Phân lập, tuyển chọn và khảo sát một số đặc điểm của xạ khuẩn kháng nấm gây bệnh hại cây trồng (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA XẠ KHUẨN KHÁNG NẤM GÂY BỆNH HẠI CÂY TRỒNG Hà Nội - 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA XẠ KHUẨN KHÁNG NẤM GÂY BỆNH HẠI CÂY TRỒNG Họ tên : Đặng Thành Đạt Khoa : Công nghệ Sinh học Mã sinh viên : 620468 Lớp : K62CNSHA Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS Nguyễn Văn Giang HÀ NỘI – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khoá luận trung thực chưa sử dụng công bố Tôi xin cam đoan giúp dỡ cho việc thực khoá luận cảm ơn thơng tin trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 16 tháng 02 năm 2021 Sinh viên Đặng Thành Đạt ii LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực tập Bộ môn Công nghệ Vi sinh, quan tâm, giúp đỡ hướng dẫn tận tình thầy, giáo cán phịng thí nghiệm Bộ môn, với hỗ trợ bạn nhóm thân, tơi hồn thành khố luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo Khoa Công nghệ sinh học truyền đạt cho kiến thức vô quý báu kết hợp với tính thực tiễn cao trình học tập, rèn luyện Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Văn Giang tận tình hướng dẫn, truyền tải kiến thức, kinh nghiệm cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS TS Nguyễn Xuân Cảnh, Th.S Trần Thị Đào, Th.S Nguyễn Thanh Huyền, Th.S Trần Thị Hồng Hạnh tồn thể cán thuộc Bộ mơn Cơng nghệ vi sinh, Ban chủ nhiệm Khoa thầy, cô giáo Khoa Công nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực tập Tôi xin chân thành cảm ơn bạn Lê Thị Phương Anh, Đỗ Thị Thuỳ Giang, Đoàn Thị Đặng Hà, Hoàng Thị Liễu, Lê Thị Thanh Mai nhóm làm khố luận tận tình giúp đỡ, hỗ trợ tơi q trình thực đề tài Cuối cùng, với tất lịng kính trọng biết ơn vô hạn, xin gửi lời cảm ơn tới bố, mẹ, chị gái người thân động viên tạo động lực cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 16 tháng 02 năm 2021 Sinh viên Đặng Thành Đạt iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix TÓM TẮT x PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa thực tiễn khoa học đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan xạ khuẩn 2.1.1 Vị trí phân bố, vai trò xạ khuẩn 2.1.2 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 2.1.2 Đặc điểm sinh lý hoá xạ khuẩn 2.1.3 Khả sinh enzyme xạ khuẩn 2.2 Ứng dụng xạ khuẩn thực tiễn 2.2.1 Trong lĩnh vực nông nghiệp 2.2.2 Trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm 2.2.3 Trong lĩnh vực y học 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng xạ khuẩn 2.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 2.3.2 Ảnh hưởng pH 2.3.3 Ảnh hưởng nồng độ muối 2.3.4 Nguồn carbon 10 iv 2.4 Các bệnh thường gặp trồng nông nghiệp 10 2.5 Các biện pháp phòng trừ nấm bệnh gây hại trồng 11 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1 Vật liệu 12 3.1.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 12 3.1.2 Nguồn mẫu phân lập, sàng lọc 12 3.1.3 Nguồn mẫu nấm thử đối kháng 12 3.1.4 Hoá chất 12 3.1.5 Môi trường nuôi cấy 13 3.1.6 Dụng cụ thiết bị 14 3.2 Phương pháp nghiên cứu 14 3.2.1 Pháp pháp phân lập xạ khuẩn 14 3.2.2 Phương pháp đáng giá khả đối kháng nấm 15 3.2.3 Khảo sát đặc điểm sinh học 15 3.2.3.1 Đặc điểm hình thái 15 3.2.3.2 Đặc điểm sinh lý-hoá 16 3.2.3.3 Đặc điểm nuôi cấy 18 3.2.4 Bảo quản giống 18 PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 19 4.1 Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả đối kháng nấm 19 4.1.1 Phân lập hoạt hoá chủng xạ khuẩn 19 4.1.2 Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có khả đối kháng nấm 21 4.2 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn 22 4.2.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 22 4.2.2 Đặc điểm hình thái sợi khí sinh 23 4.3 Đặc điểm nuôi cấy chủng xạ khuẩn môi trường khác 24 4.4 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh trưởng chủng 4.4.1 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng xạ khuẩn 26 4.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng 27 v 4.4.3 Ảnh hưởng nồng độ muối 28 4.4.4 Ảnh hưởng nguồn carbon 31 4.4.5 Khả sinh enzyme ngoại bào 33 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC 42 vi DANH MỤC VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích nghĩa VKN Vịng kháng nấm XK Xạ khuẩn µl Microlit mm Milimet g Gam ml Mililit ISP International Streptomyces Project G+C Guanine + Cytosine KTCC Khuẩn ty chất KTKS Khuẩn ty khí sinh PDA Potato Dextrose Agar CMC Carboxymethyl cellulose vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Một số chủng nấm thử hoạt tính đối kháng 12 Bảng 3.2 Cơ chất thuốc thử số enzyme ngoại bào 17 Bảng 4.1 Các chủng xạ khuẩn phân lập từ mẫu đất hoạt hoá từ chủng giống môn Công nghệ vi sinh 19 Bảng 4.2 Phân bố xạ khuẩn phân lập theo nhóm màu 20 Bảng 4.3 Khả ức chế nấm Fusarium oxysporum Corynespora cassiicola chủng Tra XK3.1 22 Bảng 4.4 Đặc điểm hình thái chủng XK3.1 chủng Tra môi trường khác 25 Bảng 4.5 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng hai chủng xạ khuẩn Tra XK3.1 27 Bảng 4.6 Nhiệt độ thích hợp hai chủng xạ khuẩn XK3.1 Tra 28 Bảng 4.7 Nồng độ muối thích hợp chủng xạ khuẩn Tra XK3.1 30 Bảng 4.8 Ảnh hưởng nguồn carbon đến sinh trưởng chủng xạ khuẩn XK3.1 Tra 32 Bảng 4.9 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng xạ khuẩn Tra XK3.1 33 viii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sinh thái học xạ khuẩn Hình 2.2 Các loại khuẩn ty xạ khuẩn Hình 2.3 Một số dạng hình thái chuỗi bào tử xạ khuẩn Hình 4.1 Hình ảnh số chủng xạ khuẩn phân lập 19 Hình 4.2 Khả đối kháng chủng xạ khuẩn Tra với chủng nấm Corynespora cassiicola Fusarium oxysporum 21 Hình 4.3 Khả đối kháng chủng xạ khuẩn XK3.1 với chủng nấm Corynespora cassiicola Fusarium oxysporum 21 Hình 4.4 Hình thái khuẩn lạc chủng XK3.1 chủng Tra 22 Hình 4.5 Khuẩn ty khí sinh chủng xạ khuẩn XK3.1 chủng Tra 23 Hình 4.6 Chuỗi sinh bào chủng xạ khuẩn XK3.1 24 Hình 4.7 Cuống sinh bào tử chủng xạ khuẩn Tra 24 Hình 4.8 Khả sinh sắc tố melalin chủng XK3.1 chủng Tra 26 Hình 4.9 Khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn XK 3.1 nồng độ muối khác 29 Hình 4.10 Khả sinh trưởng chủng Tra nồng độ muối khác 30 Hình 4.11 Hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn XK3.1 Tra 33 ix 17 Mason M G., Ball A S., Reeder B J., Silkstone G., Nicholls P., Wilson M T (2001) Extracellular heme peroxidases in actinomycetes a case of mistaken identity Appl Environ Microbiol, 67, pp 4512-4519 18 Mustafa Oskay (2009) Antifungal and antibacterial compounds from Steptomyces strains African Jounal of Biotechnology, 13, pp 3007-3017 19 Muhammad AA, Mst NJ, Nigar S, Farhana R (2016) Effect of temperature, pH and NaCl on the isolates of actinomycetes from straw and compost samples from Savar, Dharka, Bangladesh American Journal of Microbiology and Immunology 1(2):10-15 20 Mariadhas Valan Arasu, Galal Ali Esmail and Naif Abdullah Al-Dhabi (2016) Hypersaline Actinomycetes and Their Biological Applications 21 Newman D J., Cragg G M., Sander K M (2003) Natural products as ourees of new drugs over the period J Nat Prod, 66, pp 1022-1037 22 Noha Gamaleldin M., Walid Bakeer, Ahmed Sayed M., Yara Shamikh I., Ahmed El-Gendy O., Hossam Hassan M., Hannes Horn, Usama Ramadan Abdelmohsen and Wael Hozzein N (2020) Exploration of Chemical Diversity and Antitrypanosomal Activity of Some Red Sea-Derived Actinomycetes Using the OSMAC Approach Supported by LC-MS-Based Metabolomics and Molecular Modelling 23 Nanjwade Basavaraj K, Chandrashekhara S, Ali Shamarez M, Prakash Goudanavar S and Fakirappa Manvi V (2010) Isolation and Morphological Characterization of Antibiotic Producing Actinomycetes Tropical Journal of Pharmaceutical Research June 2010; (3) pp 231-236 24 Pujari JD, Yakkundimath R, Byadgi AS (2015) Image processing based detection of fungal diseases in plant Procedia Comput Sci, 46, pp 18021808 25 Ploetz RC (2006) Fusarium with of banana is caused by several pathogens referred to as Fusarium oxysporum f sp cubense Phytopathology, 96, pp 653-656 40 26 Pavitra R., Raja A Dr (2020) Optimization of Conditions (Influence of Shaking, Static and pH) for Biodecolourization of Reactive Azo-based Textile Dye by Micromonospora sp 27 Robert, Nolan D., Thomas C (1998) Isolation and Screeming of Actinomycetes In Actinomycetes in Biotechnology, Academic Press, Lodon 28 Risikat Ahmed N., Sesan Soba M., Mercy Bamigboye O., Kamoldeen Ajijolakewu A (2020) Preliminary screening of selected soils in Ilorin, North-central Nigeria for antibiotic-producing actinomycetes Notulae Scientia Biologicae 12(1):143-153 29 Shirling E B., Gotilieb D (1996) Methods for characterization of Steptomycetes spectes International Journal of Systematic Bacterriology, Vol 16, No 3, pp 313-340 30 Someya N (2008) Biological control of fungal plant diseases using antagonistic bacteria J Gen Plant Pathol, 74, pp 459-460 31 Tresner H D., Backus E J (1963) System of color wheels for streptomycete taxomoxy Applied microbiology, 11(4), pp 335-338 32 Talwinder Kaur, Riveka Rani and Rajesh Kumari Manhas (2019) Biocontrol and plant growth promoting potential of phylogenetically new Streptomyces sp MR14 of rhizospheric origin 33 Zhiyin Yu, Chuanyu Han, Bing Yu, Junwei Zhao, Yijun Yan, Shengxiong Huang, Chongxi Liu and Wensheng Xiang (2020) Taxonomic Characterization, and Secondary Metabolite Analysis of Streptomyces triticiradicis sp nov.: A Novel Actinomycete with Antifungal Activity 41 PHỤ LỤC Phụ lục Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn môi trường Gause I STT 10 11 12 13 14 15 16 17 Ký hiệu chủng CB1.1 CB1.2 CB1.4 CB1.7 CB2.1 CB2.2 CB2.4 CB3.1 CB4.2 CB4.5 CB4.6 HD3.1 HD6.1 HD6.2 Mặt trước khuẩn lạc Mặt sau khuẩn lạc Màu trắng Màu trắng Màu trắng Màu nâu Màu trắng Màu trắng Màu trắng Màu trắng Màu trắng Màu trắng Mầu hồng Màu trắng Màu vàng Màu trắng HD6.3 HD6.4 HD7.1 Màu trắng, bề mặt xù xì Màu trắng, bề mặt xù xì Màu trắng, tâm trịn Màu nâu, bề mặt xù xì Màu trắng, viền trắng Màu trắng, bề mặt trơn Màu trắng, tâm lõm Màu trắng, bề mặt nhẵn Màu trắng xám, viền trắng Màu trắng, viền trắng Màu hồng, bề mặt Màu trắng, bề mặt trơn Màu vàng, bề mặt lồi Màu trắng, bề mặt xù xì Màu hồng, bề mặt xù xì, tâm nhỏ Màu trắng, bề mặt xù xì, tâm lồi Màu trắng, bề mặt nhẵn 18 HD7.2 Màu nâu xám, bề mặt nhẵn, tâm lồi Màu trắng 19 HD7.3 Màu trắng, tâm lồi, viền trắng Màu trắng 20 21 22 23 24 HD7.4 XK3.1 XK4.1 XK2.3 XK3.4 Màu trắng Màu xám Màu đỏ Màu trắng Màu đỏ 25 XK8.2 26 Tra Màu trắng, tâm lõm, rìa trắng Màu trắng xám, bề mặt xù xì Màu đỏ, tâm lồi, viền đỏ Màu trắng, viền trắng, bề mặt xù xì Mầu đỏ, viêm trắng, tâm nhỏ Màu nâu nhạt, viềm trắng, bề mặt nhắn Màu hồng, bề mặt xù xì, tâm lồi, viền hồng 42 Màu hồng Màu trắng Màu trắng Màu trắng Màu hồng Phụ lục Khả sinh sắc tố chủng tuyển chọn môi trường ISP Phục lục 2.1 Màu sắc chủng XK3.1 môi trường ISP (ISP 1- ISP 6) ISP ISP ISP ISP ISP ISP 43 Phục lục 2.2 Màu sắc chủng Tra môi trường ISP (ISP 1- ISP 6) ISP ISP ISP ISP ISP ISP 44 Phụ lục Các điều kiện ảnh hưởng đến khả sinh trưởng xạ khuẩn Phụ lục 3.1 Khả sinh trưởng chủng XK3.1 điều kiện pH khác XK3.1, pH XK3.1, pH XK3.1, pH XK3.1, pH XK3.1, pH XK3.1, pH XK3.1, pH 10 XK3.1, pH 11 XK3.1, pH 12 45 Phụ lục 3.2 Khả sinh trưởng chủng Tra điều kiện pH khác Tra, pH Tra, pH Tra, pH Tra, pH Tra, pH Tra, pH Tra, pH 10 Tra, pH 11 Tra, pH 12 46 Phục lục 3.3 Khả sinh trưởng chủng XK3.1 nguồn Carbon khác D-Glucose Galactose Fructose Maltose Dextrin Sorbiton Lactose Sucrose Mannitol Đối chứng (-) 47 Phục lục 3.4 Khả sinh trưởng chủng Tra nguồn Carbon khác D-Glucose Galactose Fructose Maltose Dextrin Sorbiton Mannitol Lactose Sucrose Đối chứng (-) 48 Phục lục 3.5 Khả chịu muối chủng XK3.1 nồng độ muối khác NaCl 0% NaCl 0.5% NaCl 1% NaCl 3% NaCl 5% NaCl 7% 49 Phục lục 3.6 Khả chịu muối chủng Tra nồng độ muối khác NaCl 0% NaCl 0.5% NaCl 1% NaCl 3% NaCl 5% NaCl 7% 50 Phục lục 3.7 Khả sinh trưởng chủng XK3.1 nhiệt độ khác 300C 37oC 40oC 50oC 51 Phục lục 3.8 Khả sinh trưởng chủng Tra nhiệt độ khác 30oC 37oC 40oC 50oC 52 Phụ lục Sàng lọc số chủng xạ khuẩn kháng nấm Corynespora cassiicola XK8.2 XK4.1 Tra XK2.3 XK3.1 XK3.4 53