Nghiên cứu thành phần hóa học theo hướng tác dụng chống oxy hóa và kháng α glucosidase của thân rễ gừng đen (distichochlamys citrea m f newman , zingiberaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN VĂN CHỆN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ KHÁNG α-GLUCOSIDASE CỦA THÂN RỄ GỪNG ĐEN (DISTICHOCHLAMYS CITREA M.F NEWMAN., ZINGIBERACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN VĂN CHỆN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ KHÁNG α-GLUCOSIDASE CỦA THÂN RỄ GỪNG ĐEN (DISTICHOCHLAMYS CITREA M.F NEWMAN., ZINGIBERACEAE) NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THÀNH TRIẾT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học tơi Các số liệu kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa tác giả khác cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Tác giả luận văn Trần Văn Chện TÓM TẮT LUẬN VĂN Luận văn tớt nghiệp Thạc sĩ dược học – Khóa: 2019 – 2021 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ KHÁNG α-GLUCOSIDASE CỦA THÂN RỄ GỪNG ĐEN (DISTICHOCHLAMYS CITREA M.F NEWMAN., ZINGIBERACEAE) Trần Văn Chện Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thành Triết Đặt vấn đề: Distichochlamys citrea M.F Newman (Zingiberaceae) loài đặc hữu Việt Nam, dân gian sử dụng để làm thuốc chữa bệnh viêm nhiễm, đái tháo đường làm gia vị Đã có cơng trình nghiên cứu tinh dầu thân rễ D citrea chưa có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học khác hoạt tính sinh học D citrea Chính vậy, đề tài thực với mục đích nghiên cứu thành phần hóa học theo hướng tác dụng chống oxy hóa kháng α-glucosidase thân rễ Gừng đen Phương pháp nghiên cứu: Đặc điểm hình thái, vi học, thơng số lý hóa Gừng đen thực theo hướng dẫn Dược điển Việt Nam V Mã vạch DNA khuếch đại đoạn mồi ITS Khảo sát sơ thành phần hóa học theo phương pháp Ciuley cải tiến Chiết xuất dược liệu phương pháp ngấm kiệt phân bố lỏng-lỏng thu cao chiết toàn phần cao phân đoạn tương ứng Đánh giá tác dụng chống oxy hóa phương pháp trung hịa gốc tự DDPH ức chế enzym α-glucosidase phương pháp đo quang Các hợp chất có cấu trúc xác định phổ MS NMR phân lập sắc ký cột Kết quả: Về mặt hình thái học, D citrea khác với loài Distichochlamys khác Đặc biệt, Gừng đen có thân rễ thon dài, màu xanh lục, cụm phát hoa với bắc xòe rộng hoa màu vàng (cánh mơi có rãnh sâu) Ngồi ra, cấu trúc vi học D citrea tương tự chi Zingiber Loài nghiên cứu tương đồng 96,54% với ITS D citrea Genbank chứng minh khả xác định Gừng đen thị ITS Các tiêu lý hóa bột thân rễ đạt tiêu chuẩn cho phép Phân tích sơ thành phần hóa thực vật cho thấy diện tinh dầu, chất khử, acid amin, coumarin flavonoid thân rễ Trong đó, chất béo có thân rễ mà khơng có Bột thân rễ (3,5 kg) chiết ethanol 96% (tỷ lệ 1:15) thu 386 g cao tổng Qua trình chiết lỏng-lỏng, thu được cao phân đoạn cao n-hexan (28,17 g), cao CHCl3 (131,32 g), cao EtOAc (13,56 g), cao n-BuOH (20,92 g) cao nước (126,68 g) Trong cao thử nghiệm, cao chiết EtOAc có hoạt tính chống oxy hóa (IC50 = 90,27 µg/mL) ức chế enzym α-glucosidase (IC50 = 115,75 µg/mL) tốt Các hợp chất C1 (54,8 mg; 5-hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavon), C2 (505,1mg; β-sitosterol, stigmasterol), C3 (83,1 mg; platyphyllon) C4 (12,3 mg; glycerol monostearat) phân lập từ cao CHCl Các hợp chất E1 (34,1mg; kaempferol) E2 (14,1 mg; acid trans-5-O-caffeoylquinic) phân lập từ cao EtOAc Hợp chất E1 cho tác dụng chống oxy hóa ức chế enzyme α-glucosidase với giá trị IC50 14,08 µM; 31,86 µM tương tự hợp chất C1 với IC50 794,71 µM; 189,40 µM Tuy nhiên hợp chất C4 cho tác dụng yếu tác dụng Trong hợp chất C2 (IC50 > 1204,82 µM) C3 (IC50 = 69,41 µM) cho tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase hợp chất E2 (IC50 = 30,20 µM) cho tác dụng chống oxy hóa Kết luận: Nghiên cứu lần cung cấp thông tin đặc điểm vi học, thơng số lý hóa, hóa thực vật thị ITS/DNA D citrea Sáu hợp chất lần phân lập thử tác dụng sinh học từ thân rễ Gừng đen Trong đó, platyphyllon lần báo cáo khả ức chế enzym α-glucosidase Kết sử dụng làm tài liệu chuyên khảo việc định danh tiêu chuẩn hóa dược liệu góp phần cung cấp thơng tin cho nghiên cứu D citrea ABSTRACT Master’s Thesis in Pharmacy – Course: 2019 – 2021 ANTIOXIDANT AND α-GLUCOSIDASE INHIBITORY ACTIVITIES GUIDED ISOLATION OF PHYTOCHEMICALS FROM DISTICHOCHLAMYS CITREA RHIZOME Tran Van Chen Scientific Instructor: Dr Nguyen Thanh Triet Objectives: Distichochlamys citrea M.F Newman (Zingiberaceae) is an endemic plant to Vietnam and has been used as folk medication for treatments of infectionrelated diseases, diabetes, and spice Besides reported preceding studies on the essential oil of D citrea leaves and rhizomes, not any studies on other chemical components and the biological activities of D citrea have been publicized Therefore, this study was carried out to study the antioxidant and α-glucosidase inhibitory activities from D citrea rhizome by guided isolation of phytochemicals Methods: In this work, macro-and micromorphological features, and pharmacognostic parameters were performed according to the Vietnamese Pharmacopoeia V guidelines The DNA barcode was amplified by Internal Transcribe Spacer (ITS) primers The preliminary phytochemical study was conducted by the Ciuley method with slight modification Dried rhizomes powder was extracted with 96% ethanol by percolation and liquid-liquid method distribution to obtain the total crude extract and respective fractions Antioxidant effect was evaluated by DDPH free radical neutralization and α-glucosidase inhibitory activity was determined by using method of optical density measurement Compounds whose structures were determined by MS and NMR spectroscopy were isolated by column chromatography Results: Macromorphologically, D citrea differs from other Distichochlamys species D citrea, particularly, has elongated rhizomes, green leaves, spread inflorescences, and yellow labellum (with deep slits) Additionally, D citrea’s micromorphological structures are similar to the genus Zingiber The sequenced amplicons (96.54% similar to Genbank's D citrea ITS) demonstrated the ITS marker’s ability to identify D citrea The physicochemical parameters of rhizomes powder all meet acceptable standards The results of phytochemical screening revealed the presence of essential oil, reduced sugars, amino acids, coumarins, and flavonoids in both rhizomes and leaves Meanwhile, fats are found only in rhizomes but not in leaves Dried rhizomes powder (3.5 kg) was under leaching with 96% ethanol and liquid-liquid method distribution (the ratio is 1:15) to obtain 386 g of total crude extract and fractions were obtained: n-hexane fraction (28,17 g), CHCl3 fraction (131,32 g), EtOAc fraction (13,56 g), n-BuOH fraction (20,92 g), and aqueous fraction (126,68 g) In the trials, EtOAc extract possessed the best antioxidant (IC50 = 90,27 µg/mL) and α-glucosidase inhibitory activity (IC50 = 115,75 µg/mL) Compounds C1 (54.8 mg; 5-hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavone), C2 (505.1mg; β-sitosterol, stigmasterol), C3 (83.1 mg; platyphyllon), and C4 (12.3 mg; glycerol monostearate) were isolated from CHCl fraction, while E1 (34.1 mg; kaempferol) and E2 (14.1 mg; trans-5-O-caffeoylquinic acid) from EtOAc fraction Compound E1 has both antioxidant and α-glucosidase inhibitory effects with IC50 values of 14.08 µM, 31.86 µM, respectively, and similarly, compound C1 with IC50 of 794.71 µM, 189.40 µM, respectively However, compound C4 has a very weak effect in both of these effects Meanwhile, compound C2 (IC50 > 1204.82 µM) and compound C3 (IC50 = 69.41 µM) both inhibite the enzyme α-glucosidase and compound E2 (IC50 = 30.20 µM) only has antioxidant activity Conclusion: This study first provides information on the micromorphological characteristics, pharmacognostic parameters, phytochemicals and ITS/DNA markers of D citrea Six compounds first were isolated and tested for biological activities from D citrea rhizome Among them, platyphyllon was first reported to inhibit the enzyme α-glucosidase These results are used as monographs in the identification and standardization of medicinal herbs as well as contribute the information to carrying on further studies on this D citrea MỤC LỤC Danh mục chữ viết tắt i Danh mục bảng iii Danh mục hình iv MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ .11 1.4 Stress oxy hóa MƠ HÌNH THỬ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HĨA 12 1.5 BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG VÀ MƠ HÌNH ỨC CHẾ ENZYM Α-GLUCOSIDASE 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ 25 3.1 Khảo sát thực vật học .25 3.2 Thử tinh khiết 38 3.3 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 38 3.4 Chiết xuất cao toàn phần cao phân đoạn 39 3.5 Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa kháng α-glucosidase .40 3.6 Phân lập, tinh chế đánh giá hoạt tính chất tinh khiết .43 CHƯƠNG BÀN LUẬN 73 4.1 Đặc điểm hình thái định danh thực vật DNA 73 4.2 Các thơng số lý hóa, sơ thành phần hóa thực vật sàng lọc tác dụng chống oxy hóa kháng α-glucosidase cao phân đoạn 78 4.3 Nghiên cứu hóa học tác dụng sinh học chất phân lập 81 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 90 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh ABTS 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulphonic acid) Ace Acetone Aceton BLAST Basic Local Alignment Search Tool Cơng cụ tìm kiếm trình tự tương đồng CH2Cl2 Dichloromethane Dicloromethan CHCl3 (Cf) Chloroform Cloroform COPD Chronic Obstructive Pulmonary Disease Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính COSY Collerated Spectroscopy Phổ tương quan 1H-1H COVID-19 Coronavirus Disease 19 Bệnh corona vi rút CTPT Ý nghĩa Công thức phân tử d doublet dd doublet of doublet DĐVN Đỉnh đôi Dược điển Việt Nam DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl EtOAc Ethyl acetate EtOH Ethanol GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry Sắc ký khí-quang phổ khối GLUT Glucose Transporters Chất vận chuyển glucose HL-60 Human Leukemia Cell line Dòng tế bào ung thư bạch cầu Heteronuclear Multiple Bond Correlation High Performance Liquid Chromatography Phổ biểu diễn tương tác xa không gian phân tử HMBC HPLC Dimethyl sulfoxid Ethyl acetat Sắc ký lỏng hiệu cao HSQC Heteronuclear Single Bond Correlation Phổ biểu diễn tương quan nối proton carbon HT29 Human colon cancer cell line Dòng tế bào ung thư ruột kết HTCO Hoạt tính chống oxy hóa ii IC50 Half maximal Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm IR Infrared Phổ hồng ngoại ITS Internal Transcribe Spacer Chỉ thị ITS LC-MS Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Sắc ký lỏng-khối phổ m multiplet Nhiều đỉnh MeOH Methanol Motl-4B Human T lymphoblast MS Mass Spectrometry Phổ khối MW Molecular Weight Khối lượng phân tử n-BuOH n-Butanol NBCI National Center for Biotechnology Information Trung tâm thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân p-NPG p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside PCR Polymerase Chain Reaction PE Petroleum Ether RCC Renal-Cell Carcinoma ROS Reactive Oxygen Species s singlet Đỉnh đơn t triplet Đỉnh ba TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng TMS Tetramethylsilane Tetramethylsilan Ung thư biểu mơ thận TT Thuốc thử tt/kl Thể tích/ khối lượng UC Ức chế UV Ultraviolet Tia Tử ngoại VQG Vườn Quốc Gia VS Vanilin-Sulfuric DANH MỤC CÁC BẢNG iii Bảng 1.1 Thành phần hóa học tinh dầu D citrea Bảng 1.2 Thành phần tinh dầu D citrea vùng khác 11 Bảng 2.1 Bố trí thử nghiệm chống oxy hóa thử nghiệm DPPH 22 Bảng 3.1 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật D citrea 39 Bảng 3.2 Khối lượng, hiệu suất chiết, độ ẩm cao tổng cao phân đoạn 40 Bảng 3.3 Kết tác dụng ức chế α-glucosidase cao phân đoạn D citrea 41 Bảng 3.4 Giá trị IC50 cao phân đoạn từ thân rễ D citrea acarbose mơ hình ức chế α-glucosidase 42 Bảng 3.5 Kết phân tách phân đoạn từ cao CHCl3 sắc ký cột 44 Bảng 3.6 Kết phân tách phân đoạn từ cao Cf9 sắc ký cột 47 Bảng 3.7 Kết phân tách phân đoạn từ cao Cf7 sắc ký cột 50 Bảng 3.8 Kết phân tách phân đoạn từ cao EtOAc sắc ký cột .52 Bảng 3.9 Dữ liệu phổ NMR C1 5-Hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavon .57 Bảng 3.10 Dữ liệu phổ 13C-NMR C2 hỗn hợp β-Sitosterol, Stigmasterol 59 Bảng 3.11 Dữ liệu phổ NMR C3 Platyphyllon 61 Bảng 3.12 Dữ liệu phổ NMR C4 Glycerol monostearat 63 Bảng 3.13 Dữ liệu phổ NMR E1 Kaempferol 65 Bảng 3.14 Dữ liệu phổ NMR E2 Acid 5-O-caffeoylquinic 67 Bảng 3.15 Kết thử nghiệm chống oxy hóa giá trị IC 50 mẫu thử mơ hình DPPH 69 Bảng 3.16 Kết thử nghiệm giá trị IC50 mẫu thử mơ hình ức chế enzym α-glucosidase 70 Bảng 4.1 So sánh đặc điểm hình thái D citrea loài khác chi Distichochlamys 74 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Mơ tả thực vật loài D citrea Hình 1.2 Thân rễ D citrea Hình 1.3 Một số cấu tử nhóm monoterpen hydrocarbon tinh dầu D citrea.8 Hình 1.4 Một số dẫn xuất chứa oxy monoterpen tinh dầu D citrea Hình 1.5 Một số cấu tử nhóm sesquiterpen hydrocarbon tinh dầu D citrea Hình 1.6 Một số dẫn xuất chứa oxy sesquiterpen tinh dầu D citrea 10 Hình 1.7 Một số cấu tử khác tinh dầu D citrea .10 Hình 2.1 Quy trình chiết xuất phân lập thân rễ D citrea 21 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái D citrea 26 Hình 3.2 Mảnh biểu bì mang lỗ khí D citrea 27 Hình 3.3 Vi phẫu tổng quát cấu tạo chi tiết D citrea .28 Hình 3.4 Sơ đồ cấu tạo D citrea 28 Hình 3.5 Vi phẫu tổng quát, chi tiết sơ đồ cấu tạo cuống D citrea 29 Hình 3.6 Vi phẫu tổng quát cấu tạo chi tiết rễ D citrea .30 Hình 3.7 Sơ đồ cấu tạo rễ D citrea 30 Hình 3.8 Vi phẫu tổng quát cấu tạo chi tiết thân rễ D citrea .32 Hình 3.9 Sơ đồ cấu tạo thân rễ D citrea 32 Hình 3.10 Bột rễ thân rễ D citrea 33 Hình 3.11 Một số cấu tử bột rễ thân rễ D citrea 34 Hình 3.12 Một số cấu tử bột D citrea 35 Hình 3.13 Kết sản phẩm PCR tạo mồi ITS1 ITS4 36 Hình 3.14 Biểu đồ hình phát sinh lồi (Maximum likelihood) .37 Hình 3.15 Sơ đồ kết chiết xuất cao tổng cao phân đoạn thân rễ D citrea 40 Hình 3.16 Tác dụng ức chế α-glucosidase cao phân đoạn D citrea .42 Hình 3.17 Kết sắc ký đồ phân đoạn từ cao CHCl3 44 Hình 3.18 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết hợp chất C1 45 Hình 3.19 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết hợp chất C2 46 v Hình 3.20 Kết sắc ký đồ phân đoạn từ cao Cf9 47 Hình 3.21 Kết sắc ký đồ phân đoạn từ cao Cf9-5 48 Hình 3.22 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết hợp chất C3 49 Hình 3.23 Kết sắc ký đồ phân đoạn từ cao Cf7 51 Hình 3.24 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết hợp chất C4 51 Hình 3.25 Kết sắc ký đồ phân đoạn từ cao EtOAc 53 Hình 3.26 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết E1 .54 Hình 3.27 Kết sắc ký đồ phân đoạn từ cao EA7 55 Hình 3.28 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết hợp chất E2 55 Hình 3.29 Các tương quan phổ HMBC COSY hợp chất C1 58 Hình 3.30 Cấu trúc hợp chất C2 59 Hình 3.31 Các tương quan phổ HMBC COSY hợp chất C3 62 Hình 3.32 Các tương quan phổ HMBC COSY hợp chất C4 63 Hình 3.33 Các tương quan phổ HMBC COSY hợp chất E1 66 Hình 3.34 Các tương quan phổ HMBC COSY hợp chất E2 68 Hình 3.35 Sơ đồ tổng kết phân lập giá trị IC50 chất tinh khiết 71 Hình 3.36 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập .72 Hình 4.1 Liên quan cấu trúc-tác dụng chống oxy hóa ức chế α-glucosidase hợp chất C1 E1 84 MỞ ĐẦU Chi Gừng đen (Distichochlamys) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) chi thực vật đặc hữu Việt Nam, miêu tả lần M.F Newman vào năm 1995 Trong bốn loài thuộc chi Distichochlamys nhà khoa học phát lồi Gừng đen (D citrea) phát sớm Vườn Quốc gia Bạch Mã thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế Sau này, lồi D citrea cịn phát số tỉnh miền Trung Quảng Bình, Quảng Trị, Quảng Nam Nghệ An 2.,3.,4.,5 D citrea cho tinh dầu có mùi thơm đặc trưng, người dân PaKô dùng làm thuốc gia vị để cải thiện rối loạn bên thể đau bụng, bệnh liên quan đến viêm nhiễm, tiêu mủ, đông máu, làm lành vết thương dùng làm trà hỗ trợ bệnh nhân đái tháo đường 3.,4.,5 Ở Việt Nam có cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu từ thân rễ Gừng đen cho thấy thành phần gồm cấu tử đặc trưng 1,8-cineol, α-citral, β-citral, geraniol, geranyl acetat, terpinen-4-ol, linalool, borneol, α-terpinol 4.,5 Các chất giữ vai trị quan trọng có lợi cho sức khỏe, bao gồm tác dụng chống ung thư, chống viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn nhiều tác dụng sinh học khác 6.,7 Trong năm gần việc tìm kiếm hợp chất chống oxy hóa, tác dụng hạ đường huyết, kháng khuẩn tự nhiên không độc hại ly trích từ dược liệu thuộc họ Gừng quan tâm Nhiều nghiên cứu thực dược liệu từ họ Gừng Zingiber officinale (L.) Roscoe., Zingiber ottensii Valeton., dược liệu có vai trị chống oxy hóa hạ đường huyết 8.,9.,10 Các kết mang đến phát triển cho chất chống oxy hóa tự nhiên để sử dụng thực phẩm, mỹ phẩm thuốc điều trị ứng dụng khác Mặc dù chi Gừng đen (Distichochlamys) nhiều nhà nghiên cứu quan tâm, nhiên chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu cơng bố thành phần hóa học khác ngồi tinh dầu, chưa có công bố tác dụng sinh học D citrea Việt Nam giới Nếu quan tâm đầu tư nghiên cứu chắn Gừng đen trở thành chủ đề thú vị hữu ích việc tìm kiếm tác nhân chống oxy hóa, hạ đường huyết tác dụng sinh học khác từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên, từ Gừng đen trở thành dược liệu có ích cơng phòng chữa bệnh cho người dân Để làm sáng tỏ tác dụng điều trị bệnh thuốc quý, đề tài tiến hành “Nghiên cứu thành phần hóa học theo hướng tác dụng chống oxy hóa kháng α-glucosidase thân rễ Gừng đen (Distichochlamys citrea M.F Newman., Zingiberaceae)” với mục đích: - Khảo sát đặc điểm hình thái vi học lồi D citrea - Phân lập thành phần hóa học từ thân rễ loài D citrea theo định hướng tác dụng chống oxy hóa kháng α-glucosidase - Xác định cấu trúc đánh giá tác dụng sinh học chất phân lập mơ hình thử nghiệm cho sàng lọc tác dụng cao ban đầu Từ đó, cung cấp thơng tin khách quan bước đầu làm tiền đề khoa học cho thử nghiệm, nghiên cứu, kiểm nghiệm, tìm kiếm tác dụng chữa bệnh định hướng khai thác, sử dụng, bảo tồn loài D citrea sau CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan thực vật học 1.1.1 Chi Distichochlamys Họ Gừng (Zingiberaceae) phân bố vùng nhiệt đới cận nhiệt đới, chủ yếu Đông Nam Á Ở Việt Nam có khoảng 21 chi với 141 loài, phần lớn mọc hoang, số trồng làm thuốc, hương liệu gia vị 2.,11 Chi Gừng đen (Distichochlamys) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), thân thảo, sống lâu năm Cụm hoa mọc phát hoa, bắc nguyên phát, bắc hình ống Hoa bị cạp mở Cánh mơi có thùy phẳng Bao phấn khơng có gai đáy Cho đến nay, có bốn lồi đặc hữu ghi nhận Việt Nam D citrea M.F Newman M.F Newman phát Vườn quốc gia Bạch Mã (Thừa Thiên Huế) mô tả khoa học năm 1995 Đây lồi điển hình chi này, màu xanh hoa màu vàng, có điểm vệt đỏ gốc D orlowii K Larsen & M.F Newman hay gọi Gừng đen Orlow hay Gừng đen tím, K Larsen M.F Newman tìm thấy mơ tả khoa học năm 2001. Phân bố khu vực hẹp làng thuộc huyện An Khê, tỉnh Gia Lai 12 D rubrostriata W.J Kress & Rehse hay cịn gọi Gừng đen khía đỏ, John Kress (Viện Smithsonian) Tania Rehse (Đại học Duke) mô tả khoa học năm 2003 Phân bố chủ yếu khu vực Cúc Phương, Việt Nam 13 D benenica Q.B Nguyen & Škorničk nhà khoa học Nguyễn Quốc Bình (Việt Nam) Jana Leong-Škorničková (Singapore) tìm thấy Vườn quốc gia Bến En, Thanh Hóa vào tháng năm 2011 14 1.1.2 Loài D citrea M.F Newman Tên khoa học: D citrea M.F Newman Tên Việt Nam: Gừng đen 1.,2 1.1.3 Vị trí phân loại bảng hệ thống thực vật Vị trí lồi D citrea M.F Newman xếp theo hệ thống phân loại Takhtajan A sau 15.: Ngành Ngọc Lan (Magnoliophita) Lớp Hành (Liliopsida) Bộ Gừng (Zingiberales) Họ Gừng (Zingiberaeae) Chi Distichochlamys Loài D citrea M.F Newman 1.1.4 Mơ tả thực vật lồi D citrea Cây thảo nhỏ cao đến 35 cm, thân rễ dài cm Lá dài tới 42 cm, cuống dài 20 cm, cứng, rãnh sâu bề mặt sợi đồng trục, mặt song song với thân rễ Phiến dài 17–22 cm, rộng 8,3–10,7 cm, hình elip rộng, gân rõ rệt, hình chóp buồm trịn, đầu khơng, đỉnh ngắn, nhẵn bóng trên, có lơng mượt bóng bên Các chồi gần tạo cụm dày gồm 1–3 lá, bẹ phía có kích thước 10 x 2,5 cm đến mùa hoa khô lại thành lớp mỏng Lưỡi nhỏ, dài mm, khô tiêu biến theo mùa hoa Các bắc xếp thành hai hàng dọc hai bên đối diện cuống, kích thước 23–25 x 12 mm, bao phủ sợi lơng mềm mượt bên ngồi, bên nhẵn bóng, màu đỏ hồng Lá bắc hình ống, màu hồng, dài 21–23 mm, có đường nứt nửa chiều dài chúng Lá bắc có gân dọc thùy, phủ đầy lông mịn mượt; bắc khác khơng có gân dọc, thùy có lơng chủ yếu đầu Cụm hoa mọc cuống hoa dài 1,5–2,5 cm, tổng chiều cao tới 9,5 cm, thường mọc ba hoa đến trưởng thành hai hoa khơng phát triển Đài hoa hình ống, dài 9,0 mm, có lơng thưa, hai đầu có thùy, tách đối diện thùy, màu trắng Tràng hoa hình ống dài 30 mm, màu trắng gốc đến màu vàng nhạt; tràng hoa thùy hình elip, kích thước 14–16 x 4–5 mm, mặt bên lớn chút so với mặt lưng, cuộn lại hoa Mặt bên hình elip, 19–20 x 5,0 mm, có lơng phía bên trong, màu vàng sáng Cánh mơi hình tam giác, 22 x 22 mm, có khe hở Chỉ nhị dài 2,5–3,0 mm, màu vàng nhạt Bao phấn dài mm, ô Bầu nhụy dài mm, lông dày, bầu ô với kiểu đính nỗn trung trụ Đầu nhụy hình cốc dẹt, màu trắng Nhiễm sắc thể 2n = 26 Hình 1.1 Mơ tả thực vật lồi D citrea 1.,16 Cây trưởng thành hoa; A Chồi hoa; B Đỉnh lá; C Lá bắc; D Lá bắc con; E Đài hoa; G Phần hoa cắt dọc mặt bên (Tràng hoa thùy bên, Bao phấn); F Phần hoa cắt dọc (Cánh môi, Tràng hoa thùy trước); H Bao phấn; I Đính nỗn trung trụ 1.1.5 Khóa phân loại lồi thuộc chi Distichochlamys 13.,14 1A Cụm hoa có bắc xịe rộng, xếp thành xim; cánh mơi có khe hở sâu đến nửa chiều dài nó……………………… …… … D citrea 1B Cụm hoa có bắc mọc trục hoa, dày đặc; cánh môi bị chia cắt với khe hở kéo dài nửa chiều dài nó.……… ……… 2A Các nhị bên màu vàng với hai mảng dài tuyến tính màu đỏ gốc .D rubrostriata 2B Các nhị bên màu vàng.………… .……… …………….… 3A Cánh môi với mảng đỏ gốc hai thùy tròn đỉnh……………………………………… .……….D benenica 3B Cánh môi màu vàng với sọc tím, dải màu vàng đậm hai thùy hình lông chim…………………….… .D orlowii 1.1.6 Sinh học, sinh thái phân bố Sinh học sinh thái: Mùa hoa tháng 7–8; thường gặp rừng thứ sinh, rừng nguyên sinh, trảng bụi 1.,2 Phân bố: Gừng đen lồi đặc hữu có tỉnh miền Trung Việt Nam Quảng Bình, Quảng Trị, Quảng Nam, Nghệ An (Vườn quốc gia Pù Mát), Thừa Thiên – Huế (Vườn Quốc gia Bạch Mã) 2.,3.,4 1.1.7 Bộ phận dùng Bộ phần dùng Gừng đen chủ yếu thân rễ Thân rễ nhỏ hình trụ, màu vàng nhạt, có mùi thơm độc đáo vị cay nhẹ Hình 1.2 Thân rễ D citrea 1.2 Tổng quan thành phần hóa học Thành phần hóa học lồi D citrea nghiên cứu báo cáo tinh dầu hợp chất bay Tinh dầu thu dạng lỏng, không màu, nhẹ nước có mùi thơm đặc trưng Hàm lượng tinh dầu từ 0,25–0,60% (tt/kl) Cho đến có khoảng 43 cấu tử có tinh dầu Gừng đen xác định, số lượng hàm lượng cấu tử tinh dầu khác tùy theo vùng phân bố Các cấu tử phân loại thành nhóm: Các hợp chất béo, monoterpen hydrocarbon, dẫn xuất chứa oxy monoterpen (nhóm chất có mẫu tinh dầu), sesquiterpen hydrocarbon dẫn xuất chứa oxy sesquiterpen Trong đó, 1,8-cineol (43,67%, Quảng Bình), β-citral, α-citral, neryl acetat cấu tử đặc trưng tinh dầu thân rễ Gừng đen, ngồi cịn có cấu tử có hàm lượng cao như: α-pinen, β-pinen, β-linalool, D-limonen, α-terpineol, cis-geraniol 2.,3.,4.,5 Ngoài ra, năm 2022, phân tích GC-MS, hợp chất từ cao chiết nhexan thân rễ Gừng đen (VQG Bạch mã) Van Hue cộng báo cáo gồm có 21 hợp chất (geranyl acetat, 6-methyl-4,6-bis(4-methylpent-3-en-1yl)cyclohexa-1,3-diencarbaldehyd, geraniol, ethyl palmitat, neryl palmitat, endoborneol, ethyl linoleat, β-selinen, ethyl oleat, acid hexadecanoic, ethyl stearat, acid α-linoleic, (L)-α-terpineol, aristolochen, α-himachalen, ambrial, acid geranic, maaliol, m-camphoren, neointermdedeol capryophyllen oxid) 17 Bảng 1.1 Thành phần hóa học tinh dầu D citrea Nhóm chất hợp Cấu tử tinh dầu α-thujen; α-phellandren; α-pinen; camphen; sabinen; β-pinen; β-myrcen; 1,3,5-trimethylenecycloheptan; 2-caren; terpinolen; p-cymen; m-cymen; Dlimonen; β-trans-ocimen; β-cis-ocimen; β-terpinen; γ-terpinen 1,8-cineol; β-linalool; 1,3,3-trimethylbicyclo[2.2.1]heptan-2-ol; 5-isopropylDẫn xuất chứa 2-methylbicyclo[3.1.0]hexan-2-ol; trans-pinocarveol; isopulegol; (S)-cisoxy verbenol; borneol; terpinen-4-ol; α-terpineol; (1R)-myrtenal; fenchyl acetat; monoterpen verbenon; β-citral; cis-geraniol; α-citral; bornyl acetat; neryl acetat,… β-elemen; trans-α-bergamoten; β-caryophyllen; α-caryophyllen; thujopsenSesquiterpen (I2); β-chamigren; eremophilen; alloaromadendren; β-bisabolen; βhydrocarbon sesquiphellandren; β-eudesmen; patchoulen,… Dẫn xuất chứa oxy caryophyllen oxid; viridiflorol; guaiol; α-cedrol; lepidozen sesquiterpen 3-butenylhexyl ether; 3-ethyl-3-methylhexan; 2,2-dimethyl hexanol; Hợp chất khác butyloxiran; 1,5-dimethyl-7-oxabicyclo [4.1.0] heptan; 6-methyl-5-hepten-2(Aliphatic on; 1-methylheptyl acetat; 6-(2-furyl)-6-methyl-2-heptanon; 3-methylen-1compound) cyclohepten; 6-methyl-5-hepten-1-yn Monoterpen hydrocarbon 1.2.1 Monoterpen hydrocarbon α-phellandren -terpinen Sabinen α-pinen Camphen 2-caren α-thujen 1,3,5-trimethylencycloheptan Hình 1.3 Một số cấu tử nhóm monoterpen hydrocarbon tinh dầu D citrea 1.2.2 Dẫn xuất chứa oxy monoterpen Isopulegol α-terpineol β-linalool 1,8-cineol 5-isopropyl-2- 1,3,3trans-pinocarveol trimethylbicyclo- (1R)-myrtenal [2.2.1]heptan-2-ol methylbicyclo[3.1.0]hexan2-ol Hình 1.4 Một số cấu tử chứa oxy monoterpen tinh dầu D citrea 1.2.3 Sesquiterpen hydrocarbon β-elemen Thujopsen-(I2) trans-α-bergamoten β-caryophyllen β-chamigren Alloaromadendren Hình 1.5 Một số cấu tử nhóm sesquiterpen hydrocarbon tinh dầu D citrea 10 1.2.4 Dẫn xuất chứa oxy sesquiterpen Caryophyllen oxid Viridiflorol Guaiol Hình 1.6 Một số cấu tử chứa oxy sesquiterpen tinh dầu D citrea 1.2.5 Các hợp chất khác 3-butenylhexyl ether 1,5-dimethyl-7-oxabicyclo [4.1.0] heptan 6-methyl-5-hepten-1-yn 3-ethyl-3-methylhexan Butyloxiran 6-(2-furyl)-6-methyl-2heptanon Hình 1.7 Một số cấu tử khác tinh dầu D citrea Các nghiên cứu trước cho thấy có khác thành phần hàm lượng tinh dầu thân rễ Gừng đen tùy vào vùng phân bố (bảng 1.2) Bảng 1.2 Thành phần tinh dầu D citrea vùng khác Hàm lượng (%) tinh dầu 11 Thành phần tinh dầu 1,8-Cineol α-Pinen β-Pinen Camphen β-Linalool α-Terpineol Terpinen-4-ol D-Limonen Cis-Geraniol (Nerol) β-Citral (Geranial) α-Citral (Neral) Neryl acetat Quảng Bình (QB) 43,67 4,47 2,79 2,79 14,79 2,27 1,00 3,28 0,58 1,63 2,47 10,81 Nhóm chất Monoterpen 17,14 hydrocarbon Hợp chất chứa oxy 80,29 monoterpen Sesquiterpen 2,06 hydrocarbon Hợp chất chứa oxy sesquiterpen Hợp chất