Phân lập, tuyển chọn chủng xạ khuẩn đối kháng nấm colletotrichum gloeosporioides từ đất vùng rễ nha đam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -� - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG XẠ KHUẨN ĐỐI KHÁNG NẤM COLLETOTRICHUM GLOEOSPORIOIDES TỪ ĐẤT VÙNG RỄ NHA ĐAM Họ tên : Nguyễn Thị Phƣợng Mã sinh viên : 637350 Lớp : K63CNSHD Giảng viên hƣớng dẫn : ThS Trần Thị Hồng Hạnh Hà Nội 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nghiên cứu riêng Các số liệu, kết trung thực chƣa công bố nghiên cứu khác Hà nội, ngày 16 tháng 05 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Phƣợng i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến cô giáo ThS Trần Thị Hồng Hạnh tận tình giúp đỡ em trình thực hoàn thành nghiên cứu Xin cảm ơn thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học trƣờng Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam tạo nhiều điều kiện để em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Xin cảm ơn gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ suốt q trình làm khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Phƣợng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii TÓM TẮT ix CHƢƠNG 1.MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa thực tiễn khoa học đề tài 1.3.1.Ý nghĩa khoa học 1.3.2.Ý nghĩa thực tiễn CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cây Nha đam 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Đặc điểm sinh học 2.1.3 Thành phần dinh dƣỡng 2.1.4 Một số ứng dụng Nha Đam 2.2 Một số sâu bệnh hại nha đam 2.3 Tổng quan nấm Colletotrichum gloeosporioides 2.3.1 Giới thiệu nấm 2.3.2 Đặc điểm sinh học 10 2.3.3 Cơ chế lây nhiễm 10 2.4 Tổng quan xạ khuẩn 11 2.4.1 Xạ khuẩn 11 2.4.2.Đặc điểm xạ khuẩn 12 iii 2.4.3 Vai trò xạ khuẩn 14 2.5 Tổng quan tình hình nghiên cứu xạ khuẩn đối kháng với nấm bệnh trồng 15 2.5.1 Ở nƣớc 15 2.5.2 Ở nƣớc 17 2.6 Kiểm soát bệnh hại biện pháp sinh học 18 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu, thời gian địa điểm nghiên cứu 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 3.1.3 Nội dung nghiên cứu 3.1.4 Dụng cụ, thiết bị hóa chất nghiên cứu 3.1.5.Môi trƣờng phân lập nghiên cứu xạ khuẩn 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 3.2.2 Phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn 3.2.3 Sàng lọc chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với nấm 3.3 Khảo sát đặc điểm xạ khuẩn phân lập có khả đối kháng nấm gây bệnh 3.3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 3.3.2 Đặc điểm hình thái chuỗi sinh bào tử 3.3.3 Khả hình thành sắc tố Melanin 3.4 Ảnh hƣởng số yếu tố đến khả sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả sinh trưởng 3.4.2 Ảnh hưởng pH tới khả sinh trưởng 3.4.3 Ảnh hưởng nồng độ muối( NaCl) tới khả sinh trưởng iv 3.4.4 Khả đồng hóa nguồn cacbon khác 3.4.5 Khả đồng hóa nguồn Nitơ khác 3.4.6 Ảnh hưởng môi trường đến khả tổng hợp chất kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides 3.4.7 Đánh giá khả sinh enzyme ngoại bào xạ khuẩn CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Phân lập tuyển chọn tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả đối kháng nấm 4.1.1 Phân lập chủng xạ khuẩn từ đất vùng rễ nha đam 4.1.2 Xác định khả đối kháng xạ khuẩn với nấm Colletotrichum gloeosporioides 10 4.2 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn 11 4.2.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 11 4.2.2 Đặc điểm hình thái sợi khí sinh 13 4.4 Ảnh hƣởng số yếu tố đến khả sinh trƣởng chủng xạ khuẩn Đ9 Đ11 14 4.4.1 Ảnh hƣởng pH đến khả sinh trƣởng xạ khuẩn 15 4.4.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh trƣởng xạ khuẩn 16 4.4.3 Ảnh hƣởng nồng độ muối đến khả sinh trƣởng xạ khuẩn 18 4.4.4 Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến sinh trƣởng xạ khuẩn 19 4.4.5 Ảnh nguồn Nitơ đến khả sinh trƣởng xạ khuẩn 22 4.4.6 Khả sinh enzyme ngoại bào 24 4.4.7 Ảnh hƣởng môi trƣờng đến khả đối kháng nấm 25 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 27 5.1 Kết luận 27 5.2 Kiến nghị 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 PHỤ LỤC 34 v DANH MỤC VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích nghĩa XK Xạ khuẩn µl Microlit Mm Milimet ISP International