Nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin b1, b6 trong một số loại nấm lớn lấy từ vườn quốc gia pù mát nghệ an bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CAO THÚY TRINH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG VITAMIN B1, B6 TRONG MỘT SỐ LOẠI NẤM LỚN LẤY TỪ VƢỜN QUỐC GIA PÙ MÁT - NGHỆ AN BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGHỆ AN - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CAO THÚY TRINH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG VITAMIN B1, B6 TRONG MỘT SỐ LOẠI NẤM LỚN LẤY TỪ VƢỜN QUỐC GIA PÙ MÁT - NGHỆ AN BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60.44.0118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS ĐINH THỊ TRƢỜNG GIANG NGHỆ AN - 2014 LỜI CẢM ƠN Luận văn thực Viện Kiểm nghiệm ATVSTP Quốc Gia; Phịng thí nghiệm chun đề Hóa phân tích - Khoa Hóa trường Đại học Vinh Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến: - Cô giáo TS Đinh Thị Trường Giang người trực tiếp hướng dẫn tạo điều kiện cho tơi nghiên cứu hồn thành luận văn - Thầy giáo PGS TS Trần Đình Thắng giúp đỡ định danh mẫu vật - Nhân dịp này, xin cảm ơn đến Phòng đào tạo Sau Đại học, Ban chủ nhiệm khoa Hóa thầy giáo cán Phịng thí nghiệm khoa Hóa học giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình học tập làm luận văn Và xin cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đồng nghiệp động viên giúp đỡ tơi hồn thành luận Nghệ An, tháng 10 năm 2014 Ngƣời thực Cao Thúy Trinh MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ NẤM LỚN 1.1.1 Giới thiệu nấm 1.1.2 Phân loại tác dụng trị liệu nấm Linh Chi 1.1.3 Nấm lớn 1.1.4 Nấm Linh chi 1.1.5 Các mẫu nấm đƣợc nghiên cứu đề tài 10 1.2 GIỚI THIỆU VỀ VITAMIN B1, B6 11 1.2.1 Vitamin B1 11 1.2.2 Vitamin B6 13 1.2.3 Vai trò nhu cầu vitamin B1, B6 thể 14 1.3 PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN B1, B6 16 1.3.1 Cơ sở lý thuyết phƣơng pháp 16 1.3.2 Phân loại sắc ký ứng dụng 17 1.3.3 Các đại lƣợng đặc trƣng sắc ký đồ 19 1.3.4 Hệ thống HPLC 22 1.3.5 Chọn điều kiện sắc ký 25 1.3.6 Tiến hành đo sắc ký 28 1.3.7 Định lƣợng phƣơng pháp HPLC 29 CHƢƠNG KĨ THUẬT THỰC NGHIỆM 37 2.1 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ 37 2.2 CHUẨN BỊ HÓA CHẤT 37 2.2.1 Yêu cầu chung 37 2.2.2 Chuẩn bị hóa chất cho phép xác định vitamin B1 37 2.2.3 Chuẩn bị hóa chất cho phép xác định vitamin B6 38 2.3 LẤY MẪU, BẢO QUẢN VÀ CHUẨN BỊ MẪU PHÂN TÍCH 39 2.3.1 Lấy mẫu baỏ quản mẫu 39 2.3.2 Chuẩn bị mẫu phân tích 39 2.4 CÁCH TIẾN HÀNH THỰC NGHIỆM 40 2.4.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn cho phép đo HPLC với vitami B1 40 2.4.2 Xử lý mẫu nấm linh chi cho phép đo HPLC với vitamin B1 40 2.4.