Phân lập, tuyển chọn và khảo sát một số đặc điểm của chủng xạ khuẩn kháng vi khuẩn gây bệnh hại cây trồng (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN KHÁNG VI KHUẨN GÂY BỆNH HẠI CÂY TRỒNG Hà Nội, 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN KHÁNG VI KHUẨN GÂY BỆNH HẠI CÂY TRỒNG Sinh viên thực : LÊ THỊ THANH MAI Mã sinh viên : 620512 Lớp : K62-CNSHB Giáo viên hướng dẫn: PGS TS NGUYỄN VĂN GIANG Hà Nội, 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học độc lập riêng Các số liệu sử dụng khố luận tơi thu từ thí nghiệm nên có nguồn gốc rõ ràng Các kết chưa công bố nghiên cứu khác Các tài liệu trích dẫn khố luận nêu danh mục tài liệu tham khảo giúp đỡ cảm ơn Hà Nội, ngày 30 tháng 03 năm 2021 Sinh viên Lê Thị Thanh Mai i LỜI CẢM ƠN Với tình cảm chân thành lịng biết ơn sâu sắc, cho phép tơi gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám đốc, phịng, ban Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, Khoa Công nghệ Sinh học, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, thầy, tận tình giảng dạy tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu hồn thành khố luận Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến người hướng dẫn tôi: PGS.TS Nguyễn Văn Giang, người tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành khố luận Tơi xin chân thành cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh, ThS Trần Thị Đào, ThS Nguyễn Thanh Huyền, ThS Trần Thị Hồng Hạnh Nguyễn Thị Thu giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình nghiên cứu Cuối cùng, với tất lịng kính trọng biết ơn vô hạn, xin gửi lời cảm ơn đến bố, mẹ, ơng, bà, người thân tồn thể bạn bè giúp đỡ, động viên tạo động lực cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng 03 năm 2021 Sinh viên Lê Thị Thanh Mai ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi TÓM TẮT vii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa đề tài PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan xạ khuẩn 2.1.1 Giới thiệu xạ khuẩn 2.1.2 Cấu trúc xạ khuẩn 2.1.3 Môi trường sống xạ khuẩn 2.1.4 Ứng dụng nông nghiệp 2.2 Tổng quan vi sinh vật gây bệnh trồng 2.2.1 Tổng quan vi khuẩn gây bệnh 2.2.1.1 Giới thiệu vi khuẩn gây bệnh 2.2.1.2 Đặc điểm sinh học 2.2.1.3 Biện pháp phòng trừ 10 2.2.2 Tổng quan vi nấm gây bệnh 11 2.2.2.1 Tổng quan Fusarium oxysporum 12 2.2.2.2 Tác hại nấm Fusarium oxysporum 13 2.2.2.3 Biện pháp phòng trừ 14 PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Vật liệu nghiên cứu 16 3.1.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 16 3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 16 3.1.3 Hoá chất, dụng cụ thiết bị 16 i 3.1.4 Thành phần mơi trường thí nghiệm 17 3.2 Nội dung nghiên cứu 19 3.3 Phương pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Phân lập xạ khuẩn 19 3.3.2 Khảo sát khả kháng khuẩn chủng xạ khuẩn 19 3.3.3 Khảo sát khả kháng nấm chủng xạ khuẩn 20 3.3.4 Bảo quản giống 21 3.3.5 Khảo sát đặc điểm sinh học phân loại xạ khuẩn 21 3.3.5.1 Phân loại xạ khuẩn 21 3.3.5.2 Đặc điểm hình thái 21 3.3.5.3 Ảnh hưởng nhiệt độ, pH, nồng độ muối, nguồn carbon đến sinh trưởng khả kháng khuẩn 22 3.3.5.4 Khả sinh enzyme ngoại bào 23 3.3.6 Định danh chủng xạ khuẩn tuyển chọn 23 3.3.6.1 Tách chiết DNA 23 3.3.6.2 Khuếch đại trình tự DNA phản ứng PCR 24 3.3.6.3 Định danh chủng xạ khuẩn tuyển chọn phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA 25 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Phân lập 26 4.2 Khảo sát khả kháng khuẩn chủng xạ khuẩn 29 4.3 Nồng độ ức chế tối thiểu chủng CP1.3 32 4.4 Khảo sát khả kháng nấm chủng xạ khuẩn CP1.3 33 4.5 Đặc điểm sinh học 34 4.5.1 Đặc điểm hình thái 34 4.