Streptomyces Project PDA Potato Dextrose Agar CMC Carboxymethyl cellulose KTCC Khuẩn ty chất KTKS Khuẩn ty khí sinh vi DANH MỤC BẢNG Bảng Các chủng xạ khuẩn phân lập từ mẫu đất Bảng Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn Đ9 Đ11 môi trƣờng khác 12 Bảng 4 Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng xạ khuẩn Đ9 Đ11 15 Bảng Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng hai chủng xạ khuẩn Đ9 Đ11 17 Bảng Nồng độ muối thích hợp hai chủng xạ khuẩn Đ9 Đ11 19 Bảng Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến sinh trƣởng hai chủng xạ khuẩn Đ9 Đ11 20 Bảng Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh trƣởng hai chủng xạ khuẩn Đ9 Đ11 22 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cây nha đam Hình 2: Triệu chứng số bệnh nấm Colletotrichum gây số loại trồng Hình 3: Một số khu vực sinh sống xạ khuẩn 12 Hình : Một số dạng chuỗi bào tử xạ khuẩn 14 Hình 5: Vịng đời phát triển Streptomyces 14 Hình 1: Hình ảnh số chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc Bảng Phân bố xạ khuẩn theo nhóm mà 10 Hình 2: Khả đối kháng hai chủng xạ khuẩn với nấm Colletotrichum gloeosporioides 10 Hình 3: Hình thái khuẩn lạc chủng xạ khuẩn Đ9 Đ11 11 Hình 4: Khuẩn ty khí sinh chủng xạ khuẩn Đ9 Đ11 13 Hình 5: Cuống sinh bào tử chủng xạ khuẩn Đ9 Đ11 13 Hình 6: Khả sinh sắc tố melanin chủng xạ khuẩn Đ11 14 Hình 7: Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng xạ khuẩn Đ9 Đ11 16 Hình 8: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng xạ khuẩn Đ9 Đ11 17 Hình 9:Ảnh hƣởng nồng độ muối đến sinh trƣởng xạ khuẩn Đ9 Đ11 18 Hình 10: Khả đồng hóa nguồn cacbon khác chủng xạ khuẩn Đ9 Đ11 20 Hình 11: Khả đồng hóa nguồn nitơ khác xạ khuẩn Đ9 Đ11 23 Hình 12: Hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn Đ9 24 Hình 13: Khả đối kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides xạ khuẩn Đ9 môi trƣờng ISP 25 viii TÓM TẮT Với mục đích nghiên cứu tuyển chọn đƣợc chủng xạ khuẩn đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thƣ nha đam, tiến hành phân lập chủng xạ khuẩn từ mẫu đất vùng rễ nha đam địa điểm khác Kết sau phân lập thu đƣợc 28 chủng xạ khuẩn, có chủng xạ khuẩn Đ9 Đ11 có khả đối kháng mạnh Kết khảo sát đánh giá đặc điểm sinh học hai chủng xạ khuẩn Đ9 Đ11 cho thấy chúng sinh trƣởng tốt nhiệt độ 30℃, pH dao động từ pH đến pH 10 Và hai chủng xạ khuẩn có khả chịu nồng độ muối lên đến 3% Tuy nhiên chủng xạ khuẩn Đ9 có khả chịu nồng độ muối tới 5% Hai chủng xạ khuẩn Đ9 Đ11 có khả đồng hóa nguồn đƣờng Dglucose, sucrose, maltose, fructose, lactose, detrin, tinh bột, hai xạ khuẩn Đ9 Đ11 khơng có khả đồng hóa nguồn carbon D-xylose Xạ khuẩn Đ9 Đ11 khả đồng hóa nhiều nguồn nitơ khác nhƣ cao thịt, NH4NO3, KNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl, peptone, ure Chủng xạ khuẩn Đ9 có khả sử dụng tốt nguồn nitơ cao thịt, peptone, KNO3 Chủng xạ khuẩn Đ11 có khả sử dụng tốt nguồn nitơ KNO3, NaNO3 Chủng xạ khuẩn Đ9 có khả sinh enzyme ngoại bào cellulase amylase Chủng xạ khuẩn Đ11 có khả sinh sắc tố melanin môi trƣờng ISP Chủng xạ khuẩn Đ9 nuôi môi trƣờng khác cho thấy mơi trƣờng ISP có khả đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides ix 38 39 Phụ lục 3: Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng xạ khuẩn Đ9 40 Phụ lục 4: Ảnh hƣởng p H đến sinh trƣởng chủng xạ khuẩn Đ11 41 Phụ lục 5: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng xạ khuẩn Đ9 42 Phụ lục 6: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng xạ khuẩn Đ11 43 Phụ lục 7: Ảnh hƣởng nồng độ muối đến sinh trƣởng xạ khuẩn Đ9 44 Phụ lục 7: Ảnh hƣởng nồng độ muối đến khả sinh trƣởng xạ khuẩn Đ11 NaCl 0% NaCl 1% NaCl 3% NaCl 5% NaCl 7% 45 Phụ lục 8: Ảnh hƣởng nguồn đƣờng khác đến sinh trƣởng xạ khuẩn Đ9 Đối chứng âm 46 Phụ lục 9: Ảnh hƣởng nguồn đƣờng khác đến sinh trƣởng xạ khuẩn Đ11 47 Phụ lục 10: Ảnh hƣởng nguồn Nitơ đến sinh trƣởng xạ khuẩn Đ9 48 Phụ lục 11: Ảnh hƣởng nguồn Nitơ đến sinh trƣởng xạ khuẩn Đ11 49 Phụ lục 12: Đặc điểm hình thái xạ khuẩn Đ9 hệ thống môi trƣờng ISP ISP ISP ISP ISP ISP 50 ISP ISP Phụ lục 13: Đặc điểm hình thái xạ khuẩn Đ11 hệ thống môi trƣờng ISP ISP ISP ISP ISP ISP 51 ISP ISP Phụ lục 14: Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi lỏng xạ khuẩn Đ9 52