Phân lập, tuyển chọn các chủng bacillus thuringiensis có khả năng trừ sâu hại rau ăn lá

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS CÓ KHẢ NĂNG TRỪ SÂU HẠI RAU ĂN LÁ Hà Nội, 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS CÓ KHẢ NĂNG TRỪ SÂU HẠI RAU ĂN LÁ Người thực : Phạm Thanh Bình Khóa : 62 Khoa : Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn : PGS TS Nguyễn Đức Bách Khoa CNSH – HVNNVN Cán đồng hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Hồng Minh Bộ môn CNVS – VDTNNVN Địa điểm thực : Viện Di Truyền Nông Nghiệp - AGI Hà Nội, 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu trình bày khóa luận trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ để lấy học vị Đồng thời, xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận cảm ơn, thơng tin trích dẫn khóa luận rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng 07 năm 2022 Sinh viên Phạm Thanh Bình i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, trước hết cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới: TS Phạm Thị Lý Thu tạo điều kiện thuận lợi nhất, đưa cho lời động viên, quan tâm, quan sát tơi q trình thực khố luận tốt nghiệp để giúp tơi hồn thiện kỹ khố luận tốt nghiệp ThS Nguyễn Thị Hồng Minh hướng dẫn chi tiết, tận tình kỹ thuật, đưa lời khun, góp ý để tơi sáng tỏ Bên cạnh đó, đưa lời khun hữu ích, giúp tơi hồn thiện kỹ phịng thí nghiệm PGS TS Nguyễn Đức Bách hướng dẫn, giúp đỡ, động viên kịp thời phân tích, góp ý, chỉnh sửa sai sót tơi suốt q trình thực khố luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn đến Ban Giám đốc Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam; Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam; thầy cô anh chị khoa Công nghệ sinh học – VNUA môn Công nghệ vi sinh - AGI, người giảng dạy, chia sẻ kinh nghiệm giúp đỡ cho tơi q trình học tập thực khố luận tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình người thân bạn bè động viên, giúp đỡ, tạo động lực cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu q trình thực khố luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày tháng 07 năm 2022 Sinh viên Phạm Thanh Bìn ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ vii DANH MỤC HÌNH viii TÓM TẮT .ix PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích đề tài 1.2.2 Yêu cầu đề tài PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cương Bacillus thuringiensis 2.1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis 2.1.2 Đặc điểm hình thái Bacillus thuringiensis 2.1.3 Đặc điểm sinh hoá Bacillus thuringiensis 2.1.4 Đặc điểm phân loại Bacillus thuringiensis 2.2 Cơ chế diệt sâu Bacillus thuringiensis 2.2.1 Độc tính Bacillus thuringiensis 2.2.2 Cơ chế gây độc Bacillus thuringiensis 2.3 Cơ sở tiêu tuyển chọn Bacillus thuringiensis PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.2 Hoá chất, thiết bị nghiên cứu 3.1.3 Môi trường sử dụng 3.2 Phương pháp nghiên cứu 10 3.2.1 Phương pháp phân lập Bacillus thuringiensis 10 iii 3.2.2 Khảo sát khả diệt trừ sâu hại Bacillus thuringiensis tuyển chọn 12 3.2.3 Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu Bacillus thuringiensis 13 3.2.4 Khảo sát khả phân giải chitin Bacillus thuringiensis 13 3.2.5 Phương pháp định danh chủng Bacillus thuringiensis thị phân tử .14 PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .17 4.1 Kết phân lập tuyển chọn chủng Bacillus thuringiensis 17 4.1.1 Kết phân lập Bacillus thuringiensis từ mẫu đất sâu thu thập .17 4.1.2 Xác định hình thái tế bào, tinh thể độc khả di chuyển chủng Bacillus thuringiensis .19 4.2 Kết khảo sát khả diệt trừ sâu hại Bacillus thuringiensis 22 4.3 Kết khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu Bacillus thuringiensis 23 4.3.1 Kết khảo sát ngưỡng nhiệt độ nuôi cấy tối ưu Bacillus thuringiensis 23 4.3.2 Kết khảo sát ngưỡng pH tối ưu cho Bacillus thuringiensis .25 4.4 Kết khảo sát khả phân giải chitin chủng Bacillus thuringiensis 26 4.5 Kết định danh chủng Bacillus thuringiensis thị phân tử .28 4.5.1 Kết phản ứng PCR .28 4.5.2 Kết giải trình tự sản phẩm PCR 29 4.5.3 Kết phân tích trình tự nucleotide 29 4.5.4 Kết phân tích phả hệ 30 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 5.1 Kết luận .32 5.2 Kiến nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC .38 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ gốc Bt / B thuringiensis Bacillus thuringiensis BVTV Bảo vệ thực vật cs Cộng ĐC Đối chứng KB KingB LB Luria Broth PCR Polemerase Chain Reaction, phản ứng chuỗi polymerase TCCS Tiêu chuẩn sở v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Quy trình PCR 15 Bảng 3.2: Các loài vi khuẩn Bacillus spp sử dụng để tham chiếu phân tích phả hệ vùng gen 16S rDNA .16 Bảng 4.1: Mô tả khuẩn lạc chủng vi khuẩn B thuringiensis tuyển chọn từ mẫu sâu hại đất trồng rau sâu hại .18 Bảng 4.2: Kết nhuộm gram protein độc chủng vi khuẩn B thuringiensis tuyển chọn từ đất trồng rau sâu hại 20 Bảng 4.3: Khảo sát khả di động chủng Bt tuyển chọn từ đất trồng rau sâu hại 21 Bảng 4.4: Khả diệt sâu hại rau chủng Bt phân lập .22 Bảng 4.5: Đường kính vòng phân giải Chitin chủng Bt 27 Bảng 4.6: Các trình tự gần gũi Ngân hàng Gen mẫu phân tích Ba3 29 vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1: Biểu đồ thể khả sinh trưởng chủng Bt ngưỡng nhiệt độ khác sau ngày .23 Biểu đồ 4.2: Biểu đồ thể khả sinh trưởng chủng Bt ngưỡng pH khác sau ngày 25 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Tinh thể độc vi khuẩn Bacillus thuringiensis Hình 2.2: Độc tính chế gây độc vi khuẩn Bacillus thuringiensis Hình 4.1: Mẫu sâu chết đen chết treo thu thập xã Thanh Hải 17 Hình 4.2: Dãy nồng độ mẫu đất trồng rau sâu hại 17 Hình 4.3: Hiệu diệt sâu chủng Bt sau ngày 23 Hình 4.4: Khuẩn lạc chủng Bt phân lập sau ngày nuôi cấy ngưỡng nhiệt độ khác 24 Hình 4.5: Khuẩn lạc chủng Bt phân lập sau ngày nuôi cấy ngưỡng pH khác 26 Hình 4.6: Vịng phân giải Chitin chủng Bt 27 Hình 4.7: Kết điện di sản phẩm PCR với mẫu vi khuẩn Ba3 28 Hình 4.8: Cây phả hệ dựa vùng gen 16S ribosome mẫu vi khuẩn Bacillus spp 30 viii Kết luận: Chủng Ba1 có tốc độ sinh trưởng vượt trội, khuẩn lạc mọc lan kín đĩa petri sau ngày 