản ứng đổi màu của muối tetrazolium trong dung dịch WST-1 vớicác enzyme dehydrogenase trong ti thể Khi tế bào tăng sinh mạnh, mức độ hô hấpcàng nhiều dẫnđếnlượng enzyme tiết ramôi trườngcàng lớn,môi trườngn u ô i chứaWST- 1sẽchuyểnmàucàngđậm.

Sau thử nghiệm vi trọng lực, các giếng nuôi tế bào được rút bỏ môi trường vàrửa với 200 àl PBS 1X mỗi giếng (PBS-10XA, Capricorn Scientific, Đức) 100 àlmụi trường nuụi cấy và 10 àl dung dịch WST-1 (11644807001, Roche, Thụy Sĩ)được cho vào mỗi giếng nuôi của mỗi nhóm và ủ trong 3,5 giờ ở 37ºC, 5% CO2(Hình 2.5) Giá trị OD mỗi giếng được đo bởi máy quang phổ GloMax®

ExplorerMultimodeMicroplateReader(Promega,Mỹ)ởbướcsóng450nm.

Sau thử nghiệm vi trọng lực, các bình nuôi T25 chứa hucMSC được hút bỏmôi trường và rửa 3 lần với 5 ml PBS 1X (PBS-10XA, Capricorn Scientific, Đức)cho mỗi lần Mỗi bình nuôi tế bào được ủ với 1 ml dung dịch Trypsin 0,25% (TRY-2B, Capricorn Scientific, Đức) trong 5 phút ở 37ºC Sau đó, 1 ml môi trường đượccho thêm vào bình nuôi tế bào để bất hoạt Trypsin Tế bào được thu hoạch và ly tâmvớitốcđộ1500vòng/phúttrong5phútởnhiệtđộthườngđểthutủatếbào. Đánh giátỉ lệ tếbào đi vào các phatrongchu kỳ tế bào:

Hệ thống máy BD Accuri C6 flow cytometer (BD Biosciences, Mỹ) được sửdụng để phân tích những thay đổi trong chu kỳ của hucMSC khi nuôi trong môitrường mô phỏng vi trọng lực hucMSC sau khi thu hoạch được xử lý với FITCAnnexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, Mỹ) để kết hợp đánh giá tỉlệ apoptosis và chu kì tế bào Eppendorf chứa tế bào được ủ với dung dịch chứa 100ml Binding Buffer 1X, 5 μl,l PI và 5 μl,l FITC trong 25 phút ở nhiệt độ phòng, tránhánh sáng Sau đó, mẫu tế bào được bổ sung thêm 400 μl,l Binding Buffer 1X và đượcphântíchbởihệthốngmáyBDAccuriC6flowcytometer. Đánh giábiểuhiện mức phiên mã cácgene điềuhòa chu kỳ tế bào:

RNAtổngcủahucMSCđượctáchbằngkitReliaPrepTMRNAC e l l Miniprep System (Z6011, Promega, Mỹ).Ống eppendorf chứa tế bào sau khi thuhoạch được giữ lạnh ở 4ºC và được bổ sung 250 àl dung dịch BL + TG Buffer, hỳtlờn xuống đều để ly giải tế bào Sau đú, 85 àl Isopropanol 100% được cho vào ốngtếbào,trộnđềutrong5giây.DịchtếbàosaukhilygiảiđượcchovàocộtMinicolumn có chứa màng lọc và ly tâm với tốc độ 11.000 vòng/phút trong 30 giâyở 20ºC Dịch thải ra qua ống thu được loại bỏ. RNA bỏm trờn màng lọc của cộtMinicolumn được rửa với 500 àl dung dịch RNA Wash Solution bằng cách ly tâmvới tốc độ 11.000 vòng/phút trong 30 giây Cột Minicolumn chứa mẫu RNA được ủvới 30 àl DNase I incubation mix trong 15 phỳt ở 20ºC, sau đú được rửa với 200 àlColumn Wash Solution và ly tõm với tốc độ 11.000 vũng/phỳt trong 15 giõy Cộtchứa mẫu được bổ sung 500 àl RNA Wash Solution và ly tâm với tốc độ 11.000vòng/phút trong 30 giây, dịch thải qua ống được loại bỏ Cột Minicolumn đượcchuyển sang ống thu mới, được bổ sung 300 àl

RNA Wash Solution vào cột và lytâmv ớ i t ố c đ ộ 1 1 0 0 0 v ò n g / p h ú t t r o n g 2 p h ú t C ộ t M i n i c o l u m n t i ế p t ụ c đ ư ợ c chuyển sang ống eppendorf sạch và được bổ sung 50 àl nước cất Nuclease- FreeWater, ly tâm với tốc độ 11.000 vòng/phút trong 1 phút để thu RNA Các mẫu RNAthuđượcđược trữ trongNitơlỏngtrướckhitiếnhànhchạyRealtimeqRT-PCR.

Biểu hiện mức độ phiên mã của các gene liên quan đến chu kì tế bào đượcđánh giá bằng phương pháp Realtime qRT-PCR Các gene được đánh giá bao gồmCDK2,CDK6,Cyclin A GeneGAPDHđược sử dụng để làm đối chứng Phản ứngRealtimeqRT-PCRđượcchạybằngmáyReal-TimePCRSystem(ThermoScientific, Mỹ), sử dụng kit 2x qPCR SyGreen 1-Step Go Hi-ROX kit (PB25.32.03,PCRBiosystem, Anh).Mỗi phản ứng có tổng thể tích là 20 μl,l bao gồm

1 μl,l RNAmẫu,2μl,lm ồ i x uô i và ng ượ c, 10μl, l2XMi xH i- ROX, 1 μl,lR TAs evà 6μl,ldH2O.Chu trình nhiệt của phản ứng như trong Bảng 2.4 Các cặp mồi đặc trưng cho cácgene khảo sát được thể hiện trong Bảng 2.5 Giá trị Ctcủa mẫu được tính bằngphươngpháp2 −ΔΔCtΔΔCt [111].

Phương pháp 2 -∆∆Ct (Livak) (Real-time PCR Applications Guide – Biorads)được áp dụng để đánh giá mức độ biểu hiện tương đối sự biểu hiện gene [111].Phương pháp này giả định rằng cả gene đích và gene tham chiếu được khuếch đạivớihiệuquảgần100%vàtrongphạmvi5%củamỗigene.Để xác địnhsựkhá cbiệt tương đối trong mức độ biểu hiện của gene đích ở các mẫu khác nhau, phươngpháp2 -

- Chuẩn hóa giá trị CTcủa gene mục tiêu với gene tham khảo cho cả mẫu thínghiệmvàmẫuhiệuchỉnh:

∆CT(mẫu)=CT(mụctiêu,mẫu)-CT(thamchiếu,mẫu)

∆CT(chuẩn)=CT(mụctiêu,chuẩn)-CT(thamchiếu,chuẩn)

- Chuẩnhóa giátrị ∆CTcủa mẫuthínghiệmvới∆CTcủamẫuchuẩn

∆∆CT=∆CT(mẫu)-∆CT(chuẩn)

- Cuối cùng, tỉ lệ biểu hiện được tính theo công thức:Tỉlệ biểuhiện=2 -∆∆Ct

Kết quả thu được là sự tăng (hay giảm) theo tỷ lệ của gene đích trong mẫu thínghiệm tương quan với mẫu chuẩn và được chuẩn hóa theo sự biểu hiện của genetham chiếu Chuẩn hóa sự biểu hiện của gene đích theo gene tham chiếu bù đắp chonhững khácbiệtvềlượng tếbàomẫu Trongnghiên cứu này, geneGAPDHđượcsử dụngl à m g e n e t h a m c h i ế u đ ể đ á n h g i á m ứ c đ ộ b i ể u h i ệ n c ủ a c á c g e n eC

Bảng 2.4.Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime qRT-PCR cho các gene điều hòachukì tếbào