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn cho phép đo HPLC với vitamin B6 40 4.4 Xử lý mẫu nấm linh chi cho phép đo HPLC với vitamin B6 41 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 KHẢO SÁT CÁC THÔNG SỐ TỐI ƢU CHO PHÉP ĐO HPLC XÁC ĐỊNH VITAMIN B1, B6 42 3.1.1 Khảo sát bƣớc sóng 42 3.1.2 hảo sát pha động 43 3.1.3 hảo sát tốc độ dòng 45 3.2 KHẢO SÁT XÁC ĐỊNH KHOẢNG NỒNG ĐỘ TUYẾN TÍNH CỦA VITAMIN B1, VITAMIN B6 47 3.2.1 hảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến t nh vitamin B1 47 3.2.2 hảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến t nh vitamin B6 48 3.3 XÂY DỰNG ĐƢỜNG CHUẨN, XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN PHÁT HIỆN (LOD) VÀ GIỚI HẠN ĐỊNH LƢỢNG (LOQ) CỦA VITAMIN B1, VITAMIN B6 49 3.3.1 Xây dựng đƣờng chuẩn, xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) Vitamin B1 49 3.3.2 Xây dựng đƣờng chuẩn, xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) Vitamin B6 51 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 3.4 ĐÁNH GIÁ SAI SỐ VÀ ĐỘ LẶP LẠI CỦA PHÉP ĐO DÃY CHUẨN VITAMIN B1, VITAMIN B6 54 3.5 ĐỘ LẶP LẠI TRÊN MẪU NẤM LINH CHI 57 3.6 HIỆU SUẤT THU HỒI VITAMIN TRONG CÁC MẪU NẤM 57 3.6.1 Hiệu suất thu hồi Vitamin B1 mẫu nấm 58 3.6.2 Hiệu suất thu hồi vitamin B6 mẫu nấm 59 3.7 TỔNG HỢP CÁC ĐIỀU KIỆN ÁP DỤNG PHÂN TÍCH 59 3.8 ÁP DỤNG PHƢƠNG PHÁP ĐỂ XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG VIATAMIN B1, VITAMIN B6 TRONG MỘT SỐ MẪU NẤM 61 3.8.1 Xác định hàm lƣợng Viatamin B1 61 3.8.2 Xác định hàm lƣợng Viatamin B6 63 KẾT LUẬN 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC 68 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lƣợng ppm Part per million Một phần triệu ppb Part per billion Một phần tỉ Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH Trang Bảng: Bảng 3.1 ết khảo sát bƣớc sóng Vitamin B1 42 Bảng 3.2 ết khảo sát bƣớc sóng Vitamin B6 43 Bảng 3.3 ết khảo sát pha động Vitamin B1 44 Bảng 3.4 ết khảo sát pha động Vitamin B6 45 Bảng 3.5 ết khảo sát tốc độ d ng Vitamin B1 46 Bảng 3.6 ết khảo tốc độ d ng Vitamin B6 46 Bảng 3.7 hảo sát khoảng nồng độ tuyến t nh vitamin B1 47 Bảng 3.8 hảo sát khoảng nồng độ tuyến t nh vitamin B6 48 Bảng 3.9 Số liệu x y dựng đƣờng chuẩn vitamin B1 49 Bảng 3.10 Số liệu x y dựng đƣờng chuẩn vitamin B6 52 Bảng 3.11 ết đánh giá sai số độ lặp lại phép đo vitamin B1 55 Bảng 3.12 ết đánh giá sai số độ lặp lại phép đo vitamin B6 56 Bảng 3.13 Kết phân tích mẫu thử song song 57 Bảng 3.14 Kết tính hiệu suất thu hồi phép xác định vitamin B1 58 Bảng 3.15 Kết tính hiệu suất thu hồi phép xác định vitamin B6 59 Bảng 3.16 Tổng hợp điều kiện đo vitamin B1 phƣơng pháp HPLC 60 Bảng 3.17 Tổng hợp điều kiện đo vitamin B6 phƣơng pháp HPLC 60 Bảng 3.18 Kết xác định hàm lƣợng Vitamin B1 nấm linh chi 62 Bảng 3.19 Kết xác định hàm lƣợng Vitamin B6 nấm linh chi 64 Hình: H nh 3.1 Đồ thị khảo sát khoảng nồng độ tuyến t nh vitamin B1 47 H nh 3.2 Đồ thị