Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với nấm sclerotium rolfsii gây bệnh thối gốc mốc trắng trên cây lạc

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM SCLEROTIUM ROLFSII GÂY BỆNH THỐI GỐC MỐC TRẮNG TRÊN CÂY LẠC” HÀ NỘI – 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM SCLEROTIUM ROLFSII GÂY BỆNH THỐI GỐC MỐC TRẮNG TRÊN CÂY LẠC” Sinh viên thực : Tạ Hà Trang MSV : 637182 Lớp : K63CNSHB Giảng viên hƣớng dẫn : PGS TS Nguyễn Xuân Cảnh HÀ NỘI – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận kết trình nghiên cứu thân dƣới hƣớng dẫn PSG TS Nguyễn Xuân Cảnh Các số liệu nghiên cứu hoàn toàn trung thực chƣa sử dụng cơng bố trƣớc Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận đƣợc cảm ơn tài liệu tham khảo đƣợc trích dẫn đầy đủ rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2022 Sinh viên Tạ Hà Trang i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực tập thực tập Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, đƣợc dìu dắt giúp đỡ tận tình Thầy, Cơ giáo cán phịng thí nghiệm môn, với nỗ lực cố gắng thân, tơi hồn thành khóa luận tốt nhiệp Đầu tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám đốc Học viện, Ban chủ nhiệm Khoa Cơng nghệ Sinh học tồn thể Thầy, Cơ giáo ngồi khoa truyền đạt cho tơi kiến thức vơ bổ ích quý báu suốt thời gian học tập, rèn luyện Học viện Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng lòng biết ơn sâu sắc tới PSG TS Nguyễn Xuân Cảnh – Giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học định hƣớng đề tài tận tình hƣớng dẫn tơi suốt q trình thực khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thanh Huyền, ThS Trần Thị Hồng Hạnh, ThS Trần Thị Đào, KS Dƣơng Văn Hoàn, KS Nguyễn Thị Thu giúp đỡ tơi suốt q trình thực nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể Phịng, Ban khoa Cơng nghệ Sinh học tồn thể bạn bè giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi trình thực luận Và cuối cùng, với tất lịng thành kính biết ơn vô hạn, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình ngƣời thân nuôi nấng, động viên tạo động lực cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2022 Sinh Viên Tạ Hà Trang ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC VIẾT TẮT viii TÓM TẮT .ix PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu 1.2.2 Đối tƣợng nghiên cứu 1.2.3 Nội dung nghiên cứu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Tổng quan lạc 2.1.1 Tình hình sản xuất lạc giới Việt Nam 2.2 Vai trò lạc 2.3 Một số bệnh hại lạc 2.3.1 Bệnh thối gốc mốc trắng (TGMT) .7 2.3.2 Bệnh lở cổ rễ 10 2.3.3 Bệnh gỉ sắt 11 2.3.4 Bệnh thối mầm 11 2.2 Tổng quan xạ khuẩn 14 2.2.1 Giới thiệu xạ khuẩn 14 2.2.2 Đặc điểm hình thái 14 2.2.3 Đặc điểm sinh hóa 16 2.2.4 Vai trò xạ khuẩn 17 2.3 Tình hình nghiên cứu nƣớc 18 2.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 18 2.3.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 19 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .20 iii 3.1 Vật liệu nghiên cứu .20 3.1.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu .20 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 20 3.1.3 Thiết bị hóa chất 20 3.1.4 Môi trƣờng sử dụng nghiên cứu 21 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 3.2.