báo cáo trình bài về hình thành, tính chất, đặc điểm, quy trình phản ứng và giải thích các phản ứng phân biệt giữa các loại tụ cầu , liên cầu và trực khuẩn. Cũng như các hình ảnh minh họa thực tiễn cho từng phản ứng. Hơn thế, bài báo cáo còn có các sơ đồ tóm tắt quy trình định danh chung và riêng cho từng loài, bảng tóm tắt từng phản ứng phân biệt.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NAM CẦN THƠ KHOA Y BÁO CÁO VI SINH Lớp: DH20XET01 NHÓM Họ & tên: GVHD: NGUYỄN HỮU THUẬN Phùng Thị Thùy Ngân - 201406 Trịnh Thúy Anh - 200488 Trần Ngọc Quỳnh Anh - 200168 Lê Trương Ngọc Hân - 2010155 Chung Đình Khơi - 200223 Kim Thị Hồng Hà - 201186 Nguyễn Thị Ngọc Hân - 200725 Cần Thơ – 2023 Thực hành Vi sinh GVHD: Nguyễn Hữu Thuận ĐỊNH DANH NHÓM TRỰC KHUẨN GRAM (-) A QUY TRÌNH NHUỘM GRAM Trực khuẩn Gram (-) Cầu khuẩn Gram (+) Oxidase (-) Sinh hóa ống (Định danh) Oxidase (+) Trực khuẩn Mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) B ĐỊNH DANH Sinh hóa ống (Kiểm tra) I NHUỘM GRAM a) Mục đích: Phân biệt hình thể, gram dương hay gram âm , cách xếp ,… vi khuẩn b) Nguyên tắc: + Hình thể: Cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn, cầu trực khuẩn, + Tính chất bắt màu: Gram âm (bắt màu đỏ), Gram dương (bắt màu tím) + Cách xếp: Đứng đơn lẻ, xếp thành cặp, xếp thành chuỗi, xếp thành đám,… + Bán định lượng kết nhuộm soi đánh giá dựa bảng sau c) Kĩ thuật: - Lấy lượng vi khuẩn cần nhuộm que cấy - Cố định lam đèn cồn - Để nguội - Tiến hành nhuộm + Phủ dung dịch Crystal Violet vòng phút + Rửa , để khơ lame + Phủ dung dịch Lugol vịng phút + Rửa , để khô lame Thực hành Vi sinh GVHD: Nguyễn Hữu Thuận + Phủ dung dịch cồn vong 30s + Rửa , để khơ lame + Phủ dung dịch Safranin vịng phút + Rửa , để khô lame - Quan sát vật kính 100X d) Kết quả: Trực khuẩn Gram (-), bắt màu đỏ hồng II THỬ NGHIỆM OXIDASE a) Công dụng : Phân biệt khúm trực khuẩn mủ xanh với khúm trực khuẩn Gram âm Họ đường ruột nhóm trực khuẩn Gram ( - ) không lên men đường khác b) Nguyên tắc : Vài giống VK sản xuất men Oxidase oxid hoá thuốc thử Tetramethyl paraphenylene diamin dihydrocloride (1%) tạo thành chất đổi màu từ hồng đến tím than Dimethyl-p-Phenylenediamine dihydrochclride + α.naphthol Oxidase Indophenolblue + H2O Cytochrome c) Thuốc thử: - Tetramethyl-p-Phenylenediamine dihydrochloride 0,1 g ( hay Dimethy-p-Phenylenediamine monohydrochloride ) - Nước cất (ED) 10 ml Cân 0,1 g thuốc thử pha loãng với 10 ml ED, lắc cho tan Để yên 15 phút trước dùng Thuốc không bền dễ hỏng dùng ngày d) Kỹ thuật: * Phương pháp 1: Thực hành Vi sinh GVHD: Nguyễn Hữu Thuận - Đặt mãnh giấy lọc vào hộp petri Nhỏ giọt thuốc thử lên giấy lọc, dùng khuyên cấy chạm vào khúm vi khuẩn nghi ngờ, phết vi khuẩn vào chổ nhỏ thuốc thử Cũng với gốc kiểm chứng dương Đọc kết quả: + Dương tính: phết VK chuyển từ màu hồng sang màu tím thang vòng 10 giây đến phút + Âm tính: Phết vi khuẩn khơng đổi màu + Pseudomonas