khác 0,27 Tổng lượng tinh dầu 99,76 Quảng Trị (QT) 31,78 1,81 2,69 0,97 1,78 2,12 2,01 1,18 8,89 13,98 18,38 11,11 Quảng Nam (QN) 30,71 3,82 7,03 1,70 1,51 1,53 1,82 2,36 4,01 13,49 19,13 4,14 Thừa Thiên Huế (TTH) 30,34 2,02 3,21 1,57 1,50 1,36 2,22 1,48 7,61 11,05 20,88 9,90 Nghệ An (NA) 23 1,4 1,9 1,10 1,20 4,60 4,10 0,30 15,00 18,90 - 8,35 18,91 11,60 4,4 90,73 79,47 86,59 79,40 0,00 1,03 1,61 2,3 - - - 5,8 0,92 0,56 0,20 1,90 100,00 99,97 100,00 93,80 1.3 Tác dụng dược lý Trong nghiên cứu trước Chi Distichochlamys, nhà khoa học có báo cáo tác dụng ức chế acetylcholinesterase tinh dầu thân rễ D benenica 18 19 hoạt động chống viêm, kháng khuẩn hợp chất phân lập từ D benenica , tác dụng kháng khuẩn từ cao chiết thân rễ D citrea 17 chưa có thêm nghiên cứu tác dụng thành phần hóa học khác D citrea Việt Nam giới Tuy nhiên, cấu tử chính: 1,8-Cineol (23– 43,67%), β-citral (1,6–13,98%), α-citral (2,47–20,88%) neryl acetat (4,14– 11,11%) xác định tinh dầu thể số tác dụng dược lý tiềm nghiên cứu báo cáo trước đây, chẳng hạn 1,8-cineol có hoạt tính 12 chống viêm cách ức chế cytokin để giảm tình trạng trầm trọng hen suyễn, viêm xoang và COPD 20.,21 Hơn nữa, 1,8-cineol chứng minh có tác dụng ức chế hai dịng tế bào ung thư bạch cầu (Molt 4B HL-60) theo chế kích hoạt q trình apoptosis tế bào ung thư bạch cầu người 22 Ngoài ra, β-elemen chứng minh có hiệu chống lại khối u khác ung thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt u nguyên bào thần kinh đệm, ung thư biểu mô tế bào thận (RCC, 786-0) 23.,24.,25 1.4 Stress oxy hóa mơ hình thử tác dụng chống oxy hóa 1.4.1 Stress oxy hóa Q trình oxy hóa q trình bình thường thường xun thể Tuy nhiên, việc tăng sản xuất dạng oxy hoạt động (ROS) gốc superoxid (O2•–), hydroxyl (•OH), peroxyl (RO2•) alkoxyl (RO•)) loại nitơ phản ứng (RNS) 26.,27 rõ ràng dẫn đến trình stress oxy hóa, phá vỡ cân hoạt động gốc tự hệ thống chống oxy hóa tế bào mơ thể Các tác nhân oxy hóa protein, lipid acid nucleic để tạo sản phẩm phụ độc hại, dẫn đến tổn thương tế bào, bao gồm thay đổi cấu trúc màng, tổn thương bào quan, tổn thương DNA rối loạn chức tế bào 27.,28 Theo thời gian, stress oxy hóa chắn gây nhiều bệnh nghiêm trọng bệnh đái tháo đường, viêm mãn tính, tăng huyết áp, rối loạn lipid máu xơ vữa động mạch 29 Các hợp chất chống oxy hóa có tác dụng làm gốc tự ức chế chế oxy hóa dẫn đến bệnh thối hóa 26 Khử gốc tự tiến hành thông qua hai chế: SET HAT 30 Cơ chế chuyển electron đơn độc (SET – Single Electron Transfer): Phát khả chống oxy hóa chất cách chuyển electron để khử hợp chất kim loại, nhóm carbonyl gốc tự Các thử nghiệm theo chế SET TEAC (Trolox Equivalence Antioxidant Capacity), FRAP (Ferric Ion Reducing Antioxidant Power), thử nghiệm khả chống oxy hóa cách sử dụng Cu2+-complex làm chất oxy hóa, DDPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl), CUPRAC (Cupric ions (Cu2+) Reducing Antioxidant Power), ABTS (2,2'-azino-bis- 13 (3-ethylbenzothiazolin-6-sulphonic acid)), DMPD (N,N-Dimethyl-p- phenylenediamin) 30 Cơ chế chuyển nguyên tử hydro (HAT – Hydrogen Atom Transfer): Các chất chống oxy hóa loại bỏ gốc tự cách chuyển nguyên tử hydro Cơ chế bao gồm thử nghiệm khả hấp thụ gốc oxy (ORAC - Oxygen Radical Absorbance Capacity), thử nghiệm màu β-caroten, TRAP (Total Radical Trapping Antioxidant Parameter) 30 1.4.2 Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa mơ hình DPPH Thử nghiệm dựa phản ứng chất chống oxy hóa với gốc tự DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) làm DPPH bị khử màu tím đậm chuyển sang vàng nhạt Các mẫu giữ nhiệt độ phịng bóng tối sau khoảng thời gian quy định tiến hành đo quang bước sóng hấp thu 517 nm Mức độ chống oxy hóa chất thử tăng mức độ hấp thu 517 nm giảm 10.,31 Ưu điểm: thử nghiệm đơn giản không yêu cầu đặc biệt xử lý mẫu, sử dụng phổ biến Độ xác cao, chi phí thấp Tiến hành nhanh chóng Thích hợp nhiều tác nhân chống oxy hóa Nhược điểm: dùng dung môi hữu (chủ yếu alcol) Nhạy cảm với ánh sáng oxy khơng khí Khơng sử dụng phương pháp DPPH để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa huyết tương protein bị tủa alcol Các hợp chất có đỉnh hấp thu cực đại 517 nm (như carotenoid) gây trùng lặp phổ 1.4.3 Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa ABTS Hoạt động loại bỏ gốc tự xác định phương pháp khử màu ABTS•+ Cation ABTS•+ gốc tự bền, màu xanh, đặc trưng độ hấp thu 734 nm Khi cho chất chống oxy hóa vào dung dịch chứa ABTS •+, chất chống oxy hóa khử ion ABTS•+ thành ABTS (2,2'-azino-bis-(3- ethylbenzothiazolin-6-sulfonat) Các mẫu giữ nhiệt độ phịng bóng tối sau khoảng thời gian quy định tiến hành đo quang bước sóng hấp thu 734 nm Sự giảm độ hấp thu dung dịch ABTS •+ bước sóng 734 nm hiệu suất kháng oxy hóa mẫu thử Mức độ làm giảm cường độ hấp thu 734 nm nói 14 lên khả chống oxy hóa mẫu thử Hoạt động chống oxy hóa đánh giá giá trị IC50 (mg/ mL) 30.,31 Ưu điểm: Phản ứng nhanh với chất chống oxy hóa mẫu thử (30 phút) Được sử dụng phạm vi pH rộng sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng pH chế chống oxy hóa. Hịa tan dung mơi nước dung môi hữu không bị ảnh hưởng cường độ ion Nhược điểm: Cần có máy đo quang bước sóng 734 nm Nếu thực thời gian ngắn (khoảng phút) làm giảm kết định lượng phản ứng xảy chưa hồn tồn 1.5 Bệnh đái tháo đường mơ hình ức chế enzym α-glucosidase 1.5.1 Bệnh đái tháo đường Đái tháo đường bệnh mãn tính rối loạn chuyển hóa nội tiết thể với biểu lượng glucose máu tăng cao bất thường 32 Trong ấn lần thứ 10, Liên đoàn Đái tháo đường Quốc tế (International Diabetes Federation – IDF) báo cáo tỷ lệ ước tính bệnh đái tháo đường tồn cầu nhóm tuổi 20–79 10,5% (536,6 triệu) vào năm 2021 số dự kiến đạt 12,2% (783,2 triệu) vào năm 2045 Cũng báo cáo này, IDF ước tính tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường dự kiến tăng nhiều nước thu nhập trung bình (21,1%) so với nước thu nhập cao (12,2%) thấp (11,9%) Chi tiêu cho y tế liên quan đến bệnh đái tháo đường tồn cầu ước tính khoảng $966 tỷ vào năm 2021 số dự báo đạt $1,054 tỷ vào năm 2045 33 Đái tháo đường phân thành hai loại phổ biến nhất: đái tháo đường loại (đặc trưng phá hủy tế bào β tuyến tụy) đái tháo đường loại (đặc trưng kết hợp giảm tiết insulin kháng insulin ngoại vi) Đái tháo đường bất thường di truyền, rối loạn bệnh lý khác, tình trạng lâm sàng đái tháo đường thai kỳ 34 Trong số bệnh nhân đái tháo đường, đái tháo đường loại loại đái tháo đường phổ biến nhất, chiếm 90–95% 35 Bệnh nhân đái tháo đường loại dễ mắc biến chứng khác bệnh tim mạch (tăng huyết áp, tăng lipid máu, đau tim, bệnh mạch vành, đột quỵ, bệnh mạch máu não bệnh 15 mạch máu ngoại vi), bệnh thận, bệnh võng mạc, bệnh thần kinh ung thư 36.,37 Stress oxy hóa yếu tố rõ ràng liên quan đến bệnh chuyển hóa tiến triển bệnh đái tháo đường, phù hợp với gia tăng tần suất biến chứng đái tháo đường thứ phát 38.,39 Do đó, liệu pháp chống oxy hóa thường khuyến khích cách tiếp cận hiệu để ngăn ngừa biến chứng bệnh đái tháo đường bệnh liên quan Ngoài ra, ngày có nhiều chứng chắn mối liên quan bệnh đái tháo đường biến chứng nặng COVID-19 gây 40 Tuy nhiên, thông số đường huyết thay đổi theo chiều hướng xấu bệnh nhân đái tháo đường loại thời gian ngừng điều trị 41 Ngoài ra, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường ngày tăng dân số già 33., béo phì lối sống khơng lành mạnh vận động, hút thuốc uống rượu36 Enzym α-amylase enzym có vai trị quan trọng việc phá vỡ liên kết α-1,4-glucan bên tinh bột polysaccharid liên quan, chẳng hạn amylose amylopectin Enzym α-glucosidase loại enzym thiết yếu q trình tiêu hóa, kích thích phân hủy disaccharid oligosaccharid thành carbohydrat nhỏ, đơn giản dễ hấp thụ 42 α-Glucosidase thuộc nhóm enzym xúc tác giải phóng α-glucose từ điểm không bị khử α-glucosid từ polymer phức tạp có liên kết α-1,4 Các enzym tìm thấy rộng rãi loại sinh vật khác vi khuẩn, nấm, thực vật động vật Chúng phân loại thành hai ba nhóm tùy thuộc vào cấu trúc đặc tính chất chúng 43 Dựa giống trình tự gen, enzym chủ yếu chia thành hai họ: GH-13 GH-31 Các Saccharomyces cerevisiae α-glucosidase α-amylase thuộc họ GH-13 đặc trưng cho vi khuẩn côn trùng 44.,45 Thuốc ức chế α-glucosidase (AGIs) nhóm thuốc trị đái tháo đường sử dụng để kiểm sốt bệnh đái tháo đường loại 2, ví dụ acarbose, voglibose miglitol AGIs ức chế enzym α-glucosidase biểu mơ ruột, làm chậm q trình hấp thụ carbohydrat từ ruột non, đặc biệt hữu ích để làm giảm lượng đường huyết sau ăn 46 Acarbose loại thuốc sử dụng phổ biến nhóm Nó chứng minh có tác dụng ổn định đường huyết, tăng tuổi 16 thọ giảm nguy phát triển bệnh tim mạch bệnh nhân đái tháo đường loại nhờ khả chống lại stress oxy hóa rối loạn chức nội mô 47 So với loại thuốc tổng hợp, việc sử dụng thảo dược để điều trị bệnh đái tháo đường đánh giá có giá trị kinh tế cao tác dụng phụ Hiện nay, nhiều nhóm thuốc sử dụng để điều trị bệnh đái tháo đường loại biguanide, sulphonylurea, thiazolidinedione, chất ức chế DPP-4 (dipeptidyl peptidase-4), chất ức chế SGLT2 (sodium-glucose cotransporter 2), GLP-1 RAs (glucagon-like peptide receptor agonists) Meglitinides (glinides) 34 Gần đây, loại thuốc tân dược thường đóng vai trị kiểm soát đường huyết Do phải điều trị theo phác đồ thời gian dài nên loại thuốc đắt tiền kèm theo nhiều tác dụng phụ có hại cho người bệnh Chẳng hạn chất ức chế SGLT2 gây nhiễm trùng tiết niệu-sinh dục nhiễm toan ceton 48 , GLP-1 RAs gây buồn nôn, nôn, tiêu chảy 49.,50., phản ứng chỗ tiêm viêm tụy 49 Trong kinh nghiệm dân gian, nhiều loại thảo dược sử dụng từ lâu đời chúng có tác dụng tốt việc cải thiện triệu chứng bệnh đái tháo đường, giá phù hợp với kinh tế người bệnh tác dụng phụ so với loại thuốc tổng hợp hóa dược 51 Dựa nghiên cứu trước đây, hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc thực vật hợp chất phenolic, phytosterol, alkaloid, terpenoid, flavonoid glycosid cho thấy có tác dụng chống dị ứng, chống ung thư, kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa chống đái tháo đường52 Ngồi ra, hợp chất góp phần cải thiện độ nhạy insulin cách cản trở q trình stress oxy hóa Việc ức chế α-glucosidase α-amylase làm giảm đáng kể gia tăng đường huyết sau ăn, làm giảm nhu cầu insulin đóng vai trị quan trọng việc kiểm soát mức đường huyết bệnh nhân đái tháo đường 53 1.5.2 Phương pháp khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase 17 Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase xác định dựa phương pháp đo quang Enzym α-glucosidase xúc tác trình thủy phân chất saccarose p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid Do đó, để khảo sát hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase, p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (p-NPG) sử dụng chất enzym α-glucosidase chuyển hóa chất thành α-D-glucose pnitrophenol Theo phản ứng, lượng α-D-glucose sinh tỉ lệ với p-nitrophenyl-α-Dglucopyranosid bị thủy phân lượng p-nitrophenol tạo thành Vì dựa vào độ hấp thu p-nitrophenolat bước sóng 405 nm đánh giá % ức chế enzym α-glucosidase Khi mẫu thử có hoạt chất ức chế enzym α-glucosidase hàm lượng p-nitrophenol tạo thành giảm So sánh cường độ màu dung dịch có khơng có hoạt chất ức chế, xác định khả ức chế enzym αglucosidase hoạt chất 54 1.5.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-amylase Hoạt tính ức chế enzym α-amylase dựa phương pháp đo quang Enzym αamylase xúc tác trình thủy phân polysaccharid có liên kết alpha tinh bột thành đường khử Do đó, để khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-amylase, tinh bột sử dụng chất enzym α-amylase chuyển hóa chất thành đường khử Các đường khử phản ứng tạo màu với acid 3,5-dinitrosalicylic, lượng đường khử sinh tỉ lệ với cường độ màu dung dịch đo bước sóng 540 nm Khi mẫu thử có hoạt chất ức chế enzym α-amylase hàm lượng đường khử tạo giảm So sánh cường độ màu dung dịch có khơng có hoạt chất ức chế, xác định khả ức chế enzym α-amylase hoạt chất 55 18 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu nguyên liệu Gừng đen (D citrea) thu hái vào tháng 10 năm 2019 tháng 12 năm 2020 Vườn Quốc gia Bạch Mã, tỉnh Thừa Thiên Huế Mẫu định danh PGS.TS Trương Thị Bích Phượng (Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế) Tiêu mẫu dược liệu DC-10.19 lưu trữ phịng thí nghiệm Y Dược cổ truyền-Khoa Y học cổ truyền-Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Dược liệu sau thu hái hai đợt được xử lý loại bỏ đất cát, rửa và phơi khơ bóng râm nhiệt độ thường, tránh ánh nắng mặt trời 5–7 ngày, sau mẫu được xay nhỏ thành dạng bột thô với khối lượng đợt 1,3 kg dùng cho thí nghiệm thử độ tinh khiết, sàng lọc sơ hóa thực vật, sàng lọc tác dụng sinh học đợt 2,8 kg tiến hành theo điều kiện khảo sát thực cho phần phân lập Ngoài ra, số tươi lưu trữ bảo quản túi nhựa kín nhiệt độ 0C để dùng cho tách chiết DNA 2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị Các trang thiết bị, dụng cụ: - Bình ngấm kiệt - Kính hiển vi quang học Humascop (Đức) - Cân xác định độ ẩm Mettler Toledo HB-43 Lò nung Nabertherm B180 (Đức) Đèn UV 254/365 nm Vilber Lourmat LC-15 - Tủ sấy quạt gió đối lưu Contherm 8100 (Newzealand) - Bể cách thủy không lắc UF-1340012 (Anh) - Máy cô quay chân không Buchi Switzerland CH 9230-F 105 - Cân phân tích Sartorius CP-224S Cân kỹ thuật Kitchen scale - Tủ lạnh LG GR-242 MVF Bếp điện từ Sanaky SNK-2103 HGN 19 - Máy LC-MS (hệ thống Waters Alliance 2695 XE) Máy BRUCKERADVANCE 600 MHz - Bình sắc ký, cột sắc ký thủy tinh dụng cụ phịng thí nghiệm Dung mơi, hóa chất: - Silica gel cỡ hạt trung bình (37–63 μm) (Ấn Độ) Silica gel 60 cỡ hạt mịn 40–63 μm (Merck, Đức), Sephadex LH-20 (BioBomei, Trung Quốc) - Sắc ký lớp mỏng pha thuận dùng silica gel GF254 (Merck) - Ethanol (OPC); aceton, n-hexan, n-butanol, ethyl acetat, dicloromethan (Chemsol, Việt Nam); petroleum ether (60~90) (Xilong, Trung Quốc); methanol, dimethylsulfoxide (DMSO) (Merck, Đức); p-nitrophenyl-α-Dglucopyranosid (p-NPG), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), α- glucosidase từ Saccharomyces cerevisiae (Sigma, USA); acid ascorbic (A5960, A0278, Sigma, Singapore); acarbose (Chemcruz, USA), acarbose (A8980, Sigma, Trung Quốc) - Các dung môi hóa chất, thuốc thử dùng phân tích hóa học, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột đạt chuẩn phân tích 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát thực vật học Khảo sát hình thái: Sử dụng phương pháp hình thái so sánh để định tên khoa học Thu hái các bộ phận của mẫu, mô tả phân tích bằng mắt thường, sử dụng kính lúp, kính hiển vi, đối chiếu mẫu với khóa phân loại và với hình ảnh cũng mô tả các tài liệu tham khảo để xác định tên loài (PL-12.18, DĐVN V) 56 Định danh thực vật phương pháp phân tích DNA (Quy trình kết chi tiết giải trình tự DNA trình bày cụ thể phụ lục 1) Khảo sát đặc điểm vi học: Phương pháp giải phẫu mô tả cấu trúc giải phẫu phương pháp nhuộm kép son phèn, lục iod Quan sát đặc điểm bột dược liệu quan sát cảm quan mơ tả kính hiển vi (PL-12.18, DĐVN V) 56 20 2.2.2 Thử tinh khiết Xác định tiêu độ ẩm, tro hàm lượng chất chiết dược liệu dựa vào Dược điển Việt Nam V xác định sau: 56 Xác định độ ẩm dược liệu dựa theo phương pháp “Xác định hàm lượng nước phương pháp cất với dung môi” theo phụ lục 12.13–DĐVN V (trang PL-279) Xác định tro tồn phần (phụ lục 9.8) tro khơng tan acid hydroclorid (phụ lục 9.7) theo DĐVN V (trang PL-203 PL-204) Xác định chất chiết dược liệu tiến hành theo phương pháp chiết lạnh theo phụ lục 12.10–DĐVN V (trang PL-278 PL-279) với dung môi chiết cồn 96% Kết tiêu lấy giá trị trung bình lần thử độc lập, ổn định 2.2.3 Khảo sát sơ thành phần hóa thực vật lồi D citrea Bằng dụng cụ thường quy phản ứng định tính đơn giản để sơ xác định có mặt nhóm hợp chất có dược liệu phân đoạn có độ phân cực tăng dần (ether ethylic, ethanol, nước) bằng phương pháp của Ciuley 57 2.2.4 Chiết xuất Dược liệu chiết xuất phương pháp ngấm kiệt với cồn 96% Dịch chiết cồn thu sau đến đậm đặc phân tán vào nước để tiến hành chiết phân bố lỏng-lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần: nhexan, CHCl3, EtOAc, n-BuOH cô thu hồi áp suất giảm để thu phân đoạn tương ứng 58 Bằng phương pháp chiết tách hỗn hợp nhiều chất cao chiết thành phân đoạn có độ phân cực khác Độ ẩm cao chiết xác định cân đo độ ẩm Mettler Toledo HB-43 Việc chiết xuất phân lập chất tinh khiết tiến hành định hướng tác dụng sinh học Quy trình chiết xuất phân lập trình bày hình 2.1 21 Hình 2.1 Quy trình chiết xuất phân lập thân rễ D citrea 2.2.5 Sàng lọc sinh học 2.2.5.1 Xác định tác dụng chống oxy hóa cao phân đoạn thông qua khả trung hịa gốc tự DPPH Khả chống oxy hóa cao chiết xác định theo mô tả Mošovskáa cộng (2015) có hiệu chỉnh 31 Hoạt tính chống oxy hóa đối tượng nghiên cứu xác định cách cho tác dụng với DPPH, sau đánh giá khả chống oxy hóa dựa đo quang bước sóng 517 nm Hiệu quét gốc tự đánh giá thông qua thay đổi màu sắc từ tím sang vàng Phương pháp thực Cuvet Chuẩn bị: Pha thuốc thử DPPH nồng độ 0,6 mM MeOH (pha xong dùng ngay, bảo quản lọ thủy tinh màu) Các mẫu thử pha MeOH với dãy nồng độ khảo sát Acid ascorbic sử dụng làm chứng dương Thiết kế thí nghiệm: Mẫu trắng, mẫu chứng mẫu thử chuẩn bị theo bảng 2.1 22 Bảng 2.1 Bố trí thử nghiệm chống oxy hóa phương pháp DPPH Cuvet Mẫu trắng Mẫu chứng Mẫu thử MeOH (mL) 4,0 3,5 0,5 DPPH 0,6 mM (mL) - 0,5 3,0 Dung dịch thử (mL) - - 0,5 Tiến hành: Cho vào cuvet dung dịch thử, dung dịch chuẩn (chứng), MeOH, DPPH Ủ tối nhiệt độ phòng, 30 phút Xác định độ hấp thu dung dịch sau phản ứng bước sóng 517 nm Đánh giá kết quả: Hoạt tính chống oxy hóa xác định theo cơng thức % Ức chế DPPH = [(Abschứng - Absthử)/Abschứng] x 100% Trong đó: Abschứng độ hấp thu cuvet không chứa chất thử Abs thử độ hấp thu cuvet chứa chất thử đo bước sóng 517 nm Cách xác định IC50 (µg/mL): IC50 nồng độ mà chất thử trung hịa 50% gốc tự DPPH Pha giai mẫu có nồng độ khác Sử dụng phần mềm Microsoft excel 2016 để vẽ biểu đồ phụ thuộc % ức chế DPPH nồng độ chất khảo sát Từ đồ thị nội suy giá trị nồng độ trung hòa 50% gốc tự DPPH (IC50) từ phương trình hồi quy 2.2.5.2 Mơ hình khảo sát tác dụng ức chế enzym α-glucosidase Hoạt tính ức chế α-glucosidase cao chiết phân đoạn đánh giá theo phương pháp đo quang sau tạo màu theo mơ tả Abdullah cộng (2016) có hiệu chỉnh 59 Thiết kế thí nghiệm: Tiến hành đồng thời mẫu chứng trắng (không chứa enzym α-glucosidase tác nhân ức chế), mẫu chứng (chứa enzym α-glucosidase khơng có tác nhân ức chế), mẫu thử trắng (chứa tác nhân ức chế khơng có enzym α-glucosidase) mẫu thử (chứa enzym α-glucosidase tác nhân ức chế) đĩa 96 giếng Trên đĩa 96 giếng, hỗn hợp phản ứng bao gồm 60 μL dung dịch mẫu thử, 50 μL đệm phosphate 0,1 M (pH 6,8) có chứa enzym α-glucosidase (0,2 U/mL) ủ 37 °C 10 phút Thêm 50 μL dung dịch p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (p- 23 NPG) mM dung dịch đệm phosphat 0,1 M (pH 6,8) Hỗn hợp ủ tiếp 37 °C 20 phút Độ hấp thu sản phẩm đo bước sóng 405 nm máy đọc vi đĩa (Biotek, USA) Acarbose (chemcruz; A8980) sử dụng thuốc đối chứng dương Khả ức chế enzym α-glucosidase tính theo cơng thức sau: Khả ức chế (%) = [1-((Absmẫu thử - Absmẫu thử trắng)/(Absmẫu chứng - Abs mẫu chứng trắng))] x 100% Abs: Độ hấp thu đo bước sóng 405 nm Khả ức chế enzym α-glucosidase đánh giá dựa giá trị IC 50 (μg/mL) Giá trị nồng độ chất ức chế cho hoạt tính ức chế 50% 2.2.5.3 Phương pháp xử lý số liệu đánh giá kết Kết thí nghiệm biểu diễn giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ba lần tiến hành thí nghiệm độc lập Kết tính tốn vẽ đồ thị phần mềm Microsoft Excel 2016 2.2.6 Phân lập tinh chế từ phân đoạn đơn giản/ hợp chất thu 2.2.6.1 Phân lập Sắc ký cột (nhanh, cổ điển) dùng để tách cao chiết có hoạt tính thơng qua sàng lọc hoạt tính sinh học thành phân đoạn đơn giản phân lập chất tinh khiết từ phân đoạn 2.2.6.2 Tinh chế phân đoạn đơn giản/ hợp chất thu Tinh chế phương pháp kết tinh phân đoạn với lượng tối thiểu dung mơi hỗn hợp dung mơi thích hợp hay tinh chế cột Sephadex LH-20 Khi có kết tinh, tiến hành lọc lấy tinh thể phễu thủy tinh xốp rửa dung mơi thích hợp, sấy chân không, cân xác định khối lượng 2.2.6.3 Kiểm tra độ tinh khiết Phương pháp sắc ký lớp mỏng: Chất phân lập kiểm tra độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng, triển khai mỏng riêng biệt với hệ dung mơi có độ phân cực khác Chất cần xác định độ tinh khiết phát đèn UV 24 hai bước sóng 254 nm 365 nm, sau màu với thuốc thử thích hợp Hợp chất xem tinh khiết cho vết gọn 2.2.7 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập Các hợp chất phân lập kiểm tra phổ UV, MS để sơ xác định nhóm cấu trúc chất phân lập phân tử khối Sau chất tinh khiết đo phổ NMR (13C-NMR, 1H-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY) để xác định cấu trúc xác chất phân lập Phổ MS thực máy LC-MS (hệ thống Waters Alliance 2695 XE) Tín hiệu ghi nhận theo số khối (m/z) cường độ tương đối Phổ NMR đo với kỹ thuật 1-D, 2-D Mẫu hòa tan dung mơi thích hợp CDCl3, CD3OD DMSO với chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS); thực máy BRUCKER-ADVANCE 600 MHz phịng cấu trúc, Viện Hóa học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Hà Nội Độ dời hóa học tính theo thang δ (ppm) với δTMS = 0,00 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ 3.1 Khảo sát thực vật học 3.1.1 Đặc điểm hình thái D citrea lồi thuộc họ gừng, nhìn chung mang tính tương đồng cao so với loài khác thuộc họ Zingiberaceae Tuy nhiên, loài mang đặc điểm đặc trưng cho chi loài Hình thái ngồi D citrea mang đặc điểm sau: D citrea loại thân thảo với thân rễ nhỏ, bao gồm phần mặt đất (chồi lá, cuống lá, phiến lá) phần đất (thân rễ, rễ) (hình 3.1) Cây thảo cao khoảng 38–48 cm (42,75 ± 4,09 cm) (hình 3.1a, a’) có 1–3 lá, mọc thành cụm dày đặc với chồi khác Các bẹ gốc chồi dài tới 10 cm, có màu đỏ chúng khơ lại chuyển sang màu nâu Thân rễ dài, hình trụ màu vàng nhạt, có nốt vết sẹo chồi không từ năm trước Mặt cắt ngang thân rễ có màu trắng vàng vàng nhạt có vịng trịn rõ tạo ranh giới chia làm vùng rõ Mặt cắt có xơ trắng ngà (hình 3.1f) Thân rễ có mùi thơm độc đáo vị cay nhẹ Thân rễ có nhiều rễ phụ, dài 5–23 cm (–30) cm (19,5 ± 10,13 cm) đường kính 0,5–1,0 cm (0,9 ± 0,26 cm) (hình 3.1e) Lá đơn cao 18–42 cm, cuống trưởng thành cao 20 cm Phần gốc cuống có màu tím đỏ, ngả dần sang xanh mờ phía phiến Phiến hình elip có chiều dài 18 –22 cm (19,92 ± 1,43 cm) rộng 8,0–10,7 cm (9,5 ± 1,08 cm) Đỉnh ngắn có hình cánh buồm hình trịn Mặt phiến có màu xanh lục nhạt gần song song với thân rễ, mặt chúng nhẵn có màu xanh đậm Gân phiến rõ ràng (Hình 3.1a, a', b) Cụm phát hoa mọc sát mặt đất từ thân rễ, gồm hai hoa, cao 9,5–10 cm (9,6 ± 0,28 cm) Các bắc xòe dài 2,5–3,2 cm (2,92 ± 0,28 cm), hình ống, màu hồng đến đỏ sẫm Các bắc hình ống, mép nguyên, dài 1,9–2,5 cm (2,22 ± 0,23 cm), màu nâu đỏ (hình 3.1c) Hoa có cánh hoa màu vàng, hình thìa, cong phía sau Cánh hoa có ba sọc kéo dài từ gốc đến Đài hoa ống tràng hoa dài 1,2–1,5 cm chứa bốn thùy, bao 26 gồm hai thùy tràng hoa rộng phía trước hai thùy tràng hoa hẹp lưng Cánh môi xẻ sâu đến nửa trung tâm chiều dài chúng (hình 3.1d) Hoa thức: ⚥K(3)C(3)A1G(3) Hình 3.1 Đặc điểm hình thái D citrea (tại VQG Bạch Mã): a, a’ Các phận Gừng đen; b Dạng thân thảo nhỏ; c Cụm phát hoa hoa; d Hoa; e Rễ, rễ lông hút sau phơi khô; f Mặt cắt ngang dọc thân rễ tươi 3.1.2 Đặc điểm vi học 3.1.2.1 Bóc tách biểu bì Bóc tách biểu bì mặt quan sát thấy tế bào đa giác xếp nhau, biểu bì to biểu bì Khí khổng có dạng phân chia kiểu mầm, với tế bào bạn (10–12,5 x 15–19 μm) (hình 3.2B-b) song song với lỗ khí mở tế bào bảo vệ (21–24 x 16–20 μm) (hình 3.2B-a) Khí khổng tìm thấy hai mặt Tuy nhiên, mảnh biểu bì mang lỗ khí mảnh biểu bì 27 Hình 3.2 Mảnh biểu bì mang lỗ khí D citrea: (A, B) Bề mặt biểu bì dưới; (C, D) Bề mặt biểu bì trên; (a) Tế bào bảo vệ; (b) Tế bào bạn 3.1.2.2 Vi phẫu Vi phẫu lá: có tiết diện đối xứng qua trục giữa, mặt lõm nhọn, mặt hình trịn lồi Cấu tạo bao gồm gân lá, phiến cuống lá: Gân lá: Biểu bì mỏng bao phủ vách tế bào bên ngồi (hình 3.3a, i) Hạ bì gân bao gồm tế bào đa giác, dày 2–3 lớp (hình 3.3b) Mơ gân chứa tế bào đa giác có kích thước khơng (46–62 x 50–63 μm), tạo thành 7-8 lớp tế bào (hình 3.3d) Các bó mạch có gỗ (đường kính dọc từ 94–345 μm) nằm libe (hình 3.3f, g) Các bó bao phủ vịng mơ cứng có kích thước khơng Vịng mơ cứng có ba đến sáu lớp tế bào xơ cứng (dài 35–38 μm) (hình 3.3h) Tất bó mạch xếp thành hàng phía biểu bì Bó mạch lớn nằm gân giữa, gần với biểu bì Kích thước bó mạch nhỏ dần phía trái phải phiến (hình 3.3A, C) Mơ mềm (hình 3.3d) chứa tế bào nhỏ, khoang khí lớn (90–125 x 94–107 μm) (hình 3.3e), nhiều lục lạp (hình 3.3c), xen kẽ bó libe-gỗ (hình 3.3A, B, C) Ở gân có bó mạch dài 78–95 μm gồm libe gỗ (lá non) 3–4 bó mạch xếp ngẫu nhiên (lá già), đơi libe nằm gỗ (hình 3.3A) 28 Phiến lá: Trong phần cắt ngang, biểu bì biểu bì cấu tạo tế bào hình đa giác Biểu bì (hình 3.3a) có tế bào lớn biểu bì (hình 3.3i) Cả hai biểu bì có lỗ khí (hình 3.3j), với diện biểu bì nhiều biểu bì Khí khổng có dạng phân chia kiểu mầm (paracytic), với tế bào bạn hình chữ nhật (17 x 25 μm) Có lớp tế bào hạ bì khơng liên tục (hình 3.3b) (bên biểu bì) Phiến gồm 4–5 lớp mơ mềm đạo Mơ chứa nhiều lục lạp (hình 3.3c) Bó libe-gỗ có cấu tạo tương tự gân (hình 3.3B) Hình 3.3 Vi phẫu tổng quát cấu tạo chi tiết D citrea (4X, 10X, 40X): (A, B) Gân lá; (C) Phiến lá; (D, j) Lỗ khí; (E) Bó mạch (Libe – Gỗ) (a) Biểu bì trên; (b) Hạ bì; (c) Mơ mềm chứa lục lạp; (d) Mô mềm khuyết; (e) Khoang khuyết; (f), Gỗ; (g) Libe; (h) Mơ cứng; (i) Biểu bì dưới; (k) Khoang khí khổng Hình 3.4 Sơ đồ cấu tạo D citrea 29 Vi phẫu cuống lá: Mặt cắt ngang có tiết diện hình trứng, mặt có vết lõm sâu Cuống bao gồm biểu bì (20–22 μm (21,25 ± 0,37 μm)) (hình 3.5a), biểu bì (hình 3.5b), bó libe-gỗ (hình 3.5h, g) cấu trúc cuống gần tương tự cấu trúc gân Các bó libe-gỗ có kích thước khơng đồng tạo thành 2–3 hàng hình vịng cung Hàng xếp ngẫu nhiên cuống chứa bó libe-gỗ Hai hàng cịn lại gồm bó mạch xếp Các bó mạch lớn tìm thấy hàng giữa, với đặc điểm gỗ nằm libe (hình 3.5g, h) Các bó mạch lớn xếp xen kẽ với khoang khơng khí (khoảng khuyết) (93–125 μm (112,46 ± 0,24 μm) x 120–125 μm (122,47 ± 0,24 μm)) (hình 3.5c) Mơ mềm khuyết (hình 3.5f), bao quanh bó mạch này, chứa nhiều lục lạp (hình 3.5e) Ngồi cịn có vịng mơ cứng bên ngồi bó libe-gỗ (22–40 μm (31,2 ± 0,49 μm)) (hình 3.5d) Hình 3.5 Vi phẫu tổng quát (4X), chi tiết (10X) sơ đồ cấu tạo cuống D citrea: (a) Biểu bì; (b) Hạ bì; (c) Khoảng khuyết; (d) Vịng mơ cứng; (e) Mơ mềm chứa lục lạp; (f) Mô mềm khuyết; (g) Gỗ; (h) Libe 30 Vi phẫu rễ: Mặt cắt ngang rễ gần tròn bao gồm hai vùng riêng biệt (vùng vỏ vùng trung trụ) Hình 3.6 Vi phẫu tổng quát cấu tạo chi tiết rễ D citrea: (a) Ngoại bì (Tầng lơng hút ± lơng hút); (b) Tầng Suberoid; (c) Tế bào tiết; (d) Mô mềm vỏ (Mô mềm vỏ ngồi mơ mềm vỏ trong); (e) Nội bì hình chữ U; (f) Trụ bì; (g) Libe; (h, i) Gỗ (h Mạch tiền mộc; i Mạch hậu mộc); (j) Mơ mềm tủy hóa mơ cứng; (k) Mơ mềm tủy cịn cellulose; (m) Sự hình thành rễ bên Hình 3.7 Sơ đồ cấu tạo rễ D citrea Vùng vỏ nằm biểu bì mang lơng hút cịn vết tích tầng lơng hút (hình 3.6a) chiếm khoảng 2/3 bán kính mặt cắt (370–380 μm) Tầng suberoid bao gồm 3–5 lớp tế bào hình chữ nhật đa giác (60–65 μm), có thành tế bào dày 31 xếp gần (hình 3.6b) Khoảng gian bào mơ mềm vỏ ngồi có hình đa giác xếp ngẫu nhiên, nhỏ (Hình 3.6d) Mơ mềm vỏ có 4–5 lớp tế bào hình bầu dục xếp thành vòng đồng tâm xuyên tâm (90–95 μm) (hình 3.6d) Nhiều tế bào tiết nằm rải rác mơ mềm vỏ (hình 3.6c) Nội bì hình chữ U liên tục có vách dày (5,5–6,5 μm) (hình 3.6e) Vùng trung trụ chiếm 1/3 bán kính phần rễ Trụ bì, lớp tế bào đa giác có kích thước khơng đều, có xu hướng bị ép phẳng phía cực gỗ (hình 3.6f) Trụ mạch (Hậu mộc) có 15 vịm với dạng vơ hướng Các bó mạch nằm lớp mơ cứng Các vịng (chữ V) tạo cách xen kẽ libe gỗ, nằm bên trụ bì Mỗi bó gỗ (gồm 1–2 tiền mộc (hình 3.6h) nhiều hậu mộc lớn có kích thước khơng (24,5–25,5 μm)) (hình 3.6i) bố trí xung quanh trung trụ Trung trụ có vách dày hình đa giác (340–348 μm) Lớp mô cứng dần biến phía vùng trung trụ (hình 3.6j) Mơ mềm tuỷ nằm trung trụ (94–113 μm) (hình 3.6k) Rễ bên bắt nguồn từ trụ bì vùng trung trụ (hình 3.6m) Vi phẫu thân rễ: Cấu tạo thân rễ gần giống với rễ Mặt cắt ngang thân rễ trịn với cấu tạo gồm vùng biểu bì, vùng vỏ, vùng trung trụ Biểu bì chứa tế bào hình chữ nhật, xếp tương đối đặn (hình 3.8a) Dưới biểu bì ngoại bì (tầng suberoid), gồm 5–7 lớp (190–195 μm), tạo tế bào hình tròn gần tròn xen kẽ (nhuộm màu xanh lam) (hình 3.8b) Lớp tầng hạ bì có thành dày, gồm 5–6 lớp (32–35 μm), với tế bào hình chữ nhật, xếp xuyên tâm đồng tâm (hình 3.8c) Mơ mềm vỏ có hình gần trịn (Hình 3.8d), xếp khơng có khoảng gian bào nhỏ chúng Nội bì có đai Caspary rõ ràng (hình 3.8g) Vịng trụ bì đa giác (tiếp giáp với nội bì) cụm khơng liên tục, bao quanh cực bó mạch Có bó libe-gỗ rải rác vùng vỏ vùng tuỷ (150–160 μm) Số lượng bó mạch vùng tuỷ nhiều vùng vỏ Các bó mạch bao bọc vịng mơ cứng (hình 3.8e) Nhìn chung, vịng mơ cứng bó mạch vùng vỏ dày vùng tuỷ Bó mạch có hình trịn hình trứng Gỗ có khoảng 1–6 vịm dạng vơ hướng (hình 3.8m) Libe chồng lên gỗ (Hình 3.8k, m) Có tế bào tiết (hình 3.8f) hạt tinh bột nằm rải rác khắp vùng vỏ vùng tuỷ 32 Hình 3.8 Vi phẫu tổng quát cấu tạo chi tiết thân rễ D citrea: (a) Biểu bì; (b) Ngoại bì (Tầng suberoid); (c) Tầng hạ bì; (d) Mơ mềm vỏ; (e) Vịng mơ cứng; (f) Tế bào tiết; (g) Nội bì đai Caspary; (h) Trụ bì; (k) Libe; (m) Gỗ; (l) Mơ mềm tuỷ Hình 3.9 Sơ đồ cấu tạo thân rễ D citrea 3.1.3 Vi phẫu bột Bột rễ thân rễ có màu nâu nhạt (hình 3.10) Bột mịn có lẫn nhiều sợi cứng, mùi thơm đặc trưng, vị cay nhẹ Quan sát kính hiển vi cho thấy bột đặc 33 trưng diện hầu hết thành phần tìm thấy mẫu tươi (hình 3.11) Nhiều mảnh mơ mềm thành mỏng với tế bào hình đa giác (hình 3.11a, b) Các hạt tinh bột đứng riêng lẻ thành đám, có hình trứng hình bầu dục (17–19 x 19–29 μm) Các rốn hạt thường phân nhánh, không nằm hạt vân tạo thành đường đồng tâm rõ ràng (hình 3.11c) Mảnh mạch xoắn (hình 3.11d) mảnh mạch vạch (hình 3.11e) thường xuất trường quan sát Ngoài ra, khối bần màu nâu (hình 3.11f, g), khối nhựa nâu đỏ (hình 3.11h), sợi mơ cứng có thành tế bào dày (hình 3.11i, j, k), bó sợi có thành mỏng (hình 3.11n), sợi mơ cứng thành mỏng (hình 3.11l, m) tìm thấy Trong bột cịn có diện lơng đơn bào khơng tuyến (hình 3.11q, r, s) lơng che chở (hình 3.11p), chúng cịn ngun vẹn bị vỡ Hình 3.10 Bột rễ thân rễ D citrea: (a) Trước rây; (b) Sau rây Bột có màu xanh đậm, khơng mùi, khơng vị (hình 3.12a) Quan sát bột kính hiển vi cho thấy diện thành phần khác mảnh biểu bì đa giác với thành mỏng (hình 3.12b, c), mảnh biều bì mang lỗ khí (hình 3.12d), mảnh mơ mềm có thành mỏng (hình 3.12e, f), mảnh mô chứa mạch vạch với lục lạp màu xanh (hình 3.12g), mảnh mơ chứa mạch vạch (hình 3.12h), cụm lục lạp màu xanh lục (hình 3.12i), khối nhựa màu nâu đỏ đen (hình 3.12j,k,l), sợi trụ vịng kéo dài có đầu gần trịn nhọn (hình 3.12.m), sợi gỗ có thành dày (hình 3.12n, o) Nhìn chung, hầu hết thành phần có tươi tìm thấy bột Tuy nhiên, số thành phần mảnh biểu bì trên, biểu bì khó phân biệt bột khơng thể xác định vị trí chúng 34 Hình 3.11 Một số cấu tử bột rễ thân rễ D citrea: (a) Mô mềm; (b) Biểu bì; (c) Tinh bột; (d) Mảnh mạch vạch; (e) Mảnh mạch xoắn; (f, g) Khối bần màu nâu; (h) Khối nhựa nâu đỏ; (i, j, k) Sợi mô cứng có thành dày; (l, m) Sợi mơ cứng có thành mỏng; (n) Bó sợi; (o) Mảnh chứa mạch vạch; (p) Lông không tuyến (lông che chở); (q, r, s) Lông không tuyến đơn bào (lông hút) 35 Hình 3.12 Một số cấu tử bột D citrea: (a) Bột lá; (b) Bề mặt biểu bì; (c) Biểu bì; (d) Biểu bì mang lỗ khí; (e, f) Mô mềm; (g) Mảnh mô chứa mạch vạch với lục lạp màu xanh; (h) Mảnh mô chứa mạch vạch; (i) Đám lục lạp màu xanh; (i, j, k) Khối nhựa màu nâu đỏ; (m) Sợi trụ vòng; (n, o) Sợi gỗ 3.1.4 Định danh thực vật phương pháp phân tích DNA Điện di gel agarose cho thấy khuếch đại, tạo mồi ITS, có chiều dài khoảng 750 bp (Hình 3.13) Sau giải trình tự chỉnh sửa trình tự thu được, độ dài khuếch đại cuối 647 bp Các so sánh dựa BLAST khuếch đại với giải trình tự lồi nghiên cứu trình tự tham chiếu sản phẩm PCR loài 36 nghiên cứu tương đồng 96,54% (E-value = 0,0 độ bao phủ = 97%) với ITS D citrea Genbank (AF478744) Hình 3.13 Kết sản phẩm PCR tạo mồi ITS1 ITS4 (“1” “2” hai mẫu có dải băng rõ ràng “M” thang đo chuẩn DNA) Trình tự lồi nghiên cứu sau gửi đến Ngân hàng gen (NBCI) với số gia nhập MZ310840 Phương pháp Maximum Likelihood - khả tối đa phương pháp cho kết đáng tin cậy Cây tiến hóa có xác suất cao cuối chọn Phân tích bootstrap thực nhằm kiểm tra tính xác độ tin cậy cho nhánh tiến hóa Nếu nhóm taxa (clade) cho giá trị hỗ trợ từ 95% trở lên nhánh nhóm cho ủng hộ mạnh mẽ Biểu đồ hình phát sinh lồi theo phương pháp khả tối đa (Maximum likelihood) cho thấy ITS phù hợp để xác định D citrea đồng MZ310840 AF478744 (được hiển thị BLAST) 96,54% Trình tự mẫu từ VQG Bạch Mã (MZ310840) phân nhóm với chuỗi trình tự D citrea khác từ Ngân hàng Genbank cụm tách từ chuỗi trình tự khác họ Zingiberaceae Cụ thể, khoảng cách MZ310840 trình tự D citrea 0,019, nhỏ khoảng cách MZ310840 trình tự từ lồi khác Trình tự ITS gần với cụm D citrea HM236130 (D rubrostriata), với khoảng cách 0,039 (hình 3.14) Hay nói cách khác, trình tự ITS D citrea từ VQG Bạch Mã hình thành cụm với trình tự ITS lồi (AF478744, AY424757, AJ388282 37 AB552946), tách biệt với loài khác họ Zingiberaceae Các số nhánh giá trị bootstrap theo tỷ lệ phần trăm 1000 lần lặp lại (hình 3.14) Hình 3.14 Biểu đồ hình phát sinh loài (Maximum likelihood – Khả tối đa) 15 chuỗi ITS Ngồi ra, từ biểu đồ hình phát sinh loài khả xảy tối đa (bootstrap = 1000) cho thấy đồng trình tự D citrea khơng phải 100%, chúng tập hợp lại với tự tách khỏi loài khác, với 38 D rubrostriata (loài gần với D citrea) Do đó, sử dụng ITS để xác định D citrea hiệu Kết cho thấy loài khảo sát thuộc loài D citrea Điều chứng tỏ trình thu hái mẫu bảo quản mẫu tốt, đạt độ tin cậy Sau đó, mẫu nghiên cứu lập hồ sơ nhận dạng dựa DNA để gửi đến GenBank chấp thuận với mã MZ310840.1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MZ310840.1) 3.2 Thử tinh khiết Các giá trị trung bình độ ẩm, tro tồn phần, tro khơng tan acid hàm lượng chất chiết bột thân rễ Gừng đen (thu mẫu đợt 1) 12,41 ± 0,37 (%), 8,42 ± 0,26 (%), 1,08 ± 0,08 (%) 8,17 ± 0,25 (%) Các giá trị độ tinh khiết bột thân rễ Gừng đen lần thu mẫu sau kiểm soát nằm giá trị khảo sát lần thu mẫu đợt Tất mẫu đạt độ tinh khiết với tiêu nằm giới hạn cho phép DĐVN V nguyên liệu làm thuốc Sau mẫu tiếp tục tiến hành phân tích sơ thành phần hóa thực vật, chiết xuất thu cao tổng cao phân đoạn sau lắc phân bố lỏng-lỏng để tiến hành sàng lọc tác dụng sinh học Từ lựa chọn cao phân đoạn có tác dụng sinh học tốt để phân lập 3.3 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật Sau tiến hành khảo sát sơ thành phần hóa thực vật, kết tổng hợp bảng 3.1 Kết sàng lọc sơ thành phần hóa thực vật Gừng đen cho thấy diện hợp chất tinh dầu, hợp chất khử, acid hữu cơ, coumarin flavonoid thân rễ Gừng đen Trong đó, chất béo có thân rễ mà khơng có Ngồi ra, carotenoid, saponin, glycosid tim, tannin, alkaloid, anthranoid hợp chất polyuronid không phát hai phận khảo sát Tuy nhiên, mẫu thân rễ nghi ngờ có diện triterpenoid Mẫu sử dụng cho sàng lọc sơ thành phần hóa thực vật nhằm định hướng cho nghiên cứu để đa dạng phận làm thuốc loài Gừng đen 39 Bảng 3.1 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật D citrea Thành phần hóa học Chiết xuất thân rễ Tên phản ứng Chất béo Các chất khử Tinh dầu Carotenoid Alkaloid Ether Vết mờ + Molisch, Fehling Bốc đến cắn + H2SO4 Valse-Mayer, Dragendoff Acid hữu Na2CO3 Anthraquinon KOH 10% Glycosid tim Raymond-Marthoud, Xanthydrol Coumarin Đóng-mở vịng lacton + Flavonoid Shinoda test + Saponin Tạo bọt Tannin Gelatin muối, FeCl3 1% Triterpenoid Liebermann-Burchard Polyuronid Ethanol 90% Chú thích: (+): Có; (±): Nghi ngờ; (-): Khơng có Chiết xuất EtOH Nước Ether EtOH + + - + - + - + + - Nướ c + - + - + - - + - - + + ± - - + - + + - + + - 3.4 Chiết xuất cao toàn phần cao phân đoạn Thân rễ Gừng đen kiểm tra độ tinh khiết, khảo sát sơ thành phần hóa học, chiết xuất phương pháp ngấm kiệt với EtOH 96% (tỷ lệ 1:15) để thu cao đặc toàn phần tiếp tục phân bố lỏng-lỏng để thu cao phân đoạn tương ứng (hình 3.15) Cao đặc toàn phần cao phân đoạn thu với khối lượng, hiệu suất độ ẩm trình bày bảng 3.2 Đây kết lần báo cáo nghiên cứu Như vậy kết thúc quá trình chiết lỏng-lỏng, thu được cao phân đoạn từ 386 g cao tổng đợt cao n-hexan (28,17 g), cao CHCl3 (131,32 g), cao EtOAc (13,56 g), cao n-BuOH (20,92 g) cao nước (126,68 g) Các phân đoạn này được sàng lọc theo định hướng tác dụng chống oxy hóa ức chế α-glucosidase để lựa chọn phân đoạn có hoạt tính, từ đó phân lập các chất tinh khiết 40 Hình 3.15 Sơ đồ kết chiết xuất cao tổng cao phân đoạn thân rễ D citrea Bảng 3.2 Khối lượng, hiệu suất chiết, độ ẩm cao tổng cao phân đoạn Cao tổng cao phân đoạn Cao tổng Cao n-hexan Cao CHCl3 Cao EtOAc Cao n-BuOH Cao nước Khối lượng (g) 386 28,17 131,32 13,56 20,92 126,68 Hiệu suất (%) 11,03 7,30 34,02 3,51 5,42 32,82 Độ ẩm (%) 12,5 12,58 12,55 11,98 13,7 17,6 3.5 Sàng lọc hoạt tính sinh học 3.5.1 Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa cao phân đoạn thơng qua khả trung hịa gốc tự DPPH Hiệu chống oxy hóa cao chiết phân đoạn thân rễ Gừng đen xác định dựa hiệu suất quét gốc tự DPPH Kết thể khả chống oxy hóa cao EtOAc mạnh với 82,42% nồng độ 250 μg/mL thấp nồng độ 31,25 μg/mL 20,45% nồng độ khảo sát, với giá trị 41 IC50 = 90,27 µg/mL Trong đó, cao phân đoạn cịn lại thể hoạt tính chống oxy hóa thấp Khi xét nồng độ phản ứng 125 μg/mL, hoạt tính chống oxy hóa cao phân đoạn theo thứ tự sau: Cao EtOAc (59,45%) > Cao CHCl3 (12,04%) > Cao n-hexan (4,43%) > Cao n-BuOH (4,18%) > Cao nước (1,31%) Acid ascorbic sử dụng đối chứng dương Như vậy, xác định giá trị IC50 cao EtOAc (IC50 = 90,27 µg/mL, R2 = 0,9925) acid ascorbic (IC50 = 4,62 µg/mL, R2 = 0,9936) (Phụ lục PL2-1) 3.5.2 Sàng lọc hoạt tính kháng α-glucosidase cao phân đoạn Gừng đen Qua trình khảo sát khả ức chế α-glucosidase giá trị IC50 cao phân đoạn trình bày bảng 3.3 hình 3.16 Bên cạnh đó, kết ức chế enzym α-glucosidase thuốc đối chứng acarbose (chemcruz) dãy nồng độ phản ứng 18,75; 37,50; 56,25; 75,00; 93,75 μg/mL cho giá trị tương ứng 23,04 ± 0,02 (%); 36,70 ± 0,07 (%); 45,00 ± 0,06 (%); 62,85 ± 0,05 (%); 74,65 ± 0,02 (%) Bảng 3.3 Kết ức chế α-glucosidase cao phân đoạn D citrea Nồng độ mẫu (μg/mL) Ban Phản đầu ứng 250 93,75 500 187,5 1000 375 2000 750 3000 1125 Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase (%) Cao n-hexan 19,76 ± 0,01 27,16 ± 0,06 39,47 ± 0,01 51,76 ± 0,04 63,10 ± 0,06 Cao CHCl3 28,57 0,03 37,14 0,02 51,24 0,08 59,02 0,07 70,12 0,01 ± ± ± ± ± Cao EtOAc 48,25 0,12 57,84 0,09 65,94 0,04 76,68 0,03 88,86 0,01 ± ± ± ± ± Cao BuOH 23,88 0,10 29,52 0,20 41,02 0,04 62,93 0,21 81,45 0,01 ± ± ± ± ± Cao nước 11,15 0,09 15,68 0,01 20,30 0,12 38,02 0,05 59,24 0,07 ± ± ± ± ± Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase cao chiết EtOAc khảo sát dãy nồng độ phản ứng 93,75; 187,5; 375; 750; 1125 μg/mL cho kết tương ứng 48,25; 57,84; 65,94; 76,68; 88,86% Trong nồng độ phản ứng 42 187,5 µg/mL, kết cao cịn lại cho tác dụng ức chế α-glucosidase thấp so với cao EtOAc Từ kết khảo sát dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính Hoạt tính ức chế α-glucosidase giá trị IC50 cao phân đoạn thể hình 3.16 bảng 3.4 Hình 3.16 Tác dụng ức chế α-glucosidase cao phân đoạn D citrea Cao EtOAc cho thấy có tác dụng đáng kể việc ức chế α-glucosidase, đạt 57% nồng độ 187,5 µg/mL so với cao phân đoạn khác Các cao n-hexan, CHCl3, n-BuOH cao nước thể ức chế α-glucosidase 50% nồng độ 750 µg/mL, 375 µg/mL, 750 µg/mL 1125 µg/mL Bảng 3.4 Giá trị IC50 cao phân đoạn từ thân rễ D citrea acarbose mơ hình ức chế α-glucosidase Mẫu IC50 (μg/mL) Acarbose (Chemcruz) 58,51 Cao n-hexan 621,37 Cao CHCl3 371,37 Cao EtOAc 115,75 Cao n-BuOH 545,98 Cao nước 965,70 Tác dụng ức chế α-glucosidase cao phân đoạn phụ thuộc vào nồng độ (hình 3.16) Hoạt tính ức chế α-glucosidase cao phân đoạn giảm theo thứ tự sau: Cao EtOAc (IC 50 = 115,75 µg/mL) > Cao CHCl (IC50 = 371,37 µg/mL) > Cao n-BuOH (IC50 = 545,98 µg/mL) > Cao n-hexan (IC50 = 621,37 µg/mL) > Cao nước (IC50 = 965,70 µg/mL) Ngoài ra, kết bảng 3.4 cho thấy phần trăm 43 ức chế α-glucosidase acarbose (chemcruz) với giá trị IC 50 58,51 µg/mL Các giá trị IC50 cao EtOAc, CHCl 3, n-BuOH, n-hexan, nước acarbose (đối chứng dương) có hệ số hồi quy cao R = 0,9860; 0,9862; 0,9981; 0,9807; 0,9885 0,9906 (phụ lục PL2-2) Vì khả chống oxy hóa hoạt tính ức chế α-glucosidase cao EtOAc mạnh tiếp đến cao CHCl 3, hai cao ưu tiên lựa chọn để phân lập chất 3.6 Phân lập, tinh chế đánh giá tác dụng sinh học chất tinh khiết 3.6.1 Phân tách phân đoạn từ cao CHCl3 3.6.1.1 Sắc ký cột cổ điển Phân tách cao CHCl3 thành phân đoạn đơn giản phương pháp sắc ký cột cổ điển, với điều kiện sắc ký cột sau: - Cột thủy tinh có kích thước 8,0 x 60 cm, có gắn lưới bơng thủy tinh xốp - Pha tĩnh: 600 g silica gel cỡ hạt 37–63 µm (Ấn Độ) - Mẫu: 94,0 g cao CHCl3 trộn với lượng tối thiểu silica gel, phương pháp nạp mẫu khô - Nhồi cột hỗn dịch, chạy dung môi n-hexan ổn định - Pha động: n-hexan-EtOAc với tỷ lệ từ (100:0; 95:5; 90:10; 80:20; 70:30; 60:40) đến (50:50) Sau tiếp tục triển khai với hệ EtOAc-MeOH tỷ lệ (90:10) - Hệ dung môi khai triển TLC: hệ Cf-EtOAc (70:30) dùng để theo dõi kiểm tra sắc ký đồ bình dịch chiết giống gộp lại cô thu hồi dung môi thu phân đoạn tương ứng Sắc ký đồ phát cách soi đèn UV bước sóng 254 nm 365 nm, sau phun thuốc thử VS - Thể tích hứng: 100 mL/ bình Thơng qua sắc ký cột cổ điển, từ 94,0 g cao CHCl thu 10 phân đoạn khác Trong q trình quay có phân đoạn Cf3 xuất kết tủa màu vàng, phân đoạn lại dạng rắn dầu Phân đoạn Cf3 có kết tủa tách 44 riêng để tinh chế phần lại tiếp tục mang phân lập Kết phân đoạn trình bày bảng 3.5 hình 3.17 Hình 3.17 Kết sắc ký đồ phân đoạn từ cao CHCl3 Bảng 3.5 Kết phân tách phân đoạn từ cao CHCl3 sắc ký cột Phân đoạn Cf1 Cf2 Cf3 Cf4 Cf5 Cf6 Cf7 Cf8 Cf9 Cf10 Pha động (%) n-hexan EtOAc 100 95 90 10 80 20 70 30 60 40 50 50 40 60 30 70 EtOAc-MeOH (90:10) Phân đoạn hứng 1–127 128–133 134–143 144–206 207–232 233–299 300–388 389–432 433–470 Khối lượng (mg) 902,4 810,1 2252,0 2774,5 1443,1 1782,0 18376 6777,9 2172,7 Ghi Dạng dầu, màu vàng Dạng dầu, màu vàng Kết tủa vàng (54,8 mg) Dạng rắn, màu nâu Dạng rắn, màu nâu Dạng rắn, màu nâu Dạng rắn, màu nâu Dạng rắn, màu nâu Dạng rắn, màu nâu 471–710 17337,6 Dạng rắn, màu nâu đen 45 3.6.1.2 Phân lập tinh chế hợp chất từ cao phân đoạn cao CHCl3 Phân lập tinh chế chất C1 từ cao Cf3 Cao Cf3 q trình quay thu hồi dung môi thấy xuất tủa tủa tách khỏi dung dịch, phần dung mơi cịn lại bốc tự nhiên để thu cao Cf3-1 Tủa sau tách khỏi dung dịch rửa nhiều lần với n-hexan lạnh MeOH lạnh thu 54,8 mg tinh thể hình kim màu vàng đặt tên C1 Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất C1 TLC với hệ dung môi khác nhau: PE-CH2Cl2 (40:60), n-hexan-EtOAc (65:35), Cf-EtOAc (85:15) cho vết gọn sắc ký đồ (hình 3.18) Do sơ kết luận C1 đạt tinh khiết sắc ký lớp mỏng Hình 3.18 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết hợp chất C1 Trên sắc ký đồ cho thấy hợp chất C1 tắt quang UV 254 nm, khơng phát quang UV 365 nm có màu vàng cam với thuốc thử VS, màu xanh rêu với thuốc thử FeCl3 1% Phân lập tinh chế chất C2 từ cao Cf3-1 Cf4 Sau khảo sát sắc ký lớp mỏng, hai cao Cf3-1 Cf4 có vết trùng với nên gom lại thành Cf3.4 (4125,9 mg) Sau phần cao Cf3.4 hịa tan vào MeOH, đun nóng cho tan hồn tồn làm lạnh thấy xuất tủa Chất tách khỏi phần dung môi kết tinh lại nhiều lần với MeOH lạnh thu 505,1 mg chất rắn dạng bột màu trắng đặt tên C2 46 Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất C2 sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khác nhau: PE-Cf (40:60), n-hexan-EtOAc (50:50), Cf-MeOH (90:10) cho vết gọn sắc ký đồ (hình 3.19) Do sơ kết luận hợp chất C2 đạt tinh khiết sắc ký lớp mỏng Trên sắc ký đồ cho thấy hợp chất C2 không tắt quang UV 254 nm, không phát quang UV 365 nm, có màu tím với thuốc thử VS Hình 3.19 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết hợp chất C2 Phân lập tinh chế chất C3 từ cao Cf9 Cao Cf9 (2172,7 mg) kiểm tra sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CfEtOAc (70:30) (hình 3.17) Sau đó, Cf9 tiếp tục phân tách sắc ký cột Điều kiện sắc ký cột cổ điển: - Cột thủy tinh có khóa nhựa với kích thước 3,0 x 50 cm - Pha tĩnh: 103 g silica gel 60 cỡ hạt 40–63 µm (Merck, Đức) - Mẫu: 2172,7 mg cao Cf9 trộn với silica gel, phương pháp nạp mẫu khô - Nhồi cột hỗn dịch, chạy dung môi CHCl3 ổn định - Pha động: chạy cột với dung môi CHCl (100%), tăng dần tỷ lệ CHCl3EtOAc đến (0:100) - Hệ dung môi khai triển TLC: hệ CH 2Cl2-EtOAc (60:40) để theo dõi kiểm tra sắc ký đồ bình dịch chiết giống gộp lại cô thu hồi dung môi thu phân đoạn tương ứng Sắc ký đồ phát 47 cách soi đèn UV bước sóng 254 nm 365 nm, sau phun thuốc thử VS - Thể tích hứng: 50 mL/ bình Kết sau triển khai cột thu phân đoạn (Cf9-1 đến Cf9-5) trình bày bảng sau: Bảng 3.6 Kết phân tách phân đoạn từ cao Cf9 sắc ký cột Phân đoạn Cf9-1 Cf9-2 Cf9-3 Cf9-4 Cf9-5 Pha động (%) CH2Cl2 EtOAc 100 90 10 80 20 70 30 60 40 60 40 50 50 30 70 Hình 3.20 Phân đoạn hứng 1–37 38–107 108–147 Khối lượng (mg) 46,9 133,4 48,3 Ghi Dạng rắn, màu vàng Dạng rắn, màu nâu Dạng rắn, màu nâu 148–188 197,1 Dạng rắn, màu nâu 189–260 750,0 Dạng rắn, màu nâu Kết sắc ký đồ phân đoạn từ cao Cf9 Tiếp tục từ kết TLC, cao Cf9-5 (750,0 mg) lựa chọn lên cột phân tách sắc ký cột cổ điển với điều kiện sắc ký sau: - Cột thủy tinh có khóa nhựa với kích thước 2,0 x 50 cm - Pha tĩnh: 45 g silica gel 60 cỡ hạt 40–63 µm (Merck, Đức) - Mẫu: 750,0 mg cao Cf9-5 tạo khối mẫu với silica gel nạp mẫu khô - Nhồi cột hỗn dịch, chạy dung môi hỗn hợp n-hexan-CHCl3 (1:1) ổn định 48 - Pha động: chạy cột với hỗn hợp dung mơi n-hexan-CHCl3 (50:50), sau tăng dần tỷ lệ đến hệ dung môi CHCl 3-EtOAc (100:0) đến (80:20, 70:30, 60:40, 50:50) - Hệ dung môi khai triển TLC: Cf-EtOAc (30:70) Hệ dùng để theo dõi kiểm tra sắc ký đồ bình dịch chiết giống gộp lại cô thu hồi dung môi thu phân đoạn tương ứng Sắc ký đồ phát cách soi đèn UV bước sóng 254 nm 365 nm, sau phun thuốc thử VS - Thể tích hứng: 10 mL/ bình Kết sau triển khai cột thu phân đoạn: Cf9-5.1 (16,1 mg), Cf95.2 (84,1 mg), Cf9-5.3 (205,8 mg), Cf9-5.4 (62,1 mg) Cf9-5.5 (31,8 mg) Hình 3.21 Kết sắc ký đồ phân đoạn từ cao Cf9-5 Cao Cf9-5.3 (205,8 mg) triển khai cột Sephadex-LH 20 với điều kiện sắc ký sau: - Cột thủy tinh có khóa nhựa với kích thước 2,0 x 120 cm - Pha tĩnh: Sephadex LH-20 (25 g) với chiều cao pha tĩnh 38 cm - Mẫu: 205,8 mg cao Cf9-5.3 - Pha động: MeOH 100% - Thể tích hứng: 1,0 mL/ ống nghiệm Kết sau lần triển khai cột Sephadex LH-20 thu chất lỏng màu vàng có khối lượng 83,1 mg đặt tên C3, sau C3 kiểm tra tinh khiết TLC 49 với hệ dung môi khác nhau: n-henxan-EtOAc (50:50), Cf-EtOAc (50:50), CfMeOH (85:15) cho vết gọn sắc ký đồ tương ứng với R f 0,31; 0,45 0,76 Hình 3.22 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết hợp chất C3 Hợp chất C3 có dạng dầu màu vàng, tan MeOH, acetone, tan CHCl3 Soi mỏng UV 254 nm cho tắt quang UV 365 nm khơng phát quang, sau màu xanh mạ với thuốc thử VS Phân lập tinh chế chất C4 từ cao Cf7 Cao Cf7 (18376,0 mg) kiểm tra sắc ký lớp mỏng với hệ dung mơi Cf-EtOAc (70:30) hình 3.17 cho thấy cao Cf7 có khoảng vết rõ Do cao Cf7 tiếp tục phân tách sắc ký cột cổ điển Điều kiện sắc ký: - Cột thủy tinh có khóa nhựa với kích thước 3,8 x 110 cm - Pha tĩnh: 270,0 g silica gel 60 cỡ hạt 40–63 µm (Merck, Đức) - Mẫu: 18376,0 mg cao Cf7 trộn với lượng tối hiểu silica gel, mẫu sau nạp mẫu khơ - Nhồi cột hỗn dịch, chạy dung môi CHCl3 ổn định - Pha động: chạy cột với dung môi CHCl (100%), tăng dần tỷ lệ CHCl3EtOAc đến (0:100) - Hệ dung môi khai triển TLC: hệ Cf-EtOAc (70:30) dùng để theo dõi kiểm tra sắc ký đồ bình dịch chiết giống gộp lại cô thu hồi dung môi thu phân đoạn tương ứng Sắc ký đồ phát 50 cách soi đèn UV bước sóng 254 nm 365 nm, sau phun thuốc thử VS - Thể tích hứng: 50 mL/ bình Kết sau triển khai cột thu 14 phân đoạn (Cf7-1 đến Cf7-14) trình bày bảng sau: Bảng 3.7 Kết phân tách phân đoạn từ cao Cf7 sắc ký cột Phân đoạn Cf7-1 Cf7-2 Cf7-3 Cf7-4 Cf7-5 Cf7-6 Cf7-7 Cf7-8 Cf7-9 Cf7-10 Cf7-11 Cf7-12 Cf7-13 Cf7-14 Pha động (%) CHCl3 EtOAc 100 90 10 80 20 80 20 70 30 70 30 60 40 50 50 40 60 40 60 30 70 20 80 10 90 00 100 Phân đoạn hứng 1–59 60–73 74–78 79–85 86–87 88 89–135 136–151 152–159 160–165 166–202 203–273 274–315 316–394 Khối lượng (mg) 297,2 17,2 356,3 911,4 970,7 55,7 4744,4 313,6 688,3 615,8 205,8 2292,0 1778,9 5212,6 Ghi Dạng rắn, màu nâu Dạng rắn, màu nâu Dạng rắn, màu nâu Dạng rắn, màu nâu Dạng rắn, màu nâu Dạng rắn, màu nâu Dạng rắn, màu nâu Dạng rắn, màu nâu Dạng rắn, màu nâu Dạng rắn, màu nâu Dạng rắn, màu nâu Dạng rắn, màu nâu đen Dạng rắn, màu nâu đen Dạng rắn, màu nâu đen Cắn CF7-10 phân tán vào EtOAc 65 oC thu dung dịch có màu nâu cánh gián Sau để nguội xuất kết tủa màu trắng sa lắng đáy lọ Tiến hành tách riêng tủa kết tinh lại nhiều lần với EtOAc thu 12,3 mg chất rắn dạng bột vô định hình màu trắng, tan CHCl 3, n-hexan, không tan MeOH EtOH Hợp chất đặt tên C4 kiểm tra độ tinh khiết TLC với hệ dung môi khác nhau: n-henxan-EtOAc (60:40), CH2Cl2EtOAc (70:30), Cf-MeOH (85:15) cho vết gọn sắc ký đồ (hình 3.24) 51 Hình 3.23 Kết sắc ký đồ phân đoạn từ cao Cf7 Hình 3.24 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết hợp chất C4 3.6.2 Phân tách phân đoạn từ cao EtOAc 3.6.2.1 Sắc ký cột cổ điển Bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển, cao EtOAc phân tách thành phân đoạn đơn giản, với điều kiện sắc ký cột sau: - Cột thủy tinh có kích thước 4,0 x 60 cm - Pha tĩnh: 90,0 g silica gel cỡ hạt 37–63 µm (Ấn độ) 52 - Mẫu: 8,85 g cao EtOAc trộn với lượng tối thiểu silica gel, phương pháp nạp mẫu khô - Nhồi cột hỗn dịch, chạy dung môi CH2Cl2 ổn định - Pha động: chạy gradient với dung môi CH2Cl2 (100%), tăng dần tỷ lệ CH2Cl2-EtOAc đến (0:100) Sau tiếp tục triển khai với hệ EtOAc-MeOH đến (90:10) - Hệ dung môi khai triển TLC: Cf-MeOH (90:10) Hệ dùng để theo dõi kiểm tra sắc ký đồ bình dịch chiết giống gộp lại cô thu hồi dung môi thu phân đoạn tương ứng Sắc ký đồ phát cách soi đèn UV bước sóng 254 nm 365 nm, sau phun thuốc thử VS - Thể tích hứng: 50 mL/ bình Từ 8,85 g cao EtOAc qua sắc ký cột cổ điển thu phân đoạn khác (ký hiệu từ EA1 đến EA8) Sau cô quay phân đoạn dạng rắn Kết phân đoạn trình bày bảng 3.8 hình 3.25 Bảng 3.8 Kết phân tách phân đoạn từ cao EtOAc sắc ký cột Phân đoạn EA1 EA2 EA3 EA4 EA5 EA6 EA7 EA8 Pha động (%) CH2Cl2 EtOAc 100 90 10 80 20 70 30 60 40 50 50 40 60 20 80 EtOAc-MeOH (90:10) Phân đoạn hứng 1–33 34–46 47–92 93–164 165–187 188–215 Khối lượng (mg) 122,9 1120,3 1076,1 975,6 417,7 550,3 Ghi Dạng rắn, màu vàng Dạng rắn, màu vàng Dạng rắn, màu vàng Dạng rắn, màu vàng Dạng rắn, màu nâu Dạng rắn, màu nâu 216–289 752,1 Dạng rắn, màu nâu 290–340 1478,0 Dạng rắn, màu nâu đen 53 Hình 3.25 Kết sắc ký đồ phân đoạn từ cao EtOAc 3.6.2.2 Phân lập tinh chế hợp chất từ cao phân đoạn cao EtOAc Phân lập tinh chế chất E1 từ cao EA2 Cao EA2 sau cô quay thu hồi dung môi cho bay tự nhiên tiếp phần dung mơi cịn lại thu cắn (1120,3 mg) Cho hỗn hợp dung môi n-hexan-Cf (1:1) vào cắn, đun nóng nhẹ tan hồn tồn Sau để nguội, làm lạnh thấy kết tủa vàng xuất Tách tủa khỏi dung dịch, sau rửa tủa nhiều lần với CHCl3 thu 34,1 mg chất rắn màu vàng dạng bột đặt tên E1 Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất E1 sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khác nhau: n-hexan-Ace (70:30), Cf-MeOH-HCOOH (80:20:05), EtOAcMeOH (90:10) cho vết gọn sắc ký đồ với giá trị R f tương ứng lần luợt 0,22; 0,51 0,89 (hình 3.26) Do sơ kết luận hợp chất E1 đạt tinh khiết sắc ký lớp mỏng Trên sắc ký đồ cho thấy hợp chất E1 tắt quang UV 254 nm, không phát quang UV 365 nm có màu vàng cam với thuốc thử VS 54 Hình 3.26 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết hợp chất E1 Phân lập tinh chế chất E2 từ cao EA7 Cao EA7 sau cô quay thu hồi dung môi cho bay tự nhiên tiếp phần dung mơi cịn lại thu cắn (752,1 mg) Kiểm tra sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi Cf-MeOH (90:10) hình 3.25 cho thấy cao EA7 có hai vết vàng (R f = 0,1) hồng (Rf = 0,3) Do cao EA7 tiếp tục phân tách sắc ký cột Điều kiện sắc ký cột cổ điển: - Cột thủy tinh có khóa nhựa với kích thước 1,0 x 75 cm - Pha tĩnh: 45 g silica gel 60 cỡ hạt 40–63 µm (Merck, Đức) với chiều cao pha tĩnh 38 cm - Mẫu: 752,1 mg cao EA7 trộn với silica gel, phương pháp nạp mẫu khô - Nhồi cột hỗn dịch, chạy dung môi CHCl3 ổn định - Pha động: chạy cột với dung môi CHCl (100%), tăng dần tỷ lệ CHCl3EtOAc đến (0:100) Sau tiếp tục triển khai với hệ EtOAc-MeOH từ tỷ lệ (99:1) đến (80:20) - Hệ dung môi khai triển TLC: hệ EtOAc-MeOH (85:15) dùng để theo dõi kiểm tra sắc ký đồ bình dịch giống gộp lại cô thu hồi dung môi phân đoạn tương ứng Sắc ký đồ phát cách soi đèn UV bước sóng 254 nm 365 nm, sau phun thuốc thử VS - Thể tích hứng: 10 mL/ bình 55 Kết sau triển khai cột thu phân đoạn (EA7-1 đến EA7-7) Sau phân đoạn EA7-7 triển khai với sắc ký cột Sephadex LH-20 (điều kiện cột sắc ký tương tự phân lập hợp chất C3) thu phân đoạn EA7-7.1 đến EA7-7.3 Để dịch EA7-7.3 gần cạn cho CHCl vào thấy xuất tủa trắng, tách tủa khỏi dịch rửa tủa với n-hexan, CHCl3 EtOAc lạnh, thu 14,1 mg dạng bột màu trắng đặt tên E2 Hợp chất E2 kiểm tra tinh khiết TLC với hệ dung môi: EtOAcHCOOH (95:05), EtOAc-HCOOH-H2O (80:05:05); EtOAc-HCOOH-H2O (100:25:25) Trên sắc ký đồ, hợp chất E2 cho vết gọn