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu bệnh mẫu đất phân lập xạ khuẩn 21 3.2.2 Phƣơng pháp phân lập 22 3.2.3 Phƣơng pháp tái lây nhiễm 22 3.2.4 Phƣơng pháp định danh chủng nấm gây bệnh 24 3.2.5 Phƣơng pháp sàng lọc đối kháng 25 3.2.6 Phƣơng pháp xác định khả ức chế sinh trƣởng sợi nấm dịch nuôi xạ khuẩn 26 3.2.7 Phƣơng pháp xác định khả ức chế hình thành hạch nấm dịch nuôi xạ khuẩn 26 3.2.8 Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng dịch ni xạ khuẩn đến hình thái sợi nấm Sclerotium rolfsii 27 3.2.9 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn tuyển chọn 27 3.2.10 Phƣơng pháp xử lý số liệu 28 PHẦN IV: KẾT QUẢ 29 4.1 Kết xác định nấm gây bệnh thối gốc mốc trắng lạc 29 4.1.1 Kết thu thập mẫu lạc bị bệnh 29 4.1.2 Kết phân lập nấm gây bệnh thối gốc mốc trắng 29 4.1.3 Kết tái lây nhiễm 31 4.1.4 Kết tách chiết DNA định danh chủng nấm có khả gây bệnh cao 35 4.2 Phân lập, sàng lọc chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với nấm bệnh 37 4.2.1 Kết phân lập xạ khuẩn 37 4.2.2 Kết sàng lọc chủng xạ khuẩn có khả đối kháng nấm 39 4.2.3 Kết đánh giá khả ức chế sợi nấm hạch nấm dịch nuôi xạ khuẩn .40 4.3 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn 45 4.3.1 Đặc điểm hình thái 45 iv 4.3.2 Khả thích nghi chủng xạ khuẩn TB25 điều kiện khác .46 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 5.1 Kết luận 52 5.2 Kiến nghị 52 PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 60 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Tình hình sản xuất lạc Việt Nam giai đoạn từ năm 2010 đến 2020 Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR 25 Bảng 4.1 Kết phân lập chủng nấm 30 Bảng 4.2 Phân nhóm mức độ gây bệnh chủng nấm 34 Bảng 4.3 Các chủng xạ khuẩn phân lập đặc điểm hình thái chúng 38 Bảng 4.4 Phần trăm (%) kháng nấm chủng xạ khuẩn tuyển chọn 39 Bảng 4.4 Thời gian hình thành hạch số lƣợng hạch hình thành sau 20NSC 43 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Tình hình sản xuất lạc giới giai đoạn 2010 – 2020 Hình 2.2 Tình hình sản xuất lạc năm 2020 nƣớc có sản lƣợng lớn (Trung Quốc, Ấn Độ, Nigeria) .4 Hình 2.3 Bệnh thối gốc mốc trắng lạc tác nhân gây bệnh Hình 2.4 Cây lạc nhiễm bệnh lở cổ rễ gây thiệt hại xuất 10 Hình 2.5 Lá lạc bị nhiễm nấm gây bệnh gỉ sắt 11 Hình 2.6 Nấm Rhizopus arrhizus gây bệnh thối mầm lạc 12 Hình 2.7 Bệnh đốm sớm (đốm nâu) lạc 12 Hình 2.8 Bệnh đốm muộn (đốm đen) lạc 13 Hình 2.9 Khuẩn ty chất khuẩn ty khí sinh 15 Hình 2.10 Hình ảnh số dạng chuỗi bào tử xạ khuẩn 15 Hình 2.11 Đa dạng hình dạng màu sắc khuẩn lạc xạ khuẩn 16 Hình 4.1 Mẫu lạc nhiễm nấm gây bệnh thối gốc lạc 29 Hình 4.2 Hình ảnh chủng nấm ĐX4 VM2.1 sau ngày nuôi cấy (A, B) cấu trúc mấu lồi sợi nấm (C, mũi tên) 30 Hình 4.3 Hình ảnh hạch non/ già 31 Hình 4.4 Tái lây nhiễm điều kiện in vitro sau ngày .32 Hình 4.5 Tái lây nhiễm điều kiện chậu vại sau 25 ngày theo dõi .33 Hình 4.6 Sản phẩm PCR đoạn gen ITS chủng nấm ĐX4 35 Hình 4.7 So sánh trình tự nucleotide chủng nấm ĐX4 GenBank 36 Hình 4.8 Cây phân loại dựa trình tự 18S rRNA chủng nấm ĐX4 37 Hình 4.9 Khả đối kháng nấm Sclerotium rolfsii chủng xạ khuẩn TB25 sau ngày theo dõi .40 Hình 4.10 Ảnh hƣởng dịch nuôi cấy xạ khuẩn đến hệ sợi nấm S rolfsii sau ngày nuôi cấy 41 Hình 4.11 Khả ức chế hình thành hạch dịch nuôi xạ khuẩn 42 Hình 4.12 Ảnh hƣởng dịch ni xạ khuẩn đến hình thái hạch nấm 44 Hình 4.13 Ảnh hƣởng chủng xạ khuẩn TB25 đến hình thái sợi nấm S rolfsii 45 Hình 4.14 Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn TB25 46 Hình 4.15 Khảo sát khả chịu nhiệt chủng xạ khuẩn TB25 47 Hình 4.16 Khả chịu pH chủng xạ khuẩn TB25 .48 Hình 4.17 Khảo sát khả chịu mặn chủng TB25 49 Hình 4.18 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng xạ khuẩn TB25 .50 vii DANH MỤC VIẾT TẮT TGMT : Thối gốc mốc trắng TLN : Tái lây nhiễm NSC : Ngày sau cấy ĐC : Đối chứng NL : Nhắc lại ITS : Internal Transcribed Spacer CMC : Carboxymethyl cellulase CV% : Sai số thí nghiệm LSD0.05 : Giá trị sai khác nhỏ có ý nghĩa viii 0% 0.5% 1% 3% 5% 7% Hình 4.17 Khảo sát khả chịu mặn chủng TB25 Qua kết thí nghiệm khảo sát khả chịu muối chủng xạ khuẩn TB25 kết luận chủng khơng ƣa mặn, sinh trƣởng tốt với nồng độ muối khoảng – % đƣợc xếp vào nhóm sinh vật chịu nồng độ muối thấp So sánh với nghiên cứu Phạm Hồng Hiển & cs (2019) cho kết tƣơng đồng tác giả khoảng chịu đựng chủng xạ khuẩn 