aeruginosa cho phảm ứng Oxidase (+) * Phương pháp 2: - Đặt đĩa giấy có tẩm thuốc thử oxidase mặt phẳng, nhỏ giọt nước muối sinh lý lên đĩa giấy - Dùng khuyên cấy, phết vi khuẩn nghi ngờ lên đĩa giấy tẩm thuốc thử Oxidase (Tetramethyl-pPhenylenediamine dihydrochloride) Đọc kết quả: + Nếu TN (+) phết vi khuẩn đổi sang màu tím than, khoảng từ 10 giây đến phút + Cũng làm với góc kiểm chứng dương * Ghi chú: nhỏ giọt thuốc thử Oxidase trực tiếp lên khúm vi khuẩn nghi ngờ hộp petri Đọc KQ phản ứng cách quan sát đổi màu khúm Phản ứng dương tính: khúm vi khuẩn đổi thành màu hồng nhạt đến đậm sau màu đen vài phút (khi khúm khuẩn đồi màu đen: vi khuẩn chết) e) Kết quả: Oxidase (+) => Trực khuẩn Mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) Thực hành Vi sinh GVHD: Nguyễn Hữu Thuận III SINH HÓA Thử nghiệm K.I.A (kligler iron agar) a) Môi trường - KIA môi trường dùng để khảo sát lên men đường Glucose, Glactoso, khả sinh có CO, H2, H2S Môi trường đặc, pha chế dạng nghiên sâu - Chỉ thị màu Ph (acid-base) dùng môi trường Phenol Red b) Kỹ thuật - Cấy cắm sâu 2/3 phần môi trường sâu cấy vạch zigzag phần môi trường nghiêng c) Giải thích kết thử nghiệm * Chủng vi khuẩn có phản ứng Glucose âm, Lactose âm - Vi khuẩn khả lên men hai loại đường, có khả biến dưỡng pentone mơi trường, sản phẩm biến dưỡng chủ yếu có tính kiềm: hai phần nghiêng phần sâu có mơi trường điều bị kiềm hóa, có màu đỏ với thị phenol red * Chủng vi khuẩn có phản ứng Glucose dương, Latose âm - Phần sâu acid bị biến đổi thành màu vàng, phần nghiên bị kiềm hóa: có màu đỏ - Ban đầu vi khuẩn lên men đường Glucose acid hóa hai phần nghiêng sâu mơi trường tiếp đó, sản phẩm acid phần nghiêng phía bị oxy hóa đi; thêm nửa phần nghiêng vi khuẩn mọc nhanh nhiều, lượng glucose phần nghiêng bị cạn kiệt hết trước phần sâu, VK phần nghiêng chuyển sang biến dưỡng pentone, tạo NH3 làm mơi trường phần bị kiềm hóa trở lại Cuối phần sâu: vàng, phần nghiêng: đỏ * Chủng vi khuẩn có phản ứng glucose dương, lactose dương - Cả hai phần nghiêng phần sâu bị acid hóa đổi thành màu vàng - Vi khuẩn lên men hai loại đường, môi trường trở nên acid, chất có tính kiềm phóng thích từ biến dưỡng pentone phần nghiêng trung hịa hết tất chuyển hóa có tính acid hai loại đường Do đó, hai phần nghiêng phần sâu mang tính acid có màu vàng * Chủng vi khuẩn sinh khí CO, H2 - Trong ống nghiệm chứa mơi trường, có xuất bong bóng khí phần sâu, VK q trình chuyển hóa đường sinh khí CO 𝐻2, khí có nhiều làm nứt vỡ dịch chuyển thạch, có ít, cho dù có bọt nhỏ đọc kết là: khí dương Thực hành Vi sinh GVHD: Nguyễn Hữu Thuận * Chủng vi khuẩn sinh H2S - VK có khả thủy phân Sodium thiosulfate sẻ tạo khí hydrogen sulfide H2S có phản ứng với sắt pentone hóa mơi trường, tạo sulfure sắt (FeS) kết tủa có màu đen - Tùy theo loại vi khuẩn có khả sinh H2S nhiều hay màu đen có vệt đen, vịng nhẫn đen hai phần nghiêng sâu hay làm đen hết ống nghiệm d) Kết luận 370C, 