Khảo sát một số thông số của quá trình tạo vi nang probiotic hướng giải phóng tại đại tràng khoá luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU TRANG KHẢO SÁT MỘT SỐ THÔNG SỐ CỦA Q TRÌNH TẠO VI NANG PROBIOTIC HƯỚNG GIẢI PHĨNG TẠI ĐẠI TRÀNG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU TRANG 1801712 KHẢO SÁT MỘT SỐ THƠNG SỐ CỦA Q TRÌNH TẠO VI NANG PROBIOTIC HƯỚNG GIẢI PHĨNG TẠI ĐẠI TRÀNG KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Đàm Thanh Xuân Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghệ sinh học Dược Khoa Công nghệ sinh học HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Trước trình bày đề tài khố luận mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cơ, bạn bè, gia đình ln quan tâm, hỗ trợ động viên giúp đỡ em hồn thành khố luận cách tốt Với tất lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến người đáng kính PGS TS Đàm Thanh Xn, ln tận tình giúp đỡ, hướng dẫn em từ ngày thực khóa luận Cảm ơn ln bên động viên, cho em lời khuyên quý báu, kịp thời giúp em vượt qua lúc khó khăn Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Khắc Tiệp, Ths Lê Ngọc Khánh Cảm ơn hai thầy giúp đỡ, hỗ trợ cho em lời khuyên bổ ích suốt q trình làm khố luận Em xin gửi lời cảm ơn đến tất thầy cô, anh chị kỹ thuật viên khoa Công nghệ sinh học Em cảm ơn chị Phạm Thị Thanh Huyền, chị Nguyễn Thị Kim Chi - kỹ thuật viên, chị Trần Thị Minh Thu, chị Đỗ Thị Huyền Thương - học viên cao học khoá 27, bạn Khổng Thị Ngọc Anh, Nguyễn Thị Lan Anh, Thân Đắc Hùng, Vũ Thành Lập, Bùi Thị Mai Nhung, Bounthavy PHENGSAVATDY, Bùi Thị Phương Thanh, Mai Phương Thu - sinh viên nghiên cứu khoá 73, em khoá 74 môn Công nghệ sinh học Dược đồng hành sẻ chia, giúp đỡ em thời gian làm khoá luận Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám Hiệu tồn thể Thầy Cơ trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho em tham gia nghiên cứu khoa học, trang bị cho em kiến thức quý báu suốt năm học Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ vào tạo động lực cho em suốt trình học tập Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Hệ giải phóng đại tràng 1.1.1 Đặc điểm giải phẫu đại tràng 1.1.2 Yếu tố ảnh hưởng hệ giải phóng đại tràng 1.1.2.1 pH đường tiêu hoá 1.1.2.2 Thời gian vận chuyển thuốc đường tiêu hoá .2 1.1.2.3 Hệ vi sinh vật đại tràng 1.1.3 Các hệ giải phóng đại tràng 1.2 Tổng quan probiotic 1.2.1 Khái niệm probiotic 1.2.2 Một số vi khuẩn có lợi đại-trực tràng 1.2.3 Vai trò probiotic điều trị bệnh đại tràng 1.2.4 Một số chế phẩm probiotic thị trường 1.3 Tổng quan vi nang phương pháp tạo vi nang 1.3.1 Tổng quan vi nang 1.3.2 Một số nguyên liệu thường sử dụng để tạo vi nang probiotic 1.3.2.1 Alginat 1.3.2.2 Tinh bột .7 1.3.2.3 Chitosan 1.3.3 Các phương pháp tạo vi nang 1.3.3.1 Phương pháp nhỏ giọt tách pha đông tụ 1.3.3.2 Phương pháp nhũ tương hoá .9 1.3.3.3 Kỹ thuật phủ Chitosan 1.3.4 Một số nghiên cứu chế phẩm hướng giải phóng đại tràng giới Việt Nam 10 1.3.4.1 Một số nghiên cứu giới 10 1.3.4.2 Một số nghiên cứu Việt Nam 10 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .11 2.1 Nguyên liệu thiết bị 11 2.1.1 Chủng vi sinh vật 11 2.1.2 Hoá chất, thiết bị dụng cụ 11 2.1.3 Các môi trường nghiên cứu 12 2.1.4 Các dung dịch sử dụng nghiên cứu 12 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu .13 2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn nhiệt ẩm [4] 13 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào [7] 13 2.3.3 Phương pháp tạo vi nang .14 2.3.4 Phương pháp đông khô vi nang [7] .15 2.3.5 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng vi sinh vật [4] .15 2.3.6 Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật vi nang đông khô [12] 16 2.3.7 Phương pháp đánh giá độ rã vi nang mơi trường dịch tiêu hố mơ .16 2.3.8 Phương pháp đánh giá khả bảo vệ vi sinh vật môi trường dày mô dịch ruột mô [12] 16 2.3.9 Phương pháp đánh giá khả giải phóng vi sinh vật mơi trường đại tràng mô 17 2.3.10 Phương pháp xử lý số liệu 17 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN .18 3.1 Khảo sát ảnh hưởng thành phần cơng thức đến số đặc tính vi nang 18 3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ tinh bột hồ hoá đến khả tạo số đặc tính vi nang .18 3.1.2 Đánh giá ảnh hưởng lớp phủ Chitosan đến độ rã vi nang 20 3.