soi đèn UV 254 thấy tắt quang, UV 365 cho phát quang màu xanh lơ thuốc thử VS cho màu hồng nhạt (hình 3.28) Hình 3.27 Kết sắc ký đồ phân đoạn từ cao EA7 Hình 3.28 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết hợp chất E2 56 3.6.3 Xác định cấu trúc chất phân lập 3.6.3.1 Xác định cấu trúc hợp chất C1 Hợp chất C1 (54,8 mg) thu có dạng tinh thể hình kim, màu vàng, tan tốt CHCl3, MeOH, tan n-hexan Hợp chất C1 tắt quang UV 254 nm, không phát quang UV 365 nm cho màu xanh rêu với thuốc thử FeCl3 1%, màu vàng cam với thuốc thử VS Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS hợp chất C1 cho tín hiệu ion tựa phân tử m/z = 329,1029 [M+H]+ nên khối lượng phân tử hợp chất C1 tương ứng 328,1029 Chính vậy, từ HR-MS gợi ý hợp chất C1 có cơng thức phân tử C18H16O6 với độ bất bão hoà Ω = 11 (phụ lục 3-1) Kết hợp phân tích liệu phổ 1H-NMR HSQC cho thấy có diện ba tín hiệu nhóm methoxy H 3,81, H 3,87 H 3,87 Đồng thời, nhóm 5-OH thể có dạng singlet đỉnh nhọn đặc trưng vị trí H 12,63, gợi ý liên kết hydro nội phân tử nhóm OH Ngồi ra, liệu phổ cho thấy hai tín hiệu cộng hưởng proton thơm ghép đơi meta vịng A với độ dịch chuyển hóa học H 6,38 (1H, d, J = 2,2 Hz) H 6,76 (1H, d, J = 2,2 Hz) quy kết tương ứng cho H-6 H-8 Bên cạnh đó, liệu phổ cho thấy hệ thống spin AA'BB' vòng B với H 7,14 (H-3' H-5') H 8,06 (H-2' H-6') có J = 9,0 Hz vịng B gắn nhóm vị trí 4' Trong đó, liệu phổ 13C-NMR phổ DEPT-NMR xuất 18 tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho hợp chất nhóm trimethoxyflavonoid, bao gồm tín hiệu cộng hưởng nhóm methoxy C 55,4; C 56,1; C 59,7 15 Csp2 gồm ceto carbonyl C 178,1; carbon tứ cấp gắn oxy (C 138,1–165,2), cặp carbon đối xứng (có cường độ cao C 130,0 C 114,2), carbon tứ cấp không gắn oxy (C 122,1 C 105,2) carbon có C 92,4 C 97,8 tương ứng với C-8 C-6 Từ kiện dự đoán hợp chất C1 flavonol với nhóm methoxy nhóm hydroxyl Phổ HMBC thể vị trí nhóm khác khung flavonol xác định, nhóm methoxy H 3,81 (3-OCH3) cho thấy có tương tác 57 proton với C-3 C 138,1 nhóm methoxy H 3,87 (7-OCH3) thể tương tác proton C 165,2 C-7, nhóm methoxy H 3,87 (4'-OCH3) thể tương tác proton với C-4' (C 161,4) Proton thơm H 6,76 (H-8) cho thấy có tương tác với C-6 (C 97,8), C-4a (C 105,2) hai tương tác với C-8a (C 156,3) C-7 (C 165,2) xác nhận vị trí nhóm methoxy C-7 Ngồi ra, proton thơm H 8,06 (H-2', H-6') thể tương tác với C-4' (C 161,4) C-2', C-6' (C 130,0) hai tương tác với C-3', C-5' (C 114,2), proton thơm H 7,14 (H3', H-5') thể tương tác với C-1' (C 122,1) tương tác với C-4' (C 161,4) xác nhận vị trí nhóm methoxy thứ hai C-4' (phụ lục hình 3.29) Kết hợp liệu phổ tài liệu tham khảo 60 xác định hợp chất C1 5-hydroxy- 3,7,4'-trimethoxyflavon (bảng 3.9) Bảng 3.9 C Dữ liệu phổ NMR hợp chất C1 5-Hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavon 60 Hợp chất C1 (DMSO-d6, 150/600 MHz) CHn C ppm CIV CIV CIV CIV CH 155,1 138,1 178,1 160,9 97,8 CIV CH 165,2 92,4 8a 4a 1' 2' CIV CIV CIV CH 156,3 105,2 122,1 130,0 3' CH 114,2 4' 5' CIV CH 161,4 114,2 5-Hydroxy-3,7,4'trimethoxyflavon 60 (DMSO-d6, 150/500 MHz) HMBC H ppm, mult., (J=Hz) C ppm H ppm, mult., (J=Hz) 156,7 138,5 176,1 161,2 6,38 (1H, d, J = 2,2 4a, 5, 7, 98,0 6,35 (1H, d, J = Hz) 1,9 Hz) 166,0 6,76 (1H, d, J = 2,2 4a, 6, 7, 92,2 6,72 (1H, d, J = Hz) 8a 1,9 Hz) 157,0 104,0 122,6 8,06 (1H, d, J = 9,0 2, 3', 4', 129,9 8,03 (1H, d, J = Hz) 6' 9,2 Hz) 7,14 (1H, d, J = 9,0 1', 4', 5' 114,0 7,11 (1H, d, J = Hz) 9,2 Hz) 161,9 7,14 (1H, d, J = 9,0 1', 4', 3' 114,0 7,11 (1H, d, J = Hz) 9,2 Hz) 58 6' CH 130,0 5-OH - 3-OCH3 7-OCH3 4'-OCH3 59,7 56,1 55,4 Hình 3.29 8,06 (1H, d, J = 9,0 2, 2', 3', Hz) 4' 12,63 (1H, s) 4, 5, 6, 7, 4a 3,81 (3H, s) 3,87 (3H, s) 5, 3,87 (3H, s) 4' 129,9 - 8,03 (1H, d, J = 9,2 Hz) 12,50 (1H, s) 59,5 55,9 55,5 3,79 (3H, s) 3,84 (3H, s) 3,84 (3H, s) Các tương quan phổ HMBC (mũi tên) COSY (nối in đậm) hợp chất C1 3.6.3.2 Xác định cấu trúc hợp chất C2 Hợp chất C2 (505,1 mg) dạng bột vơ định hình màu trắng, tan CHCl3, không tắt quang UV 254 nm, không phát quang UV 365 nm cho màu tím với thuốc thử VS Phổ 13C-NMR hiển thị 29 tín hiệu cộng hưởng, cho thấy tín hiệu dễ nhận biết có độ dịch chuyển hóa học vị trí δC 121,7; 138,2 129,3 ứng với carbon methin δC 140,8 ứng với carbon không mang hydro, thể tín hiệu carbon olefin quy kết tương ứng cho C-6, C-22, C-23 C-5 Ngồi ra, tín hiệu carbon oxymethin quan sát δ C 71,85 quy kết cho C-3 So sánh tín hiệu vị trí C-5, C-6, C-22, C-23 hợp chất C2 với tài liệu tham khảo 61., gợi ý tín hiệu thường gặp sterol Phổ 1H-NMR (600 MHz, CDCl3) với liệu lưu ý tín hiệu đặc trưng proton nhóm oxymethin δH 3,52 (1H, tt, J = 11,2; 4,7 Hz, H-3); proton olefin (của nhóm carbon methin) δH 5,35 (1H, dt, J = 5,4; 2,0 Hz, H-6) tín hiệu proton nhóm carbon methin δ H 5,02 (dd, J = 15,2; 8,7 Hz, H-22) 5,15 (dd, J = 15,2; 8,7 Hz, H-23); nhóm methyl có δ H từ 0,68-1,01 tương ứng δH 59 0,68 (3H, s, H-18), δH 0,82 (9H, m, H-26; H-27; H-29), δH 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21), δH 1,01 (3H, s, H-19) (phụ lục 5) Phổ MS (phụ lục 3-2) hợp chất C2 cho mảnh ion giả phân tử [M+H]+ có m/z 415 gợi ý cơng thức phân tử C29H50O (Ω = 5) [MH] có m/z 412,9 gợi ý  công thức phân tử C29H48O (Ω = 6) Từ liệu phổ, dự đốn hợp chất C2 hỗn hợp β-sitosterol stigmasterol Như vậy, tín hiệu proton δH 5,02 (dd, J = 8,7; 15,2 Hz) 5,15 (dd, J = 8,7; 15,2 Hz) quy kết tương ứng cho H-22 H-23 stigmasterol Khi δH 5,35 (1H, dt, J = 2,0; 5,4 Hz) định H-6 β-sitosterol stigmasterol Liên kết đơn C22 – C23 β‐sitosterol liên kết đôi C22 = C23 stigmasterol điểm khác biệt cấu trúc hai hợp chất Đồng thời dựa vào tỷ số tích phân phổ 1H-NMR H-6, H22 H-23 cho tỷ lệ tương ứng 0,89:0,14:0,11 Do suy hỗn hợp β-sitosterol stigmasterol chiếm tỷ lệ 6,12:1,0; tức β-sitosterol chiếm đa số hỗn hợp (> 85%) β-sitosterol Hình 3.30 Stigmasterol Cấu trúc hợp chất C2 (hỗn hợp β-sitosterol stigmasterol) Bảng 3.10 Hợp chất C2 (CDCl3, 150 MHz) Dữ liệu phổ 13C-NMR C2 hỗn hợp β-sitosterol, stigmasterol 61 Hỗn hợp βsitosterol stigmasterol (CDCl3, 125 MHz) 61 Hợp chất C2 (CDCl3, 150 MHz) Hỗn hợp βsitosterol stigmasterol (CDCl3, 125 MHz) 61 60 C ppm C 10 11 12 13 14 15 C ppm C ppm C ppm C 37,2 31,6 71,8 42,3 140,7 121,7 31,9 31,9 50,1 36,5 21,0 39,7 42,3 56,7 24,3 37,2 31,7 71,8 42,3 140,7 121,7 31,9 31,9 50,2 36,5 21,1 39,8 42,3 56,8 24,3 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 - 28,2 56,0 11,9 19,3 36,1 18,7 33,9; 138,2 26,1; 129,3 45,8; 51,2 29,1; 31,6 19,0 19,8 23,0; 24,3 11,8; 11,9 28,2 56,1 11,9 19,4 36,1 18,8 33,9; 138,2 26,1; 129,3 45,8; 51,2 29,2; 31,7 19,0 19,8 23,1; 24,3 11,9; 12,2 3.6.3.3 Xác định cấu trúc hợp chất C3 Hợp chất C3 (83,1 mg) có dạng dầu màu vàng, tan MeOH, aceton, tan CHCl3 Soi UV 254 nm hợp chất C3 cho tắt quang UV 365 nm không phát quang, màu xanh mạ với thuốc thử VS Khối phổ ESI-MS cho mũi ion [M+H]+ m/z 315,0 gợi ý hợp chất có cơng thức phân tử C19H22O4 (Ω = 9, M = 314,0) (phụ lục 3-3) Phổ 13C-NMR, phổ DEPT-NMR phổ HSQC cho thấy có 19 tín hiệu cộng hưởng bao gồm carbon carbonyl, carbon oxymethin, carbon methylen 12 carbon thơm (Csp2), có carbon bậc IV khơng mang oxy (δ C 134,1 δC 133,3), carbon bậc IV mang oxy (δC 156,6 δC 156,4), bốn tín hiệu carbon thơm mang hydro δC 130,3; 130,3; 116,2; 116,1 có cường độ cao gấp đơi tín hiệu Csp2 khác, chứng tỏ có đối xứng vòng thơm Như vậy, hợp chất C3 chứa vòng benzen 1,4 mạch hở gồm carbon, dự đốn hợp chất C3 diarylheptanoid Phân tích phối hợp phổ HSQC 1H-NMR cho thấy tín hiệu vịng thơm có proton δH 6,99 (1H, d, J = 8,2 Hz, H-2'/H-6' H-2"/H-6") gắn với C2'/C-6' (δC 130,3), C-2"/C-6" (δC 130,35) proton δH 6,68 (1H, dd, J = 8,5; 5,0 61 Hz, H-3'/H-5' H-3"/5") gắn với C-3'/C-5' (δC 116,1), C-3"/C-5" (δC 116,2) Bên cạnh đó, tín hiệu proton δH 4,00 thuộc nhóm carbinol C-5 (δC 68,3) Dữ liệu phổ 1H-NMR cho thấy có xuất tín hiệu proton nhóm methylen kế cận vòng benzen δH 2,74 (2H, d, J = 4,6 Hz), δH 2,55 (2H, m) nhóm methylen mạch hở δH 2,73 (2H, d, J = 3,8 Hz), δH 2,55 (2H, m), δH 1,66 (2H, m) Tương quan HMBC proton methylen δH 2,54 (H-7) C-2'/C-6' (δC 130,3), H-2"/H-6" (δH 6,99) C-1 (δC 29,8), δH 2,74 (H-1) C-2"/C-6" (δC 130,3), C-2 (δC 46,4), δH 2,73 (H-2) C-1 (δC 29,8), C-3 (δC 212,0), δH 1,66 (H6) C-5 (δC 68,3), C-7 (δC 31,9), δH 2,62 (H-4) C-3 (δC 212,0), C-5 (δC 68,3), C-6 (δC 40,5) (phụ lục 6) Bảng 3.11 C CHn C ppm CH2 29,8 CH2 46,4 CIV CH2 CH CH2 CH2 212,0 51,3 68,3 40,5 31,9 1' 2' CIV CH 133,3 130,3 3' CH 116,1 4' 5' CIV CH 156,4 116,1 6' CH 130,3 1" 2" CIV CH 134,1 130,3 Dữ liệu phổ NMR hợp chất C3 Platyphyllon 62 Hợp chất C3 (CD3OD, 150/600 MHz) HMBC H ppm, mult., (J = Hz) 2,74 (2H, d, J = 4,6 2, 2", 3, 6" Hz) 2,73 (2H, d, J = 3,8 1, 2, Hz) 2,55 (2H, m) 3, 5, 4,00 (1H, m) 1,66 (2H, m) 4, 5, 2,65 (1H, m); 1",2', 5, 6, 6' 2,55 (1H, m) 6,99 (1H, d, J = 8,2 2', 3', 4', 6', Hz) 6,68 (1H, dd, J = 1', 2', 3', 4', 8,5; 5,0 Hz) 5' 6,68 (1H, dd, J = 1', 3', 4', 5' 8,5; 5,0 Hz) 6,99 (1H, d, J = 8,2 2', 4', 5', 6', Hz) 6,99 (1H, d, J = 8,2 1, 2", 3", 4", Platyphyllon 62 (CD3OD, 125/500 MHz) C ppm H ppm, mult., (J = Hz) 29,9 2,73 (m, H-1) 46,5 2,71 (m, H-2) 212,1 51,3 68,4 40,0 32,3 2,61 (m, H-4) 4,00 (J = 13,0 Hz) 1,66 (dd, J = 9,0 Hz) 2,51 (m, H-7) 133,4 130,4 6,99 (d, J = 8,5 Hz) 116,2 6,69 (dd, J = 8,5 Hz) 156,5 116,2 6,69 (dd, J = 8,5 Hz) 130,4 6,99 (d, J = 8,5 Hz) 134,2 130,4 6,98 (d, J = 8,5 Hz) 62 3" CH 116,2 4" 5" CIV CH 156,6 116,2 6" CH 130,3 4'-OH 4"-OH - Hz) 6,68 (1H, dd, J = 8,5; 5,0 Hz) 6,68 (1H, dd, J = 8,5; 5,0 Hz) 6,99 (1H, d, J = 8,2 Hz) 6" 1", 2", 3", 116,3 4", 5" 156,7 1", 3", 4", 5" 116,3 1, 2", 4", 5", 130,4 6" - Dựa vào dự liệu phổ tài liệu tham khảo 62 6,68 (dd, J = 9,0 Hz) 6,68 (dd, J = 9,0 Hz) 6,98 (d, J = 8,5 Hz) xác định hợp chất C3 platyphyllon Hình 3.31 Các tương quan phổ HMBC (mũi tên) COSY (nối in đậm) hợp chất C3 3.6.3.4 Xác định cấu trúc hợp chất C4 Hợp chất C4 (12,3 mg) dạng bột vơ định hình màu trắng Khối phổ ESI-MS cho mảnh ion giả phân tử có m/z 320,6 [M-2H2O-H]– (100), m/z 356,8 [M-H]– (23,73), m/z 338,6 [M-H2O-H]– (32,20) gợi ý công thức phân tử C21H42O4 (M = 358,0; Ω = gợi ý phân tử khơng vịng) (phụ lục 3-4) Phổ 13C-NMR phổ DEPT-NMR cho thấy tín hiệu cacbonyl (δ C 174,3 kết hợp Ω = gợi ý acid ester), carbon methyl (δC 14,1), tín hiệu carbon mang oxy (trong có tín hiệu carbon methin (δ C 70,3), tín hiệu carbon methylen (δC 65,2 δC 63,4)) tín hiệu cộng hưởng carbon methylen (tương ứng từ δC 22,7 đến δC 34,2) Bên cạnh đó, liệu phổ 1H-NMR cho thấy vùng trường thấp có cụm tín hiệu proton dạng hệ kép ABX-A'B'X: proton AB gắn CH2 ghép với proton X gắn CH với δHA 4,14; δHB 4,08; δHX 3,86 có JAB = 11,7 Hz, JAX = 6,2 Hz, JBX = 4,6 Hz; tương tự proton X ghép với proton A'B' gắn CH khác với δHX 3,86; δHA' 3,63; δHB’ 3,53 có 63 JA'B' = 11,5 Hz, JA'X = 5,8 Hz, JB'X = 3,9 Hz Độ dịch chuyển hóa học proton A', B', X cho thấy nhóm CH nhóm CH gắn trực tiếp với nhóm OH sau kết hợp với liệu MS Ngoài ra, proton A B bị giảm chắn (δ H 4,14; δH 4,08) nên chứng tỏ nhóm CH nằm cạnh nhóm carbonyl ester (COO; δ C 174,3), thông tin kiểm tra phổ HMBC cho thấy nhóm CH2 tương tác xa với nhóm carbonyl suy CH2 gắn vô oxy nhóm ester Hơn nữa, kết hợp phổ 1H-NMR phổ HSQC, tín hiệu proton δH 0,81 (3H, t, J = 7,0 Hz) gắn với C-18 (δC 14,1) xác định nhóm CH3 Các tín hiệu 13C-NMR cho thấy δC 34,2 δC 24,9 carbon C-2 C-3 hiệu ứng rút điện tử nhóm cacbonyl (phụ lục 7) Thơng tin phổ khơng cho thấy tín hiệu carbon nhân thơm kết hợp với liệu phân tích gợi ý glycerol ester hóa với acid bão hịa mạch hở Từ cơng thức phân tử hợp chất C4 (Phổ MS) C21H42O4 kết hợp so sánh phổ với tài liệu tham khảo 63 dự đốn hợp chất C4 glycerol monostearat Hình 3.32 Các tương quan phổ HMBC (mũi tên) COSY (nét in đậm) hợp chất C4 Bảng 3.12 C CHn Civ CH2 CH2 417 CH2 Dữ liệu phổ NMR hợp chất C4 Glycerol monostearat 63 Hợp chất C4 (CDCl3, 150/600 MHz) C ppm H ppm, mult., (J=Hz) 174,3 34,2 2,28 (2H, t, J = 7,2 Hz) 24,9 1,56 (2H, quintet, J = 7,5 Hz) 22,7; 29,1– 29,7; 31,9 1,18–1,24 (m) Glycerol monostearat 63 (CDCl3, 150/600 MHz) C ppm H ppm, mult., (J=Hz) 174,3 34,2 2,35 (2H, t, J = 7,0 Hz) 24,9 1,63 (2H, quintet, J = 7,0 Hz) 22,7; 1,23–1,35 (28H, m) 29,1– 29,7; 31,9 64 18 1' CH3 CH2 14,1 65,2 2' CH 70,3 3' CH2 63,4 2'-OH 3'-OH 0,81 (3H, t, J = 7,0 Hz) 14,1 4,14 (1H, dd, J = 11,7; 4,6 65,0 Hz) 4,08 (1H, dd, J = 11,7; 6,2 Hz) 3,86 (1H, t, J = 5,4 Hz) 70,0 3,63 (1H, dd, J = 11,5; 3,9 63,0 Hz) 3,53 (1H, dd, J = 11,4; 5,8 Hz) 2,44 (1H, brs) 1,99 (1H, brs) - - 0,80 (3H, t, J = 7,0 Hz) 4,14 (1H, dd, J = 12,0; Hz) 4,11 (1H, dd, J = 12,0; Hz) 3,88 (1H, quintet, J = Hz) 3,64 (1H, dd, J = 12,0; Hz) 3,56 (1H, dd, J = 12,0; Hz) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 3.6.3.5 Xác định cấu trúc hợp chất E1 Hợp chất E1 (34,1 mg) có dạng bột màu vàng, tan tốt MeOH, EtOH aceton, không tan n-hexan Soi đèn UV, hợp chất E1 cho tắt quang bước sóng 254 nm, khơng phát quang bước sóng 365 nm, có màu vàng cam với thuốc thử VS màu xanh rêu với thuốc thử FeCl 1% Công thức phân tử hợp chất E1 gợi ý C15H10O6 (Ω = 11, M = 286,0) dựa mũi ion phân tử có m/z = 284,8 [MH] khối phổ ESI-MS (phụ lục 3-5)  Phổ 1H-NMR hợp chất E1 xuất tín hiệu cặp proton thơm ghép đơi ortho đối xứng vị trí H 8,04 (d, J = 9,0 Hz, H-2', H-6') H 6,92 (d, J = 9,0 Hz, H-3', H-5'), proton thơm ghép meta vị trí H 6,19 (1H, d, J = 1,8 Hz) H 6,44 (1H, d, J = 1,8 Hz) tương ứng với C-6 C-8 phổ HSQC, nhóm hydroxyl kiềm nối H 12,46 (s, 5-OH) nhóm hydroxyl gắn vịng thơm 3-OH, 4'-OH, 7-OH Trong đó, phổ 13C-NMR phổ DEPT-NMR xuất 15 carbon tín hiệu, bao gồm carbonyl carbon C 175,9 carbon tứ cấp mang oxy (C 135,6–163,9), cặp carbon đối xứng (có cường độ cao C 129,5 C 115,4), carbon tứ cấp không mang oxy (C 121,7 C 103,1) carbon có C 93,5 C 98,2 tương ứng với C-8 C-6 Điều cho thấy hợp chất E1 hợp chất nhóm flavonol có nhóm 5-OH tự nhóm vị trí C-4' tạo đối xứng vòng B Kết kiểm tra lại phổ HSQC liệu cho 65 phù hợp tương ứng (phụ lục 8-6) Đồng thời, thông tin phổ HMBC cho thấy proton thơm H 6,44 (H-8) có tương tác với C-6 (C 98,2), C-4a (C 105,2) C-7 (C 163,9) xác nhận vị trí nhóm hydroxyl C-7 Ngoài ra, proton thơm H 8,04 (H-2', H-6') thể tương tác với C-4' (C 159,2) C-2', C-6' (C 129,5) hai tương tác với C-3', C-5' (C 115,4), proton thơm H 6,92 (H3', H-5') thể tương tác với C-1' (C 121,7) tương tác với C-4' (C 159,2) xác nhận vị trí nhóm hydroxyl thứ hai C-4' (phụ lục 8-9) Bảng 3.13 C CHn CIV CIV CIV CIV CH CIV CH 8a 4a 1' 2' CIV CIV CIV CH 3' CH 4' 5' CIV CH 6' CH 5-OH 3-OH 7-OH 4'-OH Dữ liệu phổ NMR hợp chất E1 Kaempferol 64 Hợp chất E1 (DMSO-d6, 150/600 MHz) HMBC C ppm H ppm, mult., (J = Hz) 146,8 135,6 175,9 156,2 98,2 6,19 (1H, d, J = 4a, 7, 1,8 Hz) 163,9 93,5 6,44 (1H, d, J = 4a, 6, 1,8 Hz) 160,7 103,1 121,7 129,5 8,04 (1H, d, J = 2, 3', 4', 6' 9,0 Hz) 115,4 6,92 (1H, d, J = 1', 2', 4', 5' 9,0 Hz) 159,2 115,4 6,92 (1H, d, J = 1', 3', 4', 6' 9,0 Hz) 129,5 8,04 (1H, d, J = 2, 2', 4', 5' 9,0 Hz) 12,46 (1H, s) 4, 4a, 6, 10,10 (1H, s) 10,79 (1H, s) 9.35 (1H, s) - Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Kaempferol 64 (DMSO-d6, 75/300 MHz) C ppm H ppm, mult., (J = Hz) 146,9 135,6 175,9 156,4 98,2 6,18 (1H, d, J = 2,0 Hz) 163,9 93,5 6,44 (1H, d, J = 2,0 Hz) 160,7 103,04 121,7 129,5 8,05 (1H, d, J = 8,9 Hz) 115,4 6,93 (1H, d, J = 8,9 Hz) 159,2 115,4 6,93 (1H, d, J = 8,9 Hz) 129,5 8,05 (1H, d, J = 8,9 Hz) - 12,48 (1H, s) 10,11 (1H, s) 10,77 (1H, s) 9,4 (1H, s) 66 Hợp chất E1 có liệu phổ tương tự hợp chất C1, ngoại trừ có mặt nhóm hydroxyl vị trí C-3, C-4', C-7 khơng bị methoxy hóa hợp chất C1 Căn vào thông tin phổ tài liệu tham khảo 64 , hợp chất E1 xác định kaempferol (C15H10O6) Hình 3.33 Các tương quan phổ HMBC (mũi tên) COSY (nối in đậm) hợp chất E1 3.6.3.6 Xác định cấu trúc hợp chất E2 Hợp chất E2 (14,1 mg) dạng bột tinh thể màu trắng Phổ ESI-MS cho mảnh ion giả phân tử có m/z 351,4 [M3H] (100), 191,8 [MCaffeoylH] (9,1) gợi ý công   thức phân tử C16H18O9 (Ω = 8, M = 354,0) (phụ lục 3-6) Phổ 13C-NMR phổ DEPT-NMR cho thấy có 16 tín hiệu cộng hưởng chia làm đơn vị: Đơn vị I bao gồm carbon carboxyl (δC 168,7), carbon olefin (δC 147,1 δC 115,2) carbon thơm (1 carbon tứ cấp không mang oxy δ C 127,8 carbon tứ cấp có mang oxy δC 149,6; δC 146,8 ba tín hiệu carbon thơm mang hydro δC 123,0; δC 116,5 δC 115,3), khơng có tín hiệu đối xứng nên có nhóm thường thấy vị trí C-3 C-4 (tương ứng với carbon tứ cấp có mang oxy) Như vậy, gợi ý đơn vị I có chứa vịng benzen mạch hở gồm carbon Phổ 1HNMR phân tích kết hợp với phổ HSQC cho thấy xuất tín hiệu proton thuộc hệ tương tác ABX vị trí H 7,07 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-2'), H 6,97 (1H, dd, J = 8,1; 2,1 Hz, H-6') H 6,80 (1H, d, J = 7,8 Hz, H-5') thuộc vòng thơm quy kết cho C-2', C-6' C-5', proton mạch hở H 7,58 (1H, d, J = 16,2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 67 Hz, H-7') H 6,28 (1H, d, J = 15,6 Hz, H-8') quy kết cho C-7' C-8' với cấu dạng trans Ngoài ra, phổ HSQC cho thấy proton H-8' (δH 6,28) liên kết với carbon C-8' (δC 115,2) phổ HMBC proton H-8' có tương quan với carbon C-9' δC 168,7 Dựa vào liệu trên, xác định đơn vị I acid trans-caffeic (C9H8O4) (phụ lục 9) Đơn vị II bao gồm carbon carbonyl (δC 177,0), carbon methylen (δC 38,8 δC 38,2) carbon liên kết với oxy (δ C 76,1; δC 73,5; δC 72,0 δC 71,3) Phân tích phối hợp phổ HSQC, phổ 1H-NMR phổ HMBC cho thấy tín hiệu proton δH 2,05 (2H, m, H-2) liên kết với C-2 (δ C 38,2) tương quan với C-3 (δ C 71,3); proton δH 4,19 (1H, m, H-3) liên kết với C-3 (δ C 71,3); proton δH 3,74 (1H, dd, J = 8,4; 3,0 Hz, H-4) liên kết với C-4 (δ C 73,5) tương quan với C-2 (δC 38,2); proton δH 2,20 (2H, m, H-6) liên kết với C-6 (δC 38,8) tương quan với C-1 (δ C 76,1), C-5 (δC 72,0) C-7 (δC 177,0); proton δH 5,35 (1H, m, H-5) liên kết với C-5 (δ C 73,5) tương quan với C-9' (δC 168,7) Dữ liệu phổ nhận định đơn vị II acid quinic (C 7H12O6) (phụ lục 9) Bảng 3.14 C CHn CIV CH2 CH CH CH CH2 CIV (-COO) Dữ liệu phổ NMR hợp chất E2 Acid 5-O-caffeoylquinic 65 Hợp chất E2 (CD3OD, 150/600 MHz) HMBC C ppm H ppm, mult., (J = Hz) 76,1 38,2 2,08 (2H, m) 1, 2, 3, 4, (2,06–2,12) 6, 71,3 4,19 (1H, m) 1, 2, 3, 4, (4,18–4,20) 73,5 3,74 (1H, dd, J = 2, 3, 4, 8,4; 3,0 Hz) 72,0 5,35 (1H, m) 1, 3, 4, 5, (5,34–5,37) 6, 9' 38,8 2,20 (2H, m) 1, 2, 4, 5, (2,18–2,21) 6, 177,0 - Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Acid 5-O-caffeoylquinic 65 (CD3OD, 75/300 MHz) C ppm H ppm, mult., (J = Hz) 76,1 38,2 2,01–2,08 (2H, m) 71,3 4,12–4,20 (1H, m) 73,5 3,70–3,75 (1H, m) 72,0 5,29–5,36 (1H, m) 38,8 2,16–2,21 (2H, m) 177,0 - 68 1' 2' CIV CH 127,8 115,3 3' 4' 5' CIV CIV CH 146,8 149,6 116,5 6' CH 123,0 7' CH 147,1 8' CH 115,2 CIV (=CO) 1/3/4/3'/4'-OH 168,7 7,07 (1H, d, J 1,8 Hz) 6,80 (1H, d, J 7,8 Hz) 6,97 (1H, dd, J 8,1; 2,1 Hz) 7,58 (1H, d, J 16,2 Hz) 6,28 (1H, d, J 15,6 Hz) - - - 9' = 3', 4', 6', 7' 127,8 115,3 = 1', 3', 4' 146,8 149,6 116,5 = 2', 4', 5', 7' 123,0 = 1', 2', 6', 7', 147,1 9' = 1', 7', 9' 115,2 7,04 (1H, d, J = 1,7 Hz) 6,77 (1H, d, J = 8,3 Hz) 6,95 (1H, d, J = 8,3 Hz) 7,56 (1H, d, J = 16 Hz) 6,27 (1H, d, J = 16 Hz) - 168,7 - - - - Kết hợp đơn vị lại với dựa vào dịch chuyển vùng trường thấp tín hiệu cộng hưởng δH 5,34–5,37 nhóm hydroxyl C-5 acyl hóa gốc acid caffeic Từ liệu phổ tài liệu tham khảo 65 , nhận định hợp chất E2 acid trans-5-O-caffeoylquinic (C16H18O9) Hình 3.34 Các tương quan phổ HMBC (mũi tên) COSY (nối in đậm) hợp chất E2 3.6.4 Đánh giá tác dụng sinh học chất tinh khiết 3.6.4.1 Tác dụng chống oxy hóa mơ hình DPPH Thử nghiệm chống oxy hóa mơ hình DPPH tiến hành mơ tả mục 2.2.5.1 với acid ascorbic(A0278) đối chứng dương Kết thể qua bảng 3.15 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 69 Bảng 3.15 Kết thử nghiệm chống oxy hóa giá trị IC50 mẫu thử mơ hình DPPH Chứng dương acid ascorbic Nồng độ (μg/mL) 2,5 5,0 7,5 10,0 % Ức chế 32,47 48,73 60,57 81,44 IC50 5,34 μg/mL = 30,33 μM (R = 0,9938) Hợp chất C1 (5-Hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavon) Nồng độ (μg/mL) 100 150 200 250 % Ức chế 23,57 35,13 42,40 49,63 IC50 260,90 μg/mL = 794,71 μM (R = 0,9931) Hợp chất E1 (Kaempferol) Nồng độ (μg/mL) 1,25 2,5 5,0 7,5 % Ức chế 26,94 42,44 59,21 75,18 IC50 4,03 μg/mL = 14,08 μM (R = 0,9808) Hợp chất E2 (acid trans-5-O-caffeoylquinic) Nồng độ (μg/mL) 2,5 5,0 10 15 % Ức chế 19,21 26,72 47,81 63,93 IC50 10,70 μg/mL = 30,20 μM (R = 0,9952) 12,5 94,06 500 83,96 10,0 87,28 20 88,35 Kết đánh giá hoạt tính chống oxy hóa giá trị IC 50 chất tinh khiết phân lập cho thấy số chất hợp chất E1 (IC50 = 14,08 μM) có tác dụng chống oxy hóa mạnh mạnh gấp lần so với acid ascorbic (IC 50 = 30,33 μM) Trong đó, hợp chất E2 (IC50 = 30,20 μM) có tác dụng chống oxy hóa tương đương acid ascorbic Ngồi ra, hợp chất C1 (IC50 = 794,71 μM) thể hoạt tính yếu so với acid ascorbic khoảng 26 lần Các hợp chất C2, C3, C4 cho tác dụng chống oxy hóa yếu, khơng thể tính giá trị IC 50 Tại nồng độ 500 μg/mL, hợp chất C3 có % hoạt tính chống oxy hóa lớn hợp chất C2 C4 với giá trị 41,89; 28,96; 25,69% (phụ lục PL2-3, PL2-48) Các kết cho thấy Gừng đen ứng viên tiềm cho hoạt tính chống oxy hóa 3.6.4.2 Tác dụng ức chế α-glucosidase Tiến hành tương tự mơ hình ức chế α-glucosidase mô tả mục 2.2.5.2 với acarbose(A8980) thuốc đối chứng dương Kết thể qua bảng 3.16 Bảng 3.16 Kết thử nghiệm giá trị IC50 mẫu thử mô hình ức chế α-glucosidase Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 70 Chứng dương acarbose Nồng độ (μg/mL) 93,75 187,5 375 750 % Ức chế 14,41 25,91 42,85 56,52 IC50 528,47 μg/mL = 818,59 μM (R = 0,9962) Hợp chất C1 (5-Hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavon) Nồng độ (μg/mL) 18,75 37,5 75,0 100 % Ức chế 5,46 27,04 53,46 72,21 IC50 62,18 μg/mL = 189,40 μM (R = 0,9894) Hợp chất C3 (Platyphyllon) Nồng độ (μg/mL) 6,25 12,5 25,0 50,0 % Ức chế 32,47 36,28 54,24 73,49 IC50 21,82 μg/mL = 69,41 μM (R2 = 0,9962) Hợp chất E1 (Kaempferol) Nồng độ (μg/mL) 2,5 5,0 10 12,5 % Ức chế 12,54 29,84 52,62 60,93 IC50 9,12 μg/mL = 31,86 μM (R = 0,9970) 1500 73,68 150 85,93 100 87,04 20 80,41 Theo kết thử hoạt tính cho thấy chất phân lập cho tác dụng ức chế α-glucosidase Trong đó, hợp chất E1 (IC50 = 31,86 μM) thể hoạt tính ức chế α-glucosidase mạnh mạnh gấp lần so với hợp chất C3 (IC50 = 69,41 μM), khoảng lần so với hợp chất C1 (IC50 = 189,40 μM) Ngoài ra, hợp chất E1, C3 C1 cho hoạt tính tốt so với thuốc đối chứng dương acarbose (IC50 = 818,59 μM) Tuy nhiên, nồng độ 500 μg/mL, hợp chất C2 cho tác dụng ức chế α-glucosidase 66,30% Trong đó, hợp chất C4 E2 thể hoạt tính ức chế α-glucosidase yếu nồng độ 400 μg/mL 4,76 3,34% (phụ lục PL2-9, PL2-1013) Kết thể khả ức chế αglucosidase Gừng đen, dược liệu quý đặc hữu Miền Trung Việt Nam, góp phần cho nguồn nguyên liệu việc phát triển sản phẩm có tác dụng hạ đường huyết 3.6.5 Sơ đồ tổng kết phân lập giá trị IC50 cho hoạt tính sinh học hợp chất tinh khiết Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 71 Kết q trình phân lập tác dụng chống oxy hóa, ức chế αglucosidase với giá trị IC5 (µM) chất tinh khiết trình bày sơ đồ sau: Hình 3.35 Sơ đồ tổng kết phân lập giá trị IC50 cho hoạt tính sinh học hợp chất tinh khiết Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 72 5-Hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavon (C1) Kaempferol (E1) β-Sitosterol Stigmasterol Glycerol monostearat (C4) Platyphyllon (C3) Acid trans-5-O-caffeoylquinic (E2) Hình 3.36 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 73 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Đặc điểm hình thái định danh thực vật DNA Trong tài liệu tham khảo có, mơ tả chi tiết đặc điểm hình thái ngồi đặc điểm vi học chi Distichochlamys (bao gồm D citrea) chưa báo cáo đầy đủ Do đó, việc xác định đặc điểm giải phẫu vi phẫu bột D citrea trở nên cần thiết Theo nghiên cứu trước đây, có bốn nghiên cứu đặc điểm hình thái Distichochlamys spp., bao gồm Newman (1995), Larsen Newman (2001), Rehse Kress (2003) Nguyễn Quốc Bình & LeongŠkorničková (2012) Tuy nhiên, tất nghiên cứu tập trung vào đặc điểm hình thái ngồi để phân loại thực vật Cho đến chưa có nghiên cứu đặc điểm vi học để xác định thực vật tiêu chuẩn hóa ngun liệu Vì vậy, cơng trình nghiên cứu trình bày đặc điểm hình thái đặc điểm vi học D citrea để làm tiền đề cho nghiên cứu sâu lồi thảo dược Bên cạnh đó, mã vạch DNA công cụ hiệu đáng tin cậy sử dụng để hỗ trợ phân loại học truyền thống dựa đặc điểm hình thái học66.,67.,68 Ngoài ra, mã vạch DNA sử dụng để xác định dược liệu 69 Trong tất mã vạch DNA, ITS báo cáo có khả phân biệt cao so với vùng plastid mức độ phân loại thấp 70 Hơn nữa, số lượng lớn loài thực vật xác định thành công cách sử dụng ITS 71.,72.,73.,74 Cho đến nay, vùng ITS D citrea số tác giả gửi vào Ngân hàng gen nhằm tạo điều kiện cho việc định danh Gừng đen (D citrea) dựa ITS 75.,76.,77 Về mặt hình thái học, đặc điểm hình thái ngồi D citrea VQG Bạch Mã tương tự mô tả Newman (1995) Lồi Gừng đen phân biệt với loài khác đặc điểm màu sắc hoa, cụm hoa cách dựa khóa phân loại Distichochlamys Newman (1995) 1., Larsen Newman (2001) 12 , Rehse Kress (2003) Škorničková (2012) 14 13 Nguyễn Quốc Bình & Leong- Cụ thể, bẹ D citrea cao loài khác (9,0–10 cm) Mặt D citrea có màu xanh lục nhạt trơn mịn, mặt D orlowii có màu đỏ sẫm D benenica có màu xanh lục nhạt với màu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 74 tím gốc Mặt D citrea có màu xanh lục sẫm bóng, mặt loài khác có màu xanh đậm Cụm hoa D citrea có bắc trải rộng hay xoè, lồi khác có bắc đính kèm ôm chắn Cánh hoa D citrea có khe hở dài nửa chiều dài nó, lồi khác có khe hở, kéo dài nửa chiều dài chúng Các đặc điểm chi tiết thể bảng 4.1 đặc điểm chi tiết để phân biệt loài chi Distichochlamys Bảng 4.1 So sánh đặc điểm hình thái D citrea lồi khác chi Distichochlamys Đặc điểm hình thái Dạng sống Bẹ Cuống D citrea Thân thảo nhỏ cao 38–48 cm Cao 9,0–10 cm Dài 20–25 cm, đỏ tím (ở gốc), xanh lục (ở đỉnh) D orlowii 12 Thân thảo nhỏ D rubrostriata 13 Thân thảo nhỏ cao đến 30 cm Cao 4,0–7,0 cm Cao 6,0 cm Dài 15–20 cm, Dài 8,0–25 cm, màu màu xanh lục đỏ hạt dẻ (ở gốc), xanh lục (ở đỉnh), có đốm trắng rải rác 18–22 x 8,0– 15–27 x 8,5–13 18–20 x 9,0–12 cm 10,7 cm cm Màu xanh Đỏ tím sẫm Màu xanh cây nhạt, trơn nhạt mịn D benenica 14 Thân thảo cao đến 60 cm Cao 3,0–5,0 cm Dài 14–23 cm, màu đỏ tía sẫm 15–28 x 10–14,5 cm Mặt Màu xanh nhạt với ánh tím bóng bên đỉnh Mặt Bóng, xanh Màu xanh Màu xanh Màu xanh đậm đậm đậm đậm Cụm phát Cao 9,5–10 cm Cao 6,0–10 cm Cao 9,5–11,5 cm Cao 15 cm hoa Cuống hoa Dài 1,5–2,5 cm Dài 1,0 cm Dài 4,0–6,0 cm Dài 3,0–6,0 cm Lá bắc mọc đối, Lá bắc áp chặt Lá bắc áp sát vào Lá bắc áp vào trục hình mác lỏng vào trục hoa, trục hoa, dày đặc, hoa, dày đặc, Lá bắc lẻo, màu hồng dày đặc, màu màu xanh lục nhạt nhiều sẫm - đỏ xanh lục với với cụm chấm nhuốm màu đỏ viền đỏ sắc tố màu hạt dẻ hồng