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ, pH, nồng độ muối, nguồn carbon đến sinh trưởng khả kháng khuẩn 37 4.5.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng kháng khuẩn 37 4.5.2.2 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng kháng khuẩn 39 4.5.2.3 Ảnh hưởng nồng độ muối đến khả sinh trưởng kháng khuẩn 44 4.5.3 Khả sinh enzyme ngoại bào 47 4.6 Định danh chủng xạ khuẩn CP1.3 49 4.6.1 Tách chiết DNA 49 ii 4.6.2 Khuếch đại trình tự 16S rRNA phản ứng PCR 50 4.6.3 Định danh phân tích phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA 50 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 5.1 Kết luận 53 5.2 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 63 iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT µl : Microliter CMC : Carboxymethyl cellulose Cs : Cộng DNA : Deoxyribonucleic acid HSCC : Hệ sợ chất HSKS : Hệ sợi khí sinh ISP : International Streptomyces Project LB : Luria – Bertani PDA : Potato dextrose agar RNA : Ribonucleic acid B sub : Bacillus subtilis C mic : Clavibacter michiganensis R sol : Rastonia solanacearum Xa1 : Xanthomonas axonopodis Xa2 : Xanthomonas sp iv DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Các chủng xạ khuẩn phân lập từ mẫu đất 26 Bảng 4.2 Phân bố xạ khuẩn theo nhóm màu 28 Bảng 4.3 Hoạt tính kháng khuẩn chủng xạ khuẩn CP1.3 31 Bảng 4.4 Đặc điểm hình thái chủng CP1.3 mơi trường khác 35 Bảng 4.5 Khả đồng hoá nguồn carbon chủng CP1.3 46 Bảng 4.6 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng xạ khuẩn CP1.3 47 Phụ lục Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn môi trường Gause I (sau ngày) 63 Phụ lục Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả kháng khuẩn chủng CP1.3 67 Phụ lục Ảnh hưởng pH đến khả kháng khuẩn chủng CP1.3 68 Phụ lục Ảnh hưởng nồng độ muối đến khả kháng khuẩn chủng CP1.3 69 v DANH MỤC HÌNH Hình 4.1 Hình ảnh khuẩn lạc số chủng phân lập 27 Hình 4.2 Hoạt tính đối kháng chủng CP1.3 với chủng vi khuẩn 30 Hình 4.3 Nồng độ ức chế tối thiểu chủng CP1.3 với chủng vi khuẩn 32 Hình 4.4 Biểu đồ thể nồng độ ức chế tối thiểu chủng xạ khuẩn CP1.3 33 Hình 4.5 Hoạt tính đối kháng chủng CP1.3 với nấm Fusarium oxysporum 34 Hình 4.6 Khả hình thành sắc tố melanin sau 7, 14 21 ngày chủng CP1.3 36 Hình 4.7 Hình ảnh chuỗi sinh bào tử chủng CP1.3 37 Hình 4.8 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng CP1.3 37 Hình 4.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả kháng khuẩn chủng CP1.3 38 Hình 4.10 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng chủng CP1.3 40 Hình 4.11 Ảnh hưởng pH đến khả kháng khuẩn sau ngày nuôi cấy chủng CP1.3 41 Hình 4.12 Ảnh hưởng pH đến khả kháng khuẩn sau ngày nuôi cấy chủng CP1.3 42 Hình 4.13 Ảnh hưởng pH đến khả kháng khuẩn sau ngày nuôi cấy chủng CP1.3 42 Hình 4.14 Ảnh hưởng pH đến khả kháng khuẩn sau ngày nuôi cấy chủng CP1.3 43 Hình 4.15 Ảnh hưởng nồng độ muối đến khả sinh trưởng chủng CP1.3 44 Hình 4.16 Ảnh hưởng nồng độ muối đến khả kháng khuẩn chủng CP1.3 45 Hình 4.17 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng xạ khuẩn CP1.3 48 Hình 4.18 Kết điện di DNA tổng số chủng CP1.3 49 Hình 