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng vi sinh vật vi nang tới vị trí đại tràng 25 3.2.1 Tạo vi nang chứa vi sinh vật theo công thức alginat 2%-tinh bột hồ hoá 5%, phủ chitosan 3% sau q trình đơng tụ 25 3.2.2 Đánh giá khả bảo vệ vi sinh vật vi nang môi trường dày mô dịch ruột mô 26 3.2.3 Đánh giá khả giải phóng vi sinh vật vi nang môi trường đại tràng mô 28 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30 4.1 KẾT LUẬN 30 4.2 ĐỀ XUẤT 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT B bifidum : Bifidobacterium bifidum B longum B breve : Bifidobacterium longum : Bifidobacterium breve E coli CFU : Escherichia coli : Số đơn vị khuẩn lạc (Colony - Forming Units) FAO : Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization of the United Nations) : Khối lượng/thể tích kl/tt L casei : Lactobacillus casei L acidophilus : Lactobacillus acidophilus LAB MRS MT ĐTMP TBHH VSV WHO CAP : Vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacterium) : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de Man, Rogosa, Sharpe) : Môi trường : Đại tràng mô : Tinh bột hồ hoá : Vi sinh vật : Tổ chức Y tế Thế Giới (World Health Organization) : Cellulose Acetat Phthalat HPMP EC N7 PI3K/Akt NF-κB TNF IL : Hypromellose Phthalat : ETHOCEL standard premium : Phosphatidylinositol-3-Kinase and Protein Kinase B : Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B : Yếu tố hoại tử u (Tumor Necrosis Factors) : Interleukin DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục hoá chất sử dụng 11 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị sử dụng 11 Bảng 2.3 Danh mục dụng cụ sử dụng 11 Bảng 2.4 Môi trường MRS lỏng 12 Bảng 3.1 Đặc điểm vi nang alginat-tinh bột hồ hoá thay đổi nồng độ tinh bột .19 Bảng 3.2 Kết thử độ rã mẫu vi nang alginat 2%-tinh bột hồ hố có khơng có lớp phủ chitosan mơi trường dịch tiêu hố mơ 22 Bảng 3.3 Kết số lượng VSV bao gói vi nang T5C-2 đơng khơ 26 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Bifidobacterium bifidum Hình 1.2 Lactobacillus acidophilus Hình 1.3 Các loại vi nang chứa VSV .6 Hình 1.4 Cấu trúc hố học alginat Hình 1.5 Mơ hình vỉ trứng phức hợp Alginat-Calci Hình 1.6 Cấu trúc hoá học Chitin Chitosan Hình 3.1 Vi nang T2, T5, T7 tươi 19 Hình 3.2 Vi nang T2, T5, T7 đông khô 19 Hình 3.3 Hình ảnh mẫu vi nang T5C-2 tươi (a), đông khô (b) .22 Hình 3.4 Vi nang T5C-2 sau dịch dày mô (c); 22 Hình 3.5 Vi nang T5 sau dịch ruột mô (e); vớt đĩa petri (f) 23 Hình 3.6 Vi nang T5C-1 (g); Vi nang T5C-2 (h) sau dịch ruột mơ .23 Hình 3.7 Vi nang T5C-1 (i); Vi nang T5C-2 (k) sau đại tràng mô 23 Hình 3.8 Hình ảnh vi nang T5C-2 sau dịch ruột mô 24 Hình 3.9 Vi nang tươi T5C-2 chứa VSV 26 Hình 3.10 Vi nang đơng khơ T5C-2 chứa VSV 26 Hình 3.11 Biểu đồ số lượng VSV sống sót vi nang T5C-2 chứa VSV qua dịch tiêu hố mơ theo thời gian 27 Hình 3.12 Biểu đồ số lượng VSV giải phóng mơi trường đại tràng mơ vi nang T5C-2 chứa VSV theo thời gian 29 ĐẶT VẤN ĐỀ Thị trường probiotic phát triển với tốc độ nhanh ngày có nhiều nghiên cứu lâm sàng chứng minh tác dụng tuyệt vời mà nhóm vi khuẩn đem lại [46] Các nghiên cứu phân tích thị trường dự báo chế phẩm sẵn sàng tăng trưởng 31,07 tỷ USD giai đoạn 2022-2026 với tốc độ tăng trưởng kép hàng năm 8,54% [86] Đây hội động lực cho doanh nghiệp dược phẩm đẩy mạnh nghiên cứu phát triển thêm nhiều sản phẩm đáp ứng nhu cầu thị trường Hệ vi sinh vật đường ruột đặc biệt hệ vi sinh vật đại tràng có liên hệ chặt chẽ đến số bệnh béo phì, tiểu đường, bệnh rối loạn chuyển hoá, viêm nhiễm, ung thư đại tràng [18], [49] Việc bổ sung chế phẩm probiotic đường uống nhắm mục tiêu giải phóng đại tràng dần trở thành cách dùng ưa chuộng so với phương pháp khác tiện lợi, đơn giản, hiệu không xâm lấn [26] Tuy nhiên, vi khuẩn probiotic nhạy cảm với điều kiện khắc nghiệt đường tiêu hoá nên uống lượng nhỏ VSV đến đại tràng, làm giảm hiệu chế phẩm [36], [19] Vì việc ứng dụng hướng giải phóng đích hứa hẹn nhiều triển vọng sản xuất chế phẩm probiotic giải phóng đại tràng Với mục đích tăng cường khả bảo vệ vi sinh vật đường tiêu hố, định hướng giải phóng vi sinh vật với nồng độ cao đại tràng, đề tài: “Khảo sát số thơng số q trình tạo vi nang probiotic hướng giải phóng đại tràng” tiến hành với mục tiêu nghiên cứu sau: Khảo sát ảnh hưởng thành phần công thức đến số đặc tính vi nang Đánh giá khả bảo vệ giải phóng vi sinh vật vi nang tới vị trí đại tràng CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Hệ giải phóng đại tràng 1.1.1 Đặc điểm giải phẫu đại tràng Ống tiêu hoá thể người chia làm phần Đi từ xuống bao gồm miệng, thực quản, dày, ruột non, ruột già Trong ruột già đoạn cuối đường tiêu hố, có cấu tạo chia làm phần: Manh tràng, đại tràng, trực tràng, hậu môn [5] Đại tràng phần dài ruột già nối tiếp sau manh tràng gồm đại tràng lên, đại tràng ngang, đại tràng xuống, đại tràng sigma Đại tràng có đường kính khoảng 5-7 cm, lớp dọc phân bố không đều, lớp niêm mạc mỏng hơn, khơng có nếp lồi lõm bao phủ lớp chất nhầy [5] Đặc điểm sinh lý đại tràng có nhiều điểm khác biệt so với phần khác đường tiêu hóa phần đại tràng có nhiều đặc điểm khác gây khó khăn cho việc nghiên cứu phát triển hệ giải phóng thuốc đại tràng [27] 1.1.2 Yếu tố ảnh hưởng hệ giải phóng đại tràng 1.1.2.1 pH đường tiêu hoá Giá trị pH vị trí khác đường tiêu hố khơng giống Ở dày, pH khoảng 1,0-2,5 lúc đói tăng lên sau ăn [30] Đoạn đầu ruột non pH nằm khoảng 