Bảng2.5 Trìnhtựmồi cácgene điềuhòachu kìtếbào

Gene Trìnhtự mồi Tài liệu thamkhảo

3’R:5’-AGTCCTTTCCACGATACCAAAGT-3’ [114] Đánh giábiểuhiện mức dịch mã các gene điềuhòachukỳ tế bào:

Trongnộidungnghiêncứunày,mứcđộbiểuhiệncủacácproteinliênquanđến c h u k ì t ế b à o b a o g ồ m C y c l i n A 1 + A 2 , C D K 4 , C D K 6 đ ư ợ c đ á n h g i á b ằ n g phươngp h á p W e s t e r n B l o t P r o t e i n G A P D H đ ư ợ c s ử d ụ n g l à m đ ố i c h ứ n g C á c bước thực hiện bao gồm: ly giải protein, điện di SDS-PAGE, chuyển màng PVDF,khóamàng,ủkhángthểsơcấp,ủkhángthểthứcấp,hiệnphim. hucMSC sau khi thu hoạch được ly giải bằng Optiblot LDS Sample Buffer(ab119196, Abcam, Mỹ) ở bể ổn nhiệt 70°C trong 10 phút Protein thu được từ cácmẫu được chuyển với lượng bằng nhau vào các giếng của gel Precast Gel SDS-PAGE 4-12% (ab139596, Abcam, Mỹ) và được điện di trong Optiblot SDS RunBuffer (ab119197, Abcam, Mỹ) trong 2 giờ ở 50 V Bể điện di được giữ lạnh bằngđá gel để tránh sự thoái hóa protein Protein đã được phân tách trong Precast GelSDS-PAGE được chuyển lên màng PVDF (ab133411, Abcam, Mỹ), được kẹp bởimột lớp giấy lọc Extra Thick Blot Paper (1703966, Bio-Rad, Mỹ) và một lớp bọtbiển ở mỗi bên và đặt cố định vào cassette (Hình 2.6) Cassette này được đặt vào bểđiện di chứa buffer TBST sao cho mặt gel nằm ở phía cực âm (cathode) và màngPVDFnằmphíacựcdương(anode)vàđượcđiệnditrong 2giờ ở50V.

Màng PVDF sau đó được khóa màng qua đêm ở 4ºC trong Blocking Buffer(ab126587, Abcam, Mỹ) Màng PVDF này tiếp tục được ủ với kháng thể sơ cấptrong Blocking Buffer qua đêm ở 4ºC Các kháng thể được sử dụng bao gồm: Anti-Cyclin A1 + Cyclin A2 antibody (ab185619, Abcam, Mỹ), Anti-CDK4 antibody(ab137675, Abcam, Mỹ)và Anti-CDK6 antibody (ab124821, Abcam, Mỹ) được phaloãng với tỉ lệ 1:5000; kháng thể Anti-GAPDH antibody (ab181602, Abcam, Mỹ)cho protein GAPDH được pha loãng với tỉ lệ 1:5000 Sau khi ủ qua kháng thể sơcấp, màng PVDF được rửa 3 lần, mỗi lần 10 phút với dung dịch TBST Màng nàysau đó được ủ với kháng thể thứ cấp Goat Anti-Rabbit IgG (HRP) (ab6721, Abcam,Mỹ)trongBlockingBufferởnhiệtđộphòngtrong1giờ.

Các vạch protein được hiển thị bằng ECL Western Blotting Substrate Kit(ab65623, Abcam, Mỹ).Màng PVDF được cố định trên cassette Dung dịch A và Bđược trộn đều với tỉ lệ 1:1 và nhỏ trực tiếp lên màng PVDF với thể tích 0,125ml/cm 2 diện tích màng Màng được ủ trong 1 phút ở nhiệt độ phòng Dung dịch hiểnthịECLđượchútbỏtrước khi tiếnhànhquátrìnhhiệnphim.

Kết quả Western Blot trong nghiên cứu này được hiển thị bằng phương pháphiện phim sử dụng kit AUTOMATIC X-RAY (873498, Fujifilm, Nhật Bản).Quátrình hiện phim được thao tác trong phòng tối Tấm phim CL-XPosure Film(34090,Thermo Scientific, Mỹ) được đặt lên màng PVDF và ủ trong 1 phút Sau đó, phimđược nhúng vào dung dịch Develope trong 15 giây và chuyển qua dung dịch Fixingtrong 15 giây Cuối cùng, phim được rửa bằng nước cất trong 30 giây Các vạchprotein phát huỳnh quang trên màng PVDF được hiển thị âm bản trên phim Phầnmềm ImageJ(National Institutes of Health, Bethesda, Mỹ) được dùng để đo cườngđộcủa các vạchproteintrongkếtquảhiệnphim[115].

Đánhgiá quátrìnhapoptosis

Quá trình thu hoạch tế bào được thực hiện như ở Mục2.2.4.2 Đánh giá chukỳtếbào,phầnThuhoạch tếbào.

TếbàohucMSCsaukhithuhoạchđượcxửlývớiFITCAnnexinV ApoptosisDetect ionKitI(BDBiosciences,Mỹ)đểđánhgiátỉlệapoptosis.Eppendorf chứa tế bào được ủ với dung dịch chứa 100 ml Binding Buffer 1X, 5 μl,lPI và 5 μl,l FITC trong 25 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Sau đó, mẫu tế bàođược bổ sung thêm 400 μl,l Binding Buffer 1X và được phân tích bởi hệ thống máyBD Accuri C6 flow cytomete (BD Biosciences, Mỹ) Những tế bào đang trong quátrình apoptosis sẽ được thể hiện bằng tỉ lệ các tế bào dương tính với Annexin- V- FITCvàcáctếbàodươngtínhvớiPI.

Biểu hiện mức độ phiên mã của các gene liên quan đến apoptosis được đánhgiábằngphươngphápRealtimeqRT-

PCR.CácgeneđượcđánhgiábaogồmBaxvàBcl-2 GeneGAPDHđược sử dụng để làm đối chứng Quá trình thực hiện thínghiệm tương tự như ở Mục2.2.4.2 Đánh giá chu kỳ tế bào, phần Đánh giá biểuhiện mức phiên mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào Chu trình nhiệt của phản ứngnhư trong Bảng 2.6 Các cặp mồi đặc trưng cho các gene khảo sát được thể hiệntrongBảng 2.7.GiátrịCtcủamẫuđượctínhbằngphươngpháp2 −ΔΔCtΔΔCt [111].

Bảng 2.6 Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime qRT-PCR cho các gene liên quanđếnapoptosis

Đánhgiásựthay đổihìnhtháinhânvàtếbàochất

Sau thử nghiệm vi trọng lực, các đĩa 96 giếng chứa tế bào hucMSC được rútbỏ môi trường và rửa 3 lần với PBS Mỗi giếng tế bào được rửa 3 lần với 100 àlPBS(PBS-

10XA,CapricornScientific,Đức).50àl4%ParaformaldehydePhosphateB u f f e r S o l u t i o n ( 0 9 1 5 4 - 8 5 , N a c a l a i T e s q u e , N h ậ t B ả n ) đ ư ợ c c h o v à o mỗi giếng tế bào và ủ trong 15 phỳt Mỗi giếng tế bào được rửa 3 lần với PBS (100àl/lần) Sau đú, 50 àl Triton 0,1% (X100, Sigma-Aldrich, Mỹ) được bổ sung vàomỗigiếngvà ủtrong1giờ.

Nhân tế bào được nhuộm bằng Hoechst 33342 (14533, Sigma-Aldrich, Mỹ)với thể tớch 30 àl/giếng trong 15 phỳt Quỏt r ỡ n h n h u ộ m h u ỳ n h q u a n g đ ư ợ c t h ự c hiện ở nhiệt độ phòng và tránh ánh sáng Tế bào sau đó được rửa lại 3 lần với PBSvà quan sát dưới hệ thống kính hiển vi huỳnh quang Cytell (GE Healthcare, Mỹ).Ứng dụng Cell Cycle App được sử dụng để đánh giá hình thái nhân, bao gồm diệntích,cườngđộvàgiátrịhìnhdạng nhân(nuclearshapevalue) [116].