24h Lactose (-) Glucose (-) Gas (+) H2S (-) => Glucose (-) , Lactose (-) , Gas (+) , H2S (-) Thử nghiệm khảo sát tính di động (Motility) H2S (SIM) a) Nguyên tắc - Thạch mềm điều kiện thuận tiện để vi khuẩn có khả di động mọc lan khỏi đường cấy hình rể hay làm môi trường quanh đường cấy - Hỗn hợp ion protein (peptonized iron) sodium thiosulphate môi trường chất thị cho sản xuất H2S H2S sinh phản ứng với hỗn hợp protein ion hố để hình thành sắt sulfide có kết tủa màu đen Những vi sinh vật có khả di động giúp tăng cường phản ứng H2S b) Môi trường - Môi trường SIM Medium: môi trường thạch mềm c) Kỹ thuật - Dùng kim cấy lấy khúm vi khuẩn, đâm thẳng sâu vào đường thạch đường Thực hành Vi sinh GVHD: Nguyễn Hữu Thuận nhất, dài 2/3 chiều cao thạch, không chạm đáy - Ủ 37oC 18 – 24 d) Kết - Di động: quan sát cách mọc vi khuẩn theo đường cấy môi trường quanh đường cấy: VK mọc lan làm đục môi trường hay mọc giống chùm rể là: Di động dương (+) Nếu đường cấy lên rỏ nét môi trường xung quanh đường cấy trong: Di động âm (-) - Có kết tủa đen môi trường thạch: H2S (+) ngược lại e) Kết luận 370C, 24h => Motility (+) , H2S (-) Thử nghiệm Citrate a) Nguyên tắc - Một số VK có khả sử dụng citrate môi trường nuôi cấy nguồn cung cấp lượng carbon nhất, sản phẩm biến dưỡng cuối tạo CO 2; Pyruvic acid CO2 thành phần khác ammonium mơi trường tiếp tục chuyển hóa để sinh Na2CO3 NH4OH làm kiềm hóa mơi trường Với thị màu pH Bromthymol Blue, môi trường chuyên màu từ xanh sang xanh dương đậm b) Môi trường - Môi trường thạch Simmons Citrate pha chế theo dạng nghiêng với thị màu Bromthymol Blue (khoảng đổi màu pH từ 6,9: xanh lá; sang pH 7,6: xanh dương) Thực hành Vi sinh GVHD: Nguyễn Hữu Thuận c) Kỹ thuật - Cấy zigzag VK cần thử nghiệm lên bề mặt thạch nghiêng - Nới lỏng nắp ống nghiệm trước ủ 37ºC 18-24 để lửa cấy thơng khí bình thường d) Kết quả: - Thử nghiệm dương: vi khuẩn mọc mặt thạch nghiêng với đổi màu thành màu xanh dương - Thử nghiệm âm: vi khuẩn không mọc thạch, môi trường xanh không đổi e) Kết luận 370C, 24h => Citrate (+) Thử nghiệm tìm Indol ( DEV Tryptone) a) Nguyên tắc - Một số vi khuẩn có khả sản xuất enzyme Tryptophanase thủy phân Trytophan môi trường, thành Indol, chất kết hợp với Para dimethyl-amino benzal dehyde thuốc thử Kovac cho hợp chất lỏng muối dimethyl ammonium màu đỏ nằm bề mặt ống thạch sâu Trytophanase Trytophan Indol + acide Pyruvic + Ammonia Thực hành Vi sinh GVHD: Nguyễn Hữu Thuận b) Thuốc thử - Thuốc thử Kovac (Kovac’s Reagent) + Para dimethylamino benzaldehyde gram + Amyl alcohol hay butyl alcohol 75 ml + HCL đậm đặc 25 ml - Thuốc thử bảo quản chai nâu ln đậy nắp kín, thuốc thử bị đổi sang màu nâu sẫm đổ bỏ c) Kĩ thuật - Lấy khúm khuẩn tinh khiết riêng lẻ từ lứa hộp thạch hay lấy vi khuẩn mọc mặt nghiêng môi trường K.I.A que cấy - Cấy lên thành ống gần mặt chất lỏng indol, nghiêng ống để vi khuẩn thành ống hòa vào dung dịch - Ủ 37oC 18 – 24 - Nhỏ 3-5 giọt thuốc thử Kovac, nghiên ống nghiệm để trộn nhẹ quan sát d) Kết Nếu lớp thuốc thử có màu hồng cánh sen: Indol dương (+), màu vàng: Indol âm (-) d) Kết luận 370C, 24h => Indol (-) Thực hành Vi sinh GVHD: Nguyễn Hữu Thuận Thử nghiệm tìm urease a) Nguyên tắc - Một số vi khuẩn sản xuất enzyme ureas môi trường thành CO2 NH3 mơi trường bị kiềm hóa chuyển sang màu hồng cánh sen Urease - Môi trường Urea lỏng: thị màu Ph dùng Phenol Red, giống urea đặc CO2 + H2O + NH3 (NH2)2CO + H2O b) Kỹ thuật - Lấy khúm khuẩn tinh khiết riêng lẻ từ lứa hộp thạch hay lấy vi khuẩn mọc mặt nghiêng môi trường K.I.A que cấy - Cấy lên thành ống gần mặt chất lỏng ure, nghiêng ống để vi khuẩn thành ống hòa vào dung dịch - Ủ 37oC 18 – 24 c) Kết - Thử nghiệm urea dương: môi trường chuyển sang màu hồng cánh sen - Thử nghiệm urea âm: môi trường không đổi màu d) Biện luận - Với urea lỏng + Proteus cho phản ứng dương sau 24 + Đối với số loại vi khuẩn khác, dạng môi trường lỏng nhạy nên khó tìm thấy phản ứng dương e) Kết luận 370C, 24h => Dung dịch không đổi màu Ure (-) 10 Thực hành Vi sinh GVHD: Nguyễn Hữu Thuận Thử nghiệm MR – VP (Methyl Red – Voges Proskauer) a) Nguyên tắc: - Thử nghiệm MR dùng để phân biệt loại vi khuẩn theo hai phương thức biến dưỡng đường glucose (lứa cấy già 48 giờ): + Loại 1: lên men mạnh đường glucose thành sản phẩm acid cuối bền cho phản ứng MR (+) + Loại 2: lên men glucose thành sản phẩm trung gian không bền Các sản phẩm tiếp tục biến đổi thành sản phẩm trung tính cuối cho phản ứng MR (-) - Thử nghiệnm VP: số vi khuẩn biến dưỡng đường glucose thành sản phẩm trung tính acetyl methyl carbinol hay acetoin Chất bị oxyt hóa mơi trường kiềm, biến đổi thành diacetyl, xong kết hợp với α - naphthol màu hồng nâu đỏ (màu đỏ rượu vang) Phản ứng chuyển màu nhanh gia nhiệt Glucose → Axit pyruvic → Acetoin Diacetyl → Phức hợp màu đỏ: VP (+) b) Thuốc thử * Thuốc thử thử nghiệm MR: - Dung dịch Methyl red 0,02% + Hòa tan 0,1 g Methyl red 300 ml Ethanol 95% + Thêm khoảng 200 ml nước cất cho đủ (qsp.) 500 ml giá gần sang + Lưu trữ - 8°C chai nâu (DD bền năm) - Methyl red thị màu pH Ở pH < 4,4 MR có màu đỏ; pH:6 MR có màu vàng * Thuốc thử thử nghiệm VP: - Dung dịch a-Naphthol 5%, cồn tuyệt đối Ethanol - Dung dịch KOH 40%, nước khử khoáng c) Kỹ thuật - Cấy VK vào ống nghiệm có chứa ml mơi trường MR-VP - Ủ 37°C/24 - 48 - Chuyển bớt nửa lứa cấy ống khác, thành hai ống ống dùng cho TN MR, ống dùng cho thử nghiệm VP + Ống MR: thêm giọt thuốc thử Methyl Red, đọc kết + Ống VP thêm: 11 Thực hành Vi sinh GVHD: Nguyễn Hữu Thuận ▪ 0,6 ml ( 12 giọt) α - naphthol 5% ứng với ml môi trường cấy ▪ 0,2 ml ( giọt) dd KOH 40%, thêm vào ml môi trường nhỏ a-naphtol trường + Đọc kết d) Kết - Thử nghiệm MR, VP dương: mơi trường có màu đỏ cam (cherry red) - Thử nghiệm MR, VP âm: mơi trường có màu vàng e) Kết luận MR (+) 370C, 24h VP (-) => MR (+), VP (-) C TỔNG KẾT Thử nghiệm Pseudomonas aeruginosa Oxidase + Di động + Glucose Lactose Indol Citrate Ure … +/- - - + -/+ … 12 Thực hành Vi sinh GVHD: Nguyễn Hữu Thuận Trực khuẩn mủ xanh gây bệnh: nhiễm khuẩn tai, mắt, vết thương, vết phỏng, đường tiểu đường hô hấp Chúng gây chứng nhiễm khuẩn huyết viêm màng não Có thể gặp Pseudomonas aeruginosa đường tiêu hóa người khả gây bệnh thấp Trực khuẩn mủ xanh gây viêm có mủ mủ có màu xanh lục vi khuẩn tiết sắc tố Pyocyanin Từ nơi nhiễm khuẩn đầu tiên, trực khuẩn lan tràn vào mơ sâu, phóng thích nội độc tố gây kích xúc làm hư hoại quan nội tạng Pseudomonas aeruginosa tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện Vi khuẩn tìm thấy túi máu, huyết tương nhiễm khuẩn ngân hàng máu dung dịch sát trùng Zephiran (Benzal konium chloride) hay loại xà phòng Phisohex (có Hexachlorophene) - Đặc tính hình thể: trực khuẩn gram âm, di động (có tiên mao đầu), khơng bào tử, đứng hay thành đơi hay thành chuỗi ngắn Hình thể thay đổi lứa cấy già - Đặc tính lứa cấy: hiếu bắt buộc, dễ nuôi cấy tăng trưởng tốt môi trường thông thường - Tạo sắc tố: pyocyanin, pyoverdin, pyorubin pyomelanin Chỉ có p Aeruginosa tiết pyocyanin sắc tố hòa tan nước, làm mơi trường có màu xanh lục Lứa cấy tỏa mùi thơm nhẹ - Trên môi trường: + BA: khúm vi khuẩn lớn, phẳng hay lồi, biên khơng đều, gây tiêu huyết hồn tồn + MC: không lên men đường lactose, khúm vi khuẩn không màu + Trong canh cấy lỏng: vi khuẩn hiếu khí mọc thành váng bề mặt mơi trường - Khảo sát đặc tính lứa cấy pseudomonas aeruginosa: có sinh sắc tố, gây tiêu huyết có mùi thơm nhẹ ba, mc ủ 37oc sau 18-24 13 Thực hành Vi sinh GVHD: Nguyễn Hữu Thuận ĐỊNH DANH NHÓM CẦU KHUẨN GRAM (+) STAPHYLOCOCCI A ĐẠI CƯƠNG Có thể nói tụ cầu khuẩn vi khuẩn tiếng nhất: nhà vi khuẩn học tiếng quan tâm nghiên cứu, tỉ lệ gây bệnh cao, có khả gây nhiều bệnh nặng đề kháng kháng sinh mạnh Các nhà vi khuẩn học lừng danh Robert Koch (1878) Louis Pasteur (1880) quan tâm nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳ đầu lịch sử ngành vi sinh vật học Có thể tìm thấy tụ cầu da, niêm mạc mũi hầu, họng người khỏe mạnh Tính gây bệnh tụ cầu khuẩn thường xem xét liên kết với khả làm đông huyết tương men coagulase vi khuẩn phịng thí nghiệm vi khuẩn thường phân chia thành nhóm: Coagulase (+) Coagulase (-) Lồi gây bệnh chủ yếu Coagulase (+), lồi nhóm Coagulase (-) thường sống hoại sinh không gây hại, số trường hợp chúng vi khuẩn gây bệnh Có 30 lồi cầu khuẩn nhận diện có lồi tụ cầu khuẩn có vai trị quan trọng y học gồm: + Staphylococcus aureus – Tụ cầu vàng (Coagulase dương) + Staphylococcus saprophyticus (Coagulase âm) + Staphylococcus haemolyticus (Coagulase âm) B ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC Nuôi cấy: - Là vi khuẩn hiếu khí, kị khí tùy nghi, tăng trưởng mạnh loại môi trường thông thường - Sau 18 – 24h ủ 37oC, khuẩn lạc dạng tròn, biên đều, tâm lồi, d= 2-4 mm, màu từ trắng đục đến vàng chanh, vàng kim - Tạo sắc tố tốt 20oC - Trong môi trường canh thang: nhiệt độ 37oC sau 5-6 làm đục môi trường, sau 24h làm đục rõ - Ở môi trường thạch thường: sau 24h vi khuẩn phát triển tạo khuẩn lạc dạng S, trịn lồi, bóng láng sinh sắc tố màu vàng 14 Thực hành Vi sinh GVHD: Nguyễn Hữu Thuận - Ở môi trường thạch máu: tụ cầu phát triển nhanh gây tan máu hoàn toàn Độc tố Enzym a) Enzym: - Coagulase: làm đông huyết tương, tạo huyết cục tĩnh mạch, gây nhiễm khuẩn di nhiễm khuẩn huyết - Hyaluronidase: phá hủy chất mơ giúp vi khuẩn phát tán mô - Desoxyribonuclease: thủy phân AND, gây tổn thương mơ - β-lactamlase: phá hủy vịng β-lactam => kháng penicillin cephalosporin - Catalase - Staphylokinase - Proteinase - Lipase b) Độc tố: - Leucocidin (độc tố diệt bạch cầu): chất protein không chịu nhiệt, làm tính di động phá hủy nhân bạch cầu - Hemolysin (dạng huyết tố): chất protein, có tính kháng nguyên, gây tan hồng cầu Một vài loại gây hoại tử da chổ giết chết súc vật thí nghiệm - Ngoại độc tố sinh mủ (pyogenic exotoxin): shock, hoại tử gan tim - Exfoliative toxin & Toxic shock syndrome toxin: gây hội chứng rộp chốc lở da - Độc tố ruột (Enterotoxin) Con đường lây truyền - Lây truyền qua tiếp xúc trực tiếp: da niêm mạc Khả đề kháng - Hiện nay, việc sử dụng kháng sinh rộng rãi, không cách, không liều tạo chủng cầu khuẩn kháng Methicilin, kháng đa kháng sinh (MRS) Các chủng đề kháng kháng sinh thường gặp MRSA - Sự kháng lại kháng sinh tụ cầu vàng đặc điểm lưu ý Đa số tụ cầu kháng lại Penicillin G vi khuẩn sản xuất men penicillinase nhờ gen R-plasmid - Hiện nay, số tụ cầu cịn đề kháng với cephalosporin hệ - Ngoài ra, tụ cầu vàng cịn có khả đề kháng với nhiệt độ hóa chất cao vi khuẩn khơng có nha bào khác (diệt 80oC/1 giờ) 15 Thực hành Vi sinh GVHD: Nguyễn Hữu Thuận - Tụ cầu vàng gây bệnh sau thời gian dài tồn môi trường B ĐỊNH DANH I BỆNH PHẨM: - Có thể máu, mủ, phân, … tùy theo loại bệnh tụ cầu II SƠ ĐỒ ĐỊNH DANH CẦU KHUẨN: Mẫu VK (quan sát) Nhuộm Gram Cầu khuẩn Gr (+) Catalase (+) => Tụ cầu MSA/Coagulase (+) Tụ cầu vàng S.aureus (-) Novobiocin ≥ 16mm S.epidermidis < 16mm S.saprophyticus III QUY TRÌNH: I NHUỘM GRAM: a) Mục đích: Phân biệt hình thể, gram dương hay gram âm , cách xếp ,… vi khuẩn b) Nguyên tắc: + Hình thể: Cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn, cầu trực khuẩn, + Tính chất bắt màu: Gram âm (bắt màu đỏ), Gram dương (bắt màu tím) + Cách xếp: Đứng đơn lẻ, xếp thành cặp, xếp thành chuỗi, xếp thành đám,… + Bán định lượng kết nhuộm soi đánh giá dựa bảng sau c) Kĩ thuật: - Lấy lượng vi khuẩn cần nhuộm que cấy - Cố định lam đèn cồn - Để nguội - Tiến hành nhuộm 16 Thực hành Vi sinh + Phủ dung dịch Crystal Violet vòng phút GVHD: Nguyễn Hữu Thuận + Rửa , để khô lame + Phủ dung dịch Lugol vòng phút + Rửa , để khô lame + Phủ dung dịch cồn vong 30s + Rửa , để khơ lame + Phủ dung dịch Safranin vịng phút + Rửa , để khô lame - Quan sát vật kính 100X d) Kết quả: - Staphylococci có dạng hình cầu, d = 0,8 - µm, đứng thành đám nhỏ, đơn lẻ chuỗi - Bắt màu Gram (+) xanh tím - Khơng vỏ, khơng lông, không sinh nha bào II THỬ NGHIỆM CATALASE: a) Mục đích: Giúp chuẩn đốn phân biệt khúm khuẩn Staphylococci với khúm vi khuẩn Pneumococci Streptococci b) Nguyên tắc: - Tụ cầu khuẩn có enzym catalase làm giải phóng oxy từ nước oxy già tạo tượng sủi bọt Catalase 2H2O2 2H2O + O2 c) Kĩ thuật: 17 Thực hành Vi sinh - Nhỏ giọt oxy già dược dụng 3% lên lam kính GVHD: Nguyễn Hữu Thuận - Lấy vi khuẩn cách chấm khuyên cấy vô khuẩn vào phần khúm khuẩn tinh khiết muốn thử - Cho khuyên cấy vi khuẩn chạm vào giọt oxy già - Quan sát sủi bọt kết luận d) Kết quả: Catalase (+) Cầu khuẩn (Staphylococci) III THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY TRÊN MSA: a) Mục đích: - Xác định khả tăng trưởng lên men đường mannitol MSA - Phân biệt S.aureus với loại tụ cầu khác b) Nguyên tắc: - Các loại tụ cầu khuẩn tăng trưởng môi trường MSA chứa 7,5% NaCl Thường đa số gốc gây bệnh Staphylococcus aureus có khả lên men đường manitol nên tạo vùng màu vàng (với thị màu phenol red) bao quanh khóm khuẩn Mơi trường làm thí nghiệm MSA pha chế dạng ống thạch nghiêng hay hộp petri - Phản ứng (+) môi trường đổi sang màu vàng Tụ cầu vàng - Phản ứng (-) môi trường không đổi màu Tụ cầu khác c) Kĩ thuật: - Dùng que cấy lấy lượng vi khuẩn có mẫu thử cần định danh (hơ nhẹ thành ống mẫu ngọc lửa đèn cồn) - Cấy vào ống chứa mơi trường MSA theo hình zic zắc (hơ nhẹ thành ống đậy kín) - Ủ 18 – 24h ủ 37 oC d) Kết quả: - Phản ứng (+) môi trường đổi sang màu vàng Tụ cầu vàng 18 Thực hành Vi sinh GVHD: Nguyễn Hữu Thuận 370C, 24h (+) Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) C TỔNG KẾT THỬ NGHIỆM ĐẶC TÍNH Cầu khuẩn gram (+) Catalase + MSA + Staphylococcus aureus – Tụ cầu vàng (Coagulase dương) - Gây bệnh như: + Nhiễm khuẩn thông thường: viêm da sinh mủ, mụn nhọt, mụn bọc, chín mé, viêm lỗ tai xoang mũi … + Nhiễm khuẩn trầm trọng: sưng phổi, nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, viêm màng tim, nhiễm khuẩn đường tiết niệu hội chứng shock nhiễm độc (nhiễm khuẩn vết thương hay phụ nữ chu kỳ, …) + Khi nhiễm vào thức ăn, tiết độc tố đường ruột (enterotoxin) bền với nhiệt Người ăn trúng thức ăn có nhiễm độc tố gây ngộ độc thực phẩm nơn mửa, tiêu chảy dội sau vài - Tụ cầu vàng kháng methincillin (MRSA) chủng cầu khuẩn có khả đề kháng lại hầu hết thuốc kháng sinh thông dụng, dẫn đến việc làm tăng nguy tử vong cho người bệnh MRSA vấn đề y tế toàn cầu thách thức lớn điều trị - Kết KSD MRSA PTN nhạy, thực tế MRSA có khả đề kháng tất kháng sinh β-lactam dùng điều trị, ngoại trừ cephalosporin hệ (ceftaroline) 19 Thực hành Vi sinh GVHD: Nguyễn Hữu Thuận - Các trường hợp MRSA xâm nhập sâu vào thể gây nên bệnh nhiễm khuẩn xương, khớp, nhiễm khuẩn máu, van tim phổi Nếu không điều trị kịp thời, gây nguy hiểm đến tính mạng cho bệnh nhân đặc tính kháng đa kháng sinh chúng 20