Hoa 1–2 2–3 2–3 2–3 Màu vàng, có Màu vàng, có Cánh mơi phân chia Màu vàng, có khe khe hở q khe hở với khe hở hở nửa Phiến Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 75 Cánh hoa nửa chiều dài cánh môi), thùy không phân chia nửa chiều dài cánh mơi, có vân tím, có dải màu vàng đậm xẻ hai thùy nửa chiều dài nó, màu vàng với hai mảng màu đỏ tuyến tính gốc chiều dài cánh mơi, với mảng đỏ gốc hai thùy tròn đỉnh Tuy nhiên, việc xác định loài thực vật dựa đặc điểm hình thái ngồi có nhược điểm cho kết khơng xác khó khăn việc xác định lồi chúng bị ảnh hưởng yếu tố mơi trường, phận sinh dưỡng 78.,79 Đặc điểm vi học hay thị định danh DNA phương pháp hỗ trợ cần thiết cho phương pháp mơ tả hình thái Về mặt cấu trúc giải phẫu, khí khổng thuộc loại lỗ khí mầm, mơ mềm bó mạch D citrea tương tự Zingiber officinale Roscoe 80.,81 Tuy nhiên, silica (có Z officinale) khơng tìm thấy D citrea 82 Silic (Si) tìm thấy với hàm lượng cao (đến 10%) mầm Trong mơ thực vật, Si thường tìm thấy dạng phức hợp hữu Si liên kết với hydro thấm qua biểu bì thành bó dẫn, với vai trị tăng cường mơ thực vật, giảm thoát nước nhiễm nấm83 Các vai trị có lợi Si sinh lý thực vật (bao gồm điều chỉnh enzym liên quan đến phòng thủ, tín hiệu hormon thực vật thay đổi hợp chất thực vật dễ bay hơi) làm rõ ràng mối liên hệ Si với chế bảo vệ sinh hóa/ phân tử Giống phận mặt đất, phận bên thực vật phải đối mặt với mối đe dọa cơng từ trùng ăn rễ dẫn đến phản ứng bảo vệ rễ chống lại loài ăn rễ 84 Các nghiên cứu phát sinh loài cho thấy khác biệt xuất hiện, mật độ vị trí protein tham gia vào trình vận chuyển Si nguyên nhân dẫn đến khả tích lũy Si khác thực vật 85 Do đó, vắng mặt tế bào silica D citrea so với lồi khác (trong họ Zingiberaceae) đặc điểm riêng loài Calci oxalat chất phổ biến giới thực vật xuất 215 họ thực vật 86 Thực vật tạo nhiều hình dạng kích thước khác tinh thể canxi oxalat, với số chức chứng minh, tinh thể canxi oxalat có vai Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 76 trò điều hòa canxi, bảo vệ thực vật giải độc hay trung hoà kim loại nặng 87 Trong nghiên cứu tại, đặc điểm độc đáo khác D citrea tìm thấy, vắng mặt canxi oxalat rễ thân rễ Canxi oxalat thường tìm thấy rễ chi thuộc họ Zingiberaceae, bao gồm chi Hedychium88., Curcuma 89 Kaempferia 90 Ngoài ra, đặc điểm hình thái canxi oxalat vị trí bảo tồn đơn vị phân loại cụ thể 87 Hơn nữa, thay đổi gen thực vật ảnh hưởng đến tạo mầm, hình thái, phân bố số lượng tinh thể canxi oxalat 91 Do đó, việc thiếu tinh thể canxi oxalat rễ thân rễ D citrea sử dụng để phân biệt lồi (hoặc chí với lồi khác chi Distichochlamys) với dược liệu khác họ Zingiberaceae Tuy nhiên, lần cấu trúc giải phẫu lồi D citrea nghiên cứu Vì vậy, nghiên cứu sâu giải phẫu chi Distichochlamys cần tiến hành để đưa kết luận khẳng định giả thuyết đề cập Nhìn chung, đặc điểm hình thái vi học rễ thân rễ D citrea tương đối giống Tuy nhiên, chúng có số điểm khác biệt hình 3.6 hình 3.8 như: Rễ có vùng vỏ rộng (gồm mơ mềm vỏ, vùng tủy hẹp với nhiều bó mạch xếp khơng liên tục, bó gỗ xen kẽ với libe vài mô mềm tuỷ nằm vùng trung tâm tủy) So với rễ thân rễ có vùng tủy rộng nhiều bó mạch xếp khơng trật tự bao gồm libe nằm gỗ Kiểm nghiệm bột nguyên liệu sử dụng kính hiển vi cần thiết để xác định xác dược liệu 92.,93 Ngồi ra, kính hiển vi chứng minh cơng cụ đơn giản nhanh chóng để kiểm tra độ tinh khiết bột nguyên liệu dựa đặc điểm mô thực vật 95.,96 Về vi phẫu bột, hầu hết thành phần có tươi tìm thấy bột Tuy nhiên, số thành phần biểu bì trên, biểu bì hạ bì khó phân biệt bột khơng thể xác định vị trí chúng Cấu trúc bột dễ dàng quan sát điều kiện mẫu tươi Tuy nhiên, trường hợp mẫu khô, mô bị biến dạng trở nên giống lồi Do đó, phân tích bột giúp phân biệt loại dược liệu tiếp xúc quan sát đặc điểm hình thái vi mơ điển hình lồi kiểm tra Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 77 Các phân tích hiển vi thành phần dược liệu cần kết hợp với soi bột để tăng độ xác việc xác định lồi 97 Vì thân rễ phận có giá trị thực vật thuộc họ Zingiberaceae nên có số nghiên cứu đề cập đến việc kiểm tra bột lồi Đặc biệt, phân tích bột Alpinia calcarata, A galanga Globba marantina 98.,99 Hơn nữa, D citrea có khối nhựa màu đỏ bột khơng tìm thấy lồi đề cập Ngồi ra, khơng quan sát thấy hạt aleuron, hạt dầu tinh thể Si bột D citrea G marantina 99 D citrea khơng có lơng lơng quan sát thấy bột A calcarata A galanga 98 D citrea có số đặc điểm điển hình bột thân rễ Đầu tiên, lồi có lơng đa bào khơng xuất lồi khác mơ tả họ Zingiberaceae, bao gồm A calcarata, A galanga Curcuma longa 101 , C caesia 102 , G marantina 99 98.,100 , Z officinale 103 Bên cạnh đó, khơng quan sát thấy tinh thể Si canxi oxalat bột thân rễ D citrea Các giọt dầu (có Z officinale 103.) không phát bột thân rễ D citrea Tuy nhiên, khối nhựa D citrea có màu đỏ hay nâu đỏ so với C longa C caesia 101.,102 Về mặt định danh DNA với trình tự ITS, kết chứng minh ITS đủ tin cậy hiệu để xác định D citrea Kết luận phù hợp với nhiều tác giả sử dụng ITS để phân biệt loài họ Zingiberaceae Đặc biệt, Vinitha cộng (2014) báo cáo ITS điểm đánh dấu với khoảng cách đặc hiệu cao (12–18,8%) số 60 mẫu 20 loài thuộc họ Zingiberaceae 104 Ngoài ra, Labrooy cộng (2018) xác định thành cơng bảy lồi thuộc chi Kaempferia (Zingiberaceae) ITS, với đặc điểm nhận dạng BLAST trình tự tác giả trình tự tham chiếu 97–100% 105 Tỷ lệ thành công cao với 96,97% thu Tan cộng (2020) sử dụng ITS để xác định 11 loài Alpinia 106 Ngoài loài họ Zingiberaceae, nhiều loài khác xác định thành công nhờ sử dụng ITS Kress cộng (2005) tuyên bố đoạn mồi ITS khuếch đại mẫu DNA từ năm tám chi thực vật có hoa cho thấy tỷ lệ phân kỳ cao bốn chi (với tỷ lệ phân kỳ trung bình Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 78 2,8%) 107 Hơn nữa, nghiên cứu A-ma-dôn, Gonzalez cộng (2009) chứng minh ITS điểm đánh dấu tốt thứ hai điểm thử nghiệm72 Chen cộng (2010) cung cấp độ xác cao với 92,7% thu cách sử dụng ITS để xác định 4800 loài 73 Trong ba nghiên cứu đề cập, lỗi khuếch đại quan sát thấy sử dụng mồi ITS PCR Tuy nhiên, nghiên cứu cho thấy có khác biệt với đặc hiệu cao q trình khuếch đại thành cơng Trong nghiên cứu tại, khơng có lỗi PCR phát đoạn mồi ITS khuếch đại mẫu DNA D citrea Do đó, mồi ITS sử dụng thuận tiện để xác định lồi D citrea tương lai Tóm lại, để xác định D citrea, việc dựa vào kỹ thuật định danh đại DNA, nghiên cứu xác định đặc điểm hình thái đặc điểm vi học, kết hợp với định danh DNA dựa thị ITS để cung cấp thông tin chi tiết xác lồi Kết nghiên cứu thiết lập tiêu chuẩn nhận dạng D citrea để phân biệt loài dược liệu với loài khác từ lựa chọn lồi để sử dụng làm thuốc 4.2 Các thơng số lý hóa, sơ thành phần hóa thực vật sàng lọc tác dụng sinh học cao phân đoạn Một loại thảo dược có hiệu điều trị bệnh khả khai thác dược liệu lớn khả cạn kiệt nguồn nguyên liệu ngày cao Để đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày tăng, dược liệu dễ bị pha trộn với nguyên liệu khác số trường hợp bị thay hồn tồn Đơi tên ngữ giống đặt cho lồi có quan hệ gần gũi lồi thực vật dễ dàng bị thay sử dụng nhầm lẫn Vì vậy, điều quan trọng phải thiết lập tiêu chuẩn để xác định xác thuốc có hiệu sử dụng điều trị bệnh Các nghiên cứu thơng số hóa lý góp phần đảm bảo nhận dạng dược liệu bột nguyên liệu từ giúp ngăn ngừa tạp nhiễm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 79 Độ ẩm cao dược liệu kết hợp với nhiệt độ tương đối cao môi trường nguyên nhân khiến dược liệu bị phân hủy giảm chất lượng biến đổi hóa học công vi sinh vật 93 Giá trị độ ẩm tro toàn phần thiết lập nghiên cứu hữu ích việc xác định độ tinh khiết chất lượng D citrea Đối với bột Gừng đen có đặc điểm độ ẩm dao động từ 12,04 đến 12,78 % Độ ẩm thấp khả hợp chất bay tinh dầu bị thất thoát trình xử lý mẫu, phơi mẫu Gừng đen cần nên phơi âm can sấy nhẹ nhiệt độ không 40 oC Kết nghiên cứu phù hợp với độ ẩm cho phép thông thường dược liệu mang tinh dầu loài Nghệ, Gừng, quy định DĐVN V 56 Giá trị tro toàn phần cao dấu hiệu nhiễm bẩn, giả mạo, tạp nhiễm sai xót q trình xử lý ngun liệu Tro không tan acid cho thấy tạp nhiễm silica đất, cát sỏi So sánh giá trị tro với tổng giá trị tro mẫu phân biệt nguyên liệu bị tạp nhiễm thành phần khác khơng có tro tự nhiên ngun liệu thơ 93.,94 Tro tồn phần thân rễ Gừng đen tương đối cao (8,42 ± 0,26%) cho thấy lượng muối vô cao muối carbonat, phosphat, silicat natri, kali, calci magie Bên cạnh đó, giá trị tro khơng tan acid thấp (1,08 ± 0,08%) Giá trị tro không tan acid cho thấy lượng nhỏ thành phần vô không tan acid Tất kết thơng số lý hóa quan trọng mặt xác định độ tinh khiết nguyên liệu Tóm lại, với thơng số lý hóa thiết lập cơng trình này, mẫu đạt độ tinh khiết hàm lượng ẩm, tro tồn phần tro khơng tan acid, giá trị nằm giới hạn cho phép DĐVN V sử dụng nguyên liệu làm thuốc 56 Sàng lọc sơ thành phần hóa thực vật biết đến phương pháp phân tích để xác định chất chuyển hóa thứ cấp phát thực vật phản ứng đặc hiệu chúng với số thuốc thử Sự diện thành phần hóa học thực vật chiết xuất dung mơi có độ phân cực khác cho thấy thành phần cụ thể hịa tan dung mơi chuyên biệt chúng sử dụng để chiết xuất với mục đích đạt hiệu suất Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 80 cao Nói chung, hợp chất tinh dầu, hợp chất khử, acid hữu cơ, coumarin flavonoid có thân rễ D.citrea tìm thấy lồi Trong nghiên cứu trước đây, phần lớn hợp chất flavonoid, coumarin tinh dầu báo cáo có tác dụng sinh học tốt, có tác dụng tích cực điều trị bệnh kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống viêm, chống dị ứng, chống đái tháo đường, chống khối u, chống ung thư hoạt tính sinh học khác 30.,93.,108.,109 Kết chứng minh chiết xuất từ phận D citrea cho tác dụng sinh học đầy hứa hẹn Cho đến nay, có nghiên cứu báo cáo tác dụng ức chế acetylcholinesterase tinh dầu thân rễ D benenica 18 kháng khuẩn hợp chất phân lập từ D benenica với hoạt tính chống viêm, 19 tác dụng kháng khuẩn cao chiết n-hexan từ thân rễ D citrea chống lại Streptococcus pyogenes 17 chưa có thêm nghiên cứu tác dụng D citrea Nghiên cứu lần chứng minh hoạt động chống oxy hóa ức chế enzym αglucosidase cao phân đoạn từ thân rễ D citrea, lồi thực vật đặc hữu có Việt Nam Acid ascorbic coi chất chống oxy hóa tự nhiên mạnh độc hại Là chất loại bỏ ROS, acid ascorbic chứng minh có hiệu chống lại O 2•–, H2O2, OH•, lO2 NO2• phản ứng acid ascorbic hay lựa chọn làm đối chứng nghiên cứu 30 Các mẫu cao khảo sát có khả chống oxy hóa, cao EtOAc (IC 50 = 90,27 µg/mL) có tác dụng mạnh cao khác thấp acid ascorbic (IC 50 = 4,62 µg/mL) khoảng 19 lần Hoạt tính chống oxy hóa cao chiết phân loại mạnh giá trị IC50 = 50–100 μg/mL, trung bình giá trị IC50 = 100–150 μg/mL yếu IC50 = 151–200 μg/mL 110.,111 Như vậy, cao EtOAc từ thân rễ Gừng đen có tác dụng chống oxy hóa mạnh với IC50 < 100 μg/mL Enzym α-glucosidase có vai trị quan trọng việc tiêu hóa hấp thu thức ăn niêm mạc ruột non Acarbose gây ức chế enzym α-glucosidase biểu mơ ruột, làm chậm trình hấp thụ carbohydrat từ ruột non, đặc biệt hữu ích để làm giảm lượng đường huyết sau ăn 46 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Acarbose loại thuốc sử dụng phổ Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 81 biến nhóm ức chế enzym α-glucosidase Chính thế, acarbose lựa chọn làm thuốc đối chứng dương nghiên cứu Tuy nhiên, nghiên cứu trước cho thấy hoạt tính ức chế α-glucosidase acarbose có giá trị dao động khác với khoảng IC 50 từ 46,0 μg/mL đến 4687,06 μg/mL 112.,113.,114.,115.,116 Điều nguồn cung cấp acarbose (hãng sản xuất, nguồn gốc enzym, …), quy trình thực Trong nghiên cứu cho kết IC 50 (μg/mL) acarbose nằm khoảng giá trị báo cáo trước Stress oxy hóa dẫn đến hình thành gốc tự chứng minh yếu tố phát triển bệnh biến chứng bệnh đái tháo đường 117 Phát nghiên cứu tất cao phân đoạn thể ức chế αglucosidase với giá trị IC50 cao so với acarbose (chemcruz, IC 50 = 58,51 μg/mL) Đặc biệt, phần cao EtOAc ghi nhận giá trị có ý nghĩa với IC 50 = 115,75 μg/mL, hiệu thấp acarbose (chemcruz) lần thí nghiệm in vitro Giá trị thấp phần cao nước Có thể nói khả chống oxy hóa ức chế α-glucosidase cao EtOAc diện lượng lớn flavonoid hợp chất có hoạt tính sinh học khác 4.3 Nghiên cứu hóa học tác dụng sinh học chất phân lập Từ cao CHCl3 phân lập bốn hợp chất 5-hydroxy-3,7,4'trimethoxyflavon (C1), hỗn hợp β-sitosterol stigmasterol (C2), platyphyllon (C3), glycerol monostearat (C4) cao EtOAc phân lập hai hợp chất kaempferol (E1), acid trans-5-O-caffeoylquinic (E2) Sáu hợp chất phân lập từ cao phân đoạn phù hợp với độ phân cực dung môi sử dụng cho chiết xuất định hướng ban đầu Lần đầu tiên, sáu hợp chất phân lập từ thân rễ Gừng đen tác dụng chúng báo cáo đề tài 5-Hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavon (C1) hay gọi kaempferol-3,7,4'trimethyl ether hợp chất flavonol bị methyl hóa vị trí C-3, C-7 C4' Hợp chất báo cáo nghiên cứu trước có khả chống oxy hóa, kháng α-glucosidase 116.,118., kháng khuẩn 119 , kháng viêm 120 Kết nghiên cứu cho thấy khả chống oxy hóa hợp chất C1 (IC50 = 794,71 μM) yếu so với acid ascorbic (IC 50 = 30,33 μM), kết phù hợp Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 82 với báo cáo Teffo LS cộng (2010) 121 Điều lý giải thông qua cấu trúc hợp chất C1 nhóm hydroxyl vị trí C-3, C-7 C-4' bị methoxy hóa dẫn đến giảm tác dụng chống oxy hóa hợp chất C1 (hình 4.1) Bên cạnh đó, hoạt tính ức chế α-glucosidase hợp chất C1 có giá trị IC50 = 189,40 µM thể tác dụng tốt so với acarbose (IC 50 = 818,59 μM) (khoảng 4,3 lần) Ngoài ra, giá trị nghiên cứu thể khả ức chế αglucosidase với giá trị IC 50 thấp nghiên cứu Dao cộng (2021) (IC 50 > 300 μM) 116 cao giá trị IC 50 báo cáo Azuma cộng (2011) (IC50 > 160 μM) 118 Kaempferol (E1) hay 3,4',5,7-tetrahydroxyflavon thành viên nhóm flavonol với cấu trúc tetrahydroxyflavon bốn nhóm hydroxyl (-OH) nằm vị trí C-3, C-5, C-7 C-4' Hoạt động chống oxy hóa loại bỏ gốc tự kaempferol khả phản ứng cao nhóm hydroxyl Kaempferol hoạt động chất chống oxy hóa mạnh cách giảm stress oxy hóa 121 hợp chất có tác dụng kháng khối u, xem xét phương pháp điều trị ung thư 122 Hơn nữa, kaempferol có nhiều tác dụng sinh học khác kháng khuẩn, kháng virus, kháng viêm, chống dị ứng, chống đái tháo đường báo cáo nghiên cứu trước 123.,124.,125.,126 Nghiên cứu cho thấy hợp chất E1 có tác dụng tốt acid ascorbic (IC 50 = 30,33 μM) hoạt tính chống oxy hóa tốt acarbose (IC 50 = 818,59 μM) hoạt tính ức chế α-glucosidase với giá trị IC50 hợp chất E1 14,08 μM 31,86 μM Đáng ý kết chống oxy hóa hợp chất E1 nghiên cứu cho tác dụng mạnh so với báo cáo Sarian cộng (2017) với giá trị IC50 = 38,05 ± 3,0 μM 127 Opeyemi cộng (2019) với giá trị IC 50 = 110,72 ± 5,49 μM 128 Có thể lý giải hợp chất E1 sau phân lập tiến hành khảo sát quét gốc DPPH nên cho kết tốt mẫu bị oxy hóa phần điều kiện bảo quản khơng kỹ ảnh hưởng đến kết khảo sát Về hoạt tính ức chế α-glucosidase, đề tài chứng minh hợp chất E1 thể hoạt tính tốt với giá trị IC 50 = 31,86 µM, kết khẳng định Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 83 nghiên cứu Sarian cộng (2017) cho kết phù hợp với khoảng IC50 = 42,59 ± 16,18 µM 127 Tuy nhiên nghiên cứu Sheng cộng (2018), Opeyemi cộng (2019) cho kết ức chế α-glucosidase yếu kết nghiên cứu tương ứng khoảng 5,8 lần (IC 50 = 52,95 µg/mL = 185 µM) 126 khoảng 2,2 lần (IC50 = 19,98 ± 1,23 µg/mL = 69,80 ± 4,30 µM) 128 Sự diện nhóm hydroxyl cấu trúc vịng A catechol nhóm 4'-hydroxyl vịng B làm tăng cường hoạt động chống oxy hóa Các nhóm hydroxyl có hoạt tính loại bỏ gốc tự coi nguồn nguyên tử hydro trung hòa loại gốc 129 Mặc dù có nhóm hydroxyl đính vịng B, kaempferol chất chống oxy hóa mạnh thể liên kết đơi C 2=C3, nhóm 5-OH 3-OH với nhóm 4-oxo vòng C 130.,131 , đặc điểm cấu trúc giải thích cho tác dụng ức chế α-glucosidase kaempferol 5-hydroxy-3,7,4'trimethoxyflavon Ngồi ra, alkyl hóa nhóm phenol vị trí C-5, C-7 C-8 làm giảm hoạt động chống oxy hóa quét gốc tự chất thử nghiệm Nghiên cứu trước chứng minh việc thay nhóm hydroxyl nhiều nhóm methoxy làm giảm đáng kể hoạt động chống oxy hóa flavonoid 127 Nghiên cứu cho thấy kaempferol có giá trị IC 50 thấp so với 5-hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavon, chứng tỏ nhóm flavonol tác dụng chống oxy hóa kaempferol mạnh nhiều so với 5-hydroxy-3,7,4'trimethoxyflavon Ngoài ra, kaempferol báo cáo chất ức chế 𝛼glucosidase đầy hứa hẹn hoạt động ức chế 𝛼-glucosidase mạnh 132 Như biết, hợp chất polyphenol (chẳng hạn nhóm flavonoid với cấu trúc có nhóm hydroxyl tự do, liên kết đơi vị trí C-2 C3, ceton C-4 có liên quan đến tác dụng chống oxy hóa chúng) chất chống oxy hóa tự nhiên việc bảo vệ chống lại tác hại q trình oxy hóa tác dụng chống oxy hóa chúng Tóm lại, kết thử nghiệm in vitro chống oxy hóa ức chế 𝛼-glucosidase có liên quan cấu trúc định đến hoạt tính sinh học hợp chất flavonol Sự thay alkyl Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 84 tổng số nhóm hydroxyl yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động chống oxy hóa ức chế 𝛼-glucosidase Vì vậy, tổng số nhóm hydroxyl, liên kết C2=C3 nhóm chức ceton vị trí C-4 đặc điểm cần thiết việc thể hoạt tính sinh học tác dụng chống oxy hóa, ức chế xanthin oxidase, ức chế 𝛼-glucosidase ức chế dipeptidyl peptidase IV (DPP-4) flavonoid 125.,127.,130.,131., đặc biệt tác dụng ức chế 𝛼-glucosidase (hình 4.1) Hình 4.1 Liên quan cấu trúc-tác dụng chống oxy hóa ức chế α-glucosidase hợp chất C1 E1 Đối với hợp chất C2, từ kết liệu phổ kết hợp với TLC so với chất chuẩn 133 , β‐sitosterol phân lập thân rễ Gừng đen thực chất xác định dạng hỗn hợp β‐sitosterol stigmasterol với tỷ lệ 6,12:1,0 (trong β‐ sitosterol chiếm 85% hỗn hợp) Tín hiệu proton δH 5,02 (dd, J = 8,7; 15,2 Hz) 5,15 (dd, J = 8,7; 15,2 Hz) quy kết tương ứng cho H-22 H-23 stigmasterol δH 5,35 (1H, dt, J = 2,0; 5,4 Hz) định H-6 βsitosterol stigmasterol Sự khác biệt hai hợp chất diện liên kết đơn C22–C23 β‐sitosterol liên kết đơi C22=C23 stigmasterol Chính vậy, thực tế giá trị R f chúng khơng có khác biệt sử dụng số hệ dung môi khác Hơn nữa, nghiên cứu khó thu β-sitosterol trạng thái tinh khiết 112.,134 β‐Sitosterol stigmasterol sterol phân bố phổ biến giới thực vật Trong Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 85 nghiên cứu trước báo cáo β‐sitosterol stigmasterol mang lại nhiều lợi ích sức khỏe đáng kể Chúng làm giảm cholesterol, giảm nguy bệnh mạch vành, đau tim xơ vữa động mạch, ngăn ngừa nhiều loại ung thư với hỗ trợ trình phục hồi tự nhiên thể, hỗ trợ điều trị béo phì, đái tháo đường với nhiều tác dụng dược lý khác kháng khuẩn, kháng viêm 135.,136.,137 Trong nghiên cứu tại, β‐sitosterol stigmasterol có khả chống oxy hóa mức độ yếu (ở 500 μg/mL có tác dụng khoảng 28,96%) Jiménez-Suárez cộng (2016) báo cáo hợp chất khơng có hoạt động qt gốc DPPH112 Bên cạnh đó, khả ức chế α-glucosidase β‐sitosterol stigmasterol nghiên cứu cho kết tốt (2 lần) so với báo cáo Dej-Adisai cộng (2021) với giá trị IC 50 500 μg/mL; 1392,81 μg/mL115 Diarylheptanoid thuộc nhóm polyphenol 62.,138., nhóm chất chuyển hóa thứ cấp thực vật với nhiều hoạt tính sinh học đáng ý tác dụng chống ung thư, chống nơn, kháng estrogen, kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống virus cúm, bảo vệ gan tế bào thần kinh 138.,139.,140.,141 Diarylheptanoid tìm thấy chủ yếu số loài thuộc chi Alpinia, Zingiber, Curcuma, Alnus, Amomum Myrica 62.,140.,142.,143 Một chất thuộc nhóm diarylheptanoid đó, platyphyllon (C3) (được phân loại thuộc cấu trúc 1,7-bis-(p-hydroxyphenyl)-3heptanon) 138 thể hoạt động chống oxy hóa, chống viêm, gây độc tế bào, chống ung thư chống virus cúm báo cáo nghiên cứu trước 62.,138.,141.,144 Liên quan cấu trúc đến hoạt động gây độc tế bào tác dụng sinh học khác platyphyllon dẫn chất thuộc cấu trúc 1,7-bis-( phydroxyphenyl)-3-heptanon có diện nhóm cacbonyl C-3, thay chuỗi heptan C-5 số lượng nhóm hydroxyl vịng thơm 138.,145 Cấu trúc platyphyllon có carbon bất đối vị trí C-5, cần đo thêm lực triền quang đo quang phổ lưỡng sắc tròn (CD: Circular Dichroism) để xác định cấu hình tuyệt đối platyphyllon Bằng cơng cụ tìm kiếm bản, lần hợp chất platyphyllon phân lập từ chi Distichochlamys Đồng thời, Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 86 thử nghiệm ức chế α-glucosidase in vitro lần báo cáo hợp chất Trong nghiên cứu tại, khả ức chế α-glucosidase platyphyllon (IC50 = 69,41 μM) cho kết ức chế mạnh so với đối chứng dương acarbose (IC50 = 818,59 μM) khoảng 11,8 lần Trong đó, tác dụng chống oxy hóa platyphyllon có giá trị IC 50 (μg/mL) cao báo cáo Han cộng (2006) với IC50 = 37,4 μg/mL 146 Tuy nhiên, kết nghiên cứu trước cho thấy hoạt tính chống oxy hóa platyphyllon yếu so với acid ascorbic 146 Acid trans-5-O-caffeoylquinic (E2) hay acid neochlorogenic chất chuyển hóa phổ biến thực vật Về mặt hóa học, acid trans-5-O-caffeoylquinic este cinnamat hình thành ngưng tụ nhóm 5-hydroxy acid quinic với nhóm carboxy acid trans-caffeoic 147 Vị trí thay caffeoyl xác định cách phân tích chuyển dịch hóa học số liên kết proton methin oxy hóa acid quinic Một methin oxy hóa acid quinic acyl hóa caffeoyl, tín hiệu proton dịch chuyển vùng trường thấp Hằng số liên kết proton dịch chuyển vùng trường thấp sau áp dụng cho vị trí acyl hóa, từ xác định hợp chất E2 acid trans-5-Ocaffeoylquinic Trong nghiên cứu báo cáo trước đây, acid trans-5-O-caffeoylquinic acid chlorogenic tìm thấy từ số loài thuộc họ Zingiberaceae Etlingera elatior (Jack) RM Smith, Etlingera fulgens (Ridl.) CK Lim, Etlingera rubrostriata (Holttum) CK Lim 148 , Etlingera philippinensis (Ridl.) RM Smith, Zingiber officinale Rosc., Curcuma longa L., Hornstedtia conoidea Ridl Amomum muricarpum Elmer 149 Acid trans-5-O-caffeoylquinic công nhận rộng rãi có tác dụng chống oxy hóa, hoạt động bảo vệ DNA 150 loạt tác dụng sinh học khác kháng khuẩn 151 , kháng virus, kháng nấm, chống ung thư, kháng viêm, chống thối hóa tăng cường khả bảo vệ tế bào thần kinh, hoạt động bảo vệ tim mạch 152 Trong nghiên cứu chứng minh acid trans-5-O-caffeoylquinic phân lập từ thân rễ D citrea có tác dụng chống Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 87 oxy hóa tốt với giá trị IC 50 = 30,20 μM (tác dụng tương đương so với đối chứng acid ascorbic, IC50 = 30,33 μM) Tuy nhiên, kết nghiên cứu cho hoạt động quét gốc DPPH tốt so với báo cáo trước Xu cộng (2012) với IC50 = 38,95 ± 3,67 μM 150 , Anh cộng (2022) với IC50 = 43,80 μg/mL = 123,62 μM 153 Do đó, có đủ chứng để chứng minh acid trans-5O-caffeoylquinic hoạt động chất chống oxy hóa mạnh để ức chế hình thành loại oxy phản ứng đóng vai trị có lợi việc ngăn ngừa bệnh liên quan đến oxy hóa lão hóa Thật ngạc nhiên nghiên cứu hợp chất có tác dụng yếu, gần khơng có tác dụng vai trò ức chế 𝛼-glucosidase Mặc dù kết ức chế 𝛼-glucosidase nghiên cứu phù hợp với báo cáo trước Chen cộng (2014) 65., Anh cộng (2022) 153 nghiên cứu Alongi cộng (2018) cho kết ức chế 𝛼-glucosidase vừa phải với giá trị IC50 = 440 µg/mL = 1241,85 μM 154 Trong báo cáo trước đây, vai trò chống bệnh đái tháo đường acid trans-5-Ocaffeoylquinic cịn nhiều chế khác, chẳng hạn hoạt động chống oxy hóa chống viêm acid trans-5-O-caffeoylquinic cải thiện rối loạn chức nội mô giảm kháng insulin, chế quan trọng để tăng cường khả bảo vệ tim mạch chống đái tháo đường loại nhờ hợp chất này152.,155 Ngồi ra, acid trans-5-O-caffeoylquinic có liên quan đến việc cải thiện chuyển hóa glucose lipid cách kích hoạt AMP protein kinase hoạt động (AMPK) AMPK cảm biến điều chỉnh cân lượng tế bào Sự hoạt hóa kích thích chuyển vị chất vận chuyển glucose loại (GLUT4) từ màng nội bào sang huyết tương gia tăng vận chuyển glucose vào tế bào 152.,156.,157 Từ kết này, chứng minh acid trans-5-O- caffeoylquinic có khả chống bệnh đái tháo đường, cần có nghiên cứu sâu để chứng minh thêm vai trò chế điều trị bệnh đái tháo đường acid trans-5-O-caffeoylquinic Glycerol monostearat (C4) hay gọi Monostearin chất biến dưỡng sơ cấp tìm thấy số lồi thực vật Clinacanthus nutans (Burm.f) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 88 Lindau158., Cleome chelidonii Lf 159 chinensis (Lour.) Hort ex Loud 160 , Dichapetalum filicaule Breteler 63 , Sargaassum sagamianum Yendo , Saururus 161 Về mặt hóa học, glycerol monostearat dạng ester glycerol acid stearic Glycerol monostearat không tan nước, tan n-hexan CHCl3 Trong báo cáo Chama cộng (2016) chứng minh hợp chất glycerol monostearat phân lập từ Dichapetalum filicaule thể đặc tính tẩy giun móc với giá trị IC 50 = 306,0 μg/mL 63 , glycerol monostearat phân lập từ Saururus chinensis, Sargaassum sagamianum cịn có tác dụng ức chế Lp-PLA2 (Lipoprotein liên kết với phospholipase A2) để điều trị chứng xơ vữa động mạch 160 ức chế vừa phải phospholipase A2 cyclooxygenase-2 trị viêm 161 Trong nghiên cứu cho thấy hoạt tính chống oxy hóa glycerol monostearat yếu nhiều so với acid ascorbic (ở nồng độ 500 µg/mL, glycerol monostearat ức chế 25,96%) Trong đó, khả ức chế 𝛼-glucosidase glycerol monostearat yếu (ở nồng độ 400 µg/mL ức chế 4,76%) Tuy nhiên nghiên cứu sàng lọc in silico Murugesu cộng (2018) báo cáo glycerol monostearat có hoạt tính chống lại enzym α-glucosidase 158 Bằng cơng cụ tìm kiếm bản, glycerol monostearat lần phân lập từ thân rễ D citrea chứng khả chống oxy hóa ức chế α-glucosidase in vitro glycerol monostearat lần báo cáo đề tài D citrea có tác dụng chống oxy hóa ức chế α-glucosidase, chứng khoa học cho việc sử dụng Gừng đen người PaKơ nói riêng dân gian nói chung để điều trị viêm bệnh đái tháo đường Những tác dụng diện hợp chất kaempferol, 5-hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavon, hỗn hợp β-sitosterol stigmasterol, platyphyllon, acid trans-5-O-caffeoylquinic lần hợp chất phân lập từ thân rễ D citrea Kết gợi ý D citrea nguồn cung cấp chất chống đái tháo đường, chống oxy hóa chống viêm tốt cần phải nghiên cứu thêm để làm sáng tỏ chế hoạt động chúng Ngồi ra, từ kết đó, tiếp tục phân lập hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa ức chế emzyme α-glucosidase, đồng thời tạo tiền đề cho Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 89 nghiên cứu tác dụng chống viêm, chống nhiễm trùng, độc tế bào, kháng Helicobacter pylori, hạ cholesterol, góp phần phát triển dạng bào chế thương mại tương lai, đồng thời cần có kế hoạch ni trồng bảo tồn sau Nếu quan tâm đầu tư nghiên cứu chắn D citrea trở thành chủ đề thú vị hữu ích việc tìm kiếm hợp chất thiên nhiên có tác dụng sinh học ứng dụng điều trị bệnh, phát triển D citrea trở thành dược liệu có ích cơng phịng chữa bệnh cho người dân Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 90 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Về thực vật học Đã mô tả chi tiết đặc điểm hình thái thực vật xác định trình tự DNA Gừng đen thu hái VQG Bạch Mã (Thừa Thiên Huế) định danh với tên khoa học D citrea M.F Newman, thuộc họ Zingiberaceae Bên cạnh đó, đề tài xác định đặc điểm vi học