Đánh giá sự thay đổi tăng sinh và cấu trúc khung xương tế bào gốc trung mô cuống rốn người trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌCV ÀCÔNGNGHỆVIỆTNAM BỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠO HỌCVIỆN KHOAHỌC VÀCÔNGNGHỆ - HồNguyễn QuỳnhChi ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI TĂNG SINH VÀ CẤU TRÚCKHUNG XƯƠNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ CUỐNG RỐNNGƯỜITRONGĐIỀUKIỆNVITRỌNGLỰCMƠPHỎNG LUẬNÁNTIẾNSĨ CƠNGNGHỆSINHHỌC Tp.Hồ ChíMinh–Năm2021 HồNguyễn QuỳnhChi ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI TĂNG SINH VÀ CẤU TRÚCKHUNG XƯƠNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MƠ CUỐNG RỐNNGƯỜITRONGĐIỀUKIỆNVITRỌNGLỰCMƠPHỎNG Chun ngành: Cơng nghệ sinh họcMãsố:9420201 LUẬNÁNTIẾNSĨ CƠNGNGHỆSINHHỌC NGƯỜIHƯỚNGDẪNKHOAHỌC: GS.TS.Hồng NghĩaSơn Tp.Hồ ChíMinh–Năm2021 LỜICAMĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trungthực chƣa đƣợc sử dụng để bảo vệ học vị Mọi giúp đỡ cho việcthực luận văn đƣợc cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn đãđƣợcchỉrõnguồngốc rõràngvàđƣợcphépcơngbố Tp.HồChíMinh,ngày19tháng 04năm 2021 Họcviênthựchiện HồNguyễnQuỳnhChi LỜICẢMƠN Để hồn thành luận án này, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc đến Thầy PGS.TS.HồngNghĩaSơn,ngƣờiđãlntậntâmchỉdẫn,tạomọiđiềukiệnchotơih ọc tập,nghiêncứu vàhoànchỉnhđềtàinày Xin chân thành cảm ơn Học Viện Khoa học Công nghệ tạo điều kiệnthuậnlợiđểtôithựchiệnđềtàinày Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới tạo điềukiệnthuậnlợiđểtôithực hiệnđềtàinày Xin chân thành cảm ơn đề tài: “Nghiên cứu đánh giá thay đổi cấutrúc khung tế bào thể sống điều kiện mô trạng thái vi trọng lực(simulated microgravity)”, thuộc Chƣơng trình Khoa học cơng nghệ vũ trụ, mã số:CNVT/16-20đãhỗtrợcho nghiên cứu Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Lê Thành Long, ngƣời hƣớng dẫntậntìnhvà giúptơicócơhộiđƣợcthực hiệnđềtài Tôi xin cảm ơn Thầy, Cô, anh chị đồng nghiệp, bạn sinh viên vàđang nghiên cứu Viện Sinh học Nhiệt đớiđ ã l u ô n đ ộ n g v i ê n g i ú p đ ỡ t ô i t r o n g qtrìnhcơngtácvànghiêncứu Con xin cảm ơn ba, mẹ, em bên con, động viên lúckhókhăn Tp.HCM, ngày19tháng04năm2021 HồNguyễnQuỳnhChi MỤCLỤC Trang LỜICAMĐOAN i LỜICẢMƠN ii MỤCLỤC iii DANHMỤCTHUẬT NGỮVIẾT TẮT vi DANHMỤCBẢNG viii DANHMỤCHÌNH ix TÓMTẮT xii MỞĐẦU CHƢƠNG1.TỔNGQUAN .5 1.1 Vaitrịcủacácnghiêncứusinhhọctrongkhơnggian 1.2 Giớithiệuvềvitrọnglựcvàvitrọnglựcmô 1.2.1 Vitrọnglực 1.2.2 Vitrọnglựcmôphỏng .8 1.3 Cáchệthống môphỏngvitrọnglực .9 1.3.1 Clinostat .10 1.3.2 Buồngquay 13 1.3.3 Máyđịnhvịngẫunhiên 