0482 nghiên cứu quy trình chiết xuất và tinh chế rotudin từ củ bình vôi (stephania rotunda lour) trồng tại tỉnh hòa bình

122 Nguyễn M Hồng, Tơn N Y Quỳnh Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(1), 122-131 Nghiên cứu quy trình chiết xuất tinh chế Rotudin từ củ bình vơi (Stephania rotunda Lour.) trồng tỉnh Hịa Bình The procedure for extracting and purifying Rotudin from tubers of (Stephania rotunda Lour.) grown in Hoa Binh province Nguyễn Minh Hồng1*, Tơn Nữ n Quỳnh1 Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam * Tác giả liên hệ, Email: hoang.nm@ou.edu.vn THÔNG TIN TĨM TẮT Củ bình vơi (Stephania rotunda Lour.) trồng tỉnh Hịa Bình DOI:10.46223/HCMCOUJS tech.vi.14.1.439.2019 sử dụng làm ngun liệu để chiết xuất l-tetrahydropalmatine Ngày nhận: 10/06/2019 Ngày nhận lại: 15/07/2019 Duyệt đăng: 15/07/2019 Từ khóa: chiết xuất, ltetrahydropalmatine, NMR, rotudin, Stephania rotunda Keywords: extraction; ltetrahydropalmatine, NMR data, rotudin, Stephania rotunda (tên hoạt chất thuốc Rotundin) C21H25NO4 - alkaloid có tác dụng an thần, gây ngủ, giảm trí nhớ Mục đích nghiên cứu tìm quy trình chiết xuất rotudin đơn giản, rẻ tiền, hiệu để ứng dụng Kết thu cho thấy: - Phương pháp ngâm chiết với tỉ lệ 1/6 bột khơ củ bình vơi thể tích dung dịch H2SO4 1% cho hiệu suất trích ly cao 0,35% Hợp chất thu đạt độ tinh khiết 98% (trên HPLC); - Cấu trúc hóa học xác nhận phổ NMR ABSTRACT Tubers of Stephania rotunda Lour grown in Hoa Binh province are used as raw materials for extracting ltetrahydropalmatine (a medical jargon-Rotundin) C21H25NO4 - a major component - alkaloid with the effects of sedative and preventing loss of memory The purpose of this research is to study a simple, inexpensive, and efficient procedure for extracting rotudin - Maceration method of 1/6 of dried powder of tubers with 1% H2SO4 solution gives the highest yield of 0.35% on the extraction The purity of rotudin is 98% on HPLC - The chemical structure of rotudin was confirmed by NMR data Đặt vấn đề Những năm gần đây, với tiến y học, loại thuốc an thần, chống ngủ sản phẩm quan tâm nghiên cứu Thực tế, phần lớn loại thuốc an thần phổ biến thị trường có nguồn gốc từ đường tổng hợp hóa dược nhập Tuy nhiên, loại thuốc lại gây số tác dụng phụ sử dụng thời gian dài nên việc xây dựng quy trình sản xuất thuốc từ thảo dược thiên nhiên quan tâm Nguyễn M Hồng, Tơn N Y Quỳnh Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(1), 122-131 123 Củ bình vơi có tên khoa học Stephania rotunda Lour thuộc họ Tiết dê (Menisspermaceae) loại dây leo chủ yếu phân bố Trung Quốc nước Đơng Nam Á Việt Nam Củ bình vơi chứa alkaloid khác nhau, hợp chất rotundin (hay L-tetrahydropalmatin) chiếm hàm lượng lớn Trong y học cổ truyền từ xưa, củ bình vơi dùng dạng thuốc sắc hay ngâm rượu chữa ngủ, an thần, nhức đầu, đau bụng, … Hiện rotundin dùng chủ yếu để chữa bệnh ngủ an thần Rotundin nguồn gốc tự nhiên có ưu điểm bật độc tính thấp, dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý, giúp hồi phục trí nhớ (L T Do, 2004; Hung et al., 2010; Semwal et al., 2010; Thuy, Franke, Porzel, Wessjohann, & Sung, 2006) Nguồn dược liệu củ bình vơi nước ta phong phú Do đó, việc nghiên cứu, xây dựng quy trình chiết xuất rotudin từ củ bình vơi đạt hiệu cao, có khả ứng dụng công nghiệp để tận dụng nguồn