6,5 lên đến 7,5 cuối ruột non [30], [56] Độ pH sau giảm dần từ phần cuối ruột non xuống đại tràng tăng dần lần đại tràng [30] Giá trị pH manh tràng 5,5-7,0; đại tràng lên 5,7-6,9; đại tràng ngang từ 5,8-7,4; đại tràng xuống đạt 6,3-7,7; đại tràng sigma trực tràng khoảng 7,0 [48], [51], [66] Một số bệnh lý viêm loét đại tràng hay bệnh Crohn làm thay đổi pH đại tràng ảnh hưởng đến dược lực học, dược động học thuốc chứa dược chất có độ tan phụ thuộc pH Đặc biệt với chế phẩm probiotic làm giảm tỷ lệ sống sót vi sinh vật [15] 1.1.2.2 Thời gian vận chuyển thuốc đường tiêu hoá Thời gian thuốc di chuyển đường tiêu hoá ảnh hưởng đến thời gian thuốc đưa tới đại tràng từ ảnh hưởng hiệu sử dụng thuốc Tuy nhiên thời gian di chuyển thuốc đường tiêu hoá bị ảnh hưởng nhiều yếu tố bệnh lý, có mặt thức ăn, dạng bào chế khó xác định xác thời điểm thuốc di chuyển tới đại tràng [71] 1.1.2.3 Hệ vi sinh vật đại tràng Hệ vi sinh vật đại tràng phong phú với khoảng 400 loài khác nhau, nồng độ 1011 - 1012 CFU/ml, chiếm chủ yếu chi Bacteroides, ngồi cịn có chi Escherichia, Clostridia, Lactobacili…các vi sinh vật có khả tiết enzym để phân giải số polysaccharid alginat, chitosan, pectin… [37], [15] (f) (e) Hình 3.5 Vi nang T5 sau dịch ruột mô (e); vớt đĩa petri (f) (g) (h) Hình 3.6 Vi nang T5C-1 (g); Vi nang T5C-2 (h) sau dịch ruột mơ (i) (k) Hình 3.7 Vi nang T5C-1 (i); Vi nang T5C-2 (k) sau đại tràng mô ❖ Nhận xét bàn luận: Về mặt cảm quan vi nang alginat 2%-tinh bột hồ hoá 5% có khơng có lớp phủ chitosan sau đơng khơ khơng có khác biệt Có thể lớp phủ chitosan mỏng so với kích thước vi nang nên khó quan sát khác mẫu mắt thường Sau môi trường dày mô phỏng: mẫu vi nang không rã, vi nang co ngót; dịch ủ trong, cho thấy khả bảo vệ VSV dày tốt Kết phù hợp với nghiên cứu sử dụng tinh bột khơng hồ hố 10% có khơng có lớp phủ chitosan sau ủ môi trường dày mô vi nang không rã, dịch ủ suốt [1], [7], [9] Nguyên nhân alginat không bị hồ tan mơi trường acid [25] [84] Đặc biệt với vi nang phủ chitosan pH 6,5, nhóm amin chitosan chủ yếu bị proton hóa tạo thành polycation Chitosan tích điện dương bao phủ xung quanh alginat tích điện âm tạo thành màng bán thấm ngăn cản xâm nhập ion tích điện H+, Na+,… cạnh tranh vị trí gắn ion calci ma trận alginat gây phá 23 huỷ cấu trúc gel [83] Khi chuyển sang môi trường dịch ruột mô mẫu vi nang nhanh chóng trương nở tăng kích thước Có thể lý giải pH thấp nhóm carboxyl alginat bị proton hoá hạn chế trương nở liên kết ngang Trong điều kiện pH trung tính nhóm carboxyl bị khử hố dẫn đến gel trương nở nhiều [34], [73] Sau giờ, vi nang T5 chưa rã hết, khơng cịn giữ cấu trúc ban đầu khơng tiếp tục tiến hành thử môi trường đại tràng mô Các mẫu vi nang có lớp phủ chitosan trương nở hình cầu, số vi nang T5C-1 bắt đầu rã; vi nang T5C-2 chưa rã nhiên dịch ủ mẫu có vẩn đục Tiếp tục thử môi trường đại tràng mô thấy vi nang T5C-1 rã nhiều dịch có nhiều vẩn đục mẫu T5C-2 Quan sát mắt thường nhận thấy vi nang T5C-2 có lớp màng chitosan rõ ràng T5C-1 Nguyên nhân công thức T5C-2 phân tử chitosan tạo liên kết với tinh bột hồ hố alginat bề mặt khơng di chuyển vào cấu trúc mạng gel Trong với vi nang T5C-1, chitosan phối hợp trình đơng tụ nên chitosan len lỏi vào bên cấu trúc mạng, cạnh tranh, cản trở liên kết alginat với ion Calci; lý khiến vi nang rã sớm môi trường dịch ruột đại tràng mô So sánh với vi nang alginat-tinh bột khơng hồ hố phủ chitosan q trình đơng tụ lại cho kết rã lâu phủ chitosan sau q trình đơng tụ [1] Có thể lý giải ảnh hưởng tinh bột hồ hoá làm thay đổi cấu trúc liên kết thành phần khiến cho vi nang T5C-2 có lớp màng chitosan liên tục bền chặt Hình 3.8 Hình ảnh vi nang T5C-2 sau dịch ruột mô So sánh với nghiên cứu trước nhận thấy vi nang tinh bột hồ hoá có khơng có lớp phủ có thời gian rã lâu vi nang sử dụng tinh bột không hồ hoá Cụ thể nghiên cứu vi nang alginat-chitosan bao đa lớp thời gian rã hoàn toàn vi nang tinh bột khơng hồ hố phủ chitosan 3% 10 phút [7] Ở nghiên cứu sau mẫu vi nang chưa rã hết Có thể lý giải tinh bột sau hồ hoá đồng vào ma trận alginat làm cho cấu trúc trở nên bền chặt, với tinh bột khơng hồ hố phân tán vào khoảng trống cấu trúc mạng gel khơng góp phần hình thành ma trận alginat [33] 24 Thơng qua kết mục 3.1 thấy với thành phần alginat 2%-tinh bột hồ hoá 5% phủ chitosan sau trình đơng tụ cho vi nang cầu đẹp, móp méo sau đơng khơ có thời gian rã lâu dịch tiêu hố mơ Vì công thức vi nang lựa chọn tiến hành nghiên cứu nhằm đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV tới vị trí đại tràng 3.