24 môi trƣờng có bổ sung từ – 4% NaCl, khoảng tối ƣu từ – 1% Kết thí nghiệm khả chịu mặn chủng xạ khuẩn TB25 phù hợp với công bố Sirisha & cs (2013) đa số chủng xạ khuẩn phát triển đƣợc mơi trƣờng có nồng độ NaCl dƣới 9% 4.3.2.4 Khả sinh enzyme ngoại bào Xạ khuẩn TB25 đƣợc ni mơi trƣờng Gause lỏng, lắc 200 vịng/ phút 30oC ngày Dịch nuôi đƣợc ly tâm 10.000 vịng/ phút thu dịch enzyme thơ Một trăm microlit dịch enzyme thô đƣợc nhỏ vào giếng môi 49 trƣờng bổ sung 1% chất Khả sinh enzyme ngoại bào đƣợc thể vòng sáng xung quanh giếng thạch TB25 TB25 Xylan CMC Chitin Hình 4.18 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng xạ khuẩn TB25 Kết hình 4.18 cho thấy chủng có khả sinh enzyme cellulase phân hủy CMC (hợp chất cellulose), enzyme xylanase phân hủy xylan enzyme chitinase phân hủy chitin Xạ khuẩn có khả sinh enzyem ngoại bào axit hữu đƣợc ghi nhận từ nhiều chủng xạ khuẩn khác You & cs (2005) ghi nhận số chủng Streptomyces sinh enzyme làm tăng khả hấp thụ chất dinh dƣỡng cho tôm nuôi Trong báo cáo Jain & cs (2016) ghi nhận S sampsonii có khả sinh số enzyme phân hủy casein, gelatin, collagen dùng S sampsonii chế phẩm sinh học nhận thấy có khả phân giải chất hữu môi trƣờng Xylanase enzyme đƣợc sử dụng nhiều ngành sản xuất tồn giới Một số ứng dụng lĩnh vực nông nghiệp: phân hủy rác thải, sản xuất chế phẩm sinh học góp phần tạo nên nông nghiệp bền vững (Ufuk & cs., 2001) Cellulose nguồn carbon hữu dồi tự nhiên đƣợc tích tụ hàng năm với lƣợng lớn nông nghiệp, công nghiệp, lâm nghiệp phế phụ phẩm ngành kinh tế (Mandels, 1975) Trong nghiên cứu Nguyễn Liêu Ba & cs (2020) 21 chủng xạ khuẩn phân lập từ 50 đất có khả sinh tổng hợp enzyme cellulase Trong chủng G1, G3, D4 tạo vòng phân giải cellulose cao; đặc biệt chủng G3 D4 phân hủy nguồn cellulose tự nhiên rơm bã mía tốt Sau 12 ngày, khối lƣợng rơm lại chủng G3 D4 lần lƣợt 13,0% 10,5% khối lƣợng ban đầu; khối lƣợng bã mía giảm cịn 10,5% 11,3% Chitin đƣợc biết thành phần cấu tạo nên thành tế bào hầu hết loại nấm (Veliz & cs., 2017) Chúng đƣợc cấu tạo đơn phân Nacetylglucosamine liên kết với β (1-4) glycoside Hợp chất đƣợc phân giải thành đơn phân đơn giản N-acetyl glucosamine chitinase đƣợc tạo vi sinh vật phân giải chitinoin, chúng đƣợc sử dụng làm chất kiểm sốt sinh học có hiệu chống lại nấm công côn trùng Theo báo cáo (Ordentlich, 1988) vai trò chitinase đƣợc sinh Serratina marcescens kiểm soát tác nhân gây bệnh Scleroitum rolfsii Serratina marcescens sinh trƣởng thành tế bào nấm Sclerotium rolfsii, thành phần cấu tạo nên nhƣ chitin, laminarin, sử dụng nhƣ nguồn cacbon Điều đƣợc chứng giải phóng Nacetyl-D-glucosamin lên đến 1-5.2 đơn vị enzyme chitinase cho thấy suy thoái chất Wibowo & cs (2020) công bố số 60 chủng xạ khuẩn phân lập, 16 chủng có khả sinh chitinase, chủng KK-05, KK06, KK-07, KK-08, KK-15 KK-16 có khả kháng nấm Fusarium Sclerotium rolfsii 51 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ 17 chủng nấm phân lập xác định đƣợc 06 chủng có khả gây bệnh cao lạc tái lây nhiễm nhân tạo bao gồm: ĐX3, ĐX4, ĐX5, VM2.1, VM3.2, VH1 Chủng nấm ĐX4 có khả gây bệnh cao đƣợc chọn làm nguồn nấm bệnh đối kháng Qua quan sát đặc điểm hình thái phƣơng pháp định danh phân tử với cặp mồi ITS1/ITS4, chủng nấm ĐX4 đƣợc xác định Athelia rolfsii (Sclerotium rolfsii sacc.) so sánh trình tự nucleotide với đoạn gene 18S rRNA sở liệu NCBI Năm số 25 chủng xạ khuẩn phân lập có khả kháng nấm bệnh bao gồm TB12, TB14, TB16, TB23, TB25, chủng xạ khuẩn TB25 có phần trăm đối kháng cao (46.11%) Dịch nuôi chủng xạ khuẩn TB25 làm giảm rõ rệt sinh trƣởng hệ sợi nấm Bên cạnh kéo dài thời gian hình thành làm giảm số lƣợng hạch sau 20 ngày ni cấy Qua thí nghiệm đặc điểm sinh học cho thấy chủng có khả sinh trƣởng khoảng nhiệt độ 25oC – 35oC, khoảng pH từ đến 11, nồng độ buối bổ sung – 4% Trong