4.19 Hình ảnh sản phẩm PCR khuếch đại với đoạn mồi thuộc vùng 16S rRNA chủng xạ khuẩn CP1.3 50 Hình 4.20 Xác định lồi chủng CP1.3 nhờ so sánh trình tự nucleotide GenBank 51 Hình 4.21 Cây phân loại dựa trình tự 16S rRNA chủng xạ khuẩn CP1.3 51 Phụ lục Đặc điểm hình thái chủng CP1.3 môi trường khác sau ngày nuôi cấy 66 Phụ lục Khả đồng hoá nguồn carbon chủng CP1.3 70 vi 13 Chisholm, S.T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B.J (2006) Host-microbe interactions: Shaping the evolution of the plant immune response Cell 124 pp 803-814 14 Dastager S.G., Wen-Jun Li, Dayanand A., Shu-Kun Tang, Xin-Peng Tian1 XiaoYang Zhi1, Li-Hua Xu1 and Cheng-Lin Jiang (2006) Seperation, identification and analysis of pigment (melanin) production in Streptomyces African Journal of Biotechnology Vol (8) pp 1131-1134 15 Davis, E.L., Hussey, R.S., Mitchum, M.G., Baum, T.J (2008) Parasitism proteins in nematode–plant interactions Current Opinion in Plant Biology 11 pp 360-366 16 Dhanasekaran D., N Thajuddin and A Panneerselvam (2012) Applications of Actinobacterial Fungicides in Agriculture and Medicine pp 29-54 17 Dong-sheng Wang, Quan-hong Xue, Yun-yan Ma, Xiao-li Wei, Jie Chen and Fei He (2014) Oligotrophy is Helpful for the Isolation of Bioactive Actinomycetes Indian J Microbiol Doi 10.1007/s12088-014-0444-1 18 Farah Ahmad, Iqbal Ahmad and M.S Khan (2006) Screening of free-living rhizospheric bacteria for their multiple plant growth promoting activities Microbiological Research 163 pp 173-181 19 Farhad Masoomi-Aladizgeh, Leila Jabbari, Reza Khayam Nekouei and Ali Aalami (2016) A Simple and Rapid System for DNA and RNA Isolation from Diverse Plants Using Handmade Kit Doi:10.1038/protex.2016.015 20 Ferial M Rashad, Hayam M Fathy, Ayatollah S El-Zayat and Ahlam M Elghonaimy (2015) Isolation and characterization of multifunctional Streptomyces species with antimicrobial, nematicidal and phytohormone activities from marine environments in Egypt Microbiological Research 175 pp 34-47 57 21 Gayathri P and Muralikrishnan V (2013) Isolation and characterization of Endophytic Actinomycetes from mangrove plant for antimicrobial activity pp 78-89 22 Gil-Jae Joo (2005) Purification and characterization of an extracellular chitinase from the antifungal biocontrol agent Streptomyces halstedii Biotechnology Letters (2005) 27 pp 1483–1486 23 Giraud T, Gladieux P and Gavrilets S (2010) Linking the emergence of fungal plant diseases with ecological speciation Trends Ecol Evol 25(7): pp 387-395 24 Girish Badrinath Mahajan and Lakshmi Balachandran (2012) Antibacterial agents from Actinomycetes - A Review Frontiers in Bioscience E4 pp 240-253 25 Goyer C and Beaulieu C (1997) Host range of streptomycetes strains causing common scab, Plant Dis 81: pp 901-904 26 Gulve1 R M and A M Deshmukh (2011) Enzymatic activity of actinomycetes isolated from marine sedimentes Recent Research in Science and Technology pp 80-83 27 Hasegawa S., A Meguro, M Shimizu, T Nishimura and H Kunoh (2006) Endophytic Actinomycetes and Their Interactions with Host Plants Actinomycetologica 20 pp 72-81 28 Hemant J Patil and Bhushan L Chaudhari (2016) Agricultural Implications of Actinomycetes pp 60-88 29 Iqbal Z, Khan MA and Sharif M (2018) An automated detection and classification of citrus plant diseases using image processing techniques: A review Comput Electron Agric.153: pp 