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng vi sinh vật vi nang tới vị trí đại tràng Từ kết mục 3.1.2 thấy việc thêm chitosan vào công thức giúp cải thiện độ rã vi nang mơi trường dịch tiêu hố mơ Điều cho thấy tiềm sử dụng chitosan giúp tăng cường khả bảo vệ giải phóng vi sinh vật hướng đích đại tràng Nghiên cứu nhằm đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV vi nang tới vị trí đại tràng Vi nang chứa vi sinh vật theo công thức alginat 2%-tinh bột hồ hoá 5% phủ chitosan 3% sau trình đơng tụ (T5C-2 chứa VSV) lựa chọn để tiến hành nghiên cứu 3.2.1 Tạo vi nang chứa vi sinh vật theo cơng thức alginat 2%-tinh bột hồ hố 5%, phủ chitosan 3% sau q trình đơng tụ Thí nghiệm nhằm tạo vi nang chứa vi sinh vật theo cơng thức alginat 2%tinh bột hồ hố 5% phủ chitosan 3% sau q trình đơng tụ (T5C-2 chứa VSV) đánh giá khả bao gói ❖ Tiến hành: Chuẩn bị 100 ml sinh khối nuôi cấy theo phương pháp nêu mục 2.3.2 Ly tâm 100 ml hỗn dịch nhân giống sau 24 giờ, thu sinh khối vi sinh vật Phối hợp sinh khối vi sinh vật vào 50 ml hỗn hợp T5 (alginat 3%-tinh bột hồ hoá 5%), thu hỗn dịch T5-VSV tạo vi nang T5C-2 chứa VSV theo phương pháp nêu phần b) mục 2.3.3 Dùng pipet Pasteur nhỏ hỗn dịch T5-VSV xuống dung dịch calci clorid 2%, để yên 30 phút cho vi nang ổn định Dùng lưới vớt hạt thu vi nang, rửa nước cất tiệt khuẩn chuyển sang dung dịch chitosan 3% kết hợp khuấy từ 30 phút Dùng lưới vớt hạt thu vi nang rửa nước cất tiệt khuẩn ta vi nang T5C-2 chứa VSV Các nguyên liệu sử dụng vô khuẩn Thao tác thực hồn tồn tủ cấy vơ trùng Đơng khơ vi nang tươi theo phương pháp nêu mục 2.3.4 Nhận xét trình tạo vi nang, cảm quan hình dạng, màu sắc, bề mặt bên ngồi vi nang tươi vi nang đông khô Đồng thời đánh giá khả bao gói VSV vi nang đơng khô theo phương pháp nêu mục 2.3.6 25 ❖ Kết quả: Hình 3.9 Vi nang tươi T5C-2 chứa Hình 3.10 Vi nang đơng khơ T5C-2 VSV chứa VSV Bảng 3.3 Kết số lượng VSV bao gói vi nang T5C-2 đông khô Lần Số lượng VSV (Log CFU/g) 9,01 ± 0,07 9,04 ± 0,05 9,01 ± 0,06 Trung bình 9,02 ± 0,06 ❖ Nhận xét bàn luận: Khi thêm sinh khối vào hỗn hợp alginat 2%-tinh bột hồ hoá 5% độ nhớt hỗn hợp thay đổi khơng đáng kể, q trình tạo vi nang dễ dàng Vi nang tươi chứa VSV có cấu trúc cầu đều, bề mặt trơn nhẵn, màu trắng ngà chứa sinh khối Vi nang đông khô co lại giảm kích thước giữ độ cầu, bề mặt xù xì nhẹ xốp, màu trắng ngà Có thể thấy việc thêm sinh khối vào cơng thức khơng ảnh hưởng nhiều đến tính lưu biến hỗn hợp alginat-TBHH; trình tạo gel hình thái, cấu trúc vi nang Về khả bao gói: Vi nang alginat 2%-tinh bột hồ hoá 5% phủ chitosan sau q trình đơng tụ cho kết bao gói đạt 9,02 Log CFU/g đáp ứng yêu cầu chế phẩm probiotic thị trường [32] 3.2.2 Đánh giá khả bảo vệ vi sinh vật vi nang môi trường dày mô dịch ruột mô Thí nghiệm nhằm đánh giá khả bảo vệ vi sinh vật môi trường dày mô dịch ruột mô vi nang T5C-2 chứa VSV ❖ Tiến hành: ➢ Xác định số lượng VSV vi nang T5C-2 chứa VSV đông khô theo phương pháp nêu mục 2.3.6 Cân 0,2 g vi nang chuyển vào 20 ml dung dịch natri citrat 2% tiệt khuẩn Khuấy từ với tốc độ khoảng 400 - 500 vòng/phút đến vi nang rã hồn tồn phân tán đồng Hút xác 1,00 ml dịch tiến hành pha lỗng, ni cấy để xác định 26 số lượng VSV sống sót theo phương pháp nêu mục 2.3.5 ➢ Xác định số lượng VSV cịn sống sót sau ủ vi nang dày mô vi nang T5C-2 chứa VSV theo phương pháp nêu mục 2.3.8 Ủ 0,2 g vi nang vào 20 ml dung dịch dày mô hấp tiệt khuẩn máy lắc tốc độ 75 vòng/phút, nhiệt độ 37°C Sau ủ, tách vi nang khỏi dịch acid, rửa nước cất tiệt khuẩn Chuyển vi nang vào bình nón chứa 20 ml dung dịch natri citrat 2% tiệt khuẩn, khuấy từ với tốc độ 400 – 500 vịng/phút đến vi nang rã hồn tồn Tiến hành cấy đếm xác định số lượng VSV sống sót theo phương pháp nêu mục 2.3.5 ➢ Xác định số lượng VSV cịn sống sót sau ủ vi nang dày dịch ruột mô vi nang T5C-2 chứa VSV theo phương pháp nêu mục 2.3.8.2 Ủ 0,2 g vi nang qua 20 ml dịch dày dịch ruột mô tiệt khuẩn máy lắc tốc độ 75 vòng/phút, nhiệt độ 37°C Sau dày dịch ruột mô phỏng, tách vi nang rửa nước cất tiệt khuẩn chuyển vào bình nón chứa 20 ml dung dịch natri citrat 2% tiệt khuẩn Khuấy từ với tốc độ 400500 vịng/phút đến vi nang rã hồn toàn Tiến hành cấy đếm xác định số lượng VSV sống sót theo phương pháp nêu mục 2.3.5 ❖ Kết quả: Log CFU/g Số lượng VSV sống sót dịch tiêu hoá (Log CFU/g) 10,00 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 - 9,02 7,83 Thời gian (h) 0h 1h 7,46 2h 3h Dịch dày mơ 4h 5h 6h Dịch ruột mơ Hình 3.11 Biểu đồ số lượng VSV sống sót vi nang T5C-2 chứa VSV qua dịch tiêu hố mơ theo thời gian 27 ❖ Nhận xét bàn luận: Tại thời điểm ban đầu (0 giờ) lượng VSV vi nang 9,02 Log CFU/g Sau ủ môi trường dày mô số lượng VSV giảm xuống 7,83 Log CFU/g (giảm 1,19 Log) ảnh hưởng pH acid Cơ chế việc giảm số lượng VSV lý giải sau: trình tạo vi nang, ion Ca2+ liên kết với nhóm -COOcủa đơn vị polyguluronat alginat tạo thành mơ hình “vỉ trứng” chứa bảo vệ VSV đó; ủ pH dày, ion Ca2+ trao đổi với ion H+ mơi trường acid, làm ion Ca2+ khớp vào khoảng trống theo mơ hình “vỉ trứng”, làm VSV khỏi vi nang bị ảnh hưởng trực tiếp acid dày Vi nang có sử dụng lớp màng bao chitosan bổ sung lớp áo polycation