Phần mềm ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Mỹ) được dùngđể đánh giá diện tích tế bào Ảnh chụp tế bào từ hệ thống Cytell được chuyển đổisang dạng 8-bit và thiết lập các thông số theo một ngưỡng chung để loại bỏ độ sángnềntrướckhitínhtoán[116].

Nhữngthayđổivềmặthìnhtháicủa hucMSCtrongđiềukiệnvitrọnglự cmô phỏng cũng được đánh giá bằng phương pháp flow cytometry thông qua kết quảđo chỉsố FSC (Forward Scatter) Khidòngtế bàođi quanguồn laser trongm á y flow cytometer, chúng sẽ tán xạ lại ánh sáng Sự tán xạ này được đo bằng hai cảmbiến quang học Một cảm biến đo sự phân tán dọc theo đường đi của tia laser và chora chỉ số FSC Chỉ số này được tính toán bằng cách chuyển đổi cường độ ánh sángphát ra thành tín hiệu điện Phép đo FSC cho phép phân biệt các tế bào theo kíchthước do cường độ FSC tỷ lệ với đường kính của tế bào Trong nghiên cứu này, cáctế bào hucMSC được nhuộm với PI và đo chỉ số FSC bằng hệ thống BD Accuri C6flow cytomete (BD Biosciences,Mỹ).Giá trị FSC từnhóm đối chứng và nhómSMG được so sánh với nhau để đánh giá sự khác biệt về kích thước tế bào ở hainhómthínghiệm.

Đánhgiásựthayđổicấutrúckhungxươngtếbào

Quá trình thu hoạch tế bào được thực hiện như ở Mục2.2.4.2 Đánh giá chukỳtếbào,phầnThuhoạch tếbào.

Biểu hiện mức độ phiên mã của các gene mã hóa cho bộ khung xương tế bàođược đánh giá bằng phương pháp Realtime qRT-PCR Các gene được đánh giá baogồm α-tubulin 3 và β-actin Gene GAPDH được sử dụng để làm đối chứng. Quátrìnht h ự c h i ệ n t h í n g h i ệ m t ươ ng t ự n h ư ở Mụ c2 2 4 2 Đ á n h g i á c h u k ỳ t ế b à o,phần Đánh giá biểu hiện mức phiên mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào Chu trìnhnhiệt của phản ứng như trong Bảng 2.8 Các cặp mồi đặc trưng cho các gene khảosát được thể hiện trong Bảng 2.9 Giá trị Ctcủa mẫu được tính bằng phương pháp2 −ΔΔCtΔΔCt [111].

Bảng 2.8.Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime qRT-PCR cho các gene mã hóakhungxươngtếbào

Gene Trìnhtựmồi Tàiliệuthamkhảo α-tubulin3 F: 5’-CATTGAAAAGTTGTGGTCTGATCA-

2.2.7.3 Đánhgiá biểuhiệnmức dịchmãcácgenemãhóaviống,vi sợi

Trong nội dung nghiên cứu này, mức độ biểu hiện của các protein cấu trúckhung xương tếbàolà α-tubulin và β-actin được đánhgiá bằng phương phápWestern Blot Protein GAPDH được sử dụng làm đối chứng Các bước thực hiện thínghiệm tương tự như ở Mục2.2.4.2 Đánh giá chu kỳ tế bào, phần Đánh giá biểuhiện mức dịch mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào Các kháng thể được sử dụng baogồm:

- Kháng thể sơ cấp: Anti-beta Actin antibody (ab8226, Abcam, Mỹ) và Anti- alpha Tubulin antibody (ab52866, Abcam, Mỹ) được pha loãng với tỉ lệ1:1000; Anti-GAPDH antibody (ab181602, Abcam, Mỹ) được pha loãng vớitỉlệ1:5000.

- Kháng thể thứ cấp: Goat Anti-Rabbit IgG (HRP) (ab6721, Abcam, Mỹ) vàGoatAnti-MouseIgG(HRP) (ab6789, Abcam,Mỹ)

Nhuộm huỳnh quang vi ống: SiR-Tubulin Kit (CY-SC002, Cytoskeleton,Inc., Mỹ) được sử dụng để nhuộm vi ống Dung dịch này là phức hợp của chấtnhuộm huỳnh quang fluorophore silicon rhodamine (SiR) và chất liên kết với vi ốngDocetaxel Sir-tubulin cho phép thực hiện trên tế bào sống với độ đặc hiệu và độtương phản với nền cao. Chuẩn bị 1mM dung dịch nhuộm Sir-Tubulin bằng cáchhòa tan toàn bộ Sir- Tubulin dạng bột trong ống kit với 50àL DMSO Dung dịch nàysau đú được bảo quản ở - 20°C trước khi sử dụng Tế bào gốc trung mô được nuôitrong đĩa 96 giếng với mật độ 10 3 tế bào/giếng Quá trình nhuộm vi ống được tiếnhành cùng lúc với thử nghiệm vi trọng lực Dung dịch SiR-tubulin và verapamilđược pha trong môi trường nuôi cấy với tỉ lệ 1:1:1000 Mỗi giếng tế bào được bổsung 395 àl mụi trường nuụi cấy chứa thuốc nhuộm sao cho nồng độ cuối cùngtrong mỗi giếng là 50 nM Các giếng nuôi tế bào sau đó được phủ bằng màngparafilm trước khi đậy nắp Quá trình thử nghiệm vi trọng lực được tiến hành trong72 giờ Sau 72 giờ, các đĩa nuôi được rút bỏ môi trường, rửa với PBS và được quansátdướihệthốnghiển vihuỳnhquangCytell(GEHealthcare,Mỹ).

Nhuộm huỳnh quang vi sợi và nhân: Tế bào hucMSC được nuôi trong đĩa 96giếng với mật độ 10 3 tế bào/giếng Sau thử nghiệm vi trọng lực, đĩa tế bào được rỳtbỏ mụi trường nuụi cấy Mỗi giếng tế bào được rửa 3 lần với 100 àl PBS (PBS- 10XA, Capricorn Scientific, Đức) 50 àl 4% Paraformaldehyde Phosphate BufferSolution (09154-85, Nacalai Tesque, Nhật Bản) được cho vào mỗi giếng tế bào và ủtrong 15 phỳt Mỗi giếng tế bào được rửa 3 lần với PBS (100 àl/lần) Sau đú, 50 àlTriton 0.1% (X100, Sigma-Aldrich, Mỹ) được bổ sung vào mỗi giếng và ủ trong 1giờ.VisợiactinđượcnhuộmvớiPhalloidinCruzFluor™488Conjugate(sc-363791, Santa Cruz Biotechnology, Mỹ)vớit h ể t ớ c h 3 0 à l / g i ế n g t r o n g 1 g i ờ T ế bào sau đó được rửa 3 lần với PBS và tiếp tục nhuộm nhân Nhân tế bào đượcnhuộm bằng Hoechst 33342 (14533, Sigma-Aldrich, Mỹ) với thể tớch 30 àl/giếngtrong 15 phỳt. Quá trình nhuộm huỳnh quang được thực hiện ở nhiệt độ phòng vàtránh ánh sáng.

Tế bào sau đó được rửa lại 3 lần với PBS và quan sát dưới hệ thốngkínhhiểnvihuỳnhquangCytell(GEHealthcare,Mỹ). Đánh gi á m ậ t đ ộ v i sợ i, v i ố n g :M ậ t đ ộc ác b ó v i sợ i, v i ố n g t r o n g tế bà o đ ượcđánhgiábằngcáchđocườngđộpháthuỳnhquangcủaproteintrongcácbó sợi này Ảnh chụp huỳnh quang của hucMSC sau khi nhuộm được phân tích bằngphần mềm ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Mỹ) Hình ảnh đượcchuyểnđổisang dạng8bitvàsửdụngmộtng ưỡ ng chungchotấtcả cáchìn hđể loại bỏ sự chênh lệch phông nền trước khi diện tích tế bào và cường độ phát huỳnhquangcủaviốngvàvisợiactinđược đo[116].