khảo sát khoảng nồng độ tuyến t nh vitamin B6 48 H nh 3.3 Đồ thị đƣờng chuẩn vitamin B1 50 H nh 3.4 Đồ thị đƣờng chuẩn vitamin B6 52 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an MỞ ĐẦU Vitamin nhóm hợp chất hữu có ph n tử bé, có cấu tạo hóa học khác t nh chất hóa học nhƣ l học khác nhau, nhƣng chúng giống chỗ cần thiết cho hoạt động sống thể Hiện ngƣời ta nghiên cứu ph n lập đƣợc 30 loại vitamin khác nhau, đồng thời nghiên cứu thành phần, cấu tạo tác dụng sinh lý chúng Vitamin đƣợc cung cấp vào thể ngƣời để đáp ứng nhu cầu dinh dƣỡng giúp thể khỏe mạnh Trong nhiều kỉ, thiếu số vitamin g y nên bệnh mù l a (thiếu vitamin A), bệnh beri-beri (thiếu vitamin B1), bệnh scobut (thiếu vitamin C), thiếu axit folic thời k thai nghén g y khuyết tật ống thần kinh thai nhi Ngƣời thiếu vitamin hàm lƣợng vitamin thể mức thấp (bệnh giảm vitamin) Trạng thái giảm vitamin phổ biến ngƣời nh n hồn tồn khoẻ mạnh Có thể g y rối loạn hệ thần kinh Họ dễ bị k ch th ch, dễ bị b nh tĩnh nguyên nh n nhỏ nhặt, họ dễ mẫn cảm với m radio, tiếng ồn trẻ con, bị bệnh ngủ, giảm khả lao động Việc cung cấp khơng đầy đủ vitamin cho thể có ảnh hƣởng xấu với hệ thần kinh mà c n với loạt quan khác thể V điều quan trọng phần ăn ngƣời khoẻ mạnh, đặc biệt ngƣời ốm cần phải có giá trị hồn chỉnh khơng phƣơng diện calo, phƣơng diện chất đạm mà c n phƣơng diện vitamin Nhiều ngƣời c n cho vitamin thần dƣợc chữa ung thƣ kéo dài tuổi thọ hoa học tiến hành nghiên cứu thực nghiệm quy mơ rộng lớn vitamin, vitamin B1 B6 đối tƣợng đƣợc nghiên cứu Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Vitamin B1 c n gọi thiamine (dƣỡng chất lƣợng) có vai tr vô quan trọng việc tr hoạt động tƣơng tác tế bào thể, việc sản xuất lƣợng Trong tế bào thể dùng ôxy để chuyển hóa carbohydrate loại đƣờng thành lƣợng Bởi vậy, khơng có vitamin B1 thiếu hụt nguồn dƣỡng chất th hiệu sản xuất lƣợng bị suy giảm bị vơ hiệu hóa Ngồi ra, vitamin B1 c n có tác dụng hỗ trợ bảo vệ hệ thống thần kinh trƣớc nguy bị tổn thƣơng thối hóa Vitamin B6 loại vitamin h a tan nƣớc phần nhóm vitamin B Vitamin B6 hoạt động nhƣ coenzym giúp chuyển hóa tryptophan thành niacin Nó c n đóng vai tr quan trọng việc chuyển hóa chất đạm, chất béo,carbohydrate Sự thiếu hụt vitamin B6 g y nhiều triệu chứng: mệt mỏi, ngủ, khó chịu, rối loạn t m thần, mơi nứt nẻ, da khơ, rụng tóc Ở trẻ em thiếu vitamin B6 thƣờng chậm lớn có co giật Với vai tr tầm quan trọng đó, vitamin B1 B6 đƣợc nghiên cứu phát có nhiều loại thực phẩm nói chung loại nấm Linh chi Xuất phát từ chức vitamin nói chung vitamin B1, B6 nói riêng thể, đồng thời góp phần vào công tác đảm bảo chất lƣợng nấm dùng để làm dƣợc liệu, chọn đề tài: “Nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin B1, B6 số loại nấm Lớn lấy từ vườn quốc gia Pù Mát - Nghệ An phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao" làm luận văn tốt nghiệp m nh Nhiệm vụ nghiên cứu luận văn: - Xác định điều kiện tối ƣu để đo sắc đồ HPLC B1, B6 - Xác định hàm lƣợng vitamin B1, B6 theo phƣơng pháp ngoại chuẩn Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 61 3.8 ÁP DỤNG PHƢƠNG PHÁP ĐỂ XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG VIATAMIN B1, VITAMIN B6 TRONG MỘT SỐ MẪU NẤM 3.8.1 Xác định hàm lƣợng Viatamin B1 Chúng tiến hành ph n t ch 10 mẫu nấm theo phƣơng pháp đƣờng chuẩn máy sắc ký lỏng cao áp với thông số khảo sát Các mẫu nấm đƣợc chuẩn bị theo mục 2.3.2 C n tƣơng đƣơng 2-5 g mẫu nấm linh chi đƣợc ký hiệu mẫu từ MN201 đến MN211 Xỷ lý mẫu theo mục 2.4.2.Với giá trị diện t ch peak đo đƣợc mẫu, dựa vào phƣơng tr nh đƣờng chuẩn nhƣ tr nh bày bảng 3.9 hình 3.3 ta t nh đƣợc hàm lƣợng vitamin B1 mẫu nấm linh chi Cx (mg/l) Từ xác định đƣợc hàm lƣợng chất ph n t ch X (mg/kg) theo công thức: X  C X V m Trong đó: X: hàm lƣợng vitamin B1 mẫu nấm linh chi (mg/kg) Cx: nồng độ vitamin B1 mẫu đo theo đƣờng chuẩn (mg/l) V: thể t ch định mức cuối (10ml) m: lƣợng mẫu ph n t ch Với 10 dung dịch ph n t ch chuẩn bị trên, mẫu nấm đƣợc đo lần, lấy trung b nh lần đo ết thu đƣợc tr nh bày bảng 3.18 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 62 Bảng 3.18 Kết xác định hàm lượng itamin B1 nấm Ký hiệu Lƣợng Diện tích mẫu mẫu (g) pic mẫu Cx (mg/l) Hàm lƣợng vitamin B1 mẫu X (mg/kg) 201a 4,0436 1960600 1,3395 3,3126 201b 3,6214 1950450 1,3320 3,6781 202a 3,7788 1294500 0,8479 2,2438 202b 3,9674 1513110 1,0092 2,5438 203a 2,9386 1450160 0,9628 3,2763 203b 2,7747 1412820 0,9352 3,3705 204a 3,3490 1443587 0,9579 2,8603 204b 3,3159 1475688 0,9816 2,9603 205a 3,3311 584970 0,3242 0,9734 205b 3,4941 555290 0,3023 0,8653 206a 4,1354 1067780 0,6806 1,6457 206b 3,8853 1075020 0,6859 1,7654 207a 2,5979 587360 0,3260 1,2549 207b 2,1595 620080 0,3502 1,6215 209a 3,9433 1657370 1,1157 2,8293 209b 3,8608 1642900 1,1050 2,8621 210a 5,9319 775370 0,4648 0,7835 210b 5,6955 797960 0,4814 0,8453 211a 4,2730 820364 0,4980 1,1654 Hàm lƣợng trung bình Vitamin B1 mẫu X (mg/kg) 3,4954 2,3938 3,3234 2,9103 0,9194 1,7056 1,4382 2,8457 0,8144 1,2553 211b 4,6790 998478 0,6294 1,3452 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 63 3.8.2 Xác định hàm lƣợng Viatamin B6 Chúng tiến hành ph n t ch 10 mẫu chi theo phƣơng pháp đƣờng chuẩn máy sắc ký lỏng cao áp với thông số khảo sát Các mẫu nấm đƣợc chuẩn bị theo mục 2.3.2 C n tƣơng đƣơng 2-6 g mẫu nấm linh chi đƣợc ký hiệu mẫu từ MN201 đến MN211 Xỷ lý mẫu theo mục 2.4.3 Với giá trị diện t ch peak đo đƣợc mẫu, dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn nhƣ tr nh bày bảng 3.10 h nh 3.4 ta t nh đƣợc hàm lƣợng vitamin B6 mẫu nấm linh chi Cx (mg/l) Từ xác định đƣợc hàm lƣợng chất ph n t ch X (mg/kg) theo công