bên tạo rào cản ion H+ môi trường acid Do làm giảm tác động tới phức hợp calci alginat lõi, bảo vệ VSV môi trường acid Như bàn luận mục 3.1 sử dụng tinh bột hồ hố góp phần làm cho cấu trúc vi nang bền chặt hơn, hạn chế trao đổi ion, giảm thất thoát VSV Khi ủ môi trường dịch ruột mô pH 6,8 lượng VSV giảm không đáng kể độ pH gần với pH tối ưu VSV (pH 5,5-6,0) [22] Tại thời điểm dịch tiêu hoá (4 dịch ruột mơ phỏng) lượng VSV cịn sống vi nang 7,46 Log CFU/g đáp ứng yêu cầu chế phẩm probiotic FAO/WHO [32] Như công thức T5C-2 chứa VSV giúp bảo vệ vi khuẩn trước ảnh hưởng môi trường dày dịch ruột mô phỏng, hướng tới việc đưa lượng vi sinh vật đủ lớn có tác dụng đến đích đại tràng 3.2.3 Đánh giá khả giải phóng vi sinh vật vi nang môi trường đại tràng mô ❖ Mục tiêu: Đánh giá khả giải phóng vi sinh vật môi trường đại tràng mô vi nang T5C-2 chứa VSV ❖ Tiến hành: Xác định số lượng VSV giải phóng khỏi mơi trường đại tràng mô theo phương pháp nêu mục 2.3.9 Ủ 0,2 g vi nang qua 20 ml môi trường dày mô dịch ruột mô máy lắc tốc độ 75 vịng/phút, nhiệt độ 37°C Sau chuyển vi nang sang 20 ml môi trường đại tràng mô ủ tiếp máy lắc với tốc độ 75 vòng/phút nhiệt độ 37°C Sau mơi trường đại tràng mơ hút xác 1,00 ml dịch, tiến hành pha lỗng ni cấy xác định số lượng VSV sống sót khỏi mơi trường phương pháp pha loãng liên tục nêu mục 2.3.5 28 ❖ Kết quả: Số lượng VSV giải phóng mơi trường đại tràng mơ 7,00 Log CFU/g 6,00 6,02 6,23 6,40 7h (ĐTMP-1h) 8h (ĐTMP-2h) 9h (ĐTMP-3h) 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 Thời gian (h) Hình 3.12 Biểu đồ số lượng VSV giải phóng mơi trường đại tràng mô vi nang T5C-2 chứa VSV theo thời gian ❖ Nhận xét bàn luận: Tại thời điểm lượng vi sinh vật vi nang T5C-2 đạt 9,02 Log CFU/g Sau qua môi trường dày-2 ruột non-4 (6 dịch tiêu hố), lượng VSV sống sót vi nang giảm xuống cịn 7,46 Log CFU/g (Hình 3.11) Khi chuyển vi nang sang môi trường đại tràng mơ lượng VSV giải phóng tăng dần theo thời gian Tại thời điểm dịch tiêu hoá (1h ĐTMP) lượng VSV giải phóng khỏi mơi trường 6,02 Log CFU/g tăng lên 6,4 lúc (3h ĐTMP) Kết cho thấy việc sử dụng vi nang alginat 2%-tinh bột hồ hoá 5% phủ chitosan sau đông tụ cho kết giải phóng tốt VSV mơi trường đại tràng, lớp phủ chitosan bền chặt chưa bị phá vỡ (theo mục 3.1.2) lượng VSV bị thất giải phóng khỏi mơi trường Tuy nhiên lượng vi sinh vật giải phóng sau chưa nhiều khoảng 6,0 Log CFU/g cho thấy tiềm giải phóng VSV đoạn xa đại tràng Từ kết thực nghiệm mục 3.2 cho thấy vi nang alginat 2%-tinh bột hồ hoá 5% phủ chitosan 3% sau q trình đơng tụ có khả bảo vệ tốt vi sinh vật môi trường dày mô dịch ruột mô (lượng VSV giảm 1,19 Log CFU/g từ 9,02 xuống 7,83), đồng thời lượng VSV giải phóng mơi trường đại tràng mơ sau 6,0 Log CFU/g Vì cơng thức vi nang có tiềm tạo chế phẩm probiotic hướng giải phóng đại tràng 29 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 KẾT LUẬN Sau thời gian thực đề tài giải số vấn đề có số kết luận sau: - Đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng nồng độ tinh bột hồ hoá, lớp phủ chitosan cơng thức đến số đặc tính vi nang Cơng thức alginat 2%-tinh bột hồ hố 5% phủ chitosan 3% sau q trình đơng tụ cho vi nang cầu đẹp, móp méo sau đơng khơ thời gian rã lâu dịch tiêu hố mơ - Đã tạo vi nang chứa vi sinh vật theo cơng thức alginat 2%-tinh bột hồ hố 5% phủ chitosan 3% sau q trình đơng tụ đồng thời đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV tới vị trí đại tràng Cụ thể lượng vi sinh vật bao gói mẫu đơng khơ đạt 9,02 Log CFU/g; sau qua môi trường dày, dịch ruột mô lượng VSV sống sót vi nang 7,46 Log CFU/g; lượng VSV giải phóng mơi trường đại tràng mô sau 6,0 Log CFU/g Cơng thức vi nang có tiềm tạo chế phẩm probiotic hướng giải phóng đại tràng 4.2 ĐỀ XUẤT Bên cạnh kết đạt được, thời gian có hạn, đề tài xin đưa số đề xuất nhằm hoàn thiện nâng cao tính ứng dụng thực tế sau: - Tiếp tục khảo sát ảnh hưởng tinh bột hồ hoá đến số đặc tính vi nang hàm ẩm, kích thước, độ trương nở, cấu trúc bên trong, độ ổn định - Tiếp tục đánh giá khả bảo vệ giải phóng vi sinh vật vi nang tới vị trí đại tràng có bổ sung thêm số muối mật, enzym dịch tiêu hố mơ 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Thị Ánh (2019), Khảo sát số đặc tính vi nang đông tụ alginattinh bột bao đa lớp chứa Lactobacillus acidophilus, Khoá luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội Trần Thị Kim Anh (2019), Nghiên cứu bào chế vi nang berberin clorid hướng giải phóng đại tràng, Luận văn thạc sĩ Dược học, Đại học Dược Hà Nội Bộ môn Bào chế - Đại học Dược Hà Nội (2005), Một số chuyên đề bào chế đại, Nhà xuất y học, Hà Nội, tr 112-128 Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V tập 2, Nhà xuất Y học, Hà Nội, PL 103, 107, 414 Bộ Y Tế (2015), Giải phẫu sinh lý người, Nhà xuất Y học, tr 166-204 Nguyễn Lân Dũng (2000), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội, tr 