đó, khoảng nhiệt độ tối ƣu 30 – 35oC, pH=7 – pH=9, nồng độ muối – 1% Ba enzyme ngoại bào sản xuất chủng xạ khuẩn TB25 bao gồm cellulase, xylanase chitinase điều kiện môi trƣờng tối ƣu 5.2 Kiến nghị Nghiên cứu định danh phân tử chủng xạ khuẩn TB25 đánh giá ảnh hƣởng chủng xạ khuẩn TB25 đến khả phòng trừ nấm Sclerotium rolfsii lạc điều kiện nhà lƣới 52 PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 6.1 Tài liệu tiếng Việt Đoàn Thị Thanh Nhàn (1996) Giáo trình cơng nghiệp, NXB Nơng nghiệp Hà Nội Đỗ Tấn Dũng (2006) Nghiên cứu bệnh héo rũ gốc mốc trắng (Sclerotium rolfsii sacc.) hại số trồng cạn vùng Hà Nội phụ cận năm 2005-2006 Tạp chí BVTV, số 4/2006 Đỗ Thu Hà (2004) Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam - Đà Nẵng Luận án tiến sĩ Khoa Học, ĐHSP Hà Nội Lê Nhƣ Cƣơng, Nguyễn Thị Nhung & Nguyễn Thị Diễm (2018) Khả kháng nấm hạn chế bệnh héo rũ gốc mốc trắng lạc (Sclerotium rolfsii) dung dịch nano bạc Hue University Journal of Science: Agriculture and Rural Development, 127(3A), 161–171–161–171 Nguyễn Bá Nghị, Nguyễn Thị Diệp, Ngô Hồng Đức, Đỗ Thu Hà, Nguyễn Thị Mộng Điệp (2012) Khả đối kháng nấm Trichoderma với nấm bệnh hại trồng Sclerotium rolfsii sacc điều kiện in vitro Hue university journal of science: agriculture and rural development, 75(6) Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến (1998) Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Liêu Ba, Hoàng Thị Phƣơng Anh, Phạm Thu Hiền, Lê Thị Hồng Hậu (2020) Phân lập chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 140 (2020) 065-070 Nguyễn Thanh Hải (2012) Khảo sát độc tính dịch ni nấm (Sclerotium rolfsii) mơ sẹo cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) in vitro Tạp chí Khoa học Phát triển 2013, tập 11, số 1: 7-15 Nguyễn Thanh Sơn & Lê Thị Thúy Ái (2013) Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học vƣờn quốc gia nam cát tiên khu sinh thái cam ranh Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Nguyễn Văn Mạnh (1997) Kinh tế có dầu, Viện kinh tế nông nghiệp, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Phan Thị Hồng Thảo, Nguyễn Vũ Mai Linh, Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Thị Hồng Linh (2016) Đặc điểm sinh học khả sinh tổng hợp chất kích thích sinh trƣởng thực vật xạ khuẩn nội sinh Streptomyces hebeiensis tqr8-7 Vietnam Journal of Science and Technology, 54(4A), 31-31 53 Phạm Hồng Hiển, Đào Ngô Tú Quỳnh, Nguyễn Thị Diệu Hƣơng, Nguyễn Thị Chúc Quỳnh, Phùng Quang Tùng, Bạch Thị Điệp & Nguyễn Xuân Cảnh (2019) Tuyển chọn nghiên cứu đặc điểm chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với nấm Phytophthora gây bệnh số loại ăn Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nông nghiệp Việt Nam-Số, 12(109) Trần Thị Thu Hà & Phạm Thanh Hòa (2012) Khả đối kháng nấm Trichoderma với nấm bệnh hại trồng Sclerotium rolfsii Sacc điều kiện in vitro Hue University Journal of Science: Agriculture and Rural Development, 75(6) Ƣng Định Đặng Phú (1999) Kinh nghiệm thâm canh tăng suất lạc NXB Nơng nghiệp Hà Nội Vũ Đình Chính (2011), Tuyển chọn nghiên cứu xạ khuẩn có khả đối kháng với số chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện Báo cáo tổng kết đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ Mã số B2009 – TN07 – 02 6.2 Tài liệu tiếng Anh Abo-Zaid, G., Abdelkhalek, A., Matar, S., Darwish, M., & Abdel-Gayed, M (2021) Application of bio-friendly formulations of chitinase-producing streptomyces cellulosae actino 48 for controlling peanut soil-borne diseases caused by sclerotium rolfsii Journal of Fungi, 7(3), 1–24 Adandonon, A., Aveling, T A., van der Merwe, N A., & Sanders, G (2005) Genetic variation among Sclerotium isolates from Benin and South Africa, determined using mycelial compatibility and ITS rDNA sequence data Australasian Plant Pathology, 34(1), 19-25 Adhilakshmi, M., Latha, P., Paranidharan, V., Balachandar, D., Ganesamurthy, K., & Velazhahan, R (2014) Biological control of stem rot of groundnut (Arachis hypogaea L.) caused by Sclerotium rolfsii Sacc with actinomycetes Archives of Phytopathology and Plant Protection, 47(3), 298-311 Alič, Naglič, T., Tušek-Žnidarič, M., Peterka, M., Ravnikar, M., & Dreo, T (2017) Putative new species of the genus Dickeya as major soft rot pathogens in Phalaenopsis orchid production Plant Pathology, 66(8), 1357– 1368 Anandan, R., Dharumadurai, D., & Manogaran, G P (2016) An introduction to actinobacteria In Actinobacteria-Basics and Biotechnological Applications IntechOpen Boukaew, S., & Chuenchit, S (2011) Evaluation of Streptomyces spp for biological control of Sclerotium root and stem rot and Ralstonia wilt of chili pepper 365–374 Chaudhary, H S., Soni, B., Shrivastava, A R., & Shrivastava, S (2013) 54 Diversity and Versatility of Actinomycetes and its Role in Antibiotic Production Journal of Applied Pharmaceutical Science, 3,(8,), S83–S94 Coulibaly, A E., Pakora, G A., Ako, A B A., Amari, G E L N O D., N’Guessan, C A., Kouabenan, A., Kone, D., & Djaman, J A (2022) Diversity of Sclerotium rolfsii antagonist fungi isolated from soils of the rhizosphere of tomato crops and identification of some antifungal compounds Heliyon, 8(2) Dhanasekaran, D., Thajuddin, N., & Panneerselvam, A (2012) Applications of Actinobacterial Fungicides in Agriculture and Medicine Truy vấn 24 Tháng Tƣ 2022, từ www.intechopen.com Dolatabadi, S., de Hoog, G S., Meis, J F., & Walther, G (2014) Species boundaries and nomenclature of Rhizopus arrhizus (syn R oryzae) Mycoses, 57, 108-127 El Hussein, A (2014) Isolation and Identification of Streptomyces rochei Strain Active against Phytopathogenic Fungi British Microbiology Research Journal, 4(10), 1057–1068 Fenical, W., & Jensen, P R (2006) Developing a new resource for drug discovery: marine actinomycete bacteria Nature Chemical Biology 2006 2:12, 2(12), 666–673 Hawaladar, S., Nandan, M., Vinaykumar, H D., Rajanna, H., Shridhar, H., Venkataravanappa, V., Jahir Basha, C R (2022) Morphological and molecular characterization of Sclerotium rolfsii associated with stem rot disease of groundnut (Arachis hypogaea L.) Indian Phytopathology 75, 25–36 Hepiyanti, A., Setyawati, T R., & Kurniatuhadi, R (2017) Potential Probiotic Microflora Isolated from Coelom Fluid, Gastrointestinal Fluid and Fecal Pellets of Nipah Worm (Namalycastis rhodochorde) Research Report on Novice EducatorsPontianak Tanjungpura University Horbach, R., Navarro-Quesada, A R., Knogge, W., & Deising, H B (2011) When and how to kill a plant cell: infection strategies of plant pathogenic fungi Journal of plant physiology, 168(1), 51-62 Jain, R., Jain, A., Rawat, N., Nair, M., & Gumashta, R (2016) Feather hydrolysate from Streptomyces sampsonii GS 1322: A potential lowcost soil amendment Journal of Bioscience and Bioengineering 121(6), 672677 Jensen, P R., & Lauro, F M (2008) An assessment of actinobacterial diversity in the marine environment Antonie van Leeuwenhoek, International Journal of General and Molecular Microbiology, 94(1), 51–62 Kator, L., Yula Hosea, Z., & Daniel Oche, O (2015) Sclerotium rolfsii; 55 Causative organism of southern blight, stem rot, white mold and sclerotia rot disease Scholars Research Library Annals of Biological Research, 6(11), 78–89 Kaur, N (2020) Screening of Endophytic Actinomycetes for their Plant Growth Promoting Activity and for Biocontrol in Chilli (Capsicum annum) against Sclerotium Rolfsii Konjengbam, R., Singh, N I., & Devi, R T (2021) In-vitro Assessment of Fungicides and pH Levels on the Mycelial Growth and Sclerotia Production of Sclerotium rolfsii Sacc causing White Rot of Onion in Manipur Journal of Current Opinion in Crop Science, 2(1), 60-67 Le Nhu Cuong, Mendes, R., Kruijt, M., & Raaijmakers, J M (2012) Genetic and phenotypic diversity of Sclerotium rolfsii in groundnut fields in central Vietnam Plant Disease, 96(3), 389–397 Lee, L H., Zainal, N., Azman, A S., Eng, S K., Ab Mutalib, N S., Yin, W F., & Chan, K G (2014) Streptomyces pluripotens sp nov., a bacteriocinproducing streptomycete that inhibits meticillin-resistant Staphylococcus aureus International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, (64), 3297–3306 Lekshmi, M., Ayona Jayadev & Navamani, S S (2014) Isolation and screening of actinomycete from marine samples for enzyme production (199-204) Li, Y., He, F., Lai, H., & Xue, Q (2017) Mechanism of in vitro antagonism of phytopathogenic Scelrotium rolfsii by actinomycetes European Journal of Plant Pathology, 149(2), 299–311 Liang, J., Xu, Z., Liu, T., Lin, J., & Cen, P (2008) Effects of cultivation conditions on the production of natamycin with Streptomyces gilvosporeus LK-196 Enzyme and Microbial Technology, 42(2), 145–150 Mandels, M (1975) Microbial sources of cellulase In Biotechnology and bioengineering symposium (No 5, pp 81-105) Manivasagan, P., Venkatesan, J., Sivakumar, K., & Kim, S K (2013) RETRACTED: Marine actinobacterial metabolites: Current status and future perspectives Microbiological Research, 168(6), 311–332 Masoomi-Aladizgeh, F., Jabbari, L., Nekouei, R K., & Aalami, A (2019) A Simple and Rapid System for DNA and RNA Isolation from Diverse Plants Using Handmade Kit Massa, A N., Arias, R S., Sorensen, R B., Sobolev, V S., Tallury, S P., Stalker, H T., & Lamb, M C (2021) Evaluation of Leaf Spot Resistance in Wild Arachis Species of Section Arachis, 48 (2), 68-75 56 Mehan, V K., Mayee, C D., & McDonald, D (1994) Management of Sclerotium rolfsii‐caused stem and pod rots of groundnut - a critical review, International Journal of Pest Management, 40:4, 313-320 Mondal, Suvendu; Badigannavar, A M (2015) Peanut rust (Puccinia arachidisSpeg.) disease: its background and recent accomplishments towards disease resistance breeding Protoplasma, 252(6), 1409–1420 NANA, T A., ZONGO, A., Fidegrave, B., & SANKARA, P (2022) Assessing the effects of Lecanicillium lecanii in the biological control of early and late leaf spot of peanut in vitro (Burkina Faso, West Africa) African Journal of Agricultural Research, 18(1), 1-7 Ordentlich, A., Elad, Y., & Chet, I (1988) The role of chitinase of Serratia marcescens in biocontrol of Sclerotium rolfsii Phytopathology, 78(1), 84-88 Ouhdouch, Y., Barakate, M., & Finance, C (2001) Actinomycetes of Moroccan habitats: isolation and screening for antifungal activities European Journal of Soil Biology, 37(2), 69-74 Paparu, P., Acur, A., Kato, F., Acam, C., Nakibuule, J., Nkuboye, A., & Mukankusi, C (2020) Morphological and pathogenic characterization of Sclerotium rolfsii, the causal agent of southern blight disease on common bean in Uganda Plant Disease, 104(8), 2130-2137 Qin, Z., Peng, K., Zhou, X., Liang, R., Zhou, Q., Chen, H., Hopwood, D A., Kieser, T., & Deng, Z (1994) Development of a gene cloning system for Streptomyces hygroscopicus subsp yingchengensis, a producer of three useful antifungal compounds, by elimination of three barriers to DNA transfer Journal of Bacteriology, 176(7), 2090–2095 Rao, A S., McDonald, D., Reddy, K R (1997) Effect of temperature on rust and late leaf spot disease development in groundnut J Oilseed Res 14:249– 255 Rathod, V., Hamid, R., Tomar, R S., Padhiyar, S., Kheni, J., Thirumalaisamy, P., & Munshi, N S (2020) Peanut (Arachis hypogaea) transcriptome revealed the molecular interactions of the defense mechanism in response to early leaf spot fungi (Cercospora arachidicola) Plant Gene, 23, 100243 xa, J B., Perry, K B., & Lumsden, R D (1991) Effect of solarization and Gliocladium virens on sclerotia of Sclerotium rolfsii, soil microbiota, and the incidence of southern blight of tomato Phytopathology, 81(10), 11171124 Shirling, E B., & Gottlieb, D (1966) Methods for characterization of streptomyces species’ International journal of systematic bacteriology, 16(3), 313–340 57 Sirisha, B., Haritha, R., Jaganmohan, Y S Y V., Sivakumar, K., & Ramana, T (2013) Bioactive compounds from marine actinomycetes isolated from the sediments of Bay of Bengal International Journal of Pharmaceutical, Chemical and Biological Sciences, 3(2), 256-264 Songvilay, P., Groenewald, J Z., Vongphachanh, P., Sayapattha, S., Chittarath, K., Crous, P W., & Burgess, L W (2013) First report of Sclerotium rolfsii in the Lao PDR Australasian Plant Disease Notes, 8(1), 13–15 Stach, J E M., & Bull, A T (2005) Estimating and comparing the diversity of marine actinobacteria Antonie van Leeuwenhoek, International Journal of General and Molecular Microbiology, 87(1), 3–9 Suthindhiran, K., Jayasri, M A., Dipali, D., & Prasar, A (2014) Screening and characterization of protease producing actinomycetes from marine saltern Journal of Basic Microbiology, 54(10), 1098–1109 Subrahmanyam, P & McDonald, D (1983) Rust disease of groundnut Information Bulletin, No 13, ICRISAT, India, pp 15 Thiessen, L D., & Woodward, J E (2012) Diseases of peanut caused by soilborne pathogens in the Southwestern United States International Scholarly Research Notices, 2012 Tresner, H D., & Backus, E J (1963) System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy Applied Microbiology, 11(4), 335–338 Tu, C C., & Kimbrough, J W (1978) Systematics and phylogeny of fungi in the Rhizoctonia complex Botanical Gazette, 139(4), 454-466 Ufuk B., Sebnem Y., Ferda G., Aysegul E (2001), ―An endo-1,4-xylanase from Rhizopus oryzae: production, partial purification and biochemical characterization‖, Journal of Applied Sciences Research, (9), pp 13731378 Veliz, E A., Martínez-Hidalgo, P., & Hirsch, A M (2017) Chitinase-producing bacteria and their role in biocontrol AIMS microbiology, 3(3), 689 Wibowo, R H., Sipriyadi, S., Mubarik, N R., Rusmana, I., & Suhartono, M T (2020) Isolation and Screening of Soil Chitinolytic Actinobacteria as the Anti-Fungal Producer of Plant Pathogens Elkawnie, 6(2), 273 Xu, M L., Yang, J G., Wang, F L., Wu, J X., & Chi, Y C (2015) First report of Rhizopus arrhizus (syn R oryzae) causing root rot of peanut in China Plant Disease, 99(10), 1448 Yanti, A H., Setyawati, T R., & Kurniatuhadi, R (2020) Composition and Characterization of Actinomycetes Isolated from Nipah Mangrove Sediment, Gastrointestinal and Fecal Pellets of Nipah Worm (Namalycastis Rhodhocorde) IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, 550(1) 58 You, J., Cao, L., Liu, G., Zhou, S., Tan, H., & Lin, Y (2005) Isolation and characterization of actinomycetes antagonistic to pathogenic Vibrio spp from nearshore marine sediments World Journal of Microbiology and Biotechnololy, (21), 679–682 Zhao, J., Xue, Q H., Shen, G H., Xue, L., Duan, J L., & Wang, D S (2012) Evaluation of Streptomyces spp for biocontrol of gummy stem blight (Didymella bryoniae) and growth promotion of Cucumis melo L Biocontrol Science and Technology, 22(1), 23–37 6.3 Tài liệu truy cập internet https://www.fao.org/faostat/en/?fbclid=IwAR1hqX3q2aGUC8NCv31a1IxjyOR PcW-cfC3geaPet2sjbaklYTs0fStRr_M#data/QCL https://www.fao.org/faostat/en/#compare) 59 PHỤ LỤC Thí nghiệm bổ sung dịch lọc chủng xạ khuẩn TB25 vào môi trƣờng PDA 1:4 1:10 NL1 NL2 NL3 60 ĐC KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ Sàng lọc đối kháng BALANCED ANOVA FOR VARIATE BK FILE PTDK4N 15/ 5/22 12:33 :PAGE Phan tram doi khang sau (%) VARIATE