Phương phápthốngkê

Phần mềm Sigma Plot (SYSTAT Software, Mỹ) được dùng để phân tích sốliệutrongnghiêncứu.PhươngphápOne- wayANOVAđượcsửdụngđểđánhgiásự khác biệt giữa các nhóm thí nghiệm, trong đó p ≤ 0,05, p ≤ 0,01, p ≤0,001 đượcxemlàcáckhácbiệtcóýnghĩathốngkê.

Đánh giácácchỉthịmarkercủatếbàogốctrung mô

Biểu hiện của các marker âm tính và dương tính cho tế bào gốc trung môđượcthểhiệnởHình3.1.Kếtquảphântíchflowcytometry chothấy tếbàohucMSC được sử dụng trong nghiên cứu biểu hiện dương tính với các marker đặctrưng cho tế bào gốc trung mô là CD90, CD73 và CD105 (Hình 3.1B2-B4) và biểuhiện âm tính với các marker không đặc trưng cho dòng tế bào này trong PE hMSCNegative Cocktail, bao gồm CD34, CD11B, CD19, CD45và HLA-DR (Hình 3.1B1).Việc âm tính với các marker CD34, CD45, CD19 chứng tỏ quần thể tế bàohucMSC không nhiễm các tế bào tiền thân tạo máu, tế bào nội mô hay tế bào bạchcầu[119].

Hình 3.1 Đánh giá biểu hiện marker ở hucMSC A1: Nhuộm với PE hMSCNegative Isotype Control Cocktail (mIgG1, κPE; PE; mIgG2a, κPE; PE) A2-A4: hMSCPositive Isotype Control Cocktail (mIgG1, κPE; FITC; mIgG1, κPE; APC; mIgG1, κPE;PerCP-Cy5.5) B1: hucMSC biểu hiện âm tính với PE hMSC Negative Cocktail(CD34PE,CD11bPE, CD19PE,CD45 PE,HLA-DRPE).B 2 -

B 4 : hucMSCbiểu hiệndươngtínhvới cácmarkerđặc trưngcho hMSC(CD90,CD73, CD105).

Hơn nữa, sự âm tính với marker CD19 cho thấy tế bào B và tế bào tua(dendritic cells) không tồn tại trong quần thể tế bào hucMSC trên Ngoài ra, sự âmtính vớimarkerHAL-DR vàCD11Bchứngtỏkhôngtồntạitếbàobạchcầuhayđại thực bào trong quần thể tế bào hucMSC [120, 121] Các kết quả phân tích trênchứng tỏ quần thể tế bào hucMSC sử dụng trong nghiên cứu vẫn giữ được các đặctínhcủa tếbàogốctrungmô.

Đánhgiásựtăng sinhtếbào

Sựthayđổi mậtđộtếbào

Mật độ quang của hucMSC trong hai nhóm thí nghiệm được tính toán và thểhiện ở Hình 3.2 Theo đó, mật độ quang trung bình ở nhóm thử nghiệm vi trọng lực(SMG) là 0,97 ± 0,05, thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng là 1,09 ± 0,13 (p ≤0,001) Điều này cho thấy mức độ tăng sinh của hucMSC giảm khi nuôi cấy trongmôitrườngvitrọnglựcmôphỏng.

Hình 3.2 Mật độ quang của hucMSC qua đánh giá bằng phương pháp WST-1.

A:Biểu đồ mật độ quang B: hucMSC trong điều kiện bình thường C: hucMSC trongđiềukiệnvitrọnglựcmô phỏng (SMG).***: p≤0,001.Thướcđo: 111,82 μl,m

Những ảnh hưởng của lực hấp dẫn đã được báo cáo trong nhiều nghiên cứutrước đây, bao gồm mô tả sự thay đổi về mặt hình thái hoặc xác định các đặc tínhcủa tế bào [25, 28, 122, 123] Một số dòngtế bào nhưtế bàomỡ,b ạ c h c ầ u đ ơ n nhân, nguyên bào xương người, tế bào gốc phôi chuột, tế bào gốc trung mô chuột đãđược sử dụng làm mô hình cho các nghiên cứu vi trọng lực mô phỏng trong cácnghiêncứucủaYugevàcộngsựnăm2003,Huangvàcộngsựn ă m 2 0 0 9 , Kawaharav àcộngsựnăm2009, Melonivàcộngsựnăm2011[124-127].

Sự sinh trưởng của tế bào được thể hiện qua quá trình tăng sinh, ở đó tế bàogia tăng về số lượng Đây là quá trình tất yếu và diễn ra thường xuyên trong cơ thểsinh vật Vi trọng lực mô phỏng đã được chứng minh là làm giảm sự tăng sinh củamột số loại tế bào Vào năm 2004, nhóm nghiên cứu của Plett đãquan sát thấy tếbào tiền thân tạo máu ở người giảm phân chia khi chịu ảnh hưởng của môi trường vitrọng lực tạo ra từ buồng xoay tế bào (RWV) trong thời gian dài [61] Đến năm2014, Benavides Damm và cộng sự đã sử dụng máy định vị vị trí ngẫu nhiên (RPM)tạo môi trường vi trọng lực mô phỏng để thử nghiệm lên nguyên bào cơ vân chuộtvà nhận thấy dòng tế bào bi ức chế tăng sinh khi nuôi cấy trong môi trường vi trọnglực mô phỏng [38] Nghiên cứu của Yan và cộng sự năm 2015 sử dụng clinostat 2Dđã chứng mình tế bào gốc trung mô tủy xương ở chuột giảm tăng sinh trong môitrường vi trọng lực mô phỏng [24] Các nghiên cứu gần đây của Tan năm 2018 trêntế bào hắc tố melanoma và Touchstone năm 2019 trên tế bào gốc trung mô chuột, sửdụng các hệ thống RMP và clinostat 2-D đều cho thấy sự giảm tăng sinh của cácdòngtếbàonàytrong môitrườngvitrọnglựcmôphỏng[22,63].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng mật độ tế bào gốc trung mô cuốngrốn ở người (hucMSC) trong nhóm thử nghiệm vi trọng lực mô phỏng (SMG) thấphơn nhóm đối chứng sau

3 ngày nuôi cấy Điều này đã chứng minh rằng các điềukiệnvitrọnglực môphỏngđãlàmgiảmsựtăngtrưởng củatếbàohucMSC.Kếtquả này tương đồng với các kết quả nghiên cứu đã đề cập ở trên Tuy nhiên, cơ chếcủa sự giảm tăng sinh này chưa được mô tả rõ ràng, nhất là trên dòng tế bào gốctrung mô cuống rốn Các đánh giá về chu kỳ tế bào, sự chết theo chương trình và sựthay đổi bộ cấu trúc khung xương tế bào ở hucMSC được trình bày ở phần kết quảtiếptheosẽgópphầnlàmrõhơncơchếnày.

Sựthayđổichukỳtếbào

Kết quả phân tích chu kỳ tế bào ở Hình 3.3 cho thấy một sự thay đổi rõ nétgiữa tỉ lệ đi vào các pha của hucMSC trong điều kiện trọng lực bình thường và vitrọng lựcmô phỏng.Qua đó, tỷ lệ tế bào hucMSC bướcvào pha nghỉG0/G1ở nhóm nuôi cấy dưới điều kiện vi trọng lực mô phỏng (SMG) là 85,65 ±0,65% caohơn rõrệtsovớinhómđối chứnglà72,27±1,28%.Đồngthời,tỉlệhucMSCđivào pha phân chia G2/M ở nhóm SMG cũng giảm so với ở nhóm đối chứng (5,65 ±0,05%ởnhómSMGvà22,10±1,27%ởnhómđốichứng).Nhữngkhác biệtnà yđều có ý nghĩa thống kê khi phân tích bằng One-way ANOVA với p ≤ 0,01 Dữ liệunày cho thấy rằng vi trọng lực mô phỏng có thể làm giảm quá trình phân chia và cóxuhướngtạoragiaiđoạnbắtgiữ chukỳtế bào.

BiểuhiệnmRNAcủacácgeneCDK2,CDK6,CyclinAcủatếbàogốctrungmô cuốngrốn(hucMSC)đượcmôtảtrongHình3.4.

Hình 3.4 Biểu hiện mức phiên mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào bằng phươngphápRealtimeqRT-PCR ***:p≤0,001;*:p≤0,05

Khi nuôi cấy trong môi trường vi trọng lực mô phỏng, biểu hiện của các genenày đều có sự giảm xuống mang ý nghĩa thống kê.CDK2ở nhóm vi trọng lực(SMG) có biểu hiện giảm mạnh còn 0,59 ± 0,07 so với nhóm đối chứng là 1,01 ±0,13 (p ≤ 0,001).CDK6giảm biểu hiện nhẹ hơn khi mức độ biểu hiện ở nhóm SMGlà 0,68 ± 0,05 so với đối chứng là 1,00 ± 0,14 (p ≤ 0,01).Cyclin Acó mức độ hiểuhiện giảm nhẹ nhất trong ba gene với mức độ biểu hiện ở nhóm SMG là 0,83 ± 0,09vàởnhómđốichứnglà1,00±0,09(p≤0,05).

Biểu hiện các protein Cyclin A1+A2, CDK4 và CDK6 ở hucMSC đều có xuhướngg i ả m k h i n u ô i c ấ y t r o n g m ô i t r ư ờ n g v i t r ọ n g l ự c m ô p h ỏ n g (

H ì n h 3 5 ) Cyclin A1+A2 có mức độ biểu hiện giảm rõ nét nhất khi tỉ lệ biểu hiện ở nhóm vitrọng lực (SMG) là 0,34 ± 0,04, bằng một phần ba tỉ lệ biểu hiện ở nhóm đối chứnglà 1,00 ± 0,07 (p ≤ 0,001) Mức độ biểu hiện CDK4 và CDK6 ở nhóm SMG lần lượtlà 0,79 ± 0,01 và 0,82 ± 0,01, giảm nhẹ so với nhóm đối chứng (1,00 ± 0,06ở CDK4và1,00±0,10ở CDK6).

Hình 3.5 Biểu hiện mức dịch mã các gene điều hòa chu kỳ tế bào bằng phươngphápWesternBlot.***:p≤0,001;**:p≤0,01;*:p≤0,05

Sự sinh trưởng của tế bào gắn liền với chu kỳ tế bào Một chu kỳ của tế bàobao gồm bốn giai đoạn cơ bản: pha G0/G1 (pha nghỉ), pha S (tổng hợp DNA), phaG2 (giai đoạn tổng hợp protein và chuẩn bị cho nguyên phân) và pha M (nguyênphân) Kết quả phân tích chu kỳ tế bào cho thấy tỷ lệ các tế bào hucMSC đi vào phaG0/G1 ở nhóm SMG cao hơn nhóm đối chứng, điều này cho thấy điều kiện vi trọnglực mô phỏng đã thúc đẩy hucMSC bước vào giai đoạn bắt giữ (arrest phase) trongchu kỳ tế bào Ngoài ra, tỷ lệ hucMSC ở pha G2/M của nhóm SMG nhỏ hơn so vớinhóm đối chứng cũng cho thấy điều kiện vi trọng lực mô phỏng gây ra sự giảm quátrìnhphânchiatế bàocủahucMSC.

Cyclins và CDKs (cyclin-dependent kinases)làhai nhóm phân tửđóng vaitrò chính trong việc điều hòa chu kỳ tế bào [128] Cyclin là những protein mangchức năng điều hòa, trong khi đó CDK là những ezyme xúc tác Trong các giai đoạncủa chu kỳ tế bào, Cyclins kích hoạt CDKs tạo ra phản ứng phosphoryl hóa nhằmkíchhoạthoặcbấthoạtcác proteinmục tiêuđểđiềuphốidiễntiếncủachuk ỳtếbào[129].

Cyclin A là một protein nắm vai trò khá quan trọng nhờ khả năng tác độngđến nhiều giai đoạn trong chu kỳ tế bào [130] Cyclin A có thể gắn kết và kích hoạtcả hai loại CDK riêng biệt là CDK1 và CDK2 [131] Liên kết giữa Cyclin A vàCDK1 cần thiết cho quá trình chuyển giao từ pha G2 sang pha M trong khi đó liênkết giữa Cyclin A và CDK2 kích hoạt tế bào đi vào pha S [132-135] Cyclin A ởngười bao gồm hai loại là Cyclin A1, thường biểu hiện ở các tế bào gốc phôi vàCyclin A2, biểu hiện trong các tế bào soma [130, 132, 133] Kết quả đánh giá biểuhiện mRNA và biểu hiện protein bằng Western Blot của Cyclin A đều cho thấyproteinnà ygiảmbiểuh i ệ n t ro ng đ i ề u k i ệ n v i trọng l ự c m ô phỏng Điềun à y phùhợp với kết quả flow cytometry trong đó tỉ lệ hucMSC đi vào pha G2/M ở nhómSMGthấphơnhẳnsovớinhómđốichứng.

CDK2 là enzyme đóng vai trò thiết yếu trong quá trình tổng hợp DNA củachu kỳ tế bào [136, 137] Ngoài liên kết với Cyclin A, CDK2 còn có thể gắn vớiCyclin E và kích hoạt quá trình chuyển giao từ pha G1 sang pha S [138].Trongnghiên cứu này, biểu hiện mRNA thông qua kết quả Realtime qRT-PCR củaCDK2ởnhómSMGthấphơnnhómđốichứng.Đồngthời,kếtquảflowcyto metryđánh giá chu kỳ tế bào lại cho thấy tỉ lệ tế bào hucMSC ở nhóm SMG trong pha G0/G1tăng trong khi pha S gần như không đổi Điều này cho thấy sự giảm biểu hiện củaCDK2 làm giảm tỉ lệ hucMSC bắt đầu quá trình chuyển giao từ pha G1 sang pha ShơnlàgiảmtỉlệhucMSC đangđivàophaS.

CDK6 là một thành viên thuộc họ CDKs, đóng vai trò quan trọng trong quátrình tiến triển pha G1 và chuyển giao pha S/G1 [139, 140] Trong chu kỳ tế bào,CDK4 và CDK6 kết hợp với Cyclin D để tạo ra các phức hợp thúc đẩy quá trìnhchuyển từ pha G1 sang pha S [141] Sự chuyển đổi này đóng một vai trò quan trọngtrong việc kiểm soát sự tăng sinh tế bào [142] Ức chế CDK4/6 gây ra sự suy giảmtăng sinh tế bào [143-145] Kết quả Western Blot cho thấy biểu hiện protein củaCDK4 và CDK6 ở hucMSC giảm trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng Đồng thời,biểu hiện mRNA củaCDK6của nhóm thử nghiệm vi trọng lực (SMG) cũng thấphơn so với nhóm đối chứng So sánh với kết quả flow cytometry, có thể suy ra rằngsự giảm biểu hiện của hai protein này ở nhóm vi trọng lực mô phỏng đã dẫn đến sựgiatăngtỉlệtếbàohucMSCđivào phaG0/G1. Ảnh hưởng của điều kiện vi trọng lực lên chu kỳ tế bào hiện vẫn chưa đượcnghiên cứu nhiều, đặc biệt là các nghiên cứu thực hiện trên máy clinostat 3D. Mộtnghiên cứu thực hiện trên hệ thống RPM của Sokolovskaya và cộng sự năm 2014trên dòng tế bào nội mô người cho thấy điều kiện vi trọng lực mô phỏng làm tăng tỉlệ tế bào đi vàopha G0/G1và giảm lượng tế bào đi vào phaS[ 3 7 ]

N g h i ê n c ứ u thực hiện trong buồng quay tế bào (RWV) của Maier trên tế bào bạch cầu đơn nhânU937 ở người cho thấy tế bào U937 không gia tăng mức độ apoptosis mà phát triểnchậmhơnsovớiđiềukiệnbìnhthường[146].