221-228 Nguyễn Thị Hằng (2020), Đánh giá vai trị bảo vệ vi sinh vật đường tiêu hóa vi nang đông tụ alginat – chitosan bao đa lớp, Khoá luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Thị Hoa (2013), Khảo sát tác dụng bảo vệ vi khuẩn Alginat trình tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacilus acidophilus, Khoá luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Mai Hương (2014), Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trình tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus, Khoá luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội 10 Mai Thị Linh (2021), Khảo sát trình tạo vi nang đa nhân Saccharomyces boulardii theo phương pháp tách pha đơng tụ, Khố luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội 11 Lê Quan Nghiệm, Huỳnh Văn Hóa (2007), Bào chế sinh dược học tập 2, Nhà xuất Giáo Dục, Hà Nội, tr 291-301 12 Phạm Thị Phương cộng (2016), "Nghiên cứu bào chế vi nang probiotic phương pháp đơng tụ.", Tạp chí dược học, số 481 Năm thứ 56, tr 62-63 13 Đàm Thanh Xuân cộng (2016), " Nghiên cứu bào chế vi nang probiotics phương pháp đơng tụ", Tạp chí Dược học, 56(5), tr 61-65 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 14 Alvarez-Fuentes J, Fernández-Arévalo M, et al (2004), "Development of entericcoated timed-release matrix tablets for colon targeting", Journal of drug targeting, 12(9-10), pp 607-612 15 Amidon S., et al (2015), "Colon-targeted oral drug delivery systems: design trends and approaches", AAPS PharmSciTech, 16(4), pp 731-741 16 Anita (2019), "A review on colon targeted drug delivery system", International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 10(1), pp 47-56 17 Ansari, et al (2017), "Effect of Eudragit S100 nanoparticles and alginate chitosan encapsulation on the viability of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus rhamnosus", AMB Express, 7(1), pp 144 18 Ansari I., et al (2020), "The microbiota programs DNA methylation to control intestinal homeostasis and inflammation", Nat Microbiol, 5(4), pp 610-619 19 Anselmo A C., McHugh K J., et al (2016), "Layer-by-Layer Encapsulation of Probiotics for Delivery to the Microbiome", Adv Mater, 28(43), pp 9486-9490 20 Badgeley A., Anwar H., et al (2021), "Effect of probiotics and gut microbiota on anti-cancer drugs: Mechanistic perspectives", Biochim Biophys Acta Rev Cancer, 1875(1), 188494 21 Borges João, Mano João F (2014), "Molecular Interactions Driving the Layerby-Layer Assembly of Multilayers", Chemical Reviews, 114(18), pp 8883-8942 22 Bull M., Plummer S., et al (2013), "The life history of Lactobacillus acidophilus as a probiotic: a tale of revisionary taxonomy, misidentification and commercial success", FEMS Microbiol Lett, 349(2), pp 77-87 23 Cai Zhendong, et al (2018), "Anti-inflammatory activity of surface layer protein SlpA of Lactobacillus acidophilus CICC 6074 in LPS-induced RAW 264.7 cells and DSS-induced mice colitis", Journal of Functional Foods, 51, pp 16-27 24 Chan Eng-Seng, Wong Sze-Ling, et al (2011), "Effects of starch filler on the physical properties of lyophilized calcium–alginate beads and the viability of encapsulated cells", Carbohydrate polymers, 83(1), pp 225-232 25 Chandramouli V., Kailasapathy K., et al (2004), "An improved method of microencapsulation and its evaluation to protect Lactobacillus spp in simulated gastric conditions", Journal of Microbiological Methods, 56(1), pp 27-35 26 Cheng Q., Liu L., et al (2021), "A Colon-Targeted Oral Probiotics Delivery System Using an Enzyme-Triggered Fuse-Like Microcapsule", Adv Healthc Mater, 10(8), e2001953 27 Coupe A J., Davis S S., et al (1991), "Variation in gastrointestinal transit of pharmaceutical dosage forms in healthy subjects", Pharm Res, 8(3), pp 360-4 28 Dodoo Cornelius C, Wang Jie, et al (2017), "Targeted delivery of probiotics to enhance gastrointestinal stability and intestinal colonisation", International journal of pharmaceutics, 530(1-2), pp 224-229 29 Donthidi, et al (2010), "Effect of lecithin and starch on alginate-encapsulated probiotic bacteria", Journal of Microencapsulation, 27(1), pp 67-77 30 Evans D F., Pye G., et al (1988), "Measurement of gastrointestinal pH profiles in normal ambulant human subjects", Gut, 29(8), pp 1035-41 31 FAO/WHO (2006), Probiotics in food: Health and nutritional properties and guidelines for evaluation, FAO food and nutrition paper, 0254-4725 ; 85., pp 32 FAO/WHO (2002), Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, Report of a Joint FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, pp 1-8 33 Feltre Gabriela, Almeida Flávia Souza, et al (2020), "Alginate and corn starch mixed gels: Effect of gelatinization and amylose content on the properties and in vitro digestibility", Food Research International, 132, 109069 34 