12-32 30 Janaki T (2017) Enzymes From Actinomycetes – Review International Journal of ChemTech Research pp 176-182 31 Junwei Zhao, Liyuan Han, Mingying Yu, Peng Cao, Dongmei Li, Xiaowei Guo, Yongqiang Liu, Xiangjing Wang and Wensheng Xiang (2019) Characterization 58 of Streptomyces sporangiiformans sp nov., a Novel Soil Actinomycete with Antibacterial Activity against Ralstonia solanacearum pp 1-17 32 Kalakoutswl, V & Agre, N S (1973) Endospores of actinomycetes: dormancy and germination In The Actinomycetales: Characteristics and Practical Importance pp 79-95 33 Keser S., M.B Mutlu and K Güven (2009) Antimicrobial Effect of Halophilic Actinomycetes on Xanthomonas and Pseudomonas Tomato Disease Agents pp 401-404 34 Khalil and M.E (2019) Efficiency of trichoderma viride and bacillus subtilis as biocontrol agents against root rot caused by fusarium solani in tomato pp 507516 35 Lahdenpera ML and Simon E, Uoti J (1991) Mycostop- a novel biofungicide based on Streptomyces bacteria Biotic interactions and soil-borne diseases; proceedings of the 1st Conference of the European Foundation for Plant Pathology (Eds Beemster ABR, Bollen GJ, Gerlach M, Ruissen MA, Schippers B, Tempel RA) Elsevier, Amsterdam pp 258-263 36 Larsen, H (1986) Halophilic and halotolerant microorganism: an overview historical perspective FEMS Microbiol Biotechnol., 24 pp 2235-2241 37 Merriman PR, Price RD, Price KF (1974) The effect of inoculation of seed with antagonists of Rhizoctonia solani on the growth of the wheat Aust J Agric Res 25 pp 213-218 38 Mo Lekhak, Anjana Singh and Dwij Raj Bhatta (2018) Antibacterial and Antifungal Property of Actinomycetes Isolates from Soil and Water of Nepal pp 136-139 39 Mondal, K.K., Shanmugam, V (2013) Advancements in the diagnosis of bacterial plant pathogens: An overview Biotechnology and Molecular Biology Review 8(1): pp 1-11 59 40 Mounyr Balouiri, Moulay Sadiki and Saad Koraichi Ibnsouda (2015) Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review Doi: 10.1016/j.jpha.2015.11.005 41 Mukesh Sharma, Pinki Dangi and Meenakshi Choudhary (2014) Actinomycetes: Source, Identification, and Their Applications Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci 3(2) pp 801-832 42 Mustafa Oskay, A Üsame Tamer and Cem Azeri (2004) Antibacterial activity of some actinomycetes isolated from farming soils of Turkey African Journal of Biotechnology Vol (9) pp 441-446 43 Naif Abdullah Al-Dhabi, Galal Ali Esmail, Abdul-Kareem Mohammed Ghilan and Mariadhas Valan Arasu (2019) Isolation and screening of Streptomyces sp Al-Dhabi-49 from the environment of Saudi Arabia with concomitant production of lipase and protease in submerged fermentation Saudi Journal of Biological Sciences 27 pp 474–479 44 Nanjwade Basavaraj K, S Chandrashekhara, Ali M Shamarez, Prakash S Goudanavar and Fakirappa V Manvi (2010) Isolation and Morphological Characterization of Antibiotic Producing Actinomycetes Tropical Journal of Pharmaceutical Research June 2010; (3) pp 231-236 45 Praveen Kumar P., J.P Preetam Raj, I.V.S Nimal Christhudas, R Sagaya Jansi, N Murugan, P Agastian, C Arunachalam and Sulaiman Ali Alharbi (2015) Screening of Actinomycetes for Enzyme and Antimicrobial Activities from the Soil Sediments of Northern Tamil Nadu, South India Journal of Biologically Active Products from Nature, doi: 10.1080/22311866.2015.1009385 46 Ralph Dean, Jan A L Van Kan, Zacharias A Pretorius, Kim E HammondKosack, Antonio Di Pietro, Pietro D Spanu, Jason J Rudd, Marty Dickman, Regine Kahmann, Jeff Ellis and Gary D Foster (2012) The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology Molecular plant pathology 13(4) pp 414-430 60 47 Ralph Dean, Jan A L Van Kan, Zacharias A Pretorius, Kim E HammondKosack, Antonio Di Pietro, Pietro D Spanu, Jason J Rudd, Marty Dickman, Regine Kahmann, Jeff Ellis and Gary D Foster (2012) The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology Molecular plant pathology 13(4) pp 414-430 48 Samuel M M Prudence, Emily Addington, Laia Castaño-Espriu, David R Mark, Linamaría Pintor-Escobar, Alicia H Russell and Thomas C McLean (2020) Advances in actinomycete research: an ActinoBase review of 2019 pp 683-694 49 Shimada S., T Nishimiya and K Watanabe (2019) Jpn J Phytopathol pp 108-111 50 Shirling E B and Gottlieb D (1966) International journal of systematic bacteriology pp 313-340 51 Singh L.S., S Mazumder and T.C Bora (2009) Optimisation of process parameters for growth and bioactive metabolite produced by a salt-tolerant and alkaliphilic actinomycete, Streptomyces tanashiensis strain A2D Journal de Mycologie Médicale 19 pp 225-233 52 Solanki R, Khanna M and Lal R (2008) Bioactive compounds from marine actinomycetes Indian J Microbiol 48 pp 410-431 53 Sudha Kalyani B., P.S Krishna and K Sreenivasuluc (2019) Screening and identification of novel isolate Streptomyces sp., NLKPB45 from Nellore costal region for its biomedical applications 26(7) pp 1655-1660 54 Suzuki S, Yamamoto K, Okuda T, Nishio M, Nakanishi N and Komatsubara S (2000) Selective isolation and distribution of Actinomadura rugatobispora strains in soil Actinomycetologica 14 pp 27-33 55 Tresner H D and Backus E J (1963) System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy pp 335-338 56 Tresner H D and Jean A Hayes (1971) Sodium Chloride Tolerance of Terrestrial Fungi Applied microbiology, Aug pp 210-213 61 57 Tsutomu Arie (2019) Fusarium diseases of cultivated plants, control, diagnosis, and molecular and genetic studies pp 275-281 58 Valois D, Fayad K, Barasubiye T, Garon T, Dery C, Brzezinski R, Beaulieu C (1996) Glucanolytic actinomycetes antagonistic to Phytophthora fragariae var rubi, the causal agent of raspberry root rot Appl Environ Microbiol 62 pp 1630-1635 59 Velu Rajesh Kannan, Kubilay Kurtulus Bastas, and Robert Antony (2015) Plant Pathogenic Bacteria: An Overview pp 1-15 60 Ventura, M.; Canchaya, C.; Tauch, A.; Chandra, G.; Fitzgerald, G.F.; Chater, K.F.; van Sinderen (2007) Genomics of Actinobacteria: Tracing the evolutionary history of an ancient phylum Microbiol Mol Biol Rev., 71 pp 495-548 61 Vijay Kumar, Alpana Bharti, Yogesh Kumar Negi, Omprakash Gusain, Piyush Pandey and Gajraj Singh Bisht (2012) Screening of actinomycetes from earthworm castings for their antimicrobial activity and industrial enzymes Brazilian Journal of Microbiology pp 205-214 62 Vimal V., Benita Mercy Rajan and K Kannabiran (2009) Antimicrobial Activity of Marine Actinomycete, Nocardiopsis sp VITSVK (FJ973467) Asian Journal of Medical Sciences 1(2) pp 57-63 63 Yin SY, Chang JK and Xun PC (1965) Studies in the mechanisms of antagonistic fertilizer ‘‘5406.’’ IV The distribution of the antagonist in soil and its influence on the rhizosphere Acta Microbiol Sin 11 pp 259-288 62 PHỤ LỤC Phụ lục Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn môi trường Gause I (sau ngày) STT Ký hiệu Mặt trước khuẩn lạc chủng CP1.1 Màu trắng có tia, tâm nhơ màu trắng CP1.2 Màu trắng bề mặt lõm, tâm nhô màu trắng CP1.3 Màu trắng bề mặt lõm, tâm nhô màu trắng CP1.4 Màu xám, viền trắng CP2 Màu nâu bề mặt lõm, tâm nhô màu trắng CP3 Màu trắng, bề mặt xù xì CP4 Màu xám, tâm nhơ màu xám đậm CP5.1 Màu trắng, có tia, tâm màu trắng đục CP5.2 Màu trắng đục, nhô cao 10 CP5.3 Màu trắng, có tia 11 CP5.4 Màu trắng, bề mặt dạng vôi 12 CP6.1 Màu trắng, tâm lõm màu vàng 13 CP6.2 Màu vàng viền trắng, tâm nhô 14 CP6.3 Màu vàng bề mặt lồi, bề mặt nhẵn 15 CP6.4 Màu trắng tâm nhô, bề mặt nhẵn 16 CP6.5 Màu trắng, bề mặt xù xì 17 CP6.6 Màu trắng, bề mặt có hạt 18 CP6.7 Màu xanh dương, bề mặt xù xì 19 CP7 Màu nâu, bề mặt nhô cao màu vàng 20 CP8 Màu trắng, bề mặt nhô cao 21 CP9.1 Màu vàng, viền trắng 22 CP9.2 Màu trắng tâm nhô, bề mặt lõm 23 CP9.3 Màu trắng tâm nhơ, bề mặt xù xì 63 Mặt sau khuẩn lạc Sắc tố Màu trắng - Màu tím - Màu vàng Vàng Màu vàng Màu nâu Vàng - Màu trắng Màu xám - Màu vàng - Màu trắng Màu trắng Màu trắng Màu nâu Màu nâu Màu nâu - Màu trắng - Màu trắng Màu trắng Màu nâu Màu nâu Nâu - Màu trắng Màu vàng Màu trắng Màu trắng - 24 25 CP10.1 CP10.2 26 27 CP10.3 CP10.4 28 29 30 31 32 33 34 CP11.1 CP11.2 CP11.3 CP11.4 CP11.5 CP11.6 CP11.7 35 36 CP11.8 CP11.9 37 38 CP12.1 CP12.2 39 ĐK1 40 41 42 ĐK2.1 ĐK2.2 ĐK2.3 43 44 45 46 47 ĐK2.4 ĐK2.5 ĐK2.6 ĐK2.7 ĐK3.1 48 ĐK3.2 49 ĐK3.3 50 51 ĐK3.4 ĐK4.1 Màu vàng, bề mặt lõm Màu trắng tâm nhô, viền dạng tia Màu trắng, tâm nhô trắng đục Màu trắng, tâm trắng đục, dạng tia Màu xám, tâm nhô màu trắng Màu trắng, bề mặt dạng vôi Màu xanh lá, tâm màu đậm Màu nâu viền trắng, dạng tia Màu trắng, bề mặt nhô cao Màu đỏ, tâm nhô Màu trắng dạng tia, bề mặt sần sùi Màu xám, bề mặt dạng nhung Màu trắng, tâm nhô màu hồng, viền dạng tia Màu trắng, bề mặt nhô cao Màu trắng sữa, tâm nhô trắng đục Màu xám viền trắng, bề mặt xù xì Màu trắng, tâm dạng tia Màu trắng, bề mặt nhô cao Màu cam viền trắng, tâm nhô, dạng tia Màu cam, dạng tia Màu xám, bề mặt xù xì Màu trắng, bề mặt có hạt Màu trắng, tâm nhơ Màu xám, tâm có hạt, bề mặt dạng nhung Màu trắng, bề mặt lõm, tâm nhô, viền dạng tia Màu hồng, bề mặt lõm, tâm nhô, viền dạng tia Màu trắng, tâm nhô Màu xám, tâm nhô, bề mặt xù xì 64 Màu vàng Màu trắng - Màu trắng Màu trắng - Màu trắng Màu trắng Màu xanh Màu nâu Màu trắng Màu đỏ Màu trắng - Màu nâu Màu hồng - Màu trắng Màu trắng - Màu xám - Màu trắng Màu vàng Màu cam - Màu cam Màu xám Màu trắng Màu trắng Màu xám - Màu trắng - Màu hồng - Màu trắng Màu xám - 52 53 54 ĐK4.2 ĐK5 ĐK6.1 55 56 57 ĐK6.2 ĐK6.3 TH1 58 TH2.1 59 60 61 TH2.2 TH2.3 TH2.4 62 TH2.5 63 TN1 64 65 66 TN2.1 TN2.2 TN2.3 67 68 TN2.4 TN2.5 69 TN2.6 70 71 TN2.7 TN3.1 72 TN3.2 Màu xám, bề mặt xù xì Màu hồng, bề mặt nhơ cao Màu xám viền trắng, bề mặt xù xì Màu trắng nhạt, tâm nhơ Màu nâu, tâm nâu đậm Màu xám viền trắng, bề mặt xù xì Màu trắng, tâm nhơ, viền dạng tia Màu vàng, dạng tia Màu cam, tâm nhô màu trắng Màu xám viền trắng, bề mặt nhơ cao xù xì Màu xám viền trắng, tâm nhơ, bề mặt xù xì Màu xám viền đen, bề mặt xù xì Màu trắng, dạng tia Màu trắng nhạt, dạng tia Màu trắng, tâm nhô trắng đục, dạng tia Màu xám, bề mặt nhô cao xù xì Màu xám, tâm nhơ màu trắng, bề mặt xù xì Màu vàng, tâm nhơ màu trắng, dạng tia Màu xám tâm đen, bề mặt xù xì