thức: X  C X V m Trong đó: X: hàm lƣợng vitamin B6 mẫu nấm linh chi (mg/kg) Cx: nồng độ vitamin B6 mẫu đo theo đƣờng chuẩn (mg/l) V: thể t ch định mức cuối (50ml) m: lƣợng mẫu ph n t ch Với 10 dung dịch ph n t ch chuẩn bị trên, mẫu nấm đƣợc đo lần, lấy trung b nh lần đo ết thu đƣợc tr nh bày bảng 3.19 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 64 Bảng 3.19 Kết xác định hàm lượng itamin B6 nấm Ký hiệu mẫu Lƣợng mẫu (g) Diện tích pic mẫu Cx (mg/l) Hàm lƣợng vitamin B6 mẫu X (mg/kg) 201a 4,1236 0,0000 0,0000 KPH 201b 3,8125 0,0000 0,0000 KPH 202a 3,7612 0,0000 0,0000 KPH 202b 3,1532 0,0000 0,0000 KPH 203a 2,9873 0,0000 0,0000 KPH 203b 2,8162 0,0000 0,0000 KPH 204a 3,3415 0,0000 0,0000 KPH 204b 3,3142 0,0000 0,0000 KPH 205a 3,2015 0,0000 0,0000 KPH 205b 3,4367 0,0000 0,0000 KPH 206a 4,1374 0,0000 0,0000 KPH 206b 3,9973 0,0000 0,0000 KPH 207a 2,7634 0,0000 0,0000 KPH 207b 2,8521 0,0000 0,0000 KPH 209a 3,8514 0,0000 0,0000 KPH 209b 3,8832 0,0000 0,0000 KPH 210a 4,0915 0,0000 0,0000 KPH 210b 3,9135 0,0000 0,0000 KPH 211a 4,2130 0,0000 0,0000 KPH 211b 4,5310 0,0000 0,0000 KPH Nhận xét: ết thu bảng 3.17 3.18 cho thấy, 10 mẫu nấm đƣợc nghiên cứu th 10 mầu có chứa Vitamin B1 khơng có mẫu phát đƣợc Vitamin B6 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 65 KẾT LUẬN Trong luận văn chúng tơi hồn thành nhiệm vụ sau đ y: Đã tiến hành kháo sát điều kiện sắc ký vtamin B1, B6 nhƣ: tốc độ d ng, pha động, bƣớc sóng Đã tiến hành x y dựng đƣờng chuẩn vitamin B1 vitamin B6 cho phép đo xác định hàm lƣợng vitamin B1, B6 mẫu nấm linh chi Đã tiến hành định lƣợng đối tƣợng mẫu nấm linh chi phƣơng pháp HPLC sử dụng phƣơng pháp định lƣợng dựa vào đƣờng chuẩn Kết phân tích cho thấy tất 10 mẫu nấm có vitamin B1 hàm lƣợng từ khoảng 0,8 mg/kg đến 3,5 mg/kg 10 mẫu nấm có hàm lƣợng vitamin B6 nằm dƣới ngƣỡng phát Đã tiến hành đánh giá độ xác phƣơng pháp qua xác định độ lặp lại độ t nh toán giới hạn pháp LOD giới hạn định lƣợng LOQ Độ lặp lại đƣợc tính thơng qua độ biến thiên RSD%, kết cho thấy phép đo có độ biến thiên thấp (RSD% 80% ) Độ nhạy phƣơng pháp đƣợc phản ánh qua giá trị giới hạn phát (LOD) giới han định lƣợng (LOQ) đƣợc t nh toán theo quy tắc  Đối với vitamin B1: Giá trị LOD là: 0,069ppm; giá trị LOQ là: 0,232ppm Đối với vitamin B6: Giá trị LOD là: 0,13ppm; giá trị LOQ là: 0,42ppm Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Trần Thị Hoàng Ba, Vũ Thị Bảy, Nguyễn im Chi, Doãn Huy hắc, Nguyễn Quang Lu n, Định lượng vitamin Nxb Y, học Hà Nội Nguyễn Thạch Cát, Tử Vọng Nghị, Đào hữu Vinh (1980), Cơ sở lý thuyết hóa học phân tích, Nxb Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Hội Phạm Thị Tr n Ch u, Trần Thị Láng (1999), Hoá sinh học NXB Giáo dục, Hà Nội Lê Dỗn Diễn, Lê Duy Thuy, Mỹ Xuyến, Hồng Văn Tuyên (1978), Vitamin đời sống, Nxb hoa học ỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Xu n Dũng, Từ Vọng Nghị, Phạm Luận (1986), Các phương pháp tách Sắc ký lỏng cao áp, Đại học tổng hợp Amsterdam, Hà Nội Phạm Luận (1999), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu suất cao, Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn hắc Nghĩa (1997), Áp dụng toán học thống kê để xử lý số liệu thực nghiệm, Đại học Vinh TCVN 5162 - 2008: Thực phẩm - Xác định Vitamin B1 sắc ký lỏng hiệu cao (HLC) TCVN 5164: 1990: Lƣơng thực - Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng vitamin B1 10 TCVN 9513: 2012 (EN 11663: 2005): Thực phẩm - Xác định Vitamin B6 (bao gồm ccs dạng glycosyl) phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 11 Lê Xuân Thám (1996), Nấm Linh chi - dược liệu quý Việt Nam, Nxb Mũi Cà Mau 12 Trần Xu n Thuyết, “Thực hƣ nấm Linh chi”, Tạp chí Sức khỏe Đời sống (số 224, 225) 13 Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xu n Dũng cộng (1985), Các phương pháp sắc ký, Nxb hoa học ỹ thuật, Hà Nội Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 67 Tài liệu tiếng Anh: 14 AOAC 941.15: Vitamin B1 (Thiamine) 15 Regina Prado Zanes Furlani, Helena Texeira Godoy(2008) , Analytical, Nutritional and Clinical Methods Vitamins B1 and B2 contents in cultivated mushrooms, Food Chemistry,106, 816-819 16 Shino Thomas, Rakesh Kumar, Ashutosh Sharma, Roshan Issarani & Badri Prakash Nagori (2008), Satability-indicating HPLC method for vitamin B1, B2, B3 and B6 in pharmaceutical liquid dosage from, Indian Journal of Chemical Technology, pp.598-63, Vol.15 17 Vitamin analysis for the health and food sciences (1998), Ronald R Êitnmiller Lin Ye W.O.Landen, Jr Trang Web: 19 http://www.vi.wikipedia.org/ wiki/ Nấm-linh-chi 20 http://www.linhchi.com.vn/bai-viet/ cac-loai-nam-linh-chi.html 21 http://www.linhchiakiko.net/dac-diem-sinh-truong-2 22 http://www.bidiphar.com/index.php?mod=newsdetail&sc=1&ns=205 23 http:/www.vietbao.vn/Suc-khoe/Nhung-dieu-can-biet-ve-vitaminB6/ /248/ 24 http://www.suckhoe.24h.com.vn› ›Vitamin khoáng chất›Tổng quan 25 http://www.namlinhchiviet.com.vn/ /thanh-phan-hoa-hoc-co-tac-dungchua-tri-benh… Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 68 PHỤ LỤC SẮC ĐỒ CHUẨN VITAMIN B1, B6 VÀ MỘT SỐ MẪU Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 69 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 70 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 71 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 72 HÌNH ẢNH MỘT SỐ TRANG THIẾT BỊ ĐƢỢC SỬ DỤNG TRONG Q TRÌNH PHÂN TÍCH Hệ thống HPLC Nồi cách thủy 06 chỗ Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 73 Máy li tâm Máy nghiền mẫu Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 74 Máy lắc Vontex Máy đo pH Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn