Phân tích sai khác di truyền giữa lợn rừng và một số giống lợn nhà bằng kỹ thuật microsatellite
PHÂN TÍCH SAI KHÁC DI TRUYỀN GIỮA LỢN RỪNG VÀ MỘT SỐ GIỐNG LỢN NHÀ BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE Phạm Doãn Lân, Nguyễn Trọng Bình, 1 Tăng Xuân Lưu và 2 Võ Văn Sự Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Động vật; 1 Trung tâm nghiên cứu bò và đồng cỏ Ba Vì, 2 Bộ môn động vật quý hiếm & đa dạng sinh học Tóm tắt Nghiên cứu được thực hiện trên tổng số 146 mẫu lợn bao gồm: 38 mẫu lợn rừng và lợn rừng lai của Việt Nam và Thái Lan, 108 mẫu lợn nhà nuôi (lợn Móng Cái, lợn Ỉ, lợn Bản Hà Giang, lợn Landrace và lợn lai giữa lợn rừng và lợn Ỉ). Kết quả phân tích trên 24 locus microsatellite đã xác định được 247 alen khác, trung bình số alen trên một locus của tất cả các mẫu là 10,2 và đã xác định được 12 alen đặc trưng xuất hiện ở các mẫu lợn rừng. Khoảng cách di truyền giữa các nhóm, giống lợn dao động trong khoảng 0,239 đến 1,209. Qua phép kiểm định thống kê cho thấy sai khác di truyền giữa các giống lợn đều có ý nghĩa (P<0,01). Khoảng cách di truyền giữa lợn rừng và các giống lợn nhà nuôi của Việt Nam là khá lớn, dao động trong khoảng từ 0,883 đến 0,974, khoảng cách di truyền giữa hai nhóm lợn rừng Việt Nam và Thái Lan là 0,406. Giống lợn ngoại (Landrace) có khoảng cách di truyền rất xa so với lợn rừng và lợn nhà nuôi. Cây phân loại di truyền giữa các giống lợn phân tích được xây dựng theo phương pháp UPGMA chia thành 3 nhánh khác nhau, nhánh thứ nhất bao gồm các giống lợn nuôi bản địa của Việt Nam, nhánh thứ hai là các mẫu lợn rừng của Việt Nam và Thái Lan, nhánh thứ ba là giống lợn ngoại (Landrace) nuôi tại Việt Nam. 1. Đặt vấn đề Lợn rừng có tên khoa học là Sus scrofa, phân bố chính ở Châu Á, Châu Âu và Bắc Châu Phi. Ở Châu Á lợn rừng có ở các nước như Thái Lan, Việt Nam, Philipin, Hàn Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Ấn Độ, Malaisia… Số lượng chính xác về các loài phụ (subspecies) hiện tại vẫn chưa được rõ ràng, tuy nhiên hiện có ít nhất 16 loài phụ lợn rừng đã được xác định (Ruvinsky và cs 1998). Lợn rừng là tổ tiên của tất cả các giống lợn nuôi thuần hóa ngày nay. Lợn nhà thuần hóa có tên khoa học là Sus scrofa domesticus được thuần hóa vào khoảng 9000 năm trước công nguyên. Theo Scherf và cộng sự (2000) thì hiện có khoảng 498 giống lợn khác nhau trên toàn thế giới trong đó ở Châu Á có khoảng 184 giống lợn, Châu Âu có khoảng 228 giống và các khu vực khác trên thế giới là 498 giống. Việt nam là một trong những quốc gia có nguồn tài nguyên đa dạng sinh học cao trên thế giới và là Quốc gia có số lượng lợn nuôi cao nhiều nhất trong khu vực. Sử dụng các chỉ thị phân tử (microsatellite, phân tích trình tự hệ gen ty thê) để đánh giá sự đa dạng di truyền và các mối quan hệ di truyền của các giống lợn nuôi đã được nhiều tác giả thực hiện (Thúy và cộng sự 2006; Kim và cộng sự 2005; Li và cộng sự 2004; Rajeev Kaul và cộng sự 2001; Spencer và cộng sự 2006; Laval và cộng sự 2000). Trong khi đó những nghiên cứu đánh giá sự sai khác di truyền giữa các giống cũng như mối quan hệ nguồn gốc phát sinh ở mức độ di truyền phân tử còn chưa được thực hiện nhiều ở Việt Nam. Đặc biệt, những nghiên cứu nhằm đánh giá sai khác di truyền giữa lợn rừng và lợn nhà nuôi còn chưa được thực hiện. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng các chỉ thị phân tử microsatellite để đánh giá sự sai khác di truyền giữa lợn rừng và một số giống lợn nuôi tại Việt Nam. 2. Vật liệu và phương pháp 2.1. Đối tượng nghiên cứu - Nhóm lợn rừng: gồm lợn rừng Thái Lan và lợn rừng Việt Nam, lợn lai giữa rừng Việt nam và Thái Lan. Các mẫu lợn này được thu thập tại công ty Mỹ Hạnh, Ba Vì Hà Nội - Nhóm lợn nhà gồm các giống: Lợn Ỉ, lợn lai giữa Ỉ và lợn rừng, lợn Đen (Hà Giang), Móng Cái, và một giống lợn ngoại nhập (Landrace). Các mẫu lợn này được thu thập tại Viện Chăn Nuôi, Hải Phòng, Hà Giang (Bảng 1). Bảng 1. Các giống lợn và số lượng cá thể phân tích Giống Số mẫu Lợn rừng Việt Nam 6 Lợn rừng Thái Lan 10 Lợn ỉ 24 Lợn đen (Hà Giang) 25 Lợn Móng Cái 24 Lợn lai giữa rừng Việt Nam và Thái 22 Lợn lai giữa lợn Ỉ và lợn rừng 11 Lợn landrace 24 2.2. Phương pháp nghiên cứu Tách chiết ADN: ADN được tách chiết theo quy trình bộ kít Qiagen (Đức) Phản ứng PCR: 30 cặp mồi microsatellite được chúng tôi sử dụng theo khuyến cáo của FAO và được chuẩn hoá trong 6 phản ứng PCR đa mồi (Bảng 2). Mỗi phản ứng PCR đa mồi (mix) được thực hiện trong thành phần phản ứng: Đệm PCR 10X: 2,0-2,5 µl, dNTP mix (2mM mỗi loại) 2,5 µl, Mg 2+ (25mM) 2,0-2,5 µl , mồi (mồi xuôi và mồi ngược 10 pM mỗi loại) 0,1-1µl, ADN Taq polymerase 0,3 µl, ADN 1,0 µl, H 2 O vô trùng thêm vào sao cho tổng thể tích cuối cùng là 25 µl. Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt: 95 0 C trong 5 phút, 30-35 chu kỳ với: 94 0 C trong 30- 45 giây, 55 0 C-58 0 C trong 30-45 giây, 72 0 C trong 30-45 giây. 72 0 C trong 10 phút. Bảng 2. Danh sách các cặp mồi microsatellite, vị trí trên nhiễm sắc thể, ký hiệu màu đánh dấu, nhiệt độ gắn mồi và khoảng kích thước các alen Tên locus Nhiễm sắc thể Ký hiệu màu đánh dấu Khoảng kích thước alen Sw2410 8 D2 90 - 131 Sw830 10 D2 168 - 203 S0355 15 D3 244 - 271 Sw1828 1 D2 82 - 110 Sw1067 6 D2 136 - 176 S0226 2 D2 180 - 210 Sw2008 11 D3 95 - 108 S0215 13 D3 135 - 169 S0228 6 D3 220 - 246 S0225 8 D4 170 - 196 S0227 4 D4 231 - 256 S0026 16 D2 87 - 105 S0155 1 D2 142 - 162 S0005 5 D2 203 - 267 Sw2410 17 D3 95 - 124 Sw632 7 D3 148 - 178 Sw936 15 D4 90 - 116 S0218 x D4 158 - 205 S0068 13 D4 211 - 262 Sw122 6 D2 106 - 128 Sw857 14 D2 141 - 159 S0097 4 D2 209 - 250 Sw240 2 D3 92 - 124 Sw2406 6 D3 222 - 262 Sw72 3 D4 97 - 114 S0143 12 D4 150 - 167 S0101 7 D2 197 - 221 Sw951 10 D3 125 - 133 S0002 3 D3 186 - 216 Sw911 9 D4 149 - 173 Phân tích đa hình các locus microsatellites: 1µl của tất cả các sản phẩm multiplex-PCR sau khi bổ sung 25µl đệm SLS (Sample Loading Solution Beckman Coulter) và 0.15µl thang ADN chuẩn (DNA Size standard Beckman Coulter) được tiến hành phân tách bằng hệ thống điện di mao quản trên máy giải trình tự tự động CEQ8000 của hãng Beckman Coulter. Kích thước các alen được phân tích tự động bằng phần mềm Genetics analysis system cho máy CEQ8000 (phiên bản 9.0). Phân tích thống kê: Một số chỉ số như: số lượng alen, trung bình số lượng alen trên mỗi locus, tần số dị hợp tử quan sát (Ho), dị hợp tử lý thuyết (He), các giá trị thống kê F theo Wright (Wright’F-statistics), khoảng cách di truyền, hệ số cận huyết Fis được ước lượng bằng phần mềm Genetix. Phân tích mối quan hệ di truyền giữa, cây phân loại di truyền giữa các nhóm, giống bằng phần mềm Population và Treeview. Khoảng cách di truyền được tính theo phương pháp của Nei (1972) và kiểm định sự sai khác di truyền theo tiêu chuẩn “khi bình phương” bằng phần mềm Genetix. Thực hiện phép phân tích PCA (Principal Coodinates Analysis) bằng phần mềm Genetix 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Tính đa hình của các locus microsatellite Trong tổng số 30 locus microsatellite được tiến hành phân tích có 24 locus microsatellite cho được kết quả tốt, 6 locus khác có kết quả không tốt nên chúng tôi đã loại đi trong các phân tích tiếp theo. Kết quả phân tích trên 24 locus microsatellite cho thấy số alen được xác định của mỗi locus dao động lớn từ 6 alen ở locus Sw2008, Sw951 đến 15 alen ở locus S0101. Tổng số có 247 alen được xác định và trung bình số alen trên một locus của toàn bộ mẫu phân tích là 10,2. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đây của tác giả Nguyễn Thị Diệu Thúy và cộng sự (2006) trên một số giống lợn khác của Việt Nam (12,4). So với kết quả nghiên cứu của Laval và cộng sự (2000) trên các giống lợn của Châu Âu thì ở các giống lợn nuôi của Việt Nam có số lượng alen trung bình trên một locus cao hơn. Điều đó cho thấy tính đa dạng về các alen của các locus microsatellite ở các giống lợn nuôi và lợn rừng của Việt Nam là tương đối cao. Ngoài ra, kết quả cũng cho thấy sự xuất hiện 12 alen đặc trưng của một số locus microsatellite trên các mẫu lợn rừng (Bảng 3). Sự xuất hiện các các alen đặc trưng đồng thời sự khác nhau về tần số alen của các locus microsatellite ở mỗi giống là những yếu tố làm cho sự sai khác di truyền giữa các giống. Đây là kết quả của quá trình chọn lọc và tiến hóa dẫn đến những sai khác về di truyền của lợn rừng và các giống lợn nhà nuôi. Bảng 3. Các alen đặc trưng của các locus microsatellite xuất hiện ở lợn rừng Locus microsatellite Alen (bp) Đặc trưng cho lợn rừng Sw2410 140 Lợn rừng Việt Nam Sw1067 153 Lợn Rừng Việt Nam S0225 192, 194 Lợn Rừng Việt Nam S0068 242 Lợn rừng Việt Nam Sw72 105 Lợn rừng Thái Lan S0097 226 Lợn rừng Việt Nam S0215 167, 183 Lợn rừng Thái Lan S0101 228, 230 Lợn rừng Việt Nam S0002 182 Lợn rừng Việt Nam 3.2. Tần số di hợp tử và tính đa dạng di truyền Trung bình số alen, tần số dị hợp tử quan sát, tần số dị hợp tử lý thuyết và hệ số cận huyết được tính cho từng nhóm, giống lợn thể hiện ở bảng 4. Trung bình số alen của một locus microsatellite được xác định ở mỗi nhóm, giống dao động từ 4,83 đến 6,08. Tần số dị hợp tử quan sát (Hobs) dao động từ 0,50 đến 0,76 và tần số dị hợp tử lý thuyết dao động từ 0,58 đến 0,74. Kết quả này tương đương với các nghiên cứu trước đây trên các giống lợn của Trung Quốc và Châu Âu (Thúy và cs, 2006; Kim và cs, 2005; Li và cs, 2004; Laval và cs, 2000) mặc dù số lượng mẫu phân tích ở các giống lợn của chúng tôi nhỏ hơn. Qua đó cho thấy ở các giống lợn nuôi cũng như lợn rừng việt nam có tính đa dạng di truyền tương đối cao. Đặc biệt ở hai nhóm lợn rừng của Việt Nam và Thái Lan cho thấy tần số dị hợp tử cao hơn so với các giống lợn nuôi, tương tự chỉ số cận huyết của nhóm lợn rừng cũng thấp hơn so với các giống lợn nuôi. Điều này có thể do tập tính hoang dã, giao phối tự nhiên dẫn đến sự duy trì tính đa dạng di truyền cao. Bảng 4. Tần số dị hợp tử quan sát (Hob), dị hợp tử lý thuyết, trùng bình số alen (MNE) và giá trị hệ số cận huyết (Fis) ở các giống lợn nghiên cứu Giống Hep Hob MNE Fis Ban 0,69 0,50 5,29 0,21 LI 0,68 0,56 4,88 0,24 I lai 0,59 0,55 6,08 0,20 LD 0,58 0,53 5,04 0,12 MC 0,61 0,57 4,83 0,08 RTL 0,70 0,76 5,25 0,03 RVN 0,74 0,73 5,50 0,08 VNxTL 0,59 0,57 5,25 0,10 3.3. Khoảng cách và cây phân loại di truyền Khoảng cách di truyền giữa các nhóm, giống lợn phân tích được ước lượng theo phương pháp chuẩn của Nei (1972) và được thể hiện ở bảng 5. Khoảng cách di truyền giữa các nhóm, giống lợn dao động trong khoảng 0,239 đến 1,209. Qua phép kiểm định thống kê cho thấy sai khác di truyền giữa các giống lợn đều có ý nghĩa (P<0,01). Khoảng cách di truyền nhỏ nhất giữa hai giống lợn Ỉ và lợn Bản Hà Giang (0,239) và khoảng cách di truyền lớn nhất giữa giống lợn Landrace nhập ngoại và các giống lợn bản địa của Việt Nam với giá trị khoảng cách di truyền đều lớn hơn 1. Khoảng cách di truyền giữa lợn rừng và các giống lợn nhà nuôi của Việt Nam là khá lớn, dao động trong khoảng từ 0,883 đến 0,974. Khoảng cách di truyền giữa hai nhóm lợn rừng Việt Nam và Thái Lan là 0,406 cao hơn so với khoảng cách di truyền giữa 2 giống lợn Ỉ và lợn Bản (0,239). Như vậy, có sự khác nhau đáng kể giữa hai nhóm lợn rừng của Việt Nam và Thái Lan, tuy nhiên theo chúng tôi thì chúng cùng thuộc một loài phụ lợn rừng phân bố ở khu vực Đông Nam Á nhưng do điều kiện sống ở các vùng sinh thái khác nhau nên chúng có những đặc điểm về di truyền và kiểu hình khác nhau. Để làm sang tỏ điều này cần thực hiện các nghiên cứu phân loại ở mức độ phân tử. Bảng 5. Ma trận khoảng cách di truyền giữa các giống lợn nghiên cứu được tính theo phương pháp của Nei 1972 Ban LI I lai LD MC RTL RVN VNxTL Ban xxxx LI 0.239 xxxx I lai 0.490 0.558 xxxx LD 1.209 1.172 0.964 xxxx MC 0.707 0.639 0.527 1.206 xxxx RTL 0.748 0.583 0.677 1.064 0.974 xxxx RVN 0.771 0.688 0.791 0.997 0.828 0.476 xxxx VNxTL 0.711 0.586 0.651 0.985 0.781 0.556 0.406 xxxx Cây phân loại di truyền giữa các giống lợn phân tích được xây dựng theo phương pháp UPGMA dựa trên khoảng cách di truyền được thể hiện ở hình 1. Qua hình 1 cho thấy cây phân loại được chia thành 3 nhánh khác nhau, nhánh thứ nhất bao gồm các giống lợn nuôi bản địa của Việt Nam (Bản, LI, MC, Ilai), nhánh thứ hai là các mẫu lợn rừng của Việt Nam và Thái Lan (RVN, RTL và lợn lai giữa RVN và RTL), nhánh thứ ba là giống lợn ngoại nhập nuôi tại Việt Nam (LD). Tuy nhiên, các giống lợn nuôi bản địa của Việt Nam và các mẫu lợn rừng tạo thành một nhánh khác biệt rõ rệt so với giống lợn ngoại nhập (LD). Theo một số nghiên cứu cho rằng quá trình thuần hóa lợn nhà nuôi của Châu Á và Châu Âu được thực hiện độc lập từ các loài phụ lợn rừng ở khu vực Châu Á và Châu Âu (Giuffra và cs 2000; Okumura và cs 2001). Do sự khác nhau rõ rệt về di truyền giữa lợn rừng của Châu Á và Châu Âu nên dẫn đến sự khác nhau giữa các giống lợn nuôi ở Châu Á và Châu Âu, bằng chứng là cũng với phương pháp phân tích tương tự (sử dụng chỉ thị microsatellite) tác giả Li và cộng sự (2000) chỉ ra sự tách biệt về di truyền giữa các giống lợn của Trung Quốc và các giống lợn ngoại nhập (Large White, Landrace và Duroc). Điều này đã giải thích cho kết quả phân tích của chúng tôi về sự sai khác di truyền giữa giống lợn ngoại nhập với các giống lợn nuôi bản địa của Việt Nam. Ngoài ra, cấu trúc và mối quan hệ di truyền giữa các giống lợn được chúng tôi tiến hành phân tích theo một hướng tiếp cận khác là sử dụng phương pháp PCA (Principle Coordinates Analysis) dựa trên khoảng cách di truyền giữa tất cả các cá thể phân tích. Kết quả phân tích được mô phỏng ở dạng không gian 3 chiều tại hình 2. Qua hình 2 cho thấy mức độ sai khác di truyền tương ứng theo các trục 1, 2, 3 là 27,53%, 20,79% và 15,83%. Tương tự kết đã phân tích ở hình 2, giống lợn ngoại nhập Landrace có sự phân ly xa nhất so với các giống lợn nuôi và lợn rừng của Việt Nam, các giống lợn nuôi tạo thành một nhóm gần nhau trong khi lợn rừng Việt Nam và Thái Lan tạo thành một nhóm. Hình 1. Cây phân loại di truyền giữa các giống lợn được xây dựng theo phương pháp UPGMA dựa trên khoảng cách di truyền Nei (1972). Hình 2. Mô phỏng kết quả phân tích PCA (Principle Coordinates Analysis) của các giống lợn nghiên cứu. Trục 1=27,53%, trục 2=20,79% và trục 3=15,83% 4. Kết luận và đề nghị 4.1. Kết luận Sự sai khác di truyền giữa lợn rừng Việt Nam, lợn rừng Thái Lan và một số giống lợn nuôi của Việt Nam là khá lớn với mức ý nghĩa thống kê P<0.01. Vì vậy sẽ có ưu thế lai cao khi tiến hành các phép lai giữa lợn rừng và lợn nhà nuôi. Khoảng cách di truyền giữa lợn rừng Việt Nam và Thái Lan là 0,406, sự sai khác di truyền giữa hai nhóm lợn rừng này có ý nghĩa thống kê P<0,01. Giống lợn ngoại nuôi tại Việt Nam có khoảng cách di truyền rất xa so với lợn rừng và các giống lợn nuôi của Việt Nam. 4.2. Đề nghị Cần tiếp tục phân tích với số lượng mẫu nhiều hơn, trên nhiều giống lợn nuôi của Việt Nam để có bức tranh toàn cảnh về mối quan hệ di truyền giữa các giống lợn nuôi và giữa lợn nuôi và lợn rừng. Tài liệu tham khảo 1. Giuffra, E., Kijas, J.M., Amarger, V., Carlborg, O., Jeon, J.T and Andersson, L. (2000). The origin of the domestic pig: indipedent domestication and subsequent introgrestion. Genetis 154, 1785-1791. 2. Laval, G., Iannuccelli, N., Legault, C., Milan, D., Martien, A., Groenen,M.A., Giuffra, E., Andersson, L., Peter H. Nissen, Claus B. Jorgensen., Beeckmann,P., Geldermann H., Foulley, J.L., Chevalet, C., Ollivier, L. (2000). Genetic diversity of eleven European pig breeds. Genet. Sel. 32:187-203. 3. Kim, T., Kim, K., Choi, B., Yoon, D., Jang, G., Lee, K., Chung, H., Lee, H., Park, H. and Lee, J. (2005). "Genetic structure of pig breeds from Korea and China using microsatellite loci analysis." Journal of animal science 83(10): 2255. 4. Li, S.J., Yang, S.H., Zhao, S.H., Fan, B., Yu, M., Wang, H.S., Li, M.H., Liu, B., Xiong T.A and Li, K. (2004). Genetic diversity analyses of 10 indigenous Chinese pig populations based on 20 microsatellites. J. Anim. Sci. 82, 368-374. 5. Nei, M. (1972). "Genetic distance between populations." Am Nat 106: 283. 6. Okumura,N., Kurosawa, Y., Kobayashi, E., Watanobe, T., Ishiguro, N., Yasue, H and Mitsuhashi, T. (2001). Genetic relationship amongst the major non-coding regions of mitochondrial DNAs in wild boars and several breeds of domesticated pigs. Animal. Genet 32 (3), 139-147. 7. Rajeev Kaul, Atar Singh, R. K. Vijk, M. S. Tantia and Rahul Bell. (2001). Evaluation of the genetic variability of 13 microsatellite markers in native Indian pigs. Journal of Genetics, 80, 149-153. 8. Rothschild, M. and Ruvinsky, A. (1998). The genetics of the pig: CAB International 9. Scherf, B. (2001). "World watch list for domestic animal diversity." ANIMAL GENETIC RESOURCES INFORMATION: 97 10. Spencer, P. B. S., Hampton, J., Lapidge, S. J., Mitchell, J., Lee, J and Pluske, J. R. (2006). An assessment of the genetic diversity and structure within and among populations of wild pigs (Sus scrofa) from Australia and Papua New Guinea. J. Gene. 85, 63-66. 11. Thuy. N. T. D., E. Melchinger Wild, A. W. Kuss, Cuong. N.V., H. Bartenschlager and H. Geldermann (2006). Comparison of Vietnamese and European pig breeds using microsatellites. Animal Sci. 84: 2601- 2608. . lai giữa lợn rừng và lợn nhà nuôi. Khoảng cách di truyền giữa lợn rừng Việt Nam và Thái Lan là 0,406, sự sai khác di truyền giữa hai nhóm lợn rừng này có ý nghĩa thống kê P<0,01. Giống lợn. PHÂN TÍCH SAI KHÁC DI TRUYỀN GIỮA LỢN RỪNG VÀ MỘT SỐ GIỐNG LỢN NHÀ BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE Phạm Doãn Lân, Nguyễn Trọng Bình, 1 Tăng Xuân Lưu và 2 Võ Văn Sự Phòng. giống lợn và số lượng cá thể phân tích Giống Số mẫu Lợn rừng Việt Nam 6 Lợn rừng Thái Lan 10 Lợn ỉ 24 Lợn đen (Hà Giang) 25 Lợn Móng Cái 24 Lợn lai giữa rừng Việt Nam và Thái 22 Lợn