Nghiên cứu hiện tại trên dòng tế bào hucMSC cũng cho ra kết quả tương tựkhi tỉ lệ tế bào đi vào pha G0/G1 tăng và tỉ lệ tế bào ở pha G2/M giảm ở nhómSMGso với ở điều kiện bình thường, dẫn đến mức độ tăng sinh của hucMSC giảm trongmôitrườngvitrọng lựcmôphỏng.Tuynhiên,thờigianthửnghiệmvàđặctr ưngcủa dòng tế bào cũng là nhân tố tác động đến sự sinh trưởng và chu kỳ tế bào Dođó, cần có các nghiên cứu thực hiện trên nhiều dòng tế bào khác nhau với các mứcthời gian, cũng như điều kiện vi trọng lực khác nhau để làm rõ hơn cơ chế tác độngcủavi trọnglực lên tếbàocủasinhvật.

Đánh giáquátrìnhapoptosis

Biểu hiệnmứcphiênmãcácgeneliên quanđếnapoptosis

Phương pháp Realtime qRT-PCR được sử dụng để ước tính biểu hiện phiênmã của hai geneBcl-2vàBaxcủa hucMSC Kết quả từ Hình 3.7 chỉ ra rằng khôngcó sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về biểu hiện mRNA củaBcl-

2vàBaxởhucMSCgiữanhómđốichứngvànhómvitrọnglực(SMG). Đã có nhiều nghiên cứu cho rằng sự chết tế bào không làm giảm mức độ tăngsinh của tế bào trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng [22, 60, 38] Nghiên cứu củaPlett và cộng sự năm 2004 cho thấy điều kiện vi trọng lực mô phỏng đã gây ra sựkéo dài pha S dẫn đến làm chậm quá trình tăng sinh của tế bào tủy xương CD34+[61] Điều kiện vi trọng lực mô phỏng còn được cho rằng đã làm ức chế quá trìnhtăng sinh của tế bào gốc trung mô tủy xương (bmMSCs) bằng cách chặn đứng giaiđoạnG2/MtrongnghiêncứucủaYanvàcộngsựnăm2015[24].Nghiêncứugần đâyc ủ a T a n v à c ộ n g s ự n ă m 2 0 1 8 đ ã c h ứ n g m i n h m ô i t r ư ờ n g v i t r ọ n g l ự c m ô phỏngứcchếsựpháttriển củatế bàoungthưbằngcáchđảongược quátrình bộmáy trao đổi chất dị hóa của một số chức năng cố định (housekeeping functions)[63].

Hình 3.7 Biểu hiện mức phiên mã các gene liên quan đến apoptosis ở hucMSCbằngphươngpháp RealtimeqRT-PCR

Trong nghiên cứu hiện tại, tỉ lệ sống và tỉ lệ apoptosis của tế bào hucMSC ởđiều kiện vi trọnglực mô phỏng không cósựkhác biệtso vớiđ i ề u k i ệ n b ì n h thường, cho thấy sự chết của tế bào không dẫn đến sự giảm tăng sinh của các tế bàohucMSC Cùng với kết quả đánh giá chu kỳ tế bào ở phần trước, có thể thấy sự ứcchếtăngsinhcủatếbàohucMSCtrongđiềukiệnvitrọnglựcmôphỏngđượcgâyr a bởi sự giảm biểu hiện các protein điều hòa chu kỳ tế bào Những protein này đãkích hoạt hucMSC gây ra sự bắt giữ các tế bào trong pha G0/G1 và làm chậm quátrìnhphânchiatế bào.

Đánhgiásựthayđổihìnhtháitếbào

Sựthayđổi hình tháinhân

Hình thái nhân của hucMSC đã có một số thay đổi khi tế bào được nuôi trongmôi trường vi trọng lực mô phỏng Trong nghiên cứu, giá trị cường độ nhân ởhucMSC được xác định bằng cách đo cường độ phát huỳnh quang trong nhân ở cáctế bào này.Ở b i ể u đ ồ

H ì n h 3 8 , c ư ờ n g đ ộ n h â n c ủ a h u c M S C c ó b i ể u h i ệ n g i ả m trongmôitrườngvitrọnglựcmôphỏng,ởnhómSMGlà5629317±39469sov ới nhóm đối chứng là 5957254 ± 65063 (p ≤ 0,001) Trong khi đó, diện tích nhân củahucMSC không có sự thay đổi đáng kể khi không tìm thấy sự khác biệt mang ýnghĩathốngkờnàogiữahainhúmSMG(314,04±2,55àm 2 )vàđốichứng(318,07 ± 1,73 àm 2 ) (Hỡnh 3.9) Giỏ trị hỡnh dạng nhõn biểu thị mức đối xứng của nhõn tếbào, nhân càng đối xứng thì giá trị càng tiệm cận đến 1,0 Hình 3.10 cho thấy giá trịhình dạng nhân của hucMSC không có sự thay đổi giữa nhóm SMG (0,89 ± 0,002)vànhómđốichứng(0,88±0,003).

Hình 3.10.Hình dạng nhân của hucMSC qua phân tích bằng ứng dụng Cell

Sự phân bố các tế bào hucMSC theo hình dạng và cường độ nhân giữa hainhóm thí nghiệm cũng khá tương đồng (Hình 3.11 và 3.12) Nhóm đối chứng có sựphân bố cường độ nhân vượt qua ngưỡng 1,5 × 10 7 trong khi đó hầu hết giá trịcườngđộnhânnhómSMGđềunằmdướingưỡng1,5×10 7

Việc tái cấu trúc hạt nhân đòi hỏi sự tổng hợp DNA và các thành phần tế bàoliên quan Trong pha S của chu kỳ tế bào, sự sao chép DNA dẫn đến sự tăng cườngđộh ạ t n h â n v à n g ư n g t ụ c h r o m a t i n [ 1 4 7 ] Q u á t r ì n h c h u y ể n t ừ p h a S s a n g p h a G2/M chuẩn bị cho giai đoạn nguyên phân cũng làm tăng cường độ nhân trong tếbào [148, 149]. Kết quả đánh giá hình thái nhân trong nghiên cứu cho thấy tuykhông có sự thay đổi mang ý nghĩa thống kê về diện tích và hình dạng, cường độnhân của hucMSC giảm khi được nuôi trong môi trường vi trọng lực mô phỏng Kếthợp với các đánh giá về chu kỳ tế bào ở kết quả trước, thay đổi này được cho là kếtquảcủasựgiảmbiểuhiệncácgeneliênquanđếnchukỳtếbào,dẫnđếnlàmgiảmtỷ lệ tế bào đi vào quá trình phân chia ở hucMSC trong môi trường vi trọng lực môphỏng.

Hình3.11.Sự phân bốnhântrongmối tươngquan giữahìnhdạng nhânvà cườngđộ nhân ở hucMSC qua phân tích bằng ứng dụng Cell Cycle App Màu xanh dươngbiểu thị tế bào đang ở pha G0/G1, màu đỏ biểu thị tế bào đang ở pha S, màu xanh lábiểuthịtếbàođangởphaG2/M.