Fontes Gizele Cardoso, Calado Verơnica Maria Arẳjo, et al (2013), "Characterization of antibiotic-loaded alginate-OSA starch microbeads produced by ionotropic pregelation", BioMed research international, 2013 35 Gao Xing Wang, Mubasher Mohamed, et al (2010), "Dose–Response Efficacy of a Proprietary Probiotic Formula of Lactobacillus acidophilus CL1285 and Lactobacillus casei LBC80R for Antibiotic-Associated Diarrhea and Clostridium difficile-Associated Diarrhea Prophylaxis in Adult Patients", The American Journal of Gastroenterology, 105(7), pp 1636-1641 36 Gardiner G E., Casey P G., et al (2004), "Relative ability of orally administered Lactobacillus murinus to predominate and persist in the porcine gastrointestinal tract", Appl Environ Microbiol, 70(4), pp 1895-906 37 Gibson S A., McFarlan C., et al (1989), "Significance of microflora in proteolysis in the colon", Appl Environ Microbiol, 55(3), pp 679-83 38 Gomes Ana M P., Malcata F Xavier (1999), "Bifidobacterium spp and Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics", Trends in Food Science & Technology, 10(4), pp 139-157 39 He Yanhui, Wu Zhansheng, et al (2015), "Encapsulation and characterization of slow-release microbial fertilizer from the composites of bentonite and alginate", Applied Clay Science, 109, pp 68-75 40 Heidebach T., et al (2012), "Microencapsulation of probiotic cells for food applications", Critical reviews in food science and nutrition, 52(4), pp 291-311 41 Hejazi Radi, Amiji Mansoor (2003), "Chitosan-based gastrointestinal delivery systems", Journal of controlled release, 89(2), pp 151-165 42 Hu Tiantian, Wang Hongxia, et al (2020), "Preventive effect of Lactobacillus acidophilus XY27 on DSS-induced ulcerative colitis in mice", Drug Design, Development Therapy, pp 5645-5657 43 Hurtado Alejandro, Aljabali Alaa A A., et al (2022), "Alginate: Enhancement Strategies for Advanced Applications", International Journal of Molecular Sciences, 23(9), pp 4486 44 Khlibsuwan Rapee, Tansena Wirinya, et al (2018), "Modification of alginate beads using gelatinized and ungelatinized arrowroot (Tacca leontopetaloides L Kuntze) starch for drug delivery", International journal of biological macromolecules, 118, pp 683-692 45 Khosravi Zanjani M A., Ghiassi Tarzi B., et al (2014), "Microencapsulation of Probiotics by Calcium Alginate-gelatinized Starch with Chitosan Coating and Evaluation of Survival in Simulated Human Gastro-intestinal Condition", Iran J 46 47 48 49 Pharm Res, 13(3), pp 843-52 Kim S K., et al (2019), "Role of Probiotics in Human Gut MicrobiomeAssociated Diseases", J Microbiol Biotechnol, 29(9), pp 1335-1340 Kim Woon-Ki, et al (2021), "Alleviation of DSS-induced colitis via Lactobacillus acidophilus treatment in mice", Food function, 12(1), pp 340-350 Leuva Vinayak R, Patel BG, et al (2012), "Oral colon-specific drug delivery system", J Pharm Res, 5(4), pp 2293-7 Li Y., Tinoco R., et al (2019), "Gut microbiota dependent anti-tumor immunity restricts melanoma growth in Rnf5(-/-) mice", Nat Commun, 10(1), pp 1492 50 Manojlović Verica, Nedović Viktor A., et al (2010), "Encapsulation of Probiotics for use in Food Products", Encapsulation Technologies for Active Food Ingredients and Food Processing, Zuidam N J.,Nedovic Viktor, Springer New York, New York, NY, pp 269-302 51 Marieb, Elaine Nicpon, et al (2007), Human anatomy & physiology, Pearson Benjamin Cummings, San Francisco 52 Mortazavian Amir, Razavi Seyed Hadi, et al (2007), "Principles and Methods of Microencapsulation of Probiotic Microorganisms", Iranian Journal of Biotechnology, 5(1), pp 1-18 53 Mounsey John S, O’Riordan E Dolores (2008), "Influence of pre-gelatinised maize starch on the rheology, microstructure and processing of imitation cheese", Journal of Food Engineering, 84(1), pp 57-64 54 Murtaza Ghulam, et al (2011), "Alginate microparticles for biodelivery: A review", African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 5, pp 2726-2737 55 Park Jin-Sil, Choi Jeong Won, et al (2018), "Lactobacillus acidophilus improves intestinal inflammation in an acute colitis mouse model by regulation of Th17 and Treg cell balance and fibrosis development", Journal of medicinal food, 21(3), pp 215-224 56 Philip A K., Philip B (2010), "Colon targeted drug delivery systems: a review on primary and novel approaches", Oman Med J, 25(2), pp 79-87 57 Quagliariello Andrea, Aloisio Irene, et al (2016), "Effect of Bifidobacterium breve on the intestinal microbiota of coeliac children on a gluten free diet: a pilot study", Nutrients, 8(10), pp 660 58 Ray Fuller (2014), Probiotics: the scientific basis, Springer Science & Business Media, pp 1-56 59 Rezaei Mokarram Reza, Mortazavi Seyed, et al (2009), "The influence of multi stage alginate coating on survivability of potential probiotic bacteria