Màu nâu, bề mặt nhô cao màu trắng, viền dạng tia Màu trắng, bề mặt lõm, tâm nhô Ghi chú: (-) Không sinh sắc tố 65 Màu xám Màu hồng Màu xám - Màu trắng Màu nâu Màu xám - Màu trắng - Màu vàng Màu cam Màu xám - Màu xám - Màu xám - Màu trắng Màu trắng Màu vàng - Màu xám Màu xám - Màu vàng - Màu nâu Màu nâu - Màu trắng - Phụ lục Đặc điểm hình thái chủng CP1.3 môi trường khác sau ngày nuôi cấy Gause I Gause II ISP1 ISP2 ISP3 ISP4 ISP5 ISP6 ISP7 66 Phụ lục Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả kháng khuẩn chủng CP1.3 Ngày Nhiệt độ (℃) Chủng Xa1 Ra Cla Xa2 Ba Xa1 Ra Cla Xa2 Ba Xa1 Ra Cla Xa2 Ba Xa1 Ra Cla Xa2 Ba 30 12 11 10 13 13 11 11 11 13 13 11 11 10 67 37 11 5 10 11 8 10 11 11 8 10 45 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Phụ lục Ảnh hưởng pH đến khả kháng khuẩn chủng CP1.3 Ngày pH Chủng Xa1 Ra Cla Xa2 Ba Xa1 Ra Cla Xa2 Ba Xa1 Ra Cla Xa2 Ba Xa1 Ra Cla Xa2 Ba 8 10 10 10 10 12 10 10 11 10 10 8 10 11 10 11.5 9 10 13 13 10 11 10 9 10 14 13 13 11 10 10 10 12 12 7 13 10 10 12 9 13 13 13 10.5 10 10 13 13 68 13 10 10 10 12 8 12 11 13.5 11 10 10 8 11 13 12 12.5 10 10 10 3 8 10 11 11 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 10 8 0 13 12 10 0 11 11 0 0 Phụ lục Ảnh hưởng nồng độ muối đến khả kháng khuẩn chủng CP1.3 Ngày Chủng Xa1 Ra Cla Xa2 Ba Xa1 Ra Cla Xa2 Ba Xa1 Ra Cla Xa2 Ba Xa1 Ra Cla Xa2 Ba 0% 11 13 10 12 7.5 11 13 10 14 11 11 11 11 11 0.5% 11 7 11 10 11.5 14 13 16 11 12 12 12 12 Nồng độ muối (%) 1% 3% 5% 0 0 0 0 0 0 12 0 11 0 0 0 12 0 15 0 13 0 15 0 0 15 0 12 0 0 13 0 13 0 69 7% 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9% 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Phụ lục Khả đồng hoá nguồn cacbon chủng CP1.3 ĐC (-) D-galactose ĐC (+) D-glucose L-arabinose Maltose Dextrin D-sorbitol D-xylose L-rhamnose D-fructose Phụ lục Kết giải trình tự đoạn gen 16S rARN chủng CP1.3 CCCCTTACGGGTTAGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCGTGAC GTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCATG CTGATCTGCGATTACTAGCAACTCCAACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGA CCCCAATCCGAACTGAGGCCGGCTTTTTGGGATTCGCTCCGCCTCGCGG CATCGCAGCCCTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGCAGCCCAAGAC ATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGAC CCCGGCAGTCTCCTGTGAGTCCCCGACATTACTCGCTGGCAACACAGAA CAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGA GCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATACCGACCACAAGGGGGCACC TATCTCTAGGTGTTTCCGGCATATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGC GTTGCGTCGAATTAAGCCACATGCTCCGCTGCTTGTGCGGGCCCCCGTC AATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGAACT TAATGCGTTAGCTGCGGCACCGACGACGTGGAATGTCGCCAACACCTA GTTCCCAACGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGC 70 TCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAATGGCCCAGAGATCCGCCT TCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAG GAATTCCGATCTCCCCTACCACACTCTAGCCTGCCCGTATCGAATGCAG ACCCGGGGTTAAGCCCCGGGCTTTCACATCCGACGCGACAGGCCGCCT ACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTCGCACCCTACGTA TTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCAGGTAC CGTCACTTGCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGAAGGTTTACAACCCGAAGGC CGTCATCCCTCAGGCGGGGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGGGGC AATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGGCCGGGTCTTAGT CCCCAGGGTGGCCGG 71