V003 BK LN Ban kinh tan nam (cm) SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 16.6450 3.32900 53.98 0.000 * RESIDUAL 12 740001 616668E-01 * TOTAL (CORRECTED) 17 17.3850 1.02265 BALANCED ANOVA FOR VARIATE PTDK FILE PTDK4N 15/ 5/22 12:33 :PAGE Phan tram doi khang sau (%) VARIATE V004 PTDK Phan tram doi khang (%) LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 4623.61 924.722 53.98 0.000 * RESIDUAL 12 205.556 17.1296 * TOTAL (CORRECTED) 17 4829.17 284.069 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE PTDK4N 15/ 5/22 12:33 :PAGE Phan tram doi khang sau (%) MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ TB12 TB14 TB16 TB23 TB25 DC NOS 3 3 3 BK 4.40000 5.23333 3.73333 3.70000 3.23333 6.00000 PTDK 26.6667 12.7778 37.7778 38.3333 46.1111 0.000000 SE(N= 3) 0.143372 2.38953 5%LSD 12DF 0.441779 7.36297 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PTDK4N 15/ 5/22 12:33 :PAGE Phan tram doi khang sau (%) F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE BK PTDK GRAND MEAN (N= 18) NO OBS 18 4.3833 18 26.944 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 1.0113 0.24833 5.7 0.0000 16.854 4.1388 15.4 0.0000 61 | | | | Thí nghiệm bổ sung dịch lọc chủng xạ khuẩn TB25 vào môi trƣờng nuôi cấy BALANCED ANOVA FOR VARIATE HN FILE BSDL 15/ 5/22 11:31 :PAGE Thi nghiem bo sung dich loc xa khuan VARIATE V003 HN LN So hinh hacnh non SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 24.0000 12.0000 36.00 0.001 * RESIDUAL 2.00000 333333 * TOTAL (CORRECTED) 26.0000 3.25000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HG FILE BSDL 15/ 5/22 11:31 :PAGE Thi nghiem bo sung dich loc xa khuan VARIATE V004 HG LN DF So hinh hach gia SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 20.6667 10.3333 18.60 0.003 * RESIDUAL 3.33333 555555 * TOTAL (CORRECTED) 24.0000 3.00000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOHACH FILE BSDL 15/ 5/22 11:31 :PAGE Thi nghiem bo sung dich loc xa khuan VARIATE V005 SOHACH So luong hach o moi cong thuc LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 417151 208575 ****** 0.000 * RESIDUAL 1135.92 189.319 * TOTAL (CORRECTED) 418287 52285.9 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BSDL 15/ 5/22 11:31 :PAGE Thi nghiem bo sung dich loc xa khuan MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ 1:4 1:10 DC NOS 3 HN 7.33333 5.33333 3.33333 HG 9.00000 7.66667 5.33333 SOHACH 261.333 320.333 744.667 SE(N= 3) 0.333333 0.430331 7.94395 5%LSD 6DF 1.15305 1.48858 27.4794 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BSDL 15/ 5/22 11:31 :PAGE Thi nghiem bo sung dich loc xa khuan F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE HN HG SOHACH GRAND MEAN (N= 9) NO OBS 5.3333 7.3333 442.11 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 1.8028 0.57735 10.8 0.0007 1.7321 0.74536 10.2 0.0032 228.66 13.759 3.1 0.0000 62 | | | | Trình tự nucleotide vùng gen IST chủng nấm ĐX4 >ĐX4 TGGACTCTCAAACAGGCTTGCCCCTCGAAATACCAAAGGGCCCAGGGGGCGTCCAAAAATCCAAT AATTCCCGGAATCCGGCATTTCCCTTAATTTATCCCTTTTCCCTGCTTCCTTCTTCAATGCAAAACCC AAAAAATCCGTGGTTGAAATTGGAATATTTTTAATTAAGAGAAACTTGTCAGAAAACAAAGTTTCA ATATGAAATCGTTCTATGTAACATACAATAAGAGTTATATAGGGTAATCATAGTTAGGATTTCTCCT GACTACAGTTGGTTCACAGGTGTATATATTATATAGCTCCAGAGTGTGCACATGCAATATTCATTAC CAGCACAACTCCTTCGCATATATGAATTCAATAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGGAAGGA TCATTATTGAATTCATATATGCGAAGGAGTTGTGCTGGTAATGAATATTGCATGTGCACACTCTGGA GCTATATAATATATACACCTGTGAACCAACTGTAGTCAGGAGAAAATCCTAACTATGATCACCCTA TATAACTCTTATTGTATGTTACATAGAAACGATTTTCATATTTGAAAACTTTTGTTTTTCTGACAAGT TTTCNNCTTAATTTAAAAATTNTACAACCTTTTTAACAACGGGNTTTCCTTGGGCCCCTTGCCTTCC ATTAAAAAAACCCCNNCCCAAATNCCCATAAAGTANNNTTGGAATTTCCCGAAATCCGGGGGAAT TCTTTCGAATTTTTTTAAACCCCCCCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTTTCGGGG 63