đặc điểm bột dược liệu Gừng đen Ngoài ra, đề tài xác định thơng số lý hóa để đánh giá độ tinh khiết dược liệu đạt giới hạn thông thường tiêu độ ẩm (< 13%), tro toàn phần (< 10%) tro không tan acid (< 3%) khảo sát hàm lượng chất chiết EtOH 96% Tất nội dung làm sở khoa học góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu Về thành phần hóa học Đã sàng lọc sơ thành phần hóa thực vật Gừng đen cho thấy diện hợp chất tinh dầu, hợp chất khử, acid hữu cơ, coumarin flavonoid thân rễ D citrea Bằng phuơng pháp chiết ngấm kiệt với EtOH 96% phân bố lỏng – lỏng với n-hexan, CHCl3, EtOAc, n-BuOH thu cao chiết toàn phần cao phân đoạn tương ứng Đã phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ thân rễ Gừng đen Cụ thể bốn hợp chất C1 (5-hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavon), C2 (hỗn hợp β-sitosterol stigmasterol), C3 (platyphyllon), C4 (glycerol monostearat) phân lập từ cao CHCl3 hai hợp chất E1 (kaempferol) E2 (acid trans-5O-caffeoylquinic) phân lập từ cao EtOAc Các hợp chất lần phân lập từ loài D citrea Kết chất phân lập tóm tắt sau: Chất Tên cấu trúc hợp chất CTPT KLPT (g/mol) P (mg) C1 5-Hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavon C18H16O6 328,0 54,8 C2 β-Sitosterol Stigmasterol 414,0; 412,0 505,1 (6,12:1,0) C29H50O; C29H48O C3 Platyphyllon C19H22O4 314,0 83,1 C4 Glycerol monostearat C21H42O4 358,0 12,3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 91 E1 Kaempferol C15H10O6 286,0 34,1 E2 Acid trans-5-O-caffeoylquinic C16H18O9 354,0 14,1 Về tác dụng sinh học Từ kết thực nghiệm thu kết luận cao phân đoạn từ thân rễ D citrea có tác dụng chống oxy hóa ức chế enzym α-glucosidase thực nghiệm in vitro Trong đó, cao EtOAc có hoạt tính chống oxy hóa (IC 50 = 90,27 μg/mL) khả ức chế enzym α-glucosidase (IC50 = 115,75 μg/mL) thể mạnh Kết ức chế enzym α-glucosidase cao phân đoạn giảm dần theo thứ tự: Cao EtOAc (IC 50 = 115,75 μg/mL) > Cao CHCl (IC50 = 371,37 μg/mL) > Cao n-BuOH (IC50 = 545,98 μg/mL) > n-hexan (IC50 = 621,37 μg/mL) > Cao nước (IC50 = 965,70 μg/mL) Đã xác định tác dụng chống oxy hóa ức chế enzym α-glucosidase sáu hợp chất phân lập Về tác dụng chống oxy hóa, hợp chất E1 cho tác dụng mạnh (mạnh gấp lần acid ascorbic), tiếp đến hợp chất E2 C3 Tuy nhiên, hợp chất C2, C3 C4 cho tác dụng yếu Về tác dụng ức chế enzym αglucosidase, hợp chất E1, C3 C1 cho hoạt tính tốt so với thuốc đối chứng dương acarbose, hợp chất C2, C4 E2 cho hoạt tính yếu Kết IC 50 (µM) hợp chất phân lập trình bày tóm tắt sau: Tác dụng chống oxy hóa Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase Hợp chất IC50 (µM) Hợp chất IC50 (µM) E1 14,08 E1 31,86 E2 30,20 C3 69,41 C1 794,71 C1 189,40 C2 >1204,82 Acarbose 818,59 Acid ascorbic 30,33 KIẾN NGHỊ Vì thời gian thực đề tài có hạn với Gừng đen lồi đặc hữu Miền Trung với nguồn mẫu tự nhiên không nhiều, nghiên cứu chuyên sâu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 92 loài chưa báo cáo, đề tài cần tiếp tục thực để giải vấn đề sau: Tiếp tục phân lập hợp chất từ phân đoạn lại thử tác dụng sinh học theo mơ hình nghiên cứu ban đầu Thực đánh giá hoạt tính sinh học khác kháng viêm, kháng khuẩn, kháng khối u, hạ cholesterol, để định hướng cho nghiên cứu Xây dựng quy trình định lượng để góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu D citrea Cần nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống nuôi trồng loại thuốc đặc hữu đạt tiêu chuẩn theo quy định để cung cấp nguyên liệu ổn định cho nghiên cứu sản xuất thuốc bảo tồn sau Cần nghiên cứu dạng bào chế thương mại thích hợp từ thân rễ D citrea để đánh giá tác dụng lâm sàng theo hướng tác dụng hạ đường huyết Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 93 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN Van chen TRAN, Tuan ND, Triet NT, et al Morphological and molecular characterization of Distichochlamys citrea MF Newman in Bach Ma National Park, Thua Thien Hue Province, Vietnam. Biodiversitas Journal of Biological Diversity 2022;23(4):2066-2079 doi:10.13057/biodiv/d230442 Van Chen TRAN, Cuong TD, Triet NT, et al Antioxidant activity and αglucosidase inhibitability of Distichochlamys citrea MF Newman rhizome fractionated extracts: in vitro and in silico screenings. Chemical Papers 2022; 76:5655-5675 doi:10.1007/s11696-022-02273-2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO Newman MF Distichochlamys, a new genus from Vietnam. Edinburgh Journal of Botany 1995;52(1):65-69 doi:10.1017/S0960 42860000192X Lê Thị Hương, Trịnh Thị Hương, Đậu Bá Thìn cộng Đa dạng họ Gừng (Zingiberaceae) Vườn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 2018;34(1):84 – 89 Phạm Việt Tý, Hồ Việt Đức, Lê Quyết Thắng Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu thân rễ Gừng đen (Distichochlamys citrea) số tỉnh miền Trung Việt Nam Tạp chí khoa học Trường Đại học An Giang 2015;8(4):60-65 Ty PV, Hoai NT, Khan NV, et al Chemical composition of the essential oils of Distichochlamys cetria leaves collected from central Vietnam Vietnam Journal of Chemistry 2017; 55(4E23):358–362 Huong LT, Chau DT, Hung NV, et al Volatile constituents of Distichochlamys citrea MF Newman and Distichochlamys orlowii K Larsen & MF Newman (Zingiberaceae) from Vietnam Journal of Medicinal Plants Research 2017;11(9):188–193 doi:10.5897/JMPR2016.6337 Moteki H, Hibasami H, Yamada Y, et al Specific induction of apoptosis by 1,8cineole in two human leukemia cell lines, but not a in human stomach cancer cell line Oncology Reports 2002;9(4):757–760 doi:10 3892/or.9.4.757 Quintans-Júnior LJ, Guimarães AG, Santana MTD, et al Citral reduces nociceptive and inflammatory response in rodents Revista Brasileira de Farmacognosia 2011;21(3):497–502 doi:10.1590/S0102- 695X2011005000065 Abeysekera WKSM, Chandrasekera A, Liyanage PK Amylase and glucosidase enzyme inhibitory activity of ginger (Zingiber officinale Roscoe) an in vitro study Tropical Argicultural Reseach 2007;19:128-135 Tiengburanatam N, Boonmee A, Sangvanich P, et al A novel α-glucosidase inhibitor protein from the rhizomes of Zingiber ottensii valeton Applied Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh biochemistry and biotechnology 2010;162(7):1938-1951 doi:10.1007/s12010010-8971-7 10 Rahath Kubra I, Ramalakshmi K, Rao LJM Antioxidant enriched fractions from Zingiber officinale Roscoe Journal of Chemistry 2011;8(2):721-726 doi:10.1155/2011/960193 11 Trần Văn Ơn, Hoàng Quỳnh Hoa Thực vật dược Chương Giới thực vật (Planta) NXB Y học; 2022: 369-370 12 Larsen K A new species of Distichochlamys from Vietnam and some observations on generic limits in Hedychieae (Zingiberaceae). Natural History Bulletin of the Siam 2001;49:77-80 13 Rehse T, Kress WJ Distichochlamys rubrostriata (Zingiberaceae), a new species from northern Vietnam Brittonia 2003;55(3):205-208 doi:10.1663/0007-196X(2003)055[0205:DRZANS]2.0.CO;2 14 Nguyen QB, Leong-Škorničková J Distichochlamys benenica (Zingiberaceae), a new species from Vietnam Gardens’ Bulletin Singapore 2012;64(1):195200 15 Takhtajan A. Flowering plants Class Liliopsida Subclass IV Commelinidae 2nd ed Springer Science and Business Media; 2009:702-707 16 Argent G Waiting for the flowers: The role of living collections in taxonomic research at the Royal Botanic Garden Edinburgh Sibbaldia 2018;16:155-167 17 Van Hue N, Triet NT, Chen TV, et al Antimicrobial Properties of Distichochlamys citrea MF Newman Rhizome n‐hexane Extract against Streptococcus pyogenes: Experimental Screening. ChemistrySelect Evidences and 2022;7(17): Computational e202200680 doi:10.1002/slct.202200680 18 Hoang HTN, Dinh TTT, Pham TV, et al Chemical composition and acetylcholinesterase inhibitory activity of essen- tial oil from rhizomes of Distichochlamys benenica Hue University Journal of Science Natural Science 2020;129(1D):43-49 doi:10.26459/hueunijns.v129i1D.5804 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 19 Pham TV, Hoang HNT, Nguyen HT, et al Anti-inflammatory and antimicrobial activities of compounds isolated from Distichochlamys benenica BioMed Research International 2021 doi:10.1155/2021/6624347 20 Juergens UR, Engelen T, Racké K, et al Inhibitory activity of 1,8-cineol (eucalyptol) on cytokine production in cultured human lymphocytes and monocytes Pulmonary pharmacology and therapeutics 2004;17(5):281-287 doi:10.1016/j.pupt.2004.06.002 21 Juergens UR Anti-inflammatory properties of the monoterpene 1.8-cineole: current evidence for co-medication in inflammatory airway diseases Drug Research 2014;64(12):638-646 doi: 10.1055/s-0034-1372609 22 Moteki H, Hibasami H, Yamada Y, et al Specific induction of apoptosis by 1, 8-cineole in two human leukemia cell lines, but not a in human stomach cancer cell line Oncology reports 2002;9(4):757-760 doi:10.3892/or.9.4.757 23 Li QQ, Wang G, Reed E, et al Evaluation of Cisplatin in Combination with β‐ elemene as a Regimen for Prostate Cancer Chemotherapy Basic and clinical pharmacology & toxicology 2010;107(5):868-876 doi:10.1111/j.1742- 7843.2010.00592.x 24 Li X, Wang G, Zhao J, et al Antiproliferative effect of β-elemene in chemoresistant ovarian carcinoma cells is mediated through arrest of the cell cycle at the G2-M phase Cellular and Molecular Life Sciences CMLS 2005;62(7-8):894-904 doi:10.1007/s00018-005-5027-1 25 Zhan YH, Liu J, Qu XJ, et al β-Elemene induces apoptosis in human renal-cell carcinoma 786-0 cells through inhibition of MAPK/ERK and PI3K/Akt/mTOR signalling pathways Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 2012;13(6):2739-2744 doi:10.7314/APJCP.2012.13.6.2739 26 Prasad S, Gupta SC, Tyagi AK Reactive oxygen species (ROS) and cancer: Role of antioxidative nutraceuticals Cancer letters 2017;387:95-105 doi:10.1016/j.canlet.2016.03.042 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 27 Radi R, Denicola A, Morgan B, et al Foreword to the Free Radical Biology and Medicine Special Issue on ăCurrent fluorescence and chemiluminescence approaches in free radical and redox biologyă Free Radical Biology and Medicine 2018;128:1-2 doi:10.1016/j.freeradbiomed.2018.09.027 28 Yaribeygi H, Sathyapalan T, Atkin SL, et al Molecular mechanisms linking oxidative stress and diabetes mellitus Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2020 doi:10.1155/2020/8609213 29 Ito F, Sono Y, Ito T Measurement and clinical significance of lipid peroxidation as a biomarker of oxidative stress: oxidative stress in diabetes, atherosclerosis, and chronic inflammation Antioxidants 2019;8(3):72 doi:10.3390/antiox8030072 30 Gulcin İ Antioxidants and antioxidant methods: an updated overview Archives of toxicology 2020;94:651-715 doi:10.1007/s00204-020-02689-3 31 Mošovská S, Nováková D, Kaliňák M Antioxidant activity of ginger extract and identification of its active components Acta Chimica Slovaca 2015;8(2):115-119 doi:10.1515/acs-2015-0020 32 American Diabetes Association 2-Classification and diagnosis of diabetes: standards of medical care in diabetes–2018 Diabetes care 2018; 41(1):S13S27 doi:10.2337/ dc18-S002 33 Sun H, Saeedi P, Karuranga S, et al IDF diabetes atlas: Global, regional and country-level diabetes prevalence estimates for 2021 and projections for 2045 Diabetes Research and Clinical Practice 2022;183:109119 doi:10.1016/j.diabres.2021.109119 34 Draznin B, Aroda VR, Bakris G, et al 2-Classification and diagnosis of diabetes: standards of medical care in diabetes-2022 Diabetes Care 2022;45(1):S17–S38 doi:10.2337/dc22-s002 35 Henning RJ Type-2 diabetes mellitus and cardiovascular disease Future cardiology 2018;14(6):491-509 doi:10.2217/fca-2018-0045 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 36 Wu Y, Ding Y, Tanaka Y, et al Risk factors contributing to type diabetes and recent advances in the treatment and prevention International journal of medical sciences 2014;11(11):1185 doi:10.7150/ ijms.10001 37 Sandholm N, Forsblom C Chapter 3: Genetics of diabetic microvascular disease Microvascular Disease in Diabetes 2020:23-44 doi:10.1002/97811 19309642.ch3 38 Newsholme P, Cruzat VF, Keane KN, et al Molecular mechanisms of ROS production and oxidative stress in diabetes Biochemical Journal 2016;473(24):4527-4550 doi:10.1042/BCJ20160503C 39 Oguntibeju OO Type diabetes mellitus, oxidative stress and inflammation: examining the links International journal of physiology, pathophysiology and pharmacology 2019;11(3):45 40 Gregory JM, Slaughter JC, Duffus SH, et al COVID-19 severity is tripled in the diabetes community: a prospective analysis of the pandemic’s impact in type and type diabetes Diabetes Care 2021;44(2):526-532 doi:10.2337/dc20-2260 41 Eberle C, Stichling S Impact of COVID-19 lockdown on glycemic control in patients with type and type diabetes mellitus: a systematic review Diabetology & metabolic syndrome 2021;13(1):1-8 doi:10.1186/s13098-02100705-9 42 Tomasik P, Horton D Enzymatic conversions of starch Advances in carbohydrate chemistry and biochemistry 2012;68:59-436 doi:10.1016/B9780-12-396523-3.00001-4 43 Del Moral S, Barradas-Dermitz DM, Aguilar-Uscanga MG Production and biochemical characterization of α-glucosidase from Aspergillus niger ITV-01 isolated from sugar cane bagasse Biotech 2018;8(1):1-9 doi:10.1007/s13205-017-1029-6 44 Dušan V, Nenad M, Dejan B, et al The specificity of α-glucosidase from Saccharomyces cerevisiae differs depending on the type of reaction: hydrolysis Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh versus transglucosylation Applied microbiology and biotechnology 2014;98(14):6317-6328 doi:10.1007/s00253-014-5587-9 45 da Costa-Latgé SG, Bates P, Dillon RJ, et al Characterization of glycoside hydrolase families 13 and 31 reveals expansion and diversification of α-amylase genes in the phlebotomine Lutzomyia longipalpis and modulation of sandfly glycosidase activities by Leishmania infection Frontiers in physiology 2021;12:635633 doi:10.3389/fphys.2021.635633 46 Akmal M, Wadhwa R Alpha glucosidase inhibitors In: StatPearls [Internet] StatPearls Publishing 2022 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK557848/ 47 DiNicolantonio JJ, Bhutani J, O’Keefe JH Acarbose: safe and effective for lowering postprandial hyperglycaemia and improving cardiovascular outcomes Open Heart 2015;2(1):e000327 doi:10.1136/openhrt-2015-000327 48 Moradi-Marjaneh R, Paseban M, Sahebkar A Natural products with SGLT2 inhibitory activity: possibilities of application for the treatment of diabetes Phytotherapy Research 2019;33(10):2518-2530 doi:10.1002/ptr.6421 49 Reid TS Practical use of glucagon-like peptide-1 receptor ago- nist therapy in primary care Clinical diabetes 2013;31(4):148-157 doi:10.2337/diaclin.31.4.148 50 Sun F, Chai S, Yu K, et al Gastrointestinal adverse events of glucagon-like peptide-1 receptor agonists in patients with type diabetes: a systematic review and network meta-analysis Diabetes technology & therapeutics 2015;17(1):35-42 doi:10.1089/dia.2014.0188 51 Alam F, Islam MA, Kamal MA, et al Updates on managing type diabetes mellitus with natural products: towards anti-diabetic drug development Current Medicinal Chemistry 2018;25(39):5395-5431 doi:10.2174/0929867323666160813222436 52 Blahova J, Martiniakova M, Babikova M, et al Pharmaceutical drugs and natural therapeutic products for the treatment of type diabetes mellitus Pharmaceuticals 2021;14(8):806 doi:10.3390/ph14080806 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 53 El-Manawaty MA, Gohar L In vitro alpha-glucosidase inhibitory activity of egyptian plant extracts as an indication for their antidiabetic activity Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research 2015;11(7):360 doi:10.22159/ajpcr.2018.v11i7.25856 54 Dang PH, Nguyen NT, Nguyen HX, et al α-Glucosidase inhibitors from the leaves of Embelia ribes Fitoterapia 2015;100:201-207 doi:10.1016/j.fitote.2014.12.004 55 Manaharan T, Appleton D, Cheng HM, et al Flavonoids isolated from Syzygium aqueum leaf extract as potential antihyperglycaemic agents Food Chemistry 2012;132(4):1802-1807 doi:10.1016/j.foodchem.2011.11.147 56 Bộ Y tế, Dược điển Việt Nam V NXB Y học 2017 57 C.I Methodology of Analysis of Vegetable and Drugs Rumania: Ministry of Chemical Industry Bucharest 1984 58 Từ Minh Koóng, Kỹ thuật sản xuất dược phẩm Nguyễn Việt Hương Một số kiến thức chiết xuất dược liệu Nhà xuất Y học 2017;1(2):156159 59 Abdullah NH, Salim F, Ahmad R Chemical constituents of Malaysian U cordata var ferruginea and their in vitro α-glucosidase inhibitory activities Molecules 2016;21(5):525 doi:10.3390/molecules21050525 60 Al-Oqail M, Hassan WH, Ahmad MS, et al Phytochemical and biological studies of Solanum schimperianum Hochst. Saudi pharmaceutical journal. 2012;20(4):371-379 doi:10.1016/j.jsps.2012.05.010 61 Hamdan D, El-Readi MZ, Tahrani A, et al Chemical composition and biological activity of Citrus jambhiri Lush. Food chemistry 2011;127(2):394403 doi:10.1016/j.foodchem.2010.12.129 62 Ryu M, Sung CK, Im YJ, et al Activation of JNK and p38 in MCF-7 Cells and the in vitro anticancer activity of Alnus extract. Molecules. 2020;25(5):1073 doi:10.3390/molecules25051073 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn hirsuta Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 63 Chama MA, Dziwornu GA, Waibel R, et al Isolation, characterization, and anthelminthic activities of a novel dichapetalin and other constituents of Dichapetalum filicaule. Pharmaceutical Biology. 2016;54(7):1179-1188 doi:10.3109/13880209.2015.1059861 64 Zefzoufi M, Fdil R, Bouamama H, et al. Effect of extracts and isolated compounds derived from Retama monosperma (L.) Boiss on anti-aging gene expression in human keratinocytes and antioxidant activity Journal of Ethnopharmacology 2021;280:114451. doi:10.1016/j.jep.2021.114451 65 Chen J, Mangelinckx S, Ma L, et al Caffeoylquinic acid derivatives isolated from the aerial parts of Gynura divaricata and their yeast α-glucosidase and PTP1B inhibitory activity Fitoterapia 2014;99:1–6 doi:10.1016/j.fitote.2014.08.015 66 Hebert PDN, Ratnasingham S, De Waard JR Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit divergences among closely related species Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 2003;270 (Suppl_1):S96-S99 doi:10.1098/rsbl.2003.0025 67 Packer L, Gibbs J, Sheffield C, et al DNA barcoding and the mediocrity of morphology Molecular Ecology Resources 2009;9:42-50 doi:10.1111/j.17550998.2009.02631.x 68 Li DZ, Liu JQ, Chen ZD, et al Plant DNA barcoding in China Journal of Systematics and Evolution 2011;49:165-168 doi:10.1111/j.1759- 6831.2011.00137.x 69 Techen N, Parveen I, Pan Z, et al DNA barcoding of medicinal plant material for identification Current opinion in Biotechnology 2014;25:103-110 doi:10.1016/j.copbio.2013.09.010 70 Hollingsworth PM, Graham SW, Little DP Choosing and using a plant DNA barcode PloS One 2011;6:e19254 doi:10.1371/journal.pone.0019254 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 71 Kress WJ, Erickson DL A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region PLoS One 2007;2:e508 doi:10.1371/journal.pone.0000508 72 Gonzalez MA, Baraloto C, Engel J, et al Identification of Amazonian trees with DNA barcodes PLoS One 2009;4:e7483 doi:10.1371/journal.pone.0007483 73 Chen S, Yao H, Han J, et al Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species PloS One 2010;5:e8613 doi:10.1371/journal.pone.0008613 74 Yao H, Song J, Liu C, et al Use of ITS2 region as the universal DNA barcode for plants and animals PloS One 2010;5:e13102 doi:10.1371/journal.pone.0013102 75 Kress WJ, Prince LM, Williams KJ The phylogeny and a new classification of the gingers (Zingiberaceae): evidence from molecular data American Journal of Botany 2002;89(10):1682-1696 doi:10.3732/ajb.89.10.1682 76 Ngamriabsakul C, Newman MF, Cronk QCB The phylogeny of tribe Zingibereae (Zingiberaceae) based on its (nrDNA) and trnl-f (cpDNA) sequences Edinburgh Journal of Botany 2003;60(3):483-507 doi:10.1017/S0960428603000362 77 Sam YY, Takano A, Ibrahim H, et al Borneocola (Zingiberaceae), a new genus from Borneo PhytoKeys 2016;75:31-55 doi:10.3897/phytokeys.75.9837 78 Conklin KY, Kurihara A, Sherwood AR A molecular method for identification of the morphologically plastic invasive algal genera Eucheuma and Kappaphycus (Rhodophyta, Gigartinales) in Hawaii Journal of applied phycology 2009;21(6):691-699 doi:10.1007/s10811-009-9404-2 79 Uma E, Muthukumar T Comparative root morphological anatomy of Zingiberaceae Systematics and biodiversity 2014;12(2):195-209 doi:10.1080/14772000.2014.894593 80 Rudall PJ, Chen ED, Cullen E Evolution and development of monocot stomata American Journal of Botany 2017;(8):1122-1141 doi:10.3732/ajb.1700086 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 81 Zahara M Identification of morphological and stomatal characteristics of Zingiberaceae as medicinal plants in Banda Aceh, Indonesia In: Samadi, Yunita D, Goritno AD (eds) IOP Conf Ser: Earth Environ Sci The 1st International Conference on Agriculture and Bioindustry, Banda Aceh, Indonesia 2020 doi:10.1088/1755-1315/425/1/012046 82 Liu H, Specht CD, Zhao T, et al Morphological anatomy of leaf and rhizome in Zingiber officinale Roscoe, with emphasis on secretory structures HortScience 2020;55(2):204-207 doi:10.21273/HORTSCI14555-19 83 Greger M, Landberg T, Vaculík M Silicon influences soil availability and accumulation of mineral nutrients in various plant species BMC Plant Biology 2018;7(2):41 doi:10.3390/plants7020041 84 Alhousari F, Greger M Silicon and mechanisms of plant resistance to insect pests Plants 2018;7(2):33 doi:10.3390/plants7020033 85 Yan GC, Nikolic M, Ye MJ, et al Silicon acquisition and accumulation in plant and its significance for agriculture Journal of Integrative Agriculture 2018;17(10):2138-2150 doi:10.1016/S2095- 3119(18)62037-4 86 McNair JB The interrelation between substances in plants: essential oils and resins, cyanogen and oxalate American Journal of Botany 1932;19(3):255-272 doi:10.2307/2436337 87 Franceschi VR, Horner HT Calcium oxalate crystals in plants The Botanical Review 1980;46(4):361-427 doi:10.1007/BF02860532 88 Gevú KV, Da Cunha M, Barros CF, et al Structural analysis of subterranean organs in Zingiberaceae Plant systematics and evolution 2014;300(5):10891098 doi:10.1007/s00606-013-0947-y 89 Amel B Microscopic analysis of Curcuma longa L using multivariate test International Journal of Pharmacology 2015;2(4):173-177 doi:10.13040/IJPSR.0975-8232.IJP.2(4).173-77 90 Paopun Y Calcium oxalate crystals and leaf anatomical characteristics of Kaempferia galanga L Microscopy and Microanalysis Research–The Journal Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh of The Microscopy Society of Thailand 2020;33(1):28-33 doi:10.14456/microsc-microanal-res.2020.7 91 Nakata PA Advances in our understanding of calcium oxalate crystal formation and function in plants Plant Science 2003;164(6):901-909 doi:10.1016/S0168-9452(03)00120-1 92 WHO Quality Control Methods for Medicinal Plant materials 1998 93 Van Chen T, Lam DNX, Thong CLT, et al Morphological characters, pharmacognostical parameters, and preliminary phytochemical screening of Curcuma sahuynhensis Škorničk & NS Lý in Quang Ngai Province, Vietnam Biodiversitas Journal of Biological Diversity 2022;23(8):3907-3920 doi:10.13057/biodiv/d230807 94 Kaskoos RA, Ahamad J Evaluation of pharmacognostic features of aerial parts of Andrographis paniculata Wall. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 2014;3(1):1-5 95 Jackson BP, Snowdon DW Atlas of Microscopy of Medicinal Plants, Culinary Herbs and Spices Belhaven Press, London, United Kingdom 1990 96 Osman AG, Raman V, Haider S, et al Overview of analytical tools for the identification of adulterants in commonly traded herbs and spices Journal of AOAC International 2019;102(2):376-385 doi:10.5740/jaoacint.18-0389 97 Aeri V, Anantha Narayana DB, Singh D Chapter - Introduction to powder microscopy In: Aeri V, Anantha Narayana DB, Singh D (eds) Powdered Crude Drug Microscopy of Leaves and Barks Elsevier, United States 2020 doi: 10.1016/B978-0-12-818092-1.00001-4 98 Mathew S, Britto SJ, Thomas S Comparative powder microscopical screening of the rhizome and leaf of Alpinia calcarata and Alpinia galanga International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research 2014;5(4):1449 doi:10.13040/IJPSR.0975-8232.5(4).1449-53 99 Roy S, Acharya RN, Harisha CR, et al Macro, microscopic and preliminary analytical evaluation of root and leaf of Globba marantina Linn -An Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh extrapharmacopoeial drug of Ayurveda Indian Journal of Pharmaceutical Sciences 2016;78(4):469-478 doi:10.4172/pharmaceutical-sciences.1000141 100 Wijayasiriwardena C, Premakumara S Comparative powder microscopy of Alpinia calcarata Roscoe and Alpinia galanga (Linn.) Willd Ayu 2012;33(3):441 doi:10.4103/0974-8520.108863 101 Danapur V, Venugopal RB Pharmacognostic Studies on Curcuma longa International Journal of Pharmacognosy & Chinese 2019;3:000163 doi:10.23880/ipcm-16000163 102 Paliwal P, Pancholi SS, Patel RK Pharmacognostic parameters for evaluation of the rhizomes of Curcuma caesia Journal of advanced pharmaceutical technology & research 2011;2(1):56 doi:10.4103/2231-4040.79811 103 Aye YY Microscopical Characters, Phytochemical and FTIR Studies on Rhizome of Zingiber officinale Rosc (Gyin) [Dissertation] University of Mandalay Research Journal 2020;11:10-20 104 Vinitha MR, Kumar US, Aishwarya K, et al Prospects for discriminating Zingiberaceae species in India using DNA barcodes Journal of integrative plant biology 2014;56(8):760-773 doi:10.1111/jipb.12189 105 Labrooy CD, Abdullah TL, Stanslas J Identification of ethnomedicinally important Kaempferia L (Zingiberaceae) species based on morphological traits and suitable DNA region Current Plant Biology 2018;14:50-55 doi:10.1016/j.cpb.2018.09.004 106 Tan WH, Chai LC, Chin CF Efficacy of DNA barcode internal transcribed spacer (ITS 2) in phylogenetic study of Alpinia species from Peninsular Malaysia Physiology and Molecular Biology of Plants 2020;26(9):1889-1896 doi:10.1007/s12298-020-00868-1 107 Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, et al Use of DNA barcodes to identify flowering plants The Proceedings of the National Academy of Sciences 2005;102(23):8369- 8374 doi:10.1073/pnas.0503123102 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 108 Bouchelaghem S, Das S, Naorem RS, et al Evaluation of total phenolic and flavonoid contents, antibacterial and antibiofilm activities of Hungarian Propolis ethanolic extract against Staphylococcus aureus Molecules 2022;27(2),574 doi:10.3390/molecules27020574 109 Xiao J Recent advances in dietary flavonoids for management of type diabetes Current Opinion in Food Science 2022;44:10086 doi:10.1016/j.cofs.2022.01.002 110 Diantini A, Subarnas A, Lestari K, et al Kaempferol-3-O-rhamnoside isolated from the leaves of Schima wallichii Korth inhibits MCF-7 breast cancer cell proliferation through activation of the caspase cascade pathway Oncology Letters 2012;3(5):1069-1072 doi:10.3892/ol.2012.596 111 Thapa CB, Paudel MR, Bhattarai HD, et al Bioactive secondary metabolites in Paris polyphylla Sm and their biological activities: A review Heliyon 2022:e08982 doi:10.1016/j.heliyon.2022.e08982 112 Jiménez-Suárez V, Nieto-Camacho A, Jiménez-Estrada M, et al Antiinflammatory, free radical scavenging and alpha-glucosidase inhibitory activities of Hamelia patens and its chemical constituents Pharmaceutical Biology 2016;54(9):1822-1830 doi:10.3109/13880209.2015.112 113 Laoufi H, Benariba N, Adjdir S, et al In vitro α-amylase and α-glucosidase inhibitory activity of Ononis angustissima extracts Journal of Applied Pharmaceutical Science 2017;7(02):191-198 doi:10.7324/JAPS.2017.70227 114 Lee HE, Kim JA, Whang WK Chemical constituents of Smilax china L stems and their inhibitory activities against glycation, aldose reductase, α-glucosidase, and lipase Molecules 2017;22(3):451 doi:10.3390/molecules22030451 115 Dej-Adisai S, Rais IR, Wattanapiromsakul C, et al Alpha-glucosidase inhibitory assay-screened isolation and molecular docking model from Bauhinia pulla active compounds doi:10.3390/molecules26195970 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Molecules 2021;26(19): 5970 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 116 Dao TBN, Nguyen TMT, Tran CL et al Flavones from Combretum quadrangulare growing in Vietnam and their alpha-glucosidase inhibitory activity Molecules 2021;26(9): 2531 doi:10.3390/molecules26092531 117 Tripathi UN, Chandra D The plant extracts of Momordica charantia and Trigonella foenum-graecum have antioxidant and anti-hyperglycemic properties for cardiac tissue during diabetes mellitus Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2009;2(5):290–296 doi:10.4161/oxim.2.5.9529 118 Azuma T, Kayano S, Matsumura Y, et al Antimutagenic and α-glucosidase inhibitory effects of constituents from Kaempferia parviflora Food Chemistry 2011;125(2):471–475 doi:10.1016/j.foodchem.2010.09 119 Macedo I, da Silva JH, da Silva PT, et al Structural and microbiological characterization of 5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone: a flavonoid isolated from Vitex gardneriana Schauer leaves Microbial Drug Resistance 2019;25(3): 434-438 doi:10.1089/mdr.2018.0359 120 Tewtrakul S, Subhadhirasakul S, Karalai C, et al Anti-inflammatory effects of compounds from Kaempferia parviflora and Boesenbergia pandurata Food Chemistry 2009;115(2):534–538 doi:10.1016/j.foodchem.2008.12.057 121 Teffo LS, Aderogba MA, Eloff JN Antibacterial and antioxidant activities of four kaempferol methyl ethers isolated from Dodonaea viscosa Jacq var angustifolia leaf extracts South African Journal of Botany 2010;76(1):25-29 doi:10.1016/j.sajb.2009.06.010 122 Wang X, Yang Y, An Y, et al The mechanism of anticancer action and potential clinical use of kaempferol in the treatment of breast cancer Biomedicine & Pharmacotherapy 2019;117:109086 doi:10.1016/j.biopha.2019.109086 123 Alam W, Khan H, Shah MA, et al Kaempferol as a dietary anti-inflammatory agent: Current therapeutic doi:10.3390/molecules25184073 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn standing Molecules 2020;25(18):4073 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 124 Khazdair MR, Anaeigoudari A, Agbor GA Anti-viral and anti-inflammatory effects of kaempferol and quercetin and COVID-2019: A scoping review Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 2021;11(8):327 doi:10.4103/22211691.319567 125 Chen L, Teng H, Xie Z, et al Modifications of dietary flavonoids towards improved bioactivity: An update on structure-activity relationship Critical Reviews in Food Science and Nutrition 2017;58(4):513–527 doi:10.1080/10408398.2016.1196334 126 Sheng Z, Ai B, Zheng L, et al Inhibitory activities of kaempferol, galangin, carnosic acid and polydatin against glycation and α‐amylase and α‐glucosidase enzymes International Journal of Food Science & Technology 2018;53(3):755-766 doi:10.1111/ijfs.13579 127 Sarian MN, Ahmed QU, Mat So’ad SZ, et al Antioxidant and antidiabetic effects of flavonoids: A structure-activity relationship based study BioMed research international 2017 doi:10.1155/2017/8386065 128 Opeyemi RF, Zaiton MSAS, Uddin AQ, et al α-glucosidase Inhibitory and Antioxidant Activities of Entada spiralis Ridl (Sintok) Stem Bark Extracts. Pertanika Journal of Tropical Agricultural Science 2019;42(1):139153 129 Seyoum A, Asres K, El-Fiky FK Structure–radical scavenging activity relationships of flavonoids Phytochemistry 2006;67(18):2058-2070 doi:10.1016/j.phytochem.2006.07.002 130 Amaral S, Mira L, Nogueira JMF, et al Plant extracts with anti-inflammatory properties—A new approach for characterization of their bioactive compounds and establishment of structure–antioxidant activity relationships Bioorganic & medicinal chemistry 2009;17(5):1876-1883 doi:10.1016/j.bmc.2009.01.045 131 Abou Baker DH An ethnopharmacological review on the therapeutical properties of flavonoids and their mechanisms of actions: A comprehensive Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh review based on up to date knowledge Toxicology Reports 2022; 9:445-469 doi:10.1016/j.toxrep.2022.03.011 132 Peng X, Zhang G, Liao Y, et al Inhibitory kinetics and mechanism of kaempferol on α-glucosidase Food Chemistry 2016;190:207-215 doi:10.1016/j.foodchem.2015.05.088 133 Nguyen TT, Kretschmer N, Pferschy-Wenzig EM, et al Triterpenoidal and phenolic compounds isolated from the aerial parts of Helicteres hirsuta and their cytotoxicity on several cancer Communications cell lines. Natural Product 2019;14(1):1934578X1901400103 doi:10.1177/1934578X1901400103 134 Pierre LL, Moses MN Isolation and characterisation of stigmasterol and βsitosterol from Odontonema strictum (acanthaceae). Journal of Innovations in Pharmaceuticals and Biological Sciences 2015;2(1): 88-95 135 Babu S, Jayaraman S An update on β-sitosterol: A potential herbal nutraceutical for diabetic management Biomedicine & Pharmacotherapy 2020;131:110702 doi:10.1016/j.biopha.2020.110702 136 Gupta E β-Sitosterol: Predominant phytosterol of therapeutic potential Innovations in food technology 2020; 465-477 doi:10.1007/978-981-15-61214_32 137 Nattagh‐Eshtivani E, Barghchi H, Pahlavani N, et al Biological and pharmacological comprehensive effects review and nutritional Phytotherapy impact of Research phytosterols: A 2022;36(1):299-322 doi:10.1002/ptr.7312 138 Ren X, He T, Chang Y, et al The genus Alnus, a comprehensive outline of its chemical constituents and biological activities Molecules 2017;22(8):1383 doi:10.3390/molecules22081383 139 Lv H, She G Naturally Occurring Diarylheptanoids-A Supplementary Version Records of Natural Products 2012:6(4):321-333 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 140 Sun DJ, Zhu LJ, Zhao YQ, et al Diarylheptanoid: A privileged structure in drug discovery Fitoterapia 2020;142:104490 doi:10.1016/j.fitote.2020.104490 141 Tung NH, Kwon HJ, Kim JH, et al Anti-influenza diarylheptanoids from the bark of Alnus japonica Bioorganic & medicinal chemistry letters 2010;20(3): 1000-1003 doi:10.1016/j.bmcl.2009.12.057 142 Dinić J, Novaković M, Podolski-Renić A, et al Antioxidative activity of diarylheptanoids from the bark of black alder (Alnus glutinosa) and their interaction with anticancer drugs Planta medica 2014;80(13):1088-1096 doi: 10.1055/s-0034-1382993 143 Giang PM, Son PT, Matsunami K, et al One new and several minor diarylheptanoids from Amomum muricarpum. Natural Product Research. 2012;26(13):1195-1200 doi:10.1080/14786419.2010.545775 144 Park D, Kim HJ, Jung SY, et al A new diarylheptanoid glycoside from the stem bark of Alnus hirsuta and protective effects of diarylheptanoid derivatives in human HepG2 cells. Chemical and Pharmaceutical Bulletin 2010;58(2):238241 doi:10.1248/cpb.58.238 145 Novaković M, Pešić M, Trifunović S, et al Diarylheptanoids from the bark of black alder inhibit the growth of sensitive and multi-drug resistant non-small cell lung carcinoma cells Phytochemistry 2014;97:46-54 doi:10.1016/j.phytochem.2013.11.001 146 Han HK, Choi SS, Kim YR, et al Diarylheptanoid and flavonoid with antioxidant activity from Alnus japonica Steud on DPPH free radical scavenging assay Preventive Nutrition and Food Science 2006;11(2):171-175 doi:10.3746/jfn.2006.11.2.171 147 Clifford MN Chlorogenic acids and other cinnamates–nature, occurrence, dietary burden, absorption and metabolism Journal of the Science of Food and Agriculture 2000;80(7):1033-1043 doi:10.1002/(SICI)1097- 0010(20000515)80:73.0.CO;2-T Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 148 Chan EWC, Lim YY, Ling SK, et al Caffeoylquinic acids from leaves of Etlingera species (Zingiberaceae) LWT-Food Science and Technology 2009;42(5):1026-1030 doi:10.1016/j.lwt.2009.01.003 149 Barbosa GB, Jayasinghe NS, Natera SH, et al From common to rare Zingiberaceae plants-A metabolomics study using GC-MS Phytochemistry 2017;140:141-150 doi:10.1016/j.phytochem.2017.05.002 150 Xu JG, Hu QP, Liu Y Antioxidant and DNA-protective activities of chlorogenic acid isomers Journal of agricultural and food chemistry 2012;60(46):11625-11630 doi:10.1021/jf303771s 151 Xia D, Wu X, Shi J, et al Phenolic compounds from the edible seeds extract of Chinese Mei (Prunus mume Sieb et Zucc) and their antimicrobial activity LWT-Food Science and Technology 2011;44(1):347-349 doi:10.1016/j.lwt.2010.05.017 152 Rojas-González A, Figueroa-Hernández CY, González-Rios O, et al Coffee Chlorogenic Acids Incorporation for Bioactivity Enhancement of Foods: A Review Molecules 2022;27(11): 3400 doi:10.3390/molecules27113400 153 Anh LTT, Van Tuyen N, Thuy PT, et al Antioxidative and α-glucosidase inhibitory constituents of Polyscias guilfoylei: experimental and computational assessments Molecular Diversity 2022;26(1):229-243 doi:10.1007/s11030021-10206-6 154 Alongi M, Anese M Effect of coffee roasting on in vitro α-glucosidase activity: Inhibition and mechanism of action Food Research International 2018;111:480–487 doi:10.1016/j.foodres.2018.05.061 155 Liang N, Kitts DD Role of chlorogenic acids in controlling oxidative and inflammatory stress conditions Nutrients 2015;8(1):16 doi:10.3390/nu8010016 156 Kahn BB, Alquier T, Carling D, et al AMP-activated protein kinase: ancient energy gauge provides clues to modern understanding of metabolism Cell metabolism 2005;1(1): 15-25 doi:10.1016/j.cmet.2004.12.003 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 157 Meng S, Cao J, Feng Q, et al Roles of chlorogenic acid on regulating glucose and lipids metabolism: a review Evidence-based complementary and alternative medicine: eCAM 2013 doi:10.1155/2013/801457 158 Murugesu S, Ibrahim Z, Ahmed QU, et al Characterization of α-glucosidase inhibitors from Clinacanthus nutans Lindau leaves by gas chromatographymass spectrometry-based metabolomics and molecular docking simulation Molecules 2018;23(9):2402 doi:10.3390/molecules23092402 159 Minh PN, Dinh Tri M, Tan Phat N, et al Two new flavonol glycosides from the leaves of Cleome chelidonii Lf Journal of Asian natural products research 2015;17(4):338-342 doi:10.1080/10286020.2014.976204 160 Lee WS, Kim MJ, Beck YI, et al Lp-PLA2 inhibitory activities of fatty acid glycerols isolated from Saururus chinensis roots Bioorganic & medicinal chemistry letters 2005;15(15):3573-3575 doi:10.1016/j.bmcl.2005.05.056 161 Chang HW, Jang KH, Lee D, et al Monoglycerides from the brown alga Sargassum Bioorganic sagamianum: & Isolation, medicinal synthesis, chemistry letters and biological activity 2008;18(12):3589-3592 doi:10.1016/j.bmcl.2008.05.008 PHỤ LỤC PHỤ LỤC ĐỊNH DANH THỰC VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP DNA .PL1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC TÁC DỤNG CHỐNG OXY HĨA TRÊN MƠ HÌNH DPPH VÀ ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE PL7 PL2-1 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa cao phân đoạn PL7 PL2-2 Sàng lọc tác dụng ức chế α-glucosidase cao phân đoạn PL8 PL2-3 Tác dụng chống oxy hóa đối chứng dương Acid ascorbic (A0278) .PL9 PL2-4 Tác dụng chống oxy hóa hợp chất C1 PL9 PL2-5 Tác dụng chống oxy hóa hợp chất C2 PL10 PL2-6 Tác dụng chống oxy hóa hợp chất C3 C4 PL10 PL2-7 Tác dụng chống oxy hóa hợp chất E1 PL10 PL2-8 Tác dụng chống oxy hóa hợp chất E2 PL11 PL2-9 Tác dụng ức chế α-glucosidase đối chứng dương Acarbose (A8980) .PL12 PL2-10 Tác dụng ức chế α-glucosidase hợp chất C1 .PL12 PL2-11 Tác dụng ức chế α-glucosidase hợp chất C3 .PL13 PL2-12 Tác dụng ức chế α-glucosidase hợp chất C2, C4 E2 .PL13 PL2-13 Tác dụng ức chế α-glucosidase hợp chất E1 PL14 PHỤ LỤC PL3-1 PHỔ MS .PL15 Phổ MS (ESI+) hợp chất C1 (5-Hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavon) PL15 PL3-2 Phổ ESI-MS hợp chất C2 (β-Sitosterol Stigmasterol) PL15 PL3-3 Phổ ESI-MS hợp chất C3 (Platyphyllon) PL16 PL3-4 Phổ ESI-MS hợp chất C4 (Glycerol monostearat) PL17 PL3-5 Phổ ESI-MS hợp chất E1 (Kaempferol) PL17 PL3-6 Phổ ESI-MS hợp chất E2 (Acid trans-5-O-caffeoylquinic) .PL18 PHỤ LỤC PHỔ NMR HỢP CHẤT C1 PL19 PL4-1 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz) hợp chất C1 PL19 PL4-2 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz) hợp chất C1 trích vùng dãn H 3,50–8,50 ppm PL19 PL4-3 Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz) hợp chất C1 PL20 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL4-4 Phổ DEPT hợp chất C1 PL21 PL4-5 Phổ HSQC (DMSO-d6, 150/600 MHz) vùng C 90,0–132,0 ppm H 6,20–8,2 ppm hợp chất C1 .PL21 PL4-6 Phổ HSQC (DMSO-d6, 150/600 MHz) vùng C 51,5–62,5 ppm H 3,60–5,00 ppm hợp chất C1 .PL22 PL4-7 Phổ HMBC (DMSO-d6, 150/600 MHz) vùng C 90,0–185,0 ppm H 3,50–13,00 ppm hợp chất C1 PL23 PL4-8 Phổ HMBC (DMSO-d6, 150/600 MHz) vùng C 90,0–180,0 ppm H 6,20–8,20 ppm hợp chất C1 .PL24 PL4-9 Phổ HMBC (DMSO-d6, 150/600 MHz) vùng C 135,0–170,0 ppm H 3,76–3,90 ppm hợp chất C1 .PL25 PL4-10 Phổ 1H-1H COSY (DMSO-d6, 600 MHz) vùng dãn H 6,20–8,30 ppm hợp chất C1 PL26 PHỤ LỤC PHỔ NMR HỢP CHẤT C2 PL27 PL5-1 Phổ 1H-NMR (CDCl3, 600 MHz) hợp chất C2 PL27 PL5-2 Phổ 1H-NMR (CDCl3, 600 MHz) hợp chất C2 trích vùng dãn H 3,30–5,50 ppm PL27 PL5-3 Phổ 13C-NMR (CDCl3, 150 MHz) hợp chất C2 PL28 PHỤ LỤC PHỔ NMR HỢP CHẤT C3 PL29 PL6-1 Phổ 1H-NMR (CD3OD-d4, 600 MHz) hợp chất C3 PL29 PL6-2 Phổ 13C-NMR (CD3OD-d4, 150 MHz) hợp chất C3 PL30 PL6-3 Phổ DEPT hợp chất C3 PL31 PL6-4 Phổ HSQC (CD3OD-d4, 150/600 MHz) hợp chất C3 .PL31 PL6-5 Phổ HSQC (CD3OD-d4, 150/600 MHz) vùng C 25,0–72,0 ppm H 1,50–4,30 ppm hợp chất C3 .PL32 PL6-6 Phổ HMBC (CD3OD-d4, 150/600 MHz) vùng C 25,0–160,0 ppm H 6,50–7,20 ppm hợp chất C3 .PL33 PL6-7 Phổ HMBC (CD3OD-d4, 150/600 MHz) vùng C 125,0–215,0 ppm H 1,50–2,90 ppm hợp chất C3 .PL34 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL6-8 Phổ HMBC (CD3OD-d4, 150/600 MHz) vùng C 25,0–75,0 ppm H 1,50–2,90 ppm hợp chất C3 .PL35 PL6-9 Phổ 1H-1H COSY (CD3OD-d4, 600 MHz) vùng vị trí H 1,00–4,10 ppm hợp chất C3 PL36 PHỤ LỤC PHỔ NMR HỢP CHẤT C4 PL37 PL7-1 Phổ 1H-NMR (CDCl3, 600 MHz) hợp chất C4 PL37 PL7-2 Phổ 1H-NMR (CDCl3, 600 MHz) hợp chất C4 trích vùng H 0,40–2,50 ppm PL38 PL7-3 Phổ 13C-NMR (CDCl3, 150 MHz) hợp chất C4 PL38 PL7-4 Phổ DEPT hợp chất C4 PL39 PL7-5 Phổ HSQC (CDCl3, 150/600 MHz) vùng C 62,0–71,5 ppm H 3,50– 4,30 ppm hợp chất C4 PL39 PL7-6 Phổ HSQC (CDCl3, 150/600 MHz) vùng C 12,0–38,0 ppm H 0,60– 2,60 ppm hợp chất C4 PL40 PL7-7 Phổ HMBC (CDCl3, 150/600 MHz) vùng C 60,0–180,0 ppm H 2,30– 4,40 ppm hợp chất C4 PL41 PL7-8 Phổ HMBC (CDCl3, 150/600 MHz) vùng C 57,0–75,0 ppm H 3,50– 4,30 ppm hợp chất C4 PL42 PL7-9 Phổ HMBC (CDCl3, 150/600 MHz) vùng C 12,0–36,0 ppm H 0,80– 2,60 ppm hợp chất C4 PL43 PL7-10 Phổ 1H-1H COSY (CDCl3, 600 MHz) vùng vị trí H 3,50–4,30 ppm hợp chất C4 PL44 PL7-11 Phổ 1H-1H COSY (CDCl3, 600 MHz) vùng vị trí H 0,80–2,60 ppm hợp chất C4 PL45 PHỤ LỤC PL8-1 PHỔ NMR HỢP CHẤT E1 PL46 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz) hợp chất E1 trích vùng H 6,00–12,50 ppm PL46 PL8-2 Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz) hợp chất E1 PL47 PL8-3 Phổ DEPT hợp chất E1 PL47 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL8-4 Phổ HSQC (DMSO-d6, 150/600 MHz) hợp chất E1 PL48 PL8-5 Phổ HSQC (DMSO-d6, 150/600 MHz) vùng C 90,0–132,0 ppm H 6,20–8,20 ppm hợp chất E1 .PL48 PL8-6 Phổ HMBC (DMSO-d6, 150/600 MHz) vùng C 90,0–180,0 ppm H 6,00–13,00 ppm hợp chất E1 PL49 PL8-7 Phổ HMBC (DMSO-d6, 150/600 MHz) vùng C 90,0–180,0 ppm H 6,00–8,20 ppm hợp chất E1 .PL50 PL8-8 Phổ 1H-1H COSY (DMSO-d6, 600 MHz) vùng dãn H 6,00–8,40 ppm hợp chất E1 PL51 PHỤ LỤC PL9-1 PHỔ NMR HỢP CHẤT E2 PL52 Phổ 1H-NMR (CD3OD-d4, 600 MHz) hợp chất E2 trích vùng H 5,20–7,80 ppm PL52 PL9-2 Phổ 1H-NMR (CD3OD-d4, 600 MHz) hợp chất E2 trích vùng H 1,80–4,40 ppm PL53 PL9-3 Phổ 13C-NMR (CD3OD-d4, 150 MHz) vùng C 40,0–180,0 ppm E2 PL54 PL9-4 Phổ DEPT hợp chất E2 PL54 PL9-5 Phổ HSQC (CD3OD-d4, 150/600 MHz) vùng C 110,0–150,0 ppm H 6,20–7,60 ppm hợp chất E2 .PL55 PL9-6 Phổ HSQC (CD3OD-d4, 150/600 MHz) vùng C 30,0–80,0 ppm H 2,00–5,50 ppm hợp chất E2 .PL56 PL9-7 Phổ HMBC (CD3OD-d4, 150/600 MHz) vùng C 112,0–173,0 ppm H 5,20–7,80 ppm hợp chất E2 .PL57 PL9-8 Phổ HMBC (CD3OD-d4, 150/600 MHz) vùng C 30,0–80,0 ppm H 1,80–5,50 ppm hợp chất E2 .PL58 PL9-9 Phổ 1H-1H COSY (CD3OD-d4, 600 MHz) vùng vị trí H 6,10–7,80 ppm hợp chất E2 PL59 PL9-10 Phổ 1H-1H COSY (CD3OD-d4, 600 MHz) vùng vị trí H 1,80–5,80 ppm hợp chất E2 PL60 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL1 PHỤ LỤC ĐỊNH DANH THỰC VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP DNA Nơi thực hiện: Thử nghiệm giải trình tự DNA thực Công Ty TNHH Dịch vụ Thương mại Nam Khoa (Nam khoa Biotek), TP Hồ Chí Minh Hóa chất thí nghiệm Hóa chất trích ly DNA: Đệm cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) (2% CTAB, 100 mM Tris pH 8,0, 20 mM EDTA pH 8,0 NaCl 1,4 M), βmercaptoethanol, hỗn hợp CHCl3: Isoamyl alcohol (24:1), Enzym RNase, Isopropanol, EtOH 70% Hóa chất PCR và điện di: PCR Mix (NEXpro, Hàn Quốc), Agarose tinh khiết, thuốc nhuộm Ethidium bromide, Đệm Tris-Acetate-EDTA (TAE) 1X, giấy parafilm, Loading dye 6x, Ladder 2-log, đệm Tris-acid etylendiamintetraacetic (TE), nước cất Quy trình nghiên cứu phân tử Tách chiết DNA phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Tổng số DNA tách chiết cách sử dụng quy trình Khanuja cộng (1999) Trong CTAB sử dụng để phá tế bào, chloroform-isoamyl alcohol để loại protein, isopropanol để tủa DNA Sau đó, nồng độ độ tinh DNA xác định máy quang phổ Gene Quant bước sóng 260, 280 230 nm DNA tinh sau bảo quản -20 °C sử dụng theo phương pháp Khanuja cộng (1999) Để phân tích DNA lồi khảo sát theo Cheng cộng (2016), vùng trình tự ITS khuếch đại cách sử dụng cặp mồi ITS1 (chiều xuôi) ITS4 (chiều ngược) tương ứng với trình tự 5'–3': TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC Quá trình PCR thực máy Mastercycler (Eppendorf, Đức) với thành phần sau: 12,5 µL Go Taq Green Master Mix (Promega, Mỹ); 1,25µL mồi xi ngược (10 µM); 9,5µL nước khử ion 0,5 µL DNA mẫu (25 µg/µL) Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR gồm: biến tính khởi đầu phút 94 °C; 35 chu kỳ gồm: biến tính (1 phút 94 °C), bắt cặp (1 phút 54 °C) kéo dài (2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL2 phút 72 °C); kéo dài bổ sung 72 °C 10 phút Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 0,6%, sử dụng thang chuẩn 1kb hãng Thermo fisher scientific, Mỹ (# SM1553, 100 - 5000 bp) Tinh giải trình tự DNA Sản phẩm PCR tinh giải trình tự chiều phương pháp Sanger máy 3130xl Genetic Analyer (16 mao quản) (ABI, Mỹ) thực Công ty Nam Khoa (BioTek, Việt Nam) Kết giải trình tự chiều vùng gen ITS lồi khảo sát xử lý thơ để loại bỏ vùng tín hiệu yếu, nhiễu hiệu chỉnh vị trí có tín hiệu khơng rõ ràng, sau kiểm tra độ xác thiết lập trình tự consensus phần mềm Seaview Mega 11 Phân tích số liệu ITS Việc kiểm tra độ xác trình tự DNA xây dựng trình tự đồng thuận thực gói phần mềm Seaview Mega 11 Sau kiểm tra trình tự, ba năm trình tự bị loại bỏ tỷ lệ tín hiệu nhiễu cao Các sản phẩm PCR giải trình tự lại sử dụng làm truy vấn cho BLAST (Basic Local Alignment Search Tool: Cơng cụ tìm kiếm chỉnh cục bản) chi Distichochlamys (taxid: 97740) để xác định tên lồi Sau đó, chuỗi trình tự MZ310840 so sánh với bốn chuỗi ITS D citrea (mã số: AF478744, AY424757, AJ388282 AB552946), chuỗi trình tự ITS D rubrostriata (HM236130) chín chuỗi trình tự ITS ngẫu nhiên lồi khác họ Zingiberaceae (mã số: AF478788, LC148074, LC148080, KY492399, HM236152, LC148062, AB245522, KY492426 KY701326) cách sử dụng biểu đồ hình phát sinh lồi (khả tối đa với bootstrap = 1000) để xác nhận hiệu ITS việc xác định D citrea (bảng PL1-1) Biểu đồ hình phát sinh lồi xây dựng phần mềm Mega11 Bảng PL1-1 Các trình tự sử dụng để xây dựng biểu đồ hình phát sinh loài theo phương pháp khả tối đa (Maximum Likelihood) Tên lồi Mã số tham chiếu Trích dẫn tham chiếu D citrea MZ310840 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Chuỗi mẫu khảo sát Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL3 D citrea AF478744 D citrea AY424757 D citrea AJ388282 D rubrostriata HM236130 Kress cộng (2002) Ngamriabsakul cộng (2003) Searle Hedderson (2000) Zheng Xia (2010) D citrea AB552946 Sam cộng (2016) AF478788 Scaphochlamys biloba LC148074 Kress cộng (2002) Sam cộng (2016) LC148080 Sam cộng (2016) S perakensis S endauensis KY492399 Borneocola calcicola Ooi (2018) HM236152 Zingiber ellipticum LC148062 Zheng Xia (2010) Sam cộng (2016) B calcicola AB245522 Myxochlamys mullerensis Takano Nagamasu (2007) KY492426 S malaccana Ooi (2018) KY701326 Boesenbergia bella 10 Mood cộng (2019) Chuỗi trình tự mẫu khảo sát 14 mẫu so sánh theo phương pháp Maximum Likelihood (bootstrap = 1000) MZ310840 AF478744 AY424757 AJ388282 HM236130 AB552946 AF478788 LC148074 LC148080 KY492399 HM236152 LC148062 AB245522 KY492426 MN803339 10 | | TTGTTGAG TTGTTGAG TTGTTGAG -TTGTTGAG TTGTTGAG TTGTTGAGAG TGAG -GAG -TTGAG TTGTTGAG -TTGAG -TTGAG -GAG TTGTTGAG 20 | | AGAG-CATAG AGAG-CATAG AGAG-CATAC AG-AATAG AGAG-CATAT AGAG-CATAG AACAACATAA AGAA-CATAA AGAAACATAA AGAG-CATAG AGAG-CATAG AGAG-CATAG AGAG-CATAG AGAAACATAA AGAG-CATAG 30 | | AAT GACGG AAT GACGG AAT GACGG AAT GACGG AAT GACGG AAT GACGG AAT GACGG AAT GACGG AAT GACGG AAT GACGG AATACGATGG AAT GACGG AAT AATGG AAT GACGG AAT GATGG 40 | | ATGGTTGTGA ATGGTTGTGA ATGGTTGTGA ATGGTTGTGA ATGGTTGTGA ATGGTTGTGA ATGGTTGTGA ATGGTTGTGA ATGGTTGTGA ATGGCCGTGA ATGGTTGTGA ATGGCCGTGA ATGATTGTGA ATGGTTGTGA ATGGTTGTGA 50 | | ATGTGTGAAT ATGTGTGAAT ATGTGTGAAT ATGTGTGAAT ATGTGTGAAT ATGCGTGAAT ACGTGTGAAT ATGTGTGAAC ATGTGTGAAT ATGTGTGAAT ATGTGTGAAC ATGTGTGAAT ATGTGTGAAT ATGTGTGAAT ACGTGTGAAT 60 | | GCGTCCCTTT GCGTCCCTTT GCGTCTCTTT GCGTCCCTTT GCGTCCCTTT GCGTCCCTTT GCGTCCCTTT GTGTCCCTTT GTGTCCCTTT GTGTCCCTTT GTGTCCCTTT GTGTCCCTTT GTGTCCCTTT GTGTCCCTTT GTGTCCCTTT 70 | | CCTTGCCCCC CCTTGCCCCC CCTTGCCCCC CCTTGCCCCC CCTTGCCCCC CCTTGCCCCC CCTCGCCCCG ACTCGCCCCA CCTCGCCCCG CCTCGCCCCA CCTCGCCCCA CCTCGCCCCA CCTTGCCCCA CCTCGCCCCG CCTTGCCCCA 80 | | CACCTTATGT AACAT-ATGT AACAT-ATGT AACAT-ATGT AACAT-ATGT AACAT-ATGT CCCCA TGT CCCCA TGT CCCCA TGT CGTTA TGT CCCAT -GT CGTTA TGT CGTT -CCCCA TGT TCCAT -GT 90 | | TGGTGGGTGA TGGTGGGTGA TGGTGGGTGA TGGTGGGTKA TGGCGGGCGA TGGTGGGTGA TGGCGGGCGA TGGCGGGCGA CGGCGGGCGA TGGCGGGCGA CGGTGGGCGA TGGCGGGCGA -GGTGGGCGA CGGCGGGCGA CGGTGGG-GA MZ310840 AF478744 AY424757 AJ388282 HM236130 AB552946 AF478788 LC148074 LC148080 KY492399 HM236152 LC148062 100 | | TTGACCGTTG TTGACMGTAG TTGACCATAG TTGACCCTAG TTGACCGTAG TTGACCCTAG TTGACCGTAG TTGACCGTAG TTGACCGTAG TCGACCGTAG TTGACCGTAG TCGACCGTAG 110 | | CTCGGTGTGA CTCGGTGCGA CTCGGTGCGA CTCGGTGCGA CTCGGTGCGA CTCGGTGCGA CTCGGTGCGA CTCGGTGCGA CTCGGTGCGA CTCAGTGCGA CTCGGTGCGA CTCAGTGCGA 120 | | TCAGCACTAA TCAGCACTAA TCAGCACTAA ACCGCACTWA TCAGCACTAA TCAGCACTAA TCAGCACTAA TCAGCACTAA TCAGCACTAA TCAGCACTAA TCAGCACTAA TCAGCACTAA 130 | | GGAACA -GGAACA -GGAACAATAA GGAASA -GGAACA -GGAACA -GGAACA -GGAACA -GGAACA -GGAACA -GGAACA -GGAACA 140 | | ATGA ATGA GGAACAATGA ATGA TTGA ATGA ATGA ATGA ATGA ATGA ATGA ATGA 150 | | A CTCAG A CTCGG A CTCGG A CTCGG A CTCAG A CTCGG A CTCGG A CTCGG A CTCGG ATGAACTCGG A CTCGG ATGAACTCGG 160 | | AAGCAAAGGG AAACAAAGGG AAGCAAAGGG AAGCAGAGGG AAGCAAAGGG AAGCAAAGGG AAGCAAAGGG AAGCAAAGGG AAGCAAAGGG AAGCAAAGGG AAGCGGAGGG AAGCAAAGG- 170 | | -CCCCTTGGC -CCCCTTGGC -CCCCTTGGC -CCCCTTGGC -CCCCTTGGA -CCCCTTGGC -TCCCTTGGC -TCCCTTGGC GTCCCTTGGC -TCCCTTGGC -CCCCTTGGC -TCCCTTGGC 180 | | GTGCACAGGG GTGCACAGGG GTGCACAGGG GTGCACAGGG ATGCGCAGGG GTGCACAGGG GTGCGCAAGG GTGCGCAAGG GTGCGCAAGG GTGCGCAGGG GTGCGCGGGG GTGCGCAGGG Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL4 AB245522 KY492426 MN803339 TTGACCGTAG CTCAGTGCGA TCGGCACTAA GGAACA ATGA A CTCGG AAGCAAAGGG -TCCCTTGGC GTGCGCAGGG TTGACCGTAG CTCGGTGCGA TCGGCACTAA GGAACA ATGA A CTCGG AAGCAAAGGG -TCCCTTGGC GTGCGCAAGG TTGACCGTAG CTCGGTGCGA TCCGCACTAA GGAACA ATGA A CTCGG AAGCAGAGGG -CCCCTTGGC GTGCACAGGG MZ310840 AF478744 AY424757 AJ388282 HM236130 AB552946 AF478788 LC148074 LC148080 KY492399 HM236152 LC148062 AB245522 KY492426 MN803339 190 | | -A-GCCCAAT -A-GCCCAAT -A-GCCCAAT -A-GCCCAAT -A-GCCCAAT -A-GCCCAAT AG CCCAAT AG CCCAAT AGAGCCCAAT AG CCCAAT GA-GCCCAAT AG CCCAAT AG CCCGAT AGAGCCCAAT -A-GCCCAAT 200 | | GCGTCGGAGA GCGTCGGAGA GCGTCGGAGA GCGTCGGAGA GCGTCGGAGA GCGTCGGAGA GCGTCGGAGA GCGTCGGAGA GCGTCGGAGA GCGTCGGAGA GCGTCGGAGA GCGTCGGAGA GCATCGGAGA GCGTCGGAGA GCGTCGGAGA 210 | | TTCCTCGGAA TTCCTCGGAA TTCCTCGGAA TTCCTCGGAA TTCCTCGGAA TTCCTCGGAA TTCCTCGGAA TTCCTCGGAA TTCCTCGGAA TTCCTCGGAA TTCCTCGGAA TTCCTCGGAA TTCCTCGGAA TTCCTCGGAA TTCCTCGGAA 220 | | CCAAATGACT CCAAATGACT CCAAATGACT CCAAATGACT CCAAATGACT CCAAATGACT TCAAATGACT TCCAATGACT TCAAATGACT TCAAATGACT TCAAATGACT TCAAATGACT TCGAATGACT TCAAATGACT TCAAATGACT 230 | | CTCGGCAATG CTCGGCAATG CTCGGCAATG CTCGGCAATG CTCGGCAATG CTCGGCAATG CTCGGCAATG CTCGGCAATG CTCGGCAATG CTCGGCAATG CTCGGCAATG CTCGGCAATG CTCGGCAATG CTCGGCAATG CTCGGCAATG 240 | | GATATCTCGG GATATCTCGG GATATCTCGG GATATCTCGG GATATCTCGG GATATCTCGG GATATCTCGG GATATCTCGG GATATCTCGG GATATCTCGG GATATCTCGG GATATCTCGG GATATCTCGG GATATCTCGG GATATCTCGG 250 | | CTCTTGCATC CTCTTGCATC CTCTTGCATC CTCTTGCATC CTCTTGCATC CTCTTGCATC CTCTTGCATC CTCTTGCATC CTCTTGCATC CTCTTGCATC CTCTTGCATC CTCTTGCATC CTCTTGCATC CTCTTGCATC CTCTTGCATC 