14 1.4 Tếbàogốctrung mô cuốngrốn 15 1.4.1 Kháiniệm 15 1.4.2 Lợiíchcủatếbàogốctrungmơcuốngrốn 16 1.5 Sựtăngsinhtếbào 17 1.5.1 Địnhnghĩa 17 1.5.2 Cácyếutốđiều hòachukỳtế bào 18 1.5.3 Các nghiên cứu vềảnhhưởngcủavitrọnglựclênsựtăng sinhtếbào 19 1.6 Quátrình apoptosis 20 1.6.1 Kháiniệm 20 1.6.2 Các yếutốảnhhưởngđếnapoptosis .22 1.6.3 Phương phápđánhgiáapoptosis 23 1.7 Nhânvàtế bàochất 26 1.7.1 Địnhnghĩavàvaitròcủanhânvàtếbàochất 26 1.7.2 Các yếutốảnhhưởngđếnhình tháinhânvàtếbàochất .26 1.8 Bộkhungxƣơngtếbào 27 1.8.1 Kháiniệm 27 1.8.2 Cấu trúckhungxươngtếbào 27 1.8.3 Các nghiên cứuvềảnhhưởngcủavitrọnglựclênkhungxươngtếbào 29 CHƢƠNG2.VẬTLIỆUVÀPHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 31 2.1 Vậtliệu 31 2.1.1 Thiếtbị vàdụngcụcầnthiết 31 2.1.2 Mơi trườngvàhóachấtsửdụng .32 2.1.3 Tếbàogốctrungmô 33 2.1.4 Hệthốngvitrọnglựcmôphỏng(clinostat 3D) 33 2.2 Nộidungvàphƣơngphápnghiêncứu 35 2.2.1 Nuôicấy tếbào 36 2.2.1.1 Phươngphápgiảiđông 36 2.2.1.2 Phươngphápcấy chuyền 36 2.2.1.3 Phươngphápđônglạnh 36 2.2.2 Đánhgiácácchỉthịmarkercủatếbàogốc trung mô 37 2.2.3 Thửnghiệmvitrọnglực 38 2.2.4 Đánhgiásựtăngsinhtếbào 39 2.2.4.1 Đánhgiámậtđộtếbào .39 2.2.4.2 Đánhgiáchukỳtếbào 39 2.2.5 Đánhgiá quátrìnhapoptosis 44 2.2.5.1 Thuhoạchtếbào .44 2.2.5.2 Đánhgiátỉlệapoptosis 44 2.2.5.3 Đánhgiá biểuhiệnmứcphiênmãcácgeneliênquanđếnapoptosis 45 2.2.6 Đánhgiásựthay đổihìnhtháinhânvàtếbàochất 46 2.2.6.1 Thuhoạchvàcốđịnhtếbào .46 2.2.6.2 Đánhgiásự thayđổihìnhtháinhân 46 2.2.6.3 Đánhgiásự thayđổihìnhtháitếbàochất 46 2.2.7 Đánhgiásựthayđổicấutrúckhungxươngtếbào 47 2.2.7.1 Thuhoạchtếbào .47 2.2.7.2 Đánhgiábiểu hiệnmứcphiênmãcácgenemãhóaviống,vi sợi 47 2.2.7.3 Đánhgiábiểu hiệnmứcdịchmãcácgenemãhóaviống,visợi 48 2.2.7.4 Đánhgiásự táicấutrúcbộ khungviống,visợitrongtếbào 49 2.2.8 Phương phápthốngkê 50 CHƢƠNG3.KẾTQUẢVÀTHẢOLUẬN .51 3.1 Đánh giácácchỉthịmarkercủatếbàogốctrung mô .51 3.2 Đánhgiásựtăng sinhtếbào 52 3.2.1 Sựthayđổi mậtđộtếbào 52 3.2.2 Sựthayđổichukỳtếbào 53 3.2.2.1 Tỉlệ cácphatrongchukỳtếbào 53 3.2.2.2 Biểuhiệnmứcđộphiênmãcácgeneđiềuhịachukìtếbào .54 3.2.2.3 Biểuhiện mứcđộdịchmãcácgeneđiềuhịachukìtếbào 55 3.3 Đánh giáquátrìnhapoptosis 58 3.3.1 Tỉapoptosis 58 3.3.2 Biểu hiệnmứcphiênmãcácgeneliên quanđếnapoptosis 58 3.4 Đánhgiásựthayđổihìnhtháitếbào 59 3.4.1 Sựthayđổi hình tháinhân .59 3.4.2 Sựthayđổi hình tháitếbào chất 63 3.5 Đánhgiácấutrúckhungxƣơngtếbào 66 3.5.1 Biểu hiệnmứcphiênmãcácgenemãhóaviống,visợi 66 3.5.2 Biểu hiệnmứcdịch mãcácgene mã hóa viống,visợi .67 3.5.3 Đánhgiásựtáicấutrúcbộkhungviống,visợitrongtếbào 67 3.6 Tóm tắt ảnh hƣởng vi trọng lực mô lên tế bào hucMSC phƣơngthứcứcchếtăngsinhtếbàotrongmôitrƣờngvitrọnglựcmôphỏng .73 KẾTLUẬNVÀKIẾN NGHỊ 77 DANHMỤCCƠNGTRÌNHCỦATÁCGIẢ 78 TÀILIỆU THAMKHẢO .79 PHỤLỤC DANHMỤCTHUẬT NGỮVIẾTTẮT Chữviếttắt TiếngAnh TiếngViệt 7-AAD 7-amino-actinomycin 7-amino- actinomycinATP Adenosine triphosphate Adenosine triphosphateBax Bcl-2-associatedX protein ProteinXliênkếtBcl-2 Bcl-2 Proteinlymphoma tếbàoB-2 B-celllymphoma2 bmMSC Tếbàogốctrungmôtủyxƣơng Bonemarrowmesenchymalste CDKs mcell Cyclin-dependentkinases DMEM Kinasephụthuộccyclin MôitrƣờngDulbecco'smodifiedEagle Dulbecco'smodifiedEaglem edium DNA Deoxyribonucleicacid deoxyribonucleicFBS Axit Fetalbovineserum Huyết thai bòGVHD hucMSC Graftversushostdisease Bệnhghépchốngchủ Human umbilical Tế bào gốc trung mô cuống cordmesenchymalstem rốnngƣời cell Hiệp hội liệu pháp tế bào ISCT quốctế Kínhhiển viquétlaserđồngtiêu InternationalSocietyforC ellularTherapy LSCM Laser scanning mRNA confocalmicroscopy Messengerribonucleicacid Axit ribonucleic thông tinMSC Mesenchymalstemcell Tếbàogốctrungmô NASA National Aeronautics Cơ quan Hàng không Vũ andSpaceAdministration trụHoaKỳ Opticaldensity Mậtđộquang OD PBS Phosphate-bufferedsaline Phosphate-buffered salinePen/Strep Penicillin-Streptomycin Penicillin- StreptomycinPI Propidiumiodide Propidiumiodide PS Màng phospholipidphosphati Phospholipidphos dylserine phatidylserine PVDF qRT-PCR Polyvinylidenefluoride Quantitativereverse Polyvinylidenefluoride Phản ứng định lƣợng transcriptionpolymerasechainrea chuỗipolymerasephiênmãng ction ƣợc RNA Ribonucleicacid Axitribonucleic RPM Randompositioning machine Máy định vị ngẫu nhiênRWV Rotatingwallvessel Buồngquay SDS-PAGE Sodiumdodecyl sulfate– Điện di gel sodium polyacrylamidegel dodecylsulfate–polyacrylamide electrophoresis SMG Simulated microgravity TEM Vitrọnglựcmơphỏng Kínhhiển vitruyềnqua Transmissionelectron microscopy TUNEL TerminaldUTPNickEndLabeling ucMSC Umbilicalcordmesenchymalste mcell Kĩ thuật gắn nhãn cuối dUTPNick Tếbàogốctrungmơcuốngrốn DANHMỤCBẢNG Trang Bảng2.1.Mộtsốthiết bịchínhsửdụngtrong đềtài .31 Bảng2.2 Mộtsốdụng cụchínhsửdụngtrong đềtài 31 Bảng2.3.Mơitrƣờng,hóachấtsửdụngtrong đềtài 32 Bảng2.4.ChutrìnhnhiệtcủaphảnứngRealtimeqRTPCRchocácgeneđiềuhịachukì tếbào 42 Bảng2.5.Trìnhtựmồi cácgeneđiềuhịachu kìtếbào 42 Bảng2.6.ChutrìnhnhiệtcủaphảnứngRealtimeqRTPCRchocácgeneliênquanđếnapoptosis 45 Bảng2.7.Trìnhtựmồi cácgeneliênquanđến apoptosis 45 Bảng2.8.Chutrìnhnhiệt củaphản ứngRealtime qRTPCRchocác genemãhóakhungxƣơngtếbào 47 Bảng2.9.Trìnhtựmồicácgenemãhóakhungxƣơngtếbào 47