in simulated gastric and intestinal juice", Food Research International, 42, pp 1040-1045 60 Rinaudo Marguerite (2006), "Chitin and chitosan: Properties and applications", Progress in Polymer Science, 31, pp 603-632 61 Rohman Saefur, Kaewtatip Kaewta, et al (2021), "Encapsulation of Rhodopseudomonas palustris KTSSR54 using beads from alginate/starch blends", Journal of Applied Polymer Science, 138(12), 50084 62 Rowe Raymond C, Sheskey Paul J (2006), Handbook of pharmaceutical excipients, Pharmaceutical press London 63 Sanders Mary, Klaenhammer T R (2001), "Invited Review: The Scientific Basis of Lactobacillus acidophilus NCFM Functionality as a Probiotic", Journal of dairy science, 84, pp 319-31 64 Serna-Cock Liliana, Vallejo-Castillo Vladimir (2013), Probiotic encapsulation, African Journal of Microbiology Research, pp 4743-4753 65 Serna Liliana, Vallejo-Castillo Vladimir (2013), "Probiotic encapsulation", African journal of microbiology research, 7, pp 4743 66 Sethi S Harikumar SL, Nirmala (2012), "Review on advances in colon targeted drug delivery system", Int J Pharm Sci Res, 3(9), pp 2989-3000 67 Sgorbati B., Biavati B., et al (1995), "The genus Bifidobacterium", The Genera of Lactic Acid Bacteria, Wood B J B.,Holzapfel W H., Springer US, Boston, MA, pp 279-306 68 Shen Z H., Zhu C X., et al (2018), "Relationship between intestinal microbiota and ulcerative colitis: Mechanisms and clinical application of probiotics and fecal microbiota transplantation", World J Gastroenterol, 24(1), pp 5-14 69 Sinha Vivek Ranjan, Kumria Rachna (2001), "Polysaccharides in colon-specific drug delivery", International journal of pharmaceutics, 224(1-2), pp 19-38 70 Sinha Vivek Ranjan, et al (2004), "Chitosan microspheres as a potential carrier for drugs", International journal of pharmaceutics, 274 1-2, pp 1-33 71 Stubbs J B., Valenzuela G A., et al (1991), "A noninvasive scintigraphic assessment of the colonic transit of nondigestible solids in man", J Nucl Med, 32(7), pp 1375-81 72 Sun X., Liu C., et al (2019), "Dual-layered pH-sensitive alginate/chitosan/kappacarrageenan microbeads for colon-targeted release of 5-fluorouracil", Int J Biol Macromol, 132, pp 487-494 73 Swamy Bala Yerri, Yun Yeoung-Sang (2015), "In vitro release of metformin from iron (III) cross-linked alginate–carboxymethyl cellulose hydrogel beads", International journal of biological macromolecules, 77, pp 114-119 74 Tajehmiri Ahmad, Darsanaki Reza Kazemi, et al (2014), "Antimicrobial Activity of Lactobacillus spp Isolated from Commercial Yoghurts against Pathogenic Bacteria", J Appl Microbiol, 8, pp 2211-5 75 Tissier H (1900), Recherches sur la flore intestinale des nourrissons (etat normal et pathologique), M.D thesis, University of Paris, Paris, France 76 Tissier H (1899), "La reaction chromophile d'Escherich et le Bacterium coli", CR Soc Biol, 51, pp 943-945 77 Ventura M., et al (2014), "Bifidobacteria and humans: our special friends, from ecological to genomics perspectives", J Sci Food Agric, 94(2), pp 163-8 78 Wang Mengxia, Chen Yongxiong, et al (2018), "Beneficial changes of gut microbiota and metabolism in weaned rats with Lactobacillus acidophilus NCFM and Bifidobacterium lactis Bi-07 supplementation", Journal of Functional Foods, 48, pp 252-265 79 Yoon Jun Sik, Sohn Won, et al (2014), "Effect of multispecies probiotics on irritable bowel syndrome: a randomized, double‐blind, placebo‐controlled trial", Journal of gastroenterology hepatology, 29(1), pp 52-59 80 Yue Yuanchun, Ye Kai, et al (2020), "Probiotic strain Lactobacillus plantarum YYC-3 prevents colon cancer in mice by regulating the tumour microenvironment", Biomedicine & Pharmacotherapy, 127, 110159 81 Zhang C., Zhao Y., et al (2021), "Identification of the key characteristics of Bifidobacterium longum strains for the alleviation of ulcerative colitis", Food Funct, 12(8), pp 3476-3492 82 Zhang L., Sang Y., et al (2016), "Polysaccharide-based micro/nanocarriers for oral colon-targeted drug delivery", J Drug Target, 24(7), pp 579-89 83 Zhou Huan bin, Chen Jiashu, et al (2017), "Preparation of Acid-Resistant Microcapsules with Shell-Matrix Structure to Enhance Stability of Streptococcus Thermophilus IFFI 6038", Journal of Food Science, 82(8), pp 1978-1984 84 Zhu Yanli, Wang Zheng, et al (2021), "Biomaterial-based encapsulated probiotics for biomedical applications: Current status and future perspectives", Materials & Design, 210, 110018 NGUỒN INTERNET 85 Bifina (2020), "Công nghệ Seamless Micro Capsule", https://bifina.vn/congnghe-dot-pha-smc/ 86 Infiniti Research Limited (October 2022), "Global Probiotics Market 20222026", https://www.reportlinker.com/p03571296/Global-Probiotics-MarketInfiniti-Research-Limited.html 87 Wikipedia, "Bifidobacterium", https://en.wikipedia.org/wiki/Bifidobacterium