Hình 3.12.Sự phân bố nhân trong mối tương quan giữa diện tích nhân và cường độnhân ở hucMSC qua phân tích bằng ứng dụng Cell Cycle App Màu xanh dươngbiểu thị tế bào đang ở pha G0/G1, màu đỏ biểu thị tế bào đang ở pha S, màu xanh lábiểuthịtếbàođangởphaG2/M

Sựthayđổi hình tháitếbào chất

Hình 3.13A và 3.13B cho thấy hình thái hucMSC ở hai nhóm vi trọng lực(SMG) và đối chứng đều có dạng thuôn dài đặc trưng của tế bào gốc trung mô. Tuynhiên màng tế bào chất của các tế bào hucMSC ở nhóm SMG có xu hướng trải rộngra hơn nhiều so với nhóm đối chứng Nhận định này được bổ sung bằng kết quả đodiện tích tế bào ở Hình 3.13C, trong đó diện tích trung bình của các tế bào hucMSCởnhúmSMGlà14083,34±1069,38àm 2 ,caohơnsovớinhúmđốichứng(11368,6

7 ± 535,27 àm 2 ) (p ≤ 0,05) Cỏc tế bào hucMSC cũng cho thấy sự sinhtrưởng bỡnh thường ởcả hainhóm khikhông pháthiệndấuhiệu củacác thểapoptosis nàotrongquầnthể.

Hình 3.13 Hình thái tế bào chất của hucMSC A, B: Hình thái tế bào chất củahucMSC trong điều kiện bình thường (A) và trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng(B) C: Biểu đồ đỏnh giỏ diện tớch tế bào ở hucMSC *: p ≤ 0,05 Thước đo: 223,64àm.

NhữngthayđổivềmặthìnhtháicủahucMSC trongđiềukiệnvitrọng lự cmô phỏng cũng được đánh giá bằng phương pháp flow cytometry thông qua kết quảđo chỉ số FSC (Forward Scatter).Chỉ số này cho phép đo lượng tia laser đi qua tếbào,từđócóthểtínhtoánđượckíchthướctươngđốicủatếbàosovớiđốichứng.

Kết quả ở Hình 3.14 cho thấy giá trị FSC của hucMSC ở nhóm SMG tăng lên vớigiá trị trung bình là 10803988,58 ± 20960,12, cao hơn so với nhóm đối chứng(9829898,02 ± 206370,30) (p ≤ 0,01) Điều này cho thấy điều kiện vi trọng lực môphỏngđãlàmtăngkích thước tếbàoởtếbàohucMSC.

Hình 3.14 Giá trị FSC biểu thị kích thước tế bào ở hucMSC A, B: Biểu đồthể hiện giá trị FSC của hucMSC ở nhóm đối chứng (A) và nhóm vi trọng lực môphỏng(B).C:Biểuđồsosánhgiá trịFSCtrungbìnhở hucMSCgiữanhómđối chứngvànhómvitrọnglựcmôphỏng(SMG).**:p≤0,01

Kết quả phân tích hình thái tế bào chất cho thấy điều kiện vi trọng lực môphỏng gây ra những thay đổi về mặt hình thái của hucMSC sau 3 ngày nuôi cấy. Cụthể là các tế bào trong môi trường vi trọng lực mô phỏng có xu hướng mở rộng diệntích hơn so với ở điều kiện bình thường Các nghiên cứu trước đây đã khám pháđược điều kiện vi trọng lực mô phỏng có thể tạo ra sự thay đổi hình thái của tế bàođộng vật có vú bằng nhiều cơ chế khác nhau Năm 2018, Dinarelli và cộng sự đãchứng minh rằng môi trường vi trọng lực mô phỏng gây ra những thay đổi về hìnhdạng tế bào và độ nhám màng trên hồng cầu ở người [150] Nghiên cứu trên nguyênbào xương nguyên phát ở người của Gioia và cộng sự cũng trong năm này cho thấycáctế bà o x ư ơ n g t h a y đổihì nh th ái từ d ạ n g phẳ ng san gdạ ng hì nh th oi kh i đư ợc nuôit ro ng m ô i t rư ờn g v i tr ọn gl ực m ô p hỏ ng [ 1 5 1 ] M ô i t rư ờn g v i tr ọn g l ự c m ô phỏng cũng gây ra sự thay đổi khung xương actin trong các tế bào A431 ở ngườitrong nghiên cứu của Moes năm 2011 [152] Một nghiên cứu khác của Kapitonovanăm 2013 báo cáo rằng môi trường vi trọng lực mô phỏng tạo ra những thay đổimạnh mẽ về kích thước và hình dạng của các tế bào và sự chuyên môn hóa bề mặtcủa chúng [153] Sự tăng diện tích của hucMSC trong nghiên cứu này có thể đượcgiải thích bằng việc tác động của môi trường vi trọng lực mô phỏng lên bộ khungxương tế bào, cụ thể là vi sợi actin và vi ống Những thay đổi này được đánh giá vàchứng minhởkếtquảđánhgiácấutrúckhungxươngtếbào.

Đánhgiácấutrúckhungxươngtếbào

Biểu hiệnmứcphiênmãcácgenemãhóaviống,visợi

Nghiên cứu đánh giá biểu hiện mức phiên mã của các geneα-tubulin 3mãhóa vi ống vàβ-actinmã hóa vi sợi ở hucMSC Kết quả Realtime qRT-PCR chothấy hai gene này giảm mức độ biểu hiệnm R N A k h i t ế b à o đ ư ợ c n u ô i c ấ y t r o n g môi trường vi trọng lực mô phỏng (SMG) (Hình 3.15) Mức độ biểu hiện củaβ-actinở nhóm SMG là 0,60 ± 0,03, thấp hơn hẳn so với nhóm đối chứng là 1,00 ±0,06 (p ≤ 0,001) Sự thay đổi biểu hiện củaα-tubulin 3càng rõ rệt hơn khi mức độbiểu hiện ở nhóm SMG là 0,23 ± 0,03 giảm gần năm lần so với nhóm đối chứng là1,00±0,08(p≤0,001).

Hình 3.15 Biểu hiện mức phiên mã các gene mã hóa vi ống, vi sợi bằng phươngphápRealtimeqRT-PCR.***:p≤0,001

Biểu hiệnmứcdịch mãcácgene mã hóa viống,visợi

Kết quả Western Blot đánh giá biểu hiện protein của β-actin ở vi sợi và α- tubulin ở vi ống được thể hiện ở Hình 3.16 Theo đó, protein β-actin giảm biểu hiệnmạnh trongmôi trường vi trọng lựcmôphỏng (SMG).M ứ c đ ộ b i ể u h i ệ n c ủ a β - actin trong nhóm SMG 0,06 ± 0,01, giảm 16 lần so với nhóm đối chứng (1,00 ±0,02) Biểu hiện protein của α-tubulin cũng giảm khimức độb i ể u h i ệ n ở n h ó m SMG là 0,42 ± 0,01 và ở nhóm đối chứng là 1,00 ± 0,02 Các khác biệt này đều có ýnghĩathốngkêquaphântíchbằngOne-wayANOVA(p≤0,001).

Hình 3.16 Biểu hiện mức dịch mã các protein cấu trúc vi sợi, vi ống bằng phươngphápWesternBlot.***:p≤0,001

Đánhgiásựtáicấutrúcbộkhungviống,visợitrongtếbào

Vi ống là các protein có hình dạng ống và là một thành phần của bộ xương tếbào.Chúngthamgiavàoviệcduytrìhìnhdạngcủatếbào;nếukhôngcóchúng,tế bào sẽ bị chén ép bởi các tế bào lân cận của nó Chúng cũng chịu trách nhiệm tổchức bên trong tế bào và các chuyển động khác nhau trong tế bào, đặc biệt là sựchuyển động của các bào quan và thành phần nhỏ khác di chuyển từ vị trí này sangvị trí khác trong tế bào chất Chức năng này làm cho các vi ống quan trọng đối vớiquá trình phân chia tếbào Các vi ống hìnhthành bộmáy thoi vôs ắ c , g i ú p p h â n chia nhiễm sắc thể trực tiếp trong quá trình phân bào Kết quả ở Hình 3.17 cho thấyhucMSC ở nhóm đối chứng có mật độ vi ống (tubulin) dày hơn và tập trung nhiềuxung quanh nhân Trong khi đó các bó vi ống ở nhóm vi trọng lực (SMG) có mật độthấp hơn và trải đều khắp tế bào Qua quan sát, hucMSC ở nhóm đối chứng có hìnhdạng giống như nguyên bào sợi với các bó vi ống phân bố song song dọc theo chiềudài tế bào. Cách sắp xếp này không được tìm thấy ở nhóm SMG, thay vào đó là sựphânbốđanxencácbóviốngtrongtếbàochất.

Vi sợi, một thành phần khác của bộ khung xương tế bào, là các protein dạngsợi được trải rộng khắp tế bào Chúng cóm ộ t v a i t r ò n h ỏ t r o n g v i ệ c h ỗ t r ợ h ì n h dạng của tế bào và tổ chức bên trong của nó Vi sợi đóng vai trò quan trọng trongcác chuyểnđộng của tế bào Cácvi sợichịut r á c h n h i ệ m c h o b ấ t k ỳ c h u y ể n đ ộ n g nào mà tế bào tạo ra, chẳng hạn như hình dạng thay đổi, tế bào co lại hay tế bào dichuyển trên bề mặt Ngoài ra trong quá trình phân chia tế bào, hệ thống vi sợi thamgiác ấ u t r ú c n ê n v ò n g t h ắ t p h â n c h i a t ế b à o , c ũ n g n h ư t h a m g i a v ậ n c h u y ể n b à o quan bằng các protein vận động dọc theo các bó vi sợi Hình 3.18 mô tả sự phân bốsong song dọc theo chiều dài tế bào của các bó vi sợi trong nhóm hucMSC đốichứng Quan sát cho thấy ở nhóm SMG vi sợi biểu hiện mật độ thấp hơn và phân bốđều trong tế bào Các bó sợi actin ở nhóm SMG cũng mảnh hơn so với nhóm đốichứng Cả hai kết quả nhuộm actin và tubulin đều cho thấy sự giới hạn về chiều dàitế bào của hucMSC ở nhóm SMG Các tế bào trong nhóm này có xu hướng mở rộngtheohìnhtrònthayvìkéodài.

Hình 3.17 Ảnh nhuộm huỳnh quang vi ống của hucMSC trong điều kiện bìnhthường và điều kiện vi trọng lực mô phỏng (SMG) Vi ống được nhuộm với Sir-Tubulin(đỏ).Thướcđo:223,64àm

Hình 3.18.Ảnh nhuộm huỳnh quang vi sợi của hucMSC trong điều kiện bìnhthường và điều kiện vi trọng lực mô phỏng (SMG) Vi sợi được nhuộm vớiPhalloidin (xanh lá) Nhân được nhuộm với H33342 (xanh dương).

Cường độ phát huỳnh quang của vi ống ở hai nhóm đối chứng và SMG đượcthể hiện ở Hình 3.19 Qua tính toán, cường độ vi ống của hucMSC trong nhóm đốichứng là 3980694.27 ± 842699,73, cao hơn so với nhóm SMG (2860286.60 ±338612.60) (p ≤ 0,001) Điều này chứng tỏ mật độ vi ống phân bố dày hơn ở nhómtếbàođượcnuôiởđiềukiệnbình thườngso với môitrường mô phỏngvitrọng lực.

Hình 3.19.Kết quả đánh giá mật độ vi ống của hucMSC A: Ảnh nhuộmhuỳnhquangviống ở nhómđốichứng.B:Ảnhnhuộmhuỳnhquangvi ốngởnhóm SMG C: Cường độ phát huỳnh quang vi ống của hucMSC ở nhóm đối chứng vànhúmSMG ***:p≤ 0,001.Thướcđo:223,64àm.

Kết quảđánhgiá cường độ phát huỳnhquang củavi sợiởH ì n h 3 2 0 c h o thấy cường độ actin của hucMSC ở nhóm SMG là 3364019,71 ± 688901,20,thấphơn so với nhóm đối chứng (4276497,43 ± 1190673,58) (p ≤ 0,05) Do đó có thể kếtluận môi trường mô phỏng vi trọng lực (SMG) làm giảm khả năng biểu hiện của viốngtronghucMSC.

Hình 3.20.Kết quả đánh giá mật độ vi sợi actin của hucMSC A: Ảnh nhuộmhuỳnh quang vi sợi actin ở nhóm đối chứng B: Ảnh nhuộm huỳnh quang vi sợiactinởnhómSMG.C: Cườngđộpháthuỳnh quangvisợiactincủahucMSCở nhúmđốichứngvànhúmSMG.*:p ≤0,05.Thướcđo: 223,64 àm.

Khung xương tế bào đóng vai trò quan trọng trong việc xây dựng hình dạngvà cấu trúc tế bào, hỗ trợ các chuyển động và góp phần vào sự tương tác của tế bào[154] Vi sợi và vi ống là hai thành phần cấu trúc chính của khung xương tế bào, rấtcần thiết cho sự phân chia tế bào [155] Trong nguyên phân, vi ống kéo dài từ trungtửđếnrìatếbào,hìnhthànhcácthoivôsắcphântáchnhiễmsắcthểtrongtế bàocon[156].Bêncạnhđó, visợigópphầnvào việcxâydựngrãnhphântáchtr ongquátrìnhnguyênphân[157].

Trong nghiên cứu này, các tế bào hucMSC đã có sự tổ chức lại vi sợi và viống khi nuôi trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng Kết quả đánh giá hình tháikhung xương tế bào cho thấy trong môi trường vi trọng lực, các bó vi ống và vi sợidànt r ả i v ớ i m ậ t đ ộ đ ề u n h a u v à p h â n b ố đ a n x e n t r o n g t ế b à o t r o n g k h i ở m ô i trường bình thường, các bó vi ống tập trung song song với mật độ cao xung quanhnhân.Việctái sắp xếpvi sợi cũngđượcquansát thấytrongtếbàohucMSCkhi nuôi trong môi trường vi trọng lực mô phỏng Mật độ của vi ống và vi sợi trong tế bàohucMSCở môitrường vitrọnglựcmôphỏngđềuthấphơnởnhómđốichứng.

Actin và Tubulin là các thành phần tương ứng của vi sợi và vi ống. Nhữngthay đổi trong quá trình tổng hợp của chúng có thể làm thay đổi cấu trúc của vi sợivà vi ống Trong nghiên cứu hiện tại, các tế bào hucMSC giảm biểu hiện β- Actin vàα-Tubulin 3 trong môi trường vi trọng lực mô phỏng, dẫn đến giảm sự hình thànhthoi vô sắc và rãnh phân tách hỗ trợ sự phân chia tế bào Sự tái tổ chức vi sợi và viống của tế bào gốc trung mô và tế bào sụn đã được nhắc đến trong nhiều nghiên cứutrước đây của Aleshcheva và cộng sự năm 2013, Chen và cộng sự, Cazzaniga vàcộng sự năm 2016, sử dụng các hệ thống clinostat 2D và máy định vị vị trí ngẫunhiên(RPM)để t ạ o m ô i t rư ờn gv it rọ ng lự c môph ỏn g[ 36 , 3 9 , 15 8] T uy nhiên,mối quan hệ giữa sự tái tổ chức các vi sợi, vi ống và mức độ biểu hiện của Actin,Tubulin vẫn chưa được mô tả Nghiên cứu hiện tại đã chứng minh rằng việc tái sắpxếp các vi ống và vi sợi có liên quan đến việc giảm biểu hiện Tubulin và Actin, chothấy rằng sự giảm biểu hiện của hai gene này ở hucMSC trong môi trường vi trọnglựcmôphỏngcóthểdẫnđếnviệctáicấutrúckhungxương tếbào.