dược liệu phong phú nước cơng việc có ý nghĩa Vật liệu phương pháp nghiên cứu Bài báo trình bày kết nghiên cứu quy trình chiết xuất tinh chế rotudin trích từ củ bình vơi (Stephania rotunda Lour.) trồng tỉnh Hịa Bình dung môi acid H2SO4 1% Cấu trúc rotudin xác định khối phổ (MS) phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Ngun liệu Củ bình vơi (Stephania rotunda Lour.) tươi thu hái địa bàn xã Sủ Ngịi, thành phố Hịa Bình, tỉnh Hịa Bình vào tháng 10 năm 2017 Mẫu giám định tên khoa học dựa vào đặc điểm hình thái mơ tả tài liệu thực vật dược điển (Bộ Y tế, 2009; B H Do, 2004; L T Do, 2004) Sau thu hái, nguyên liệu rửa để loại bỏ bụi đất, cắt bỏ phần hư; để nước cắt thành lát mỏng đem sấy khô, xay nhỏ bảo quản nhiệt độ phòng túi nilon kín Phương pháp nghiên cứu Rotudin thơ chiết dung dịch H2SO4 3% mô tả tài liệu (Le et al., 2014), có bổ sung cho phù hợp với thực tế (Hình 1) Phương pháp sắc ký với chất hấp phụ silica gel sử dụng để cô lập rotudin tinh khiết 124 Nguyễn M Hồng, Tơn N Y Quỳnh Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(1), 122-131 Quy trình chiết xuất chung rotudin alkaloid Hình Sơ đồ tóm tắt quy trình chung chiết xuất rotudin alkaloid khác Thực nghiệm Bước 1: Chuẩn bị ngun liệu chiết alkaloid tồn phần Củ bình vơi rửa sạch, để nước, cắt thành lát mỏng đem sấy 60oC khô cứng, sau xay thành bột Cân xác 50g bột củ bình vơi sấy khơ vào ngâm dung dịch H2SO4 với thể tích nồng độ phù hợp (Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất rotudin thô) Thời gian ngâm chiết lần 24 Lọc lấy dịch chiết alkaloid Chiết thêm hai lần Gộp dịch chiết lọc với kiềm hóa dung dịch Na2CO3 bão hịa đến pH=9 (thay cho việc dùng NaOH 10% Le cộng (2014)) Lọc lấy tủa alkaloid toàn phần đem sấy khô nhiệt độ 60oC Bước 2: Tinh chế rotudin alkaloid khác Tủa (cặn) alkaloid toàn phần thu đem nghiền thành bột mịn, chiết với ethanol 96o phương pháp đun khuấy từ nhiệt độ 80oC lọc Gộp dịch chiết thu Nguyễn M Hồng, Tơn N Y Quỳnh Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(1), 122-131 125 hồi dung mơi, thu hỗn hợp dịch rotudin thô alkaloid khác Hỗn hợp dịch rotudin thô tẩy màu than hoạt tính Dịch lọc để yên - ngày nhiệt độ phòng để kết tinh Lọc lấy tinh thể phễu Buchner, rửa ethanol 96o để loại bỏ tạp chất lại Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất rotudin thô Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ thể tích dung dịch H2SO4 ngâm chiết tối ưu Cân xác 50g bột củ bình vơi sấy khơ Tiến hành ngâm chiết nguyên liệu dung dịch H2SO4 (3%) với tỉ lệ bột nguyên liệu thể tích dung dịch tăng dần 1/4, 1/5, 1/6, 1/7 Ở nghiệm thức thực chiết lần để chiết kiệt alkaloid Dịch chiết thu nghiệm thức tiếp tục đem tinh chế theo quy trình chung Sản phẩm cân tính hiệu suất kiểm tra độ tinh khiết sắc ký mỏng Tỉ lệ thể tích dung dịch H2SO4 tối ưu sử dụng cho thí nghiệm khảo sát Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ dung dịch acid sulfuric ngâm chiết tối ưu Bột củ bình vơi đem ngâm chiết theo nồng độ khác nhau: 0,5%, 1%, 2% 3% Dịch chiết sau lọc kiềm hóa với dung dịch Na2CO3 bão hòa, tiến hành thu tủa quy trình chung 126 Nguyễn M Hồng, Tơn N Y Quỳnh Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(1), 122-131 Bước 3: Cơ lập thành phần rotudin phương pháp sắc ký cột Pha động: hệ dung môi giải ly chloroform: ethanol (99:1 đến 10:90) Pha tĩnh: silica gel cỡ hạt 0,063 - 0,200mm (Merck) Khối lượng mẫu g thể tích phân đoạn 10ml Pha động hệ dung môi chloroform: ethanol (tỉ lệ 99:1 tới 0:100) Vận tốc giải ly 1ml/2 phút Các phân đoạn giống TLC gộp lại Phân đoạn II dùng hệ chloroform:ethanol (70:30) có vết TLC, đặt tên RO1 Bước 4: Nhận danh xác định cấu trúc hợp chất thu - Phương pháp HPLC-MS: thực máy Thermo Scientific MSQ Plus Trung tâm nghiên cứu ứng dụng, Viện Hàn lâm khoa học & công nghệ Việt Nam; - Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR: kết phân tích đo máy Bruker Avance III 500MHz Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm khoa học & công nghệ Việt Nam Kết thảo luận Kết khảo sát tỉ lệ thể tích dung dịch H2SO4 ngâm chiết tối ưu Hình Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết rotudin thô theo tỉ lệ ngâm chiết khác Qua trình khảo sát cho thấy tỉ lệ 1/6 bột bình vơi thể tích dung dịch H2SO4 phù hợp để chiết thô rotudin đạt hiệu suất cao (0,23%) Trong dịch kết tinh không thấy xuất nhựa dầu Bên cạnh đó, thời gian tạo thành tinh thể ngâm chiết theo tỉ lệ 1/6 nhanh so với tỉ lệ khác Kết khảo sát nồng độ dung dịch H2SO4 ngâm chiết tối ưu Thực chiết rotudin thô dung dịch acid sulfuric với nồng độ khác theo tỉ lệ 1/6 thí nghiệm trước Qua q trình khảo sát, hiệu suất chiết dung dịch H2SO4 1% cao (0,35%) Nguyễn M Hồng, Tơn N Y Quỳnh Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(1), 122-131 127 Hình Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết rotudin thô theo nồng độ H2SO4 khác Kết quả: bột bình vơi ngâm chiết dung dịch H2SO4 1% với tỉ lệ thể tích 1/6 tối ưu Kết có khác biệt so với Le cộng (2014) cho thấy nồng độ H2SO4 tối ưu 3-4% tác giả thực mẫu củ bình vơi tươi nên cần nồng độ lớn chiết Kết định tính rotudin alkaloid khác Tinh thể thu sau thực khảo sát ngâm chiết đánh giá độ tinh khiết sơ phương pháp sắc ký mỏng, đo điểm nóng chảy HPLC-MS Kết sắc ký mỏng (Hình 6) cho thấy có vệt đậm cao tương đương chất chuẩn rotudin với Rf = 0,48, cho thấy rotudin Kết đo điểm nóng chảy Kết đo điểm nóng chảy cho thấy nhiệt độ nóng chảy chất chiết (141oC) gần với nhiệt độ nóng chảy rotudin chuẩn (142oC) tài liệu tham khảo (Blanchfield, Sands, Kennard, Byriel, & Kitching, 2003) Kết sắc ký lỏng hiệu cao ghép đầu dò khối phổ (HPLC-MS) Lấy mẫu khảo sát tỉ lệ thể tích nồng độ dung dịch H2SO4 tối ưu cho trình ngâm chiết kiểm tra độ tinh khiết phương pháp HPLC-MS Tại thời gian lưu 7,689 phút xuất mũi cao có độ tinh khiết 98,875% Ngoài ra, thời gian lưu 5,281 phút 6,405 phút xuất hai mũi nhỏ có hàm lượng 0,876% 0,249% 128 Nguyễn M Hoàng, Tơn N Y Quỳnh Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(1), 122-131 Hình Kết sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) Sau chạy khối phổ (MS) chất có thời gian lưu 7,689 phút, kết cho thấy có mũi ion phân tử 355,3m/z tương đương với công thức phân tử rotudin C21H25O4N Như vậy, với kết từ đo điểm nóng chảy, sắc kí mỏng, LC-MS bước đầu nhận định sản phẩm thu sau trình chiết rotudin Định danh hợp chất RO1 cô lập Phổ 13C-NMR 1H-NMR hợp chất RO1 dung môi CDCl3 cho số liệu bảng Phổ 1H-NMR có mặt nhóm methyl singlet 3,88; 3,85; 3,86 3,84ppm nhóm -OCH3 gắn C2, C3, C9, C10 Tổng số nguyên tử hidro phổ 1H-NMR 25 Phổ H-NMR cho thấy mũi singlet proton gắn C1 C4 6,74ppm (1H, s) 6,62ppm (1H, s) Hình Cấu trúc hóa học chất RO1 - rotudin Nguyễn M Hồng, Tơn N Y Quỳnh Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(1), 122-131 129 Proton C11 (6,77ppm) chẻ đôi với proton C12 (6,86ppm) với số ghép 3J 8,5Hz, proton vị trí ortho với vịng benzen Bảng Số liệu phổ 13C-NMR 1H-NMR (500MHz, CDCl3) RO1 Vị trí C 4a 8a 10 11 12 12a δC (ppm) 108,7 147,4 147,5 111,4 126,8 29,1 51,5 δH (ppm) [J (Hz)] 6,74 (s; 1H) 54,0 127,8 145,1 150,3 111,0 123,8 128,6 3,52 (m; 2H) 13 36,4 14 14a 2- OCH3 3- OCH3 9- OCH3 10- OCH3 59,3 129,8 55,86 56,1 60,2 55,89 6,62 (s; 1H) 2,61 (m; 2H) 3,11 (m; 2H) 6,77 (d; J =8,5Hz; 1H) 6,86 (d; J =8,5Hz; 1H) 2,80 (m; 1H) 4,22 (d; 1H) 3,55 (m; 1H) 3,88 (s; 3H) 3,85 (s; 3H) 3,86 (s; 3H) 3,84 (s; 3H) Nguồn: Kết phân tích liệu nhóm nghiên cứu Dựa vào kết phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất RO1 thu nhận có 21 carbon Phổ 13C-NMR cho mũi giá trị 55,86; 56,1; 60,2 55,89ppm carbon nhóm -OCH3 gắn C2, C3, C9 C10 Ngồi phổ 13C-NMR có mũi nhóm methylene 29,1; 51,5; 54,0 36,4ppm carbon C5, C6, C8, C13 Từ phân tích số liệu phổ hợp chất RO1 nêu trên, kết hợp so sánh với công bố Blanchfield cộng (2003), hợp chất RO1 xác định rotudin (Hình 5) Kết sắc ký mỏng hợp chất rotudin thu nhận số mẫu thuốc thị trường 130 Nguyễn M Hồng, Tơn N Y Quỳnh Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(1), 122-131 Hình Kết sắc ký mỏng rotudin số loại thuốc Ghi chú: C- rotudin chuẩn, S- thuốc Stilux 60 mg, R- thuốc Rotunda 30 mg, M-thuốc Mimosa, RO1 - rotudin thu Nguyễn M Hồng, Tơn N Y Quỳnh Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(1), 122-131 131 Kết luận Bột bình vơi ngâm chiết dung dịch H2SO4 1% với tỉ lệ rắn lỏng 1/6 cho hiệu suất chiết alkaloid đạt 0,35% Từ hỗn hợp alkaloid thô cô lập rotudin đạt độ tinh khiết 98%, cấu trúc hóa học khẳng định dựa kết phổ NMR MS Tài liệu tham khảo Blanchfield, J T., Sands, D P A., Kennard, C H L., Byriel, K A., & Kitching, W (2003) Characterisation of alkaloids from some Australian Stephania (Menispermaceae) species Phytochemistry, 63, 711-720 Bộ Y tế (2009) Dược điển Việt Nam IV [Vietnamese pharmacopoeia IV] Hanoi, Vietnam: Nhà xuất Y học Do, B H (2004) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam [Medicinal plants and animals for medicine in Vietnam] Hanoi, Vietnam: Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Do, L T (2004) Những thuốc vị thuốc Việt Nam [Vietnamese medicinal plants and herbs] Hanoi, Vietnam: Nhà xuất Y học Hung, T M., Dang, N H., Kim, J C., Jang, H., Ryoo, S., Lee, J H., … Min, B S (2010) Alkaloids from roots of Stephania rotunda and their cholinesterase inhibitory activity Planta Medica, 76, 1762-1764 Le, H M., Ngo, P T., Nguyen, D V., Tran, T V., Nguyen, S C., Vu, T D., … Do, T T (2014) Xây dựng phương pháp định lượng rotundin củ bình vơi tươi sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-scanning) Tạp chí Dược liệu, 19(6), 375-380 Semwal, D K., Badoni, R., Semwal, R., Kothiyal, S K., Singh, G J P., & Rawat, U (2010) The genus Stephania (Menispermaceae): Chemical and pharmacological perspectives Journal of Ethnopharmacology, 132, 369-383 Thuy, T T., Franke, K., Porzel, A., Wessjohann, L., & Sung, T V (2006) Quaternary protoberberine alkaloids from Stephania rotunda Lour Journal of Chemistry, 44(2), 259264