260 | | GATGAAGAAC GATGAAGAAC GATGAAGAAC GATGAAGAAC GATGAAGAAC GATGAAGAAC GATGAAGAAC GATGAAGAAC GATGAAGAAC GATGAAGAAC GATGAAGAAC GATGAAGAAC GATGAAGAAC GATGAAGAAC GATGAAGAAC 270 | | GTAGTGAAAT GTAGTGAAAT GTAGTGAAAT GTAGTGAAAT GTAGTGAAAT GTAGTGAAAT GTAGTGAAAT GTAGTGAAAT GTAGTGAAAT GTAGTGAAAT GTAGTGAAAT GTAGTGAAAT GTAGTGAAAT GTAGTGAAAT GTAGTGAAAT MZ310840 AF478744 AY424757 AJ388282 HM236130 AB552946 AF478788 LC148074 LC148080 KY492399 HM236152 LC148062 AB245522 KY492426 MN803339 280 | | GCGATACTTG GCGATACTTG GCGATACTTG GCGATACTTG GCGATACTTG GCGATACTTG GCGATACTTG GCGATACTTG GCGATACTTG GCGATACTTG GCGATACTTG GCGATACTTG GCGATACTTG GCGATACTTG GCGATACTTG 290 | | GTGTGAATTG GTGTGAATTG GTGTGAATTG GTGTGAATTG GTGTGAATTG GTGTGAATTG GTGTGAATTG GTGTGAATTG GTGTGAATTG GTGTGAATTG GTGTGAATTG GTGTGAATTG GTGTGAATTG GTGTGAATTG GTGTGAATTG 300 | | CAGAATCTCG CAGAATCTCG CAGAATCTCG CAGAATCTCG CAGAATCTCG CAGAATCTCG CAGAATCTCG CAGAATCTCG CAGAATCTCG CAGAATCTCG CAGAATCTCG CAGAATCTCG CAGAATCTCG CAGAATCTCG CAGAATCTCG 310 | | TGAACCATTG TGAACCATTG TGAACCATTG TGAACCATTG TGAACCATTG TGAACCATTG TGAACCATTG TGAACCATTG TGAACCATTG TGAACCATTG TGAACCATTG TGAACCATTG TGAACCATTG TGAACCATTG TGAACCATTG 320 | | AGTCTTTGAA AGTCTTTGAA AGTCTTTGAA AGTCTTTGAA AGTCTTTGAA AGTCTTTGAA AGTCTTTGAA AGTCTTTGAA AGTCTTTGAA AGTCTTTGAA AGTCTTTGAA AGTCTTTGAA AGTCTTTGAA AGTCTTTGAA AGTCTTTGAA 330 | | CGCAAGTTGT CGCAAGTTGT CGCAAGTTGT CGCAAGTTGT CGCAAGTTGT CGCAAGTTGT CGCAAGTTGT CGCAAGTTGT CGCAAGTTGT CGCAAGTTGT CGCAAGTTGT CGCAAGTTGT CGCAAGTTGT CGCAAGTTGT CGCAAGTTGT 340 | | GCCCGAGGCC GCCCGAGGCC GCCCGAGGCC GCCCGAGGCC GCCCGAGGCC GCCCGAGGCC GCCCGAGGCC GCCCGAGGCC GCCCGAGGCC GCCCGAGGCC GCCCGAGGCC GCCCGAGGCC GCCCGAGGCC GCCCGAGGCC GCCCGAGGCC 350 | | TTGTGGTCGA TTGTGGTCGA TTGTGGTCGA TTGTGGTCGA TTGTGGTCGA TTGTGGTCGA TTGTGGTCGA TTGTGGTCGA TTCGGGTCGA CTGTGGTCGA TTGTGGCCGA CTGTGGTCGA TTCTGGACGA TTGTGGTCGA TTGTGGTCGA 360 | | GGGCACGCCT GGGCACGCCT GGGCACGCCT GGGCACGCCT GGGCACGCCT GGGCACGCCT GGGCACGCCT GGGCACGCCT GGGCACGCCT GGGCACGCCT GGGCACGCCT GGGCACGCCT GGGCACGCCT GGGCACGCCT GGGCACGCCT MZ310840 AF478744 AY424757 AJ388282 HM236130 AB552946 AF478788 LC148074 LC148080 KY492399 HM236152 LC148062 AB245522 KY492426 MN803339 370 | | GCTTGGGTGT GCTTGGGTGT GCTTGGGTGT GCTTGGGTGT GCTTGGGCGT GCTTGGGTGT GCTTGGGTGT GCTTGGGTGT GCTTGGGTGT GCTTGGGGGT GCTTGGGCGT GCTTGGGGGT GCTTGGGGGT GCTTGGGCGT GCTTGGGCGT 380 | | CATGGCATCG CATGGCATCG CATGGCATCG CATGGCATCG CATGGCATCG CATGGCATCG CATGGCATCG CATGGCATCG CATGGCATCG CATGGCATCG CATGGCATCG CATGGCATCG CATGGCATCG CATGGCATCG CATGGCATCG 390 | | TCGCCTTTGC TCGCCTTTGC TCGCCTTTGC TCGCCTTTGC TCGCCTTTGC TCGCCTTTGC TCGCCTTTGC CCGCCTTTGC TCGCCTTTGC TCGCCTTTGC TCGCCTCTGC TCGCCTTTGC TCGCCTTTGC TCGCCTTTGC TCGCCTTTGC 400 | | TCCATGCGTC TCCATGCGTC TCCATGCGTC TCCATGCGTC TCCATGCGTT TCCATGCGTT TCCACGCATG TCCATGCATG TCCATGCATG TCCATGC TCCATGCGTTCCATGC TCCATGC TCCATGCATG TCCATGCGT- 410 | | -GTTGT -GTTGY -GTTGC -GTTGT -GTTGT -GTTGC C GTTGC CATACGTTGC C GCTGC -GTTGT -CGT -GTTGT -GTTGT CATGCGCTGC -TGC 420 | | TGGTGCCGAG TGGTGCCGAG TGGTGCCGAG TGGTGCCGAG TGGTGCCGAG TGGTGCCGAG TGGTGCCGAG TGGTGCCGAG TGGTGCCGAG TGGTGCCGAG TGGTGCCGAG TGGTGCCGAG TGGTGCCGAG TGGTGCCGAG TGGTGCTGAG 430 | | TGCGGAAATT TGCGGAAATT TGCGGAAATT TGCGGAAATT TGCGGAAATT TGCGGAAATT TGCGGAAATT TGCGGAAATT TGCGGAAATT TGCGGAAATT CGCGGAAATT TGCGGAAATT TGCGGAAATT TGCGGAAATT CGCGGAAATT 440 | | GGCCCCGTGT GRCCCCGTGT GGCCCCGTGT GRCCCCGTGT GGCCCCGTGT GGCCCCGTGT GGCCCCGTGT GGCCCCGTGT GGCCCCGTGT GGCCCCGTGT GGCCCCGTGT GGCCCCGTGT GGCCCCGTGT GGCCCCGTGT GACCCCGTGT 450 | | GCCCTCG G GCCCTCG G GCCCTCG G GCCCTCG G GCCCTCG G GCCCTCG G GCCCTCG G GCCCTCG G GCCCTCG G GCCCTCG G GCCCTCG G GCCCTCG G GCCCTCG G GCCCTCG G GCCCTCGAGG MZ310840 AF478744 AY424757 AJ388282 HM236130 AB552946 AF478788 LC148074 LC148080 KY492399 HM236152 LC148062 AB245522 KY492426 MN803339 460 | | GCATAGTCGG GCATAGTCGG GCATAGTCGG GCATAGTCGG GCATAGTCGG GCATAGTCGG GCACAGTCGG GCACAGTCGG GCACAGTCGG GCACAGTCGG GCACAGTCGG GCACAGTCGG GCACAGTCGG GCACAGTCGG GCGCAGTCGG 470 | | TCGAAGAGTG TCGAAGAGTG TCGAAGAGTG TCGAAGAGTG TCGAAGAGTG TCGAAGAGTG TCGAAGAGTG TCGAAGAGTG TCGAAGAGCG TTAAAGAGTG TTGAAGAGCG TTAAAGAGTG TCAAAGAGTG TCGAAGAGCG TCGAAGAGCG 480 | | GGAA-GTCGA GGAA-GTCGA GGAA-GTCGA GGAA-GTCGA GGAA-GTCGA GGAA-GTCGA GGAA-GTCGG GGAA-GTCGG GGAA-GTCGG GGAA-GTCGG GGTA-GTCGG GGAA-GTCGG GGAA-GTCGG GGAA-GTCGG GGAAAGTCGG 490 | | CAATCGTCGG CAATCGTCGG CAATCGTCGG CAATCGTCGG CAATCGTCGG CAATCGTCGG CAATCGTCGG CAA-CGTCGG CAATCGTCGG CAATCGTCGG CAGTCGTCGG CAATCGTCGG CAATCGTCGG CAATCGTCGG CAGTCGTCGG 500 | | G-CACGATGG G-CACGATGG G-CACGATGG G-CACGATGG G-CACGATGG G-CACGATGG G-CACGATGG G-CACGATGG G-CACGATGG G-CACGACGG G-CACGATGG G-CACGACGG GGCACGATGG G-CACGATGG G-CACGATGG 510 | | GTGTTGGTCG GTGTTGGTCG GTGTTGGTCG GTGTTGGTCG GTGTTGGTCG GTGTTGGTCG ATGTTGGTCG ATGTTGGTCG ATGTTGGTCG GCGTTGGTCG GCGTTGGTCG GCGTTGGTCG GTGTTGGTCG ATGTTGGTCG GTGTTGGTCG 520 | | CCGTGAGCGG CCGTGAGCGG CCGTGAGCGG CCGTGAGCGG CCGTGAGCGG CCGTGAGCGG CCGTGAGCGG CCGTGAGCGG CCGTGAGCGG CCGTGGGCGG CCGTGAGCGG CCGTGGGCGG CCGTGAGCGG CCGGGAGCGG CCGTGAGCGG 530 | | GAACAGAACG GAACAGAACG GAACAGAACG GAACAGAACG GAACAGAACG GAACAGAACG GAACAGAACG GAACAGAACG GAACAGAACG GAACAGAACG GAACAGAACG GAACAGAACG GAACAGAACG GAACAGAACG GAACAGAACA 540 | | TCGTCCTCGT TCGTCCTCGT TCGTCCTCGT TCGTCCTCGT TCGTCCTCGT TCGTCCTCGT TCGTCCTCGT TCGTCCTCGT TCGTCCTCGT TCGTCCTCGT TCGTCCCCGT TCGTCCTCGT TCGTCCTCGT TCGTCCTCGT TCGCGCTCGT MZ310840 AF478744 AY424757 AJ388282 HM236130 AB552946 AF478788 LC148074 LC148080 KY492399 HM236152 LC148062 AB245522 KY492426 MN803339 550 | | CGTTTGGAGA CGTTTGGAGA CGTTTGGAGA CGTTTGGAGA CGTTTTGAGA CGTTTGGAGA CGTTTGGAGA CGTTTTGAGA CGTTTTGAGA CGTTTTGAGA CGTTTTGGGA CGTTTTGAGA CGTTTTAAGA CGTTTTGAAA CGTTTTTGGA 560 | | TGAGTTCTCA TGAGTTCTCA TGAGTTCTCA TGAGTTCTCA TGAGTTCTCA TGAGTTCTCA TGAGTCCTCA TGAGTCCTCA TGAGTCCTCA TGAGTTCTCA TGAGTCCTCA TGAGTTCTCA TGAGTTCCCA CGAGTCCTCA CGAGTCCTCA 570 | | AGAGACCCTAGAGACCCTAGAGACCCTAGAGACCCTAGAGACCCTAGAGACCCTAGAGACCCTAGAGACCCTAGAGACCCTT AGAGACCCTAGAGACCCTAGAGACCCTAGAGACCCCAGAGACCCTAGAGACCCC- 580 | | GTGTGT GTGTGT GTGTGT GTGTGT GTGTGT GTGTGT GTGTGA ATGTGA GTGTGCGTGA GTGCGA GTGTGA GTGCGA GTGTGA GCGCGA GTGTGA 590 | | TTGTGGCATC TTGTGGCATC TTGTGGCATC TTGTGGCATC TTGTGGCATC TTGTGGCATC TTGCGGCGTC TTGCGGCGTC TTGCGGCGTC TTGTGGCGCC TCGTGGCATC TTGTGGCGCC TTGCGGCGTC TTGCGGCGTC TCGTGGCATC 600 | | GGGCGAAAGGGGCGAAAGGGGCGAAAGGGGCGAAAGGGGCGAAAGGGGCGAAAGGGGCGAAAGGAGCGAAAGG GGGCGAAAGGGATGAAAGGGTCGAAAGGGATGAAAGGGGTGAAAGGGGCGAAAGGGGTGAAAG- 610 | | TGCCGTGTCC TGCCGTGTCC TGCCGTGTCC TGCCGTGTCC TGCCGTGTCC TGCCGTGTCC TGCCGCGTCC CGCCGTGTCC CGCCGTGTCC CGCCGTGCCC CGCCGTGTCC AGCCGTGCCC TCCCGCGCCC TGCCGTGTCC TGCCATGT 620 | | TATCAACTTG -ATCAACTTG -ATCAACTTG -ATCA -ATCA -ATCA -GTCACCTAA -ATCA -ATCA -ATCA -ATCA -ATCA -ATCA - 630 | | TGGCCCTC-G TGGCCCCAAG TGGCCC CTTGTGGCCC - 640 650 660 | | | | | | | Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL5 MZ310840 AF478744 AY424757 AJ388282 HM236130 AB552946 AF478788 LC148074 LC148080 KY492399 HM236152 LC148062 AB245522 KY492426 MN803339 TCTCGCGAGG TCAGGCGAGG CAAGTCAGGC - CTACCCCCCC CTACCCGCCG GAGGCCACCC - AGATTAAACA AGTTTAA GCCGAGTTTA - TATCACTA -A - Kết trình tự mẫu khảo sát (MZ310840) công bố ngân hàng gen giới (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MZ310840.1) 11 GTCACGTGGG GAAGGCTCAT TGTTGAGAGA GCATAGAATG ACGGATGGTT GTGAATGTGT 61 GAATGCGTCC GTTGCTCGGT CTTTCCTTGC CCCCCACCTT ATGTTGGTGG GTGATTGACC 121 GTGATCAGCA CTAAGGAACA ATGAACTCAG AAGCAAAGGG CCCCTTGGCG 181 GCCCAATGCG TCGGAGATTC CTCGGAACCA AATGACTCTC TGCACAGGGA GGCAATGGAT ATCTCGGCTC 241 TTGCATCGAT GAAGAACGTA GTGAAATGCG ATACTTGGTG TGAATTGCAG AATCTCGTGA 301 ACCATTGAGT CTTTGAACGC AAGTTGTGCC CGAGGCCTTG TGGTCGAGGG CACGCCTGCT 361 TGGGTGTCAT GGCATCGTCG CCTTTGCTCC ATGCGTCGTT GTTGGTGCCG 421 TTGGCCCCGT GTGCCCTCGG GCATAGTCGG TCGAAGAGTG GGAAGTCGAC AATCGTCGGG AGTGCGGAAA 481 CACGATGGGT GTTGGTCGCC GTGAGCGGGA ACAGAACGTC GTCCTCGTCG TTTGGAGATG 541 AGTTCTCAAG AGACCCTGTG TGTTTGTGGC ATCGGGCGAA AGTGCCGTGT CCTATCAACT 601 TGTGGCCCTC GTCTCGCGAG GCTACCCCCC CAGATTAAAC ATATCACTA Kết Phản ứng PCR với cặp mồi ITS1, ITS4 khuếch đại đoạn gen ITS loài khảo sát với xuất băng có kích thước khoảng 647 bp Kết kiểm tra độ tương đồng trình tự sau hiệu chỉnh Genbank biểu thị bảng PL-1.2 cho thấy loài khảo sát có kết trùng khớp với trình tự Genbank (độ bao phủ 97% độ tương đồng 96,54% đoạn ITS) Kết cho thấy lồi khảo sát có quan hệ gần gũi với lồi D citrea báo cáo nghiên cứu Kress cộng (2002) nghiên cứu Ngamriabsakul cộng (2003) Điều chứng tỏ trình thu hái mẫu bảo quản mẫu tốt, đạt độ tin cậy Bảng PL1-2 Kiểm tra độ tương đồng trình tự sau hiệu chỉnh Genbank Đoạn gen ITS Loài tương đồng GenBank D citrea Mã tham chiếu AF478744 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Chiều dài (bp) 647 Độ bao phủ 97% Evalue 0.0 % nhận định 96,54% Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL6 Tài liệu tham khảo Khanuja SP, Shasany AK, Darokar MP, et al Rapid isolation of DNA from dry and fresh samples of plants producing large amounts of secondary metabolites and essential oils Plant molecular biology Reporter.1999;17(1):74-74 Cheng T, Xu C, Lei L, et al Barcoding the kingdom Plantae: new PCR primers for ITS regions of plants with improved universality and specificity Molecular Ecology Resources 2016;16(1):138-149 doi:10.1111/1755-0998.12438 Kress WJ, Prince LM, Williams KJ The phylogeny and a new classification of the gingers (Zingiberaceae): evidence from molecular data American Journal of Botany 2002;89(10):1682-1696 doi:10.3732/ajb.89.10.1682 Ngamriabsakul C, Newman MF, Cronk QCB The phylogeny of tribe Zingibereae (Zingiberaceae) based on its (nrDNA) and trnl–f (cpDNA) sequences Edinburgh Journal of Botany 2003;60(3):483-507 doi:10.1017/S0960428603000362 Searle RJ, Hedderson TA A preliminary phylogeny of the Hedychieae tribe (Zingiberaceae) based on ITS sequences of the nuclear rRNA cistron In: Wilson K, Morrin D (eds) Monocotyledons: Systematics and Evolution CSIRO Publishing, Clayton (Australia) 2000 Zheng ML, Xia YM A Investigation on The Phylogeny of Tribe Zingibereae (Zingiberaceae) Based on nrDNA ITS and cpDNA matK Sequence Data [Dissertation] Yunnan University (Chinese) 2010 Sam YY, Takano A, Ibrahim H, et al Borneocola (Zingiberaceae), a new genus from Borneo PhytoKeys 2016;75:31-55 doi: 10.3897/phytokeys.75.9837 Ooi IH Taxonomy, Phylogenetic Analyses and Pollination Biology of Scaphochlamys (Zingiberaceae) of Borneo [Dissertation] Universiti Malaysia Sarawak (UNIMAS) (Malaysian) 2018 Takano A, Nagamasu H Myxochlamys (Zingiberaceae), a new genus from Borneo Acta Phytotaxonomica doi:10.18942/apg.KJ00004609388 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn et Geobotanica 2007;58(1):19- 32 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL7 10 Mood JD, Veldkamp JF, Mandáková T, et al Three new species of Boesenbergia (Zingiberaceae) from Thailand and Lao PDR Gardens' Bulletin (Singapore) 2019;71(2):477-498 doi:10.26492/gbs71(2).2019-15 11 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MZ310840 PHỤ LỤC TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA TRÊN MƠ HÌNH DPPH VÀ ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE PL2-1 Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa cao phân đoạn Sàng lọc Cao 125 (µg/mL) n-hexan 250 (µg/mL) chứng CHCl3 BuOH Nước n-hexan CHCl3 BuOH Nước Lần 0,638 0,591 0,656 0,666 0,535 0,512 0,616 0,641 0,662 Lần 0,645 0,596 0,641 0,661 0,529 0,513 0,608 0,637 0,666 Lần 0,647 0,601 0,644 0,665 0,534 0,504 0,622 0,638 0,657 0,014 0,013 0,011 0,021 0,034 0,025 0,022 0,662 12,04 4,18 1,31 22,67 28,11 10,78 6,80 - Chứng mẫu % chế 0,011 Ức 4,43 Cao EtOAc 125 187,5 250 Chứng IC50 Lần 0,561 0,444 0,273 0,214 0,139 0,662 90,28 Lần 0,527 0,452 0,277 0,223 0,143 0,666 Lần 0,533 0,448 0,291 0,153 0,151 0,657 Chứng mẫu 0,014 0,023 0,012 0,007 0,028 0,662 Ức 20,45 35,77 59,45 71,34 82,42 - % chế y = aln(x) + b0, R2 y = 30,04ln(x) – 85,266 62,5 R2 = 0,9925 Nồng độ 31,25 (µg/mL) Đối chứng dương acid ascorbic Cban (µM) đầu 62,5 Cphản ứng 1,38 (µg/mL) 125,0 250,0 500 1000 Chứng 2,75 5,50 11,01 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 22,02 IC50 y = aln(x) + b0, R2 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL8 Lần 0,610 0,490 0,321 0,176 0,068 0,662 4,62 Lần 0,609 0,491 0,319 0,177 0,065 0,666 µg/mL Lần 0,608 0,489 0,320 0,180 0,065 0,657 Chứng mẫu 0,029 0,032 0,043 0,044 0,041 0,662 (26,25 µM) % chế Ức 12,34 30,78 58,14 79,80 96,22 y= 31,274l n(x) + 163,84 R2 = 0,9936 - PL2-2 Sàng lọc tác dụng ức chế α-glucosidase cao phân đoạn 93,75 187,5 1,927 1,876 1,869 1,909 1,917 1,917 0,122 0,332 28,57 37,14 317,37 µg/mL 1125 2,789 2,745 2,679 1,817 63,10 Chứng 2,336 2,741 2,562 0,051 - Cao CHCl3 375 750 2,075 2,725 2,234 2,596 2,179 2,601 0,946 1,618 51,24 59,02 1125 2,693 2,675 2,674 1,935 70,12 Chứng 2,336 2,741 2,562 0,051 - Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Y, R2 Chứng 2,336 2,741 2,562 0,051 - Y, R2 y = 0,0562x + 19,316 R2 = 0,9981 Cao EtOAc Nồng độ (µg/mL) 46,875 93,75 187,5 375 750 1125 Lần 1,706 1,307 1,176 1,105 1,063 0,794 Lần 1,678 1,369 1,149 1,074 1,069 0,791 Lần 1,714 1,537 1,317 1,034 1,015 0,809 Chứng mẫu 0,094 0,113 0,162 0,221 0,467 0,520 % Ức chế 35,67 48,25 57,84 65,94 76,68 88,86 IC50, y 115,75 µg/mL, y = 15,624ln(x) -24,236, R = 0,9860 Cao n-BuOH Nồng độ (µg/mL) 93,75 187,5 375 750 1125 Chứng Lần 1,883 1,713 1,531 1,249 0,651 2,336 Lần 2,021 1,819 1,603 0,834 0,643 2,741 Lần 2,067 2,092 1,605 1,103 0,632 2,562 Chứng mẫu 0,091 0,116 0,108 0,137 0,179 0,051 % Ức chế 23,89 29,52 41,02 62,93 81,45 - Y, R2 y= 16,387ln(x) – 46,965 R2 = 0,9862 Nồng độ (µg/mL) Lần Lần Lần Chứng mẫu % Ức chế IC50 93,75 187,5 2,106 2,254 2,111 2,179 2,099 2,127 0,103 0,369 19,76 27,16 621,37 µg/mL y= 17,327ln(x) – 61,446 R2 = 0,9807 Nồng độ (µg/mL) Lần Lần Lần Chứng mẫu % Ức chế IC50 Cao n-hexan 375 750 2,309 2,674 2,291 2,639 2,304 2,591 0,791 1,431 39,47 51,76 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL9 IC50 545,98 µg/mL Nồng độ (µg/mL) Lần Lần Lần Chứng mẫu % Ức chế IC50 Nồng độ (µg/mL) Lần Lần Lần Chứng mẫu % Ức chế IC50 Cao Nước 375 1,963 2,195 2,111 0,101 20,30 93,75 187,5 750 1125 Chứng 2,412 2,214 1,652 1,234 2,336 2,274 2,211 1,724 1,117 2,741 2,238 2,229 1,741 1,102 2,562 0,091 0,114 0,159 0,134 0,051 11,15 15,68 38,02 59,24 965,70 µg/mL Thuốc đối chứng dương Acarbose 50,0 100 150 200 250 Chứng 18,75 37,5 56,25 75,0 93,75 1,963 1,684 1,508 0,972 0,695 2,336 2,012 1,674 1,401 1,035 0,711 2,741 1,993 1,558 1,422 0,945 0,678 2,562 0,069 0,059 0,071 0,057 0,062 0,051 23,04 36,70 44,99 62,85 74,65 58,51 µg/mL (tương ứng nồng độ ban đầu: 156,03 µg/mL) Y, R2 y = 0,046x + 5,5781 R2 =0,9885 Y, R2 y= 0,6899x + 9,6367 R2 = 0,9906 PL2-3 Tác dụng chống oxy hóa đối chứng dương Acid ascorbic (A0278) Acid ascorbic (µg/mL) Chứng mẫu % ức chế IC50 Sàng lọc Chứng 2,5 Lần 0,457 0,867 0,512 Lần 0,463 0,870 0,538 Lần 0,468 0,861 0,545 0,041 0,040 0,043 48,95 32,47 5,34 μg/mL = 30,33 μM 5,0 0,446 0,414 0,424 0,057 48,73 Xác định IC50 7,5 10,0 0,343 0,191 0,318 0,196 0,324 0,193 0,043 0,059 60,57 81,44 12,5 0,077 0,091 0,087 0,042 94,06 PL2-4 Tác dụng chống oxy hóa hợp chất C1 C1 (µg/mL) 100 Chứng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Sàng lọc 500 Chứng Chứng 0,782 0,785 0,736 0,044 - Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL10 Lần Lần Lần Chứng mẫu % ức chế C1 (µg/mL) Lần Lần Lần Chứng mẫu % ức chế IC50 0,685 0,679 0,668 0,065 25,87 0,867 0,087 0,861 0,04 - 0,225 0,217 0,222 0,066 72,21 Xác định IC50 100 150 200 250 0,568 0,531 0,490 0,442 0,579 0,528 0,480 0,441 0,567 0,504 0,468 0,446 0,060 0,087 0,094 0,106 23,57 35,13 42,40 49,63 260,90 μg/mL = 794,7 μM 0,818 0,816 0,817 0,070 500 0,239 0,230 0,237 0,128 83,96 Chứng 0,716 0,739 0,729 0,059 - PL2-5 Tác dụng chống oxy hóa hợp chất C2 Sàng lọc C2 (µg/mL) Lần Lần Lần Chứng mẫu % ức chế 100 0,762 0,676 0,780 0,040 15,33 Chứng 0,867 0,087 0,861 0,04 - 500 0,604 0,613 0,603 0,076 28,96 Chứng 0,818 0,816 0,817 0,070 - PL2-6 Tác dụng chống oxy hóa hợp chất C3 C4 Sàng lọc C3 Lần 0,513 Lần 0,498 Lần 0,517 Chứng mẫu 0,044 % ức chế 30,65 100 µg/mL C4 0,661 0,692 0,672 0,113 16,24 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Chứng 0,708 0,717 0,720 0,044 - C3 0,428 0,431 0,425 0,046 41,89 500 µg/mL C4 0,716 0,720 0,702 0,226 25,96 Chứng 0,692 0,715 0,706 0,047 - Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL11 PL2-7 Tác dụng chống oxy hóa hợp chất E1 E1 (µg/mL) Xác định IC50 1,25 2,5 5,0 7,5 10,0 Chứng Lần 0,564 0,476 0,329 0,216 0,138 0,732 Lần 0,577 0,426 0,331 0,221 0,131 0,739 Lần 0,572 0,455 0,338 0,219 0,139 0,781 Chứng mẫu 0,054 0,045 0,044 0,043 0,046 0,043 % ức chế 26,94 42,44 59,21 75,18 87,28 - IC50 4,03 μg/mL = 14,08 μM PL2-8 Tác dụng chống oxy hóa hợp chất E2 E2 (µg/mL) Xác định IC50 2,5 5,0 10,0 15,0 20,0 Chứng Lần 0,642 0,571 0,428 0,298 0,136 0,764 Lần 0,629 0,569 0,431 0,311 0,132 0,771 Lần 0,615 0,592 0,403 0,303 0,123 0,759 Chứng mẫu 0,044 0,047 0,043 0,043 0,046 0,041 % ức chế 19,21 26,72 47,81 63,93 88,35 - IC50 10,7 μg/mL = 30,2 μM Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL12 PL2-9 Tác dụng ức chế α-glucosidase đối chứng dương Acarbose (A8980) Acarbose (µg/mL) Sàng lọc 750 Chứng 93,75 187,5 Lần 0,625 1,409 1,32 1,178 Lần 0,606 1,309 1,318 1,104 Lần 0,711 1,391 1,343 1,193 Chứng mẫu 0,064 0,052 0,064 0,065 % ức chế 55,73 14,41 25,91 IC50 528,48 μg/mL = 818,59 μM Xác định IC50 375 750 0,926 0,685 0,894 0,707 0,923 0,698 0,071 0,055 42,85 56,52 1500 0,421 0,478 0,422 0,052 73,68 Chứng 1,477 1,596 1,546 0,064 - PL2-10 Tác dụng ức chế α-glucosidase hợp chất C1 C1 (µg/mL) Lần Lần Lần Chứng mẫu % ức chế 100 0,487 0,494 0,503 0,224 72,87 1,097 1,029 1,056 0,063 - C1 (µg/mL) 18,75 37,5 Sàng lọc ức chế α-glucosidase Chứng 500 Chứng 0,103 0,935 0,116 0,963 0,112 0,964 0,112 0,047 100,18 Xác định IC50 75,0 100 150 Chứng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL13 Lần Lần Lần Chứng mẫu % ức chế IC50 0,929 0,758 0,515 0,956 0,762 0,518 0,939 0,751 0,513 0,059 0,076 0,081 5,46 27,04 53,46 62,18 μg/mL = 189,40 μM 0,485 0,475 0,484 0,222 72,21 0,367 0,356 0,343 0,224 85,93 0,974 0,975 0,989 0,046 - PL2-11 Tác dụng ức chế α-glucosidase hợp chất C3 Sàng lọc 100 Chứng 6,25 Lần 0,256 1,416 1,329 Lần 0,278 1,397 1,403 Lần 0,242 1,415 1,383 Chứng mẫu 0,058 0,052 0,073 % ức chế 85,22 32,47 IC50 21,82 μg/mL = 69,41 μM C3 (µg/mL) 12,5 1,066 1,065 1,053 0,055 36,28 Xác định IC50 25,0 50,0 0,802 0,509 0,794 0,524 0,809 0,517 0,079 0,098 54,24 73,49 100,0 0,355 0,345 0,331 0,139 87,04 Chứng 1,533 1,646 1,745 0,062 - PL2-12 Tác dụng ức chế α-glucosidase hợp chất C2, C4 E2 Sàng lọc C2 100 (µg/mL) Chứng C4 E2 400 (µg/mL) 500 (µg/mL) Chứng C4 E2 Chứng C2 Chứng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL14 Lần Lần Lần Chứng mẫu % ức chế 0,988 0,989 0,984 0,073 1,097 1,029 1,056 0,063 1,378 1,374 1,391 0,070 1,398 1,384 1,366 0,047 1,416 1,397 1,415 0,052 1,351 1,319 1,281 0,062 1,324 1,364 1,316 0,061 1,409 1,309 1,391 0,052 0,342 0,361 0,385 0,057 0,935 0,963 0,964 0,047 8,39 - 3,41 1,60 - 4,76 3,34 - 66,30 - PL2-13 Tác dụng ức chế α-glucosidase hợp chất E1 Sàng lọc 100 Chứng 2,5 Lần 0,993 1,416 1,392 Lần 0,953 1,397 1,428 Lần 0,965 1,415 1,483 Chứng mẫu 0,959 0,052 0,053 % ức chế 99,12 12,54 IC50 9,12 μg/mL = 31,86 μM E1 (µg/mL) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 5,0 1,196 1,175 1,199 0,082 29,84 Xác định IC50 10,0 12,5 0,857 0,728 0,835 0,742 0,859 0,726 0,102 0,115 52,62 60,93 25,0 0,608 0,624 0,623 0,312 80,41 Chứng 1,533 1,646 1,745 0,062 - Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL15 PHỤ LỤC PHỔ MS [M+H]+ [M+Na]+ [M+K]+ PL3-1 Phổ HR-ESI-MS hợp chất C1 (5-Hydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavon) [MH2O+H]+ [M+H]+ PL3-2 Phổ ESI-MS hợp chất C2 (β-Sitosterol) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL16 [MH] PL3-2 Phổ ESI-MS hợp chất C2 (Stigmasterol) [MH2O+H]+ [M+H]+ PL3-3 Phổ ESI-MS hợp chất C3 (Platyphyllon) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL17 [M2H2OH] [MH2OH] [MH] PL3-4 Phổ ESI-MS hợp chất C4 (Glycerol monostearat) [MH] PL3-5 Phổ ESI-MS hợp chất E1 (Kaempferol) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL18 [M3H] [MCaffeoylH] PL3-6 Phổ ESI-MS hợp chất E2 (Acid trans-5-O-caffeoylquinic) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL19 PHỤ LỤC PHỔ NMR HỢP CHẤT C1 PL4-1 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz) hợp chất C1 PL4-2 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz) hợp chất C1 trích vùng H 3,50–8,50 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL20 PL4-3 Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz) hợp chất C1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL21 PL4-4 Phổ DEPT hợp chất C1 PL4-5 Phổ HSQC (DMSO-d6, 150/600 MHz) vùng C 90,0–132,0 ppm H 6,20– 8,2 ppm hợp chất C1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL22 PL4-6 Phổ HSQC (DMSO-d6, 150/600 MHz) vùng C 51,5–62,5 ppm H 3,60– 5,00 ppm hợp chất C1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL23 PL4-7 Phổ HMBC (DMSO-d6, 150/600 MHz) vùng C 90,0–185,0 ppm H 3,50– 13,00 ppm hợp chất C1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL24 PL4-8 Phổ HMBC (DMSO-d6, 150/600 MHz) vùng C 90,0–180,0 ppm H 6,20– 8,20 ppm hợp chất C1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL25 PL4-9 Phổ HMBC (DMSO-d6, 150/600 MHz) vùng C 135,0–170,0 ppm H 3,76–3,90 ppm hợp chất C1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL26 PL4-10 Phổ 1H-1H COSY (DMSO-d6, 600 MHz) vùng H 6,20–8,30 ppm hợp chất C1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL27 PHỤ LỤC PHỔ NMR HỢP CHẤT C2 PL5-1 Phổ 1H-NMR (CDCl3, 600 MHz) hợp chất C2 PL5-2 Phổ 1H-NMR (CDCl3, 600 MHz) hợp chất C2 trích vùng H 3,30– 5,50 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL28 PL5-3 Phổ 13C-NMR (CDCl3, 150 MHz) hợp chất C2 β‐sitosterol Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Stigmasterol Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL29 PHỤ LỤC PHỔ NMR HỢP CHẤT C3 PL6-1 Phổ 1H-NMR (CD3OD-d4, 600 MHz) hợp chất C3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL30 PL6-2 Phổ 13C-NMR (CD3OD-d4, 150 MHz) hợp chất C3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL31 PL6-3 Phổ DEPT hợp chất C3 PL6-4 Phổ HSQC (CD3OD-d4, 150/600 MHz) hợp chất C3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL32 PL6-5 Phổ HSQC (CD3OD-d4, 150/600 MHz) vùng C 25,0–72,0 ppm H 1,50– 4,30 ppm hợp chất C3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL33 PL6-6 Phổ HMBC (CD3OD-d4, 150/600 MHz) vùng C 25,0–160,0 ppm H 6,50–7,20 ppm hợp chất C3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL34 PL6-7 Phổ HMBC (CD3OD-d4, 150/600 MHz) vùng C 125,0–215,0 ppm H 1,50–2,90 ppm hợp chất C3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL35 PL6-8 Phổ HMBC (CD3OD-d4, 150/600 MHz) vùng C 25,0–75,0 ppm H 1,50– 2,90 ppm hợp chất C3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL36 PL6-9 Phổ 1H-1H COSY (CD3OD-d4, 600 MHz) vùng vị trí H 1,00–4,10 ppm hợp chất C3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL37 PHỤ LỤC PHỔ NMR HỢP CHẤT C4 PL7-1 Phổ 1H-NMR (CDCl3, 600 MHz) hợp chất C4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL38 PL7-2 Phổ 1H-NMR (CDCl3, 600 MHz) hợp chất C4 trích vùng H 0,40– 2,50 ppm PL7-3 Phổ 13C-NMR (CDCl3, 150 MHz) hợp chất C4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL39 PL7-4 Phổ DEPT hợp chất C4 PL7-5 Phổ HSQC (CDCl3, 150/600 MHz) vùng C 62,0–71,5 ppm H 3,50–4,30 ppm hợp chất C4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL40 PL7-6 Phổ HSQC (CDCl3, 150/600 MHz) vùng C 12,0–38,0 ppm H 0,60–2,60 ppm hợp chất C4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL41 PL7-7 Phổ HMBC (CDCl3, 150/600 MHz) vùng C 60,0–180,0 ppm H 2,30– 4,40 ppm hợp chất C4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL42 PL7-8 Phổ HMBC (CDCl3, 150/600 MHz) vùng C 57,0–75,0 ppm H 3,50–4,30 ppm hợp chất C4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL43 PL7-9 Phổ HMBC (CDCl3, 150/600 MHz) vùng C 12,0–36,0 ppm H 0,80–2,60 ppm hợp chất C4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL44 PL7-10 Phổ 1H-1H COSY (CDCl3, 600 MHz) vùng vị trí H 3,50–4,30 ppm hợp chất C4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL45 PL7-11 Phổ 1H-1H COSY (CDCl3, 600 MHz) vùng vị trí H 0,80–2,60 ppm hợp chất C4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL46 PHỤ LỤC PHỔ NMR HỢP CHẤT E1 PL8-1 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz) hợp chất E1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL47 PL8-2 Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz) hợp chất E1 PL8-3 Phổ DEPT hợp chất E1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL48 PL8-4 Phổ HSQC (DMSO-d6, 150/600 MHz) hợp chất E1 PL8-5 Phổ HSQC (DMSO-d6, 150/600 MHz) vùng C 90,0–132,0 ppm H 6,20– 8,20 ppm hợp chất E1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL49 PL8-6 Phổ HMBC (DMSO-d6, 150/600 MHz) vùng C 90,0–180,0 ppm H 6,00– 13,00 ppm hợp chất E1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL50 PL8-7 Phổ HMBC (DMSO-d6, 150/600 MHz) vùng C 90,0–180,0 ppm H 6,00– 8,20 ppm hợp chất E1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL51 PL8-8 Phổ 1H-1H COSY (DMSO-d6, 600 MHz) vùng H 6,00–8,40 ppm hợp chất E1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL52 PHỤ LỤC PHỔ NMR HỢP CHẤT E2 PL9-1 Phổ 1H-NMR (CD3OD-d4, 600 MHz) hợp chất E2 (vùng H 0,0–13,0 ppm vùng dãn H 5,20–7,80 ppm) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL53 PL9-2 Phổ 1H-NMR (CD3OD-d4, 600 MHz) hợp chất E2 trích vùng H 1,80–4,40 ppm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL54 PL9-3 Phổ 13C-NMR (CD3OD-d4, 150 MHz) vùng C 0,0–180,0 ppm vũng dãn C 40,0–180,0 ppm E2 PL9-4 Phổ DEPT hợp chất E2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL55 PL9-5 Phổ HSQC (CD3OD-d4, 150/600 MHz) vùng C 110,0–150,0 ppm H 6,20–7,60 ppm hợp chất E2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL56 PL9-6 Phổ HSQC (CD3OD-d4, 150/600 MHz) vùng C 30,0–80,0 ppm H 2,00– 5,50 ppm hợp chất E2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL57 PL9-7 Phổ HMBC (CD3OD-d4, 150/600 MHz) vùng C 112,0–173,0 ppm H 5,20–7,80 ppm hợp chất E2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL58 PL9-8 Phổ HMBC (CD3OD-d4, 150/600 MHz) vùng C 30,0–80,0 ppm H 1,80– 5,50 ppm hợp chất E2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL59 PL9-9 Phổ 1H-1H COSY (CD3OD-d4, 600 MHz) vùng vị trí H 6,10–7,80 ppm hợp chất E2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL60 PL9-10 Phổ 1H-1H COSY (CD3OD-d4, 600 MHz) vùng vị trí H 1,80–5,80 ppm hợp chất E2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn