Nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch

BỘGIÁOVÀĐÀOTẠO TRƯỜNGĐẠIHỌCNHATRANG VŨTHỊ HOAN NGHIÊNCỨUSẢNXUẤT OLIGOCHITOSAN VÀ ỨNG DỤNGTRONG BẢO QUẢN TÔM NGUYÊNLIỆUSAUTHUHOẠCH LUẬNÁNTIẾNSĨ KHÁNHHÒA-2018 BỘGIÁOVÀĐÀOTẠO TRƯỜNGĐẠIHỌCNHATRANG VŨTHỊ HOAN NGHIÊNCỨUSẢNXUẤT OLIGOCHITOSAN VÀ ỨNG DỤNGTRONG BẢO QUẢN TƠM NGUNLIỆUSAUTHUHOẠCH LUẬNÁNTIẾNSĨ Chunngành : Cơngnghệchếbiếnthủysản Mãsố : 9540105 Ngườihướngdẫnkhoahọc:GS.TS.TrầnThịLuyến PGS.TS.VũNgọcBội KHÁNHHỊA-2018 LỜICAMĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thực từ kinh phícủa Đề tài Cấp Nhà nước KC07.02/11-15:“Nghiên cứu công nghệ sản xuất vàứng dụng chế phẩm oligosaccharid (oligochitin oligochitosan) để bảo quảnsau thu hoạch nguyên liệu thuỷ sảnđánh bắt xa bờ”do PGS TS Vũ Ngọc BộichủtrìvàđãđượcChủnhiệmđềtàichophépsửdụngtrongLuậnán.Cácsốliệu,kết nêu trongLuậnánlàtrungthựcvàchưatừngđượcaicơngbốtrongbấtkỳmộtcơng trìnhnghiêncứunàotrướcđó Tácgiảluậnán LỜICẢM ƠN Đểhồnthành Luậnánnày, Trước hết, tơi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Lãnhđạo Khoa Sau đại học Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm lòng biếtơn vàniềmtựhào họctậptại Trường trongnhững nămqua Lòng biết ơn sâu sắc xin gửi tới GS TS Trần Thị Luyến – ngunPhóHiệutrưởngTrườngĐạihọcNhaTrangvàPGS.TS.VũNgọcBộiTrưởngkhoaCơngnghệThựcphẩm-TrườngĐạihọcNhaTrangđãhếtlịnghướngdẫn,giúp đỡ,tơitrongsuốtqtrìnhthựchiệnLuậnánnày Xin chân thành cám ơn PGS TS Vũ Ngọc Bội - Chủ nhiệmđề tài Cấp Nhànước KC07.02/11-15: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất ứng dụng chế phẩmoligosaccharid (oligochitin oligochitosan) để bảo quản sau thu hoạch ngunliệuthuỷsảnđ n h bắtxabờ”đãtạođiềukiệnvềkinhphíđểLuậnánhồnthànhcó chấtlượng Đặcbiệt,xinchânthànhcảmơnPGS.TS.ĐàmSaoMai -ViệntrưởngViệnCơng nghệ SinhhọcvàThựcphẩm-TrườngĐạihọcCơngnghiệpTP.HồChíMinh thầy Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm tận tìnhgiúp đỡtơitrongqtrìnhthực hiệnluậnán Xin chân thành cám ơn PGS TS Trang Sĩ Trung - Hiệu trưởng TrườngĐại học Nha Trang, PGS TS Nguyễn Anh Tuấn, TS Huỳnh Nguyễn Duy Bảo -Bộ môn Công nghệ Chế biến, TS Nguyễn Thị Mỹ Hương - Trưởng Bộ mơn CơngnghệSauthuhoạch-KhoaCơngnghệThựcphẩm- TrườngĐạihọcNhaTrang,PGS.TS.NgơĐăngNghĩa-GiámđốcViệnCơngnghệSinhhọcvàMơitrườngvàcácthầycơphảnbiệnđãchotơilờikhunqbáu đểLuậnánhồnthànhcóchấtlượng Xin chân thành cám ơn thầy giáo phịng thí nghiệm TrungtâmThựchànhThínghiệmvàcácthầycơgiáotrongkhoaCơngnghệThựcphẩm -Trường Đại học Nha Trang giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho trongsuốt qtrìnhthựchiệnLuận án Xinbàytỏlịngbiếtơnsâusắcđếngiađình,ngườithânvàbạnbèđãquantâm,độngviên,cùn gtơichiasẻ khókhăntrongsuốtthờigianthựchiệnLuậnánnày DANHMỤCCÁCCHỮVIẾTTẮT ANOVA: Phântíchphươngsai(Analysisof variance) AOAC:Hiệphộicácnhàhốphântíchchínhthống(Association ofOfficialAnalyticalChemists) BSA:Huyếtthanhbị(BovineSerumAlbumin) BHI: Mơi trường ni cấy vi sinh vật BHI (Brain Heart Infusion)COSY: Phổ tương quan proton-proton (Correlation Spectroscopy)COS:Chitooligosaccharides CTS:Chitosan DA:Độacetyl(DegreeofAcetylation)DD: Độdeacetyl(DegreeofDeacetylation)DPPH:2,2Diphenyl-1-picrylhydrazylEDTA: Ethylenediaminetetraacetic acidGlcN:Dglucosamine GlcNAc:N-acetylglucosamine GPC:Sắckýgelthấmqua(GelPermeationChromatography) HPLC: Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography)HQKK:Hiệu quảkhử khoáng HQKP:Hiệuquảkhửprotein HSQC:P h ổ t n g t c d ị h t n h â n q u a m ộ t l i ê n k ế t ( H e t e r o n u c l e a r S i n g l e Q u a n t u m Correlation) LMWC:Chitosankhốilượngphântửthấp(LowMolecular WeightChitosan)MHS:PhươngtrìnhMark-Houwink-Sakurada MIC:Nồngđộtốithiểuứcchếvikhuẩn(MinimumInhibitoryConcentration)MRS:Mơitr ường nicấyvisinh vật(deMan,Rogosa, Sharpe) Mw: Phân tử lượng trung bình khối lượngMv: Phân tử lượng trung bình thể tíchNAG:N-acetylglucosamine NMR:Cộnghưởng từhạtnhân(NuclearMagneticResonance)OD:Mậtđộquang (Optical Density) PhổIR:Quangphổ hồngngoại(Infraredspectroscopy) TCA:Trichloroacetic acidTCVN: Tiêu chuẩn Việt NamX-ray:TiaX MỤCLỤC DANHMỤCHÌNH .xii DANHMỤCBẢNG xvii TÓMTẮTNHỮNGĐÓNGGÓPMỚICỦALUẬNÁN xix MỞĐẦU CHƯƠNG 1.TỔNGQUANTÀILIỆU 1.1.CƠS Ở L Ý T H U Y Ế T V Ề S Ả N X U Ấ T C H I T O S A N V À O L I G O C H I T O S A N .3 1.1.1 Giớithiệuvềchitin,chitosanvàoligochitosan 1.1.1.1 Chitinvàchitosan .3 1.1.1.2 Oligochitosan 1.1.2 Phươngphápsảnxuấtchitinvàchitosan 1.1.3 Phươngphápsảnxuấtoligochitosan 19 1.2.MỘTS Ố N G H I Ê N C Ứ U Ứ N G D Ụ N G O L I G O C H I T O S A N 30 1.3 CƠSỞLÝTHUYẾTVỀBIẾNĐỔIVÀPHƯƠNGPHÁPBẢOQUẢNTÔMSAUTHUHOẠC H 32 1.3.1 Cơsởlýthuyếtvềbiếnđổicủatômsauthuhoạch 32 1.3.2 Phươngphápbảoquảntômsauthuhoạch .34 1.4.GIỚITHIỆUVỀKỸTHUẬT BỨCXẠ 37 CHƯƠNG 2.NGUYÊNVẬTLIỆUVÀ PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU .39 2.1.NGUYÊNVẬTLIỆU 39 2.1.1 Đầuvỏtômdùngsảnxuấtoligochitosan 39 2.1.2 Tômbạcbiển .39 2.1.3 Enzymeprotease .39 2.1.4 Nguyênvậtliệuđểxácđịnhđộcchấthọc 39 2.1.5 Giốngvikhuẩn 40 2.2.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 40 2.2.1 Phươngphápbốtrí thínghiệm 40 2.2.2 Cácphươngphápphântíchhóahọc .46 2.2.3 Phươngphápxácđịnhhoạtđộenzymeprotease 48 2.2.4 Phươngphápnghiêncứuvikhuẩn .48 2.2.4.1 Phươngphápthu sinhkhốivikhuẩnlactic .48 2.2.4.2 Phươngphápphântíchvisinhvật 49 2.2.4.3 Phươngp hápxácđịnhhoạttínhkhángkhuẩncủachếphẩmoligochitosan .49 2.2.5 Phươngphápxácđịnhđộcchấthọc 50 2.3 HÓA CHẤT VÀTHIẾTBỊCHỦYẾUSỬDỤNGTRONGLUẬNÁN 51 2.4 PHƯƠNGPHÁPXỬLÝSỐLIỆU 52 CHƯƠNGIII.KẾT QUẢNGHIÊNCỨU VÀTHẢOLUẬN 53 3.1.XÁCĐỊNHTHÀNHPHẦNHĨAHỌCCƠBẢNCỦAPHẾLIỆUĐẦUVỎ TƠM 53 3.2 NGHIÊNCỨUSỬDỤN G PHƯƠNGPHÁP SINHHỌC ĐỂKHỬ PROTEIN VÀT Ạ P CHẤTỞĐẦUVỎTÔM THẺCHÂNTRẮNGTRONGSẢNXUẤT CHITIN .53 3.2.1.NGHIÊNCỨUSẢNXUẤTCHITINTỪĐẦUVỎTÔMBẰNGPHƯƠNGPHÁPSỬD ỤNGE N Z Y M E P R O T E A S E 53 3.2.1.1 Nghiêncứulựachọnenzymeprotease .53 3.2.1.2 NghiêncứukhửproteincịnlạiởđầuvỏtơmbằngNaOHlỗngvàkhửkhốngbằngHCllo ãng 60 3.2.1.3 Đề xuất quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tơm phương pháp sử dụng enzymeflavourzymekhửprotein 63 3.2.2.NGHIÊNCỨUSẢNXUẤTCHITINTỪĐẦUVỎTÔMBẰNGPHƯƠNGPHÁPSỬD ỤNGVIKHUẨNLACTICĐỂ KHỬPROTEINVÀCÁCTẠPCHẤT 65 3.2.2.1 Lựachọnchủngvikhuẩnlacticthíchhợp 65 3.2.2.2 Nghiêncứusảnxuấtchitintừđầuvỏtômbằngphươngphápsửdụngvikhuẩnlactic L.plantarumVTCC-B431đểkhửproteinvàcáctạpchất 70 3.2.2.3.Nghiêncứukhửproteincịnlạiởbánchếphẩmchitinbằngenzymeflavourzyme 80 3.2.2.4 NghiêncứukhửkhốngcịnlạiởchitinthơbằngHCl 82 3.2.2.5 ĐềxuấtquytrìnhsảnxuấtchitintừđầuvỏtơmbằngphươngphápsửdụngvikhuẩnlacticL.plantar umVTCC-B431đểkhửproteinvàcáctạpchất 84 3.2.2.6 Đánhgiáchấtlượngchitinsảnxuấttheoquytrìnhsửvikhuẩnlacticđểkhửpr oteinvàcáctạpchất 86 3.3 NGHIÊNC Ứ U D E A C E T Y L C H I T I N Đ Ể S Ả N X U Ấ T C H I T O S A N C Ó Đ Ộ DEACETYLCAO 88 3.3.1 X ÁCĐỊNHNỒNGĐỘNAOHTHÍCHHỢPCHOQTRÌNHDEACET YLCHITIN.883.3.2.X ÁCĐỊNHTHỜI GIANDEACETYL .89 3.3.3.ĐỀ XUẤTQUYTRÌNHSẢNXUẤTCHITOSANCĨĐỘDEACETYLCAO .93 3.4 NGHIÊNC Ứ U SẢ N X U Ấ T CHẾP H Ẩ M O L I G O C H I T O S A N B Ằ N G K ỸTHU ẬTBỨCXẠCOBAN60 .97 3.4.1.XÁCĐỊNHĐỘHỊATANCỦACHITOSANTRONG DUNGDỊCHACID 97 3.4.2 XÁCĐỊNHLIỀUXẠTHÍCHHỢPCHOVIỆCCẮTMẠCHCHITOSANTẠOOLIGOCHIT OSAN 99 3.4.3 TÁCHP H  N Đ O Ạ N O L I G O C H I T O S A N S A U K H I C H I Ế U X Ạ .102 3.4.4 ĐỀX U Ấ T Q U Y T R Ì N H S Ả N X U Ấ T O L I G O C H I T O S A N B Ằ N G P H Ư Ơ N G P H Á P CHIẾUXẠSỬDỤNGBỨCXẠGAMMACO-60 103 3.4.5 NGHIÊNCỨUXÁCĐỊNHCẤUTRÚCVÀTRỌNGLƯỢNGPHÂNTỬCỦAOLIGOCHIT OSANSẢNXUẤTBẰNGCÁCHSỬDỤNGBỨCXẠĐỂPHÂNCẮTCHITOSAN .105 3.4.5.1 Đánhgiáthànhphầncácphânđoạncủachếphẩmchiếuxạchitosan 105 3.4.5.2 Sửdụngph ổFTIRđểđánhgiácấutrúccủasảnphẩmsauchiếuxạchitosan .106 3.4.5.3 Xácđịnhkhốilượngphântửvàcấutrúccủaoligochitosan .109 3.46 NGHIÊNC Ứ U ĐÁNHGIÁKHẢN Ă N G KH Á N G KHU ẨN C Ủ A O LI GOC HI T OS AN 114 3.4.6.1XácđịnhhoạttínhkhángkhuẩncủachếphẩmoligochitosanbằngphươngphápMIC1 3.4.6.2.Xácđịnhhoạttínhkhángkhuẩncủachếphẩmoligochitosanbằngphươngphápnicấytrênđĩathạch 115 3.4.7 ĐỀXUẤTQUYTRÌNHHỒNTHIỆNSẢNXUẤTOLIGOCHITOSANBẰNGPHƯƠN GPHÁPSỬDỤNGBỨCXẠGAMMACOBAN60 116 3.4.8 THỬNGHIỆMĐỘCTÍNHCỦAOLIGOCHITOSANTRÊNCHUỘTLAN GTHÍNGHIỆM 117 3.5.SỬD Ụ N G O L I G O C H I T O S A N T R O N G B Ả O Q U Ả N T Ô M B Ạ C N G U Y Ê N L I Ệ U 125 3.5.1 XÁCĐ Ị N H N Ồ N G Đ Ộ O L I G O C H I T O S A N T H Í C H H Ợ P C H O Q U Á T R Ì N H B Ả O QUẢNTÔM .125 3.5.2 XÁCĐỊNHCHẾĐỘBẢOQUẢNTƠMNGUNLIỆUBẰNGOLIGOCHITOSAN 3.5.2.1 Xácđịnhthờigiannhúngtơmngunliệubằngdungdịcholigochitosan1 3.5.2.2 Xácđịnhchếđộbaogóithíchhợpđểbảoquảntơmbạcbằngoligochitosan1 3.5.3.ĐỀX U Ấ T Q U Y T R Ì N H B Ả O Q U Ả N T Ô M B Ằ N G O L I G O C H I T O S A N 140 KẾTLUẬNVÀĐỀXUẤTÝKIẾN .142 TÀILIỆU THAM KHẢO 145