40oC Các chủng cịn lại có khả sinh trưởng tốt gần tương đương Sự chênh lệch đường kính khuẩn lạc ngưỡng nhiệt độ rõ ràng Vậy, kết luận chủng Bt phân lập sinh trưởng tốt khoảng 35oC đến 40oC Từ khoảng nhiệt độ tối ưu, lựa chọn ngưỡng nhiệt độ 37oC để thực thí nghiệm 4.3.2 Kết khảo sát ngưỡng pH tối ưu cho Bacillus thuringiensis Mức pH yếu tố quan trọng liên quan đến sinh trưởng phát triển sinh vật pH thay đổi cao hay thấp ảnh hưởng không tốt đến phát triển sinh vật Để xác định ảnh hưởng pH, chủng Bt nuôi cấy môi trường KB mức pH khác 37oC Để có góc nhìn tổng qt khả sinh trưởng chủng Bt ngưỡng pH khác nhau, đường kính khuẩn lạc chủng Bt sau ngày dùng để so sánh đồng thời chủng ngưỡng pH khác nhằm xác định ngưỡng pH tối ưu với chủng Biểu đồ 4.2 : Biểu đồ thể khả sinh trưởng chủng Bt ngưỡng pH khác sau ngày 25 A B D C Hình 4.5: Khuẩn lạc chủng Bt phân lập sau ngày nuôi cấy ngưỡng pH khác A: Chủng Ba1; B: Chủng Ba2; C: Chủng Ba3; D: Chủng Ba4 Kết luận: Ở thí nghiệm này, tốc độ sinh trưởng chủng Bt phân lập khơng có nhiều khác biệt Tuy nhiên, ngưỡng pH khác lại có chênh lệch rõ ràng điển hình Các chủng Bt phân lập có tốc độ sinh trưởng tăng mạnh từ pH 5, đạt đỉnh pH giảm pH tăng dần Đặc biệt, pH tất chủng Bt sinh trưởng Dựa vào thí nghiệm trên, đưa kết luận: khoảng nhiệt độ tối ưu ngưỡng pH tối ưu cho chủng Bt phân lập 35-40oC pH chủng sinh trưởng pH≤ 4.4 Kết khảo sát khả phân giải chitin chủng Bacillus thuringiensis Chitin lớp xương đa số lồi trùng nay, số có loài sâu hại Khả phân giải chitin tốt giúp tăng hiệu vi khuẩn Bt sâu hại cơng diệt trừ sâu hại từ bên Để đánh giá khả phân giải chitin chủng vi khuẩn Bt, phương pháp sử dụng để đánh 26 giá phương pháp khuếch tán đĩa thạch Nguyễn Lân Dũng cs (1976) Các chủng vi khuẩn Bt nuôi cấy môi trường KB lỏng, lắc nhiệt độ 30oC, 160 vịng/phút ngày Sau tiến hành ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút 20 phút thu dịch enzyme thô Nhỏ dịch enzyme thô vào giếng thạch chuẩn bị sẵn để 37oC 24 Sau thời gian ủ, tiến hành nhuộm thuốc nhuộm lugol chờ khoảng phút Nếu enzyme có khả phân giải Chitin đĩa thạch xuất vịng phân giải Kết thu được thể bảng 4.5 hình 4.6 Bảng 4.5: Đường kính vịng phân giải Chitin chủng Bt Công thức Đối chứng (ĐC) Ba1 Ba2 Ba3 Ba4 D-d (d=8mm) 26 34 37 16 Hình 4.6: Vịng phân giải Chitin chủng Bt D-d ≥2,5cm : Hoạt tính sinh enzyme mạnh; D-d ≥1,5-2,0cm : Hoạt tính sinh enzyme trung bình; D-d ≤1,5cm : Hoạt tính sinh enzyme yếu 27 Theo tiêu đa số chủng Bt phân lập có hoạt tính sinh enzyme mạnh, tiêu biểu chủng Ba3 với D-d=37 mm, mạnh Chỉ có chủng Ba4 có hoạt lực sinh enzyme trung bình Như vậy, chủng Bt phân lập hầu hết có hoạt tính phân giải chitin mức mạnh 4.5 Kết định danh chủng Bacillus thuringiensis thị phân tử 4.5.1 Kết phản ứng PCR Qua thí nghiệm trên, chủng Ba3 vượt trội khả sinh enzyme phân giải chitin khả diệt sâu hại Đồng thời tiêu sinh trưởng tốt Vì vậy, chủng Ba3 chọn làm đại diện cho chủng vi khuẩn Bt phân lập để đem định danh đến mức loài thị phân tử Để tiến hành định danh, mẫu vi khuẩn Ba3 PCR vùng gen r16S Mẫu vi khuẩn Ba3 tách chiết DNA tổng số CTAB theo mơ tả Doyle & Doyle (1987), hịa tan cặn có chứa DNA tổng số vi khuẩn đệm TE dùng làm khuôn phản ứng PCR với cặp mồi Col1A/Col1B để nhân đoạn gen r16S vi khuẩn Ba3 Kết chạy điện di trình bày hình 4.7 Hình 4.7: Kết điện di sản phẩm PCR với mẫu vi khuẩn Ba3 M: Marker phân tử (1 kb); giếng 1-đối chứng nước cất; giếng 2- DNA mẫu vi khuẩn Ba3 28 Kết PCR dùng cặp mồi Col1A/Col1B để nhân gen r16S vi khuẩn cho phản ứng dương tính, xác nhận có xuất vùng gen r16S với kích thước xấp xỉ 650 bp 4.5.2 Kết giải trình tự sản phẩm PCR Sản phẩm PCR mẫu Ba3 tinh kit tách chiết theo hướng dẫn nhà sản xuất giải trình tự chiều dùng cặp mồi giống phản ứng PCR Sau cắt bỏ đoạn nhiễu, trình tự nucleotide mẫu Ba3 587 bp Trình tự mẫu phân tích: >Ba3 TCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTA CGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGG TGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTG ACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGA CAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGT CCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCAC TCTAAAGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAA ATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTA CAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTC AGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTA ATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACCCC GCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACAC 4.5.3 Kết phân tích trình tự nucleotide Các chuỗi nucleotide gần gũi với trình tự mẫu phân tích Ba3 trình bày bảng 4.6 Bảng 4.6: Các trình tự gần gũi Ngân hàng Gen mẫu phân tích Ba3 STT Tên loài gần gũi nhất* Mẫu phân lập Mã truy cập Phần trăm đoạn so sánh (%) Mức đồng trình tự (%) Bacillus thuringiensis S914 MT705425 100 100 Bacillus thuringiensis Q1-S2 JX994096 100 99,83 Bacillus thuringiensis CSRD14 MT641254 100 99,83 Ghi chú: * trình bày trình tự nucleotide 29 Kết phân tích cho thấy, trình tự nucleotide tìm chuỗi mã hóa gen 16S RNA ribosome lồi vi khuẩn ký sinh trùng, mẫu Ba3 (100% đoạn so sánh có mức đồng trình tự 100%) gần gũi với loài B thuringiensis phân lập từ mẫu đất thu thập Ấn Độ (MT705425) 4.5.4 Kết phân tích phả hệ Quan hệ mẫu vi khuẩn Ba3 so sánh với đại diện mẫu chuẩn loài Bacillus thuringiensis số lồi khác thuộc chi Bacillus Kết trình bày hình 4.8 Hình 4.8: Cây phả hệ dựa vùng gen 16S ribosome mẫu vi khuẩn Bacillus spp Mẫu phân lập (Ba3) Việt Nam (in chữ đậm) mẫu vi khuẩn sẵn có Ngân hàng Gen; T: mẫu chuẩn loài (type species) Thanh bar trình bày khoảng cách di truyền Giá trị nốt giá trị thống kê bootstrap dạng % (1.000 lần lặp) Kết phân tích phả hệ cho thấy rằng, mẫu Ba3 nằm nhánh với mẫu phân lập cơng bố lồi Bacillus thuringiensis Như vậy, kết kiểm tra PCR vùng gen Cry3A kết hợp với giải trình tự nucleotide vùng gen r16S mẫu vi khuẩn Ba3 khẳng định xác tên lồi mẫu Ba3 Bacillus thuringiensis Ba3 có mức độ tương đồng vùng gen r16S lên đến 100% với lồi 30 Bacillus thuringiensis có mã truy cập MT705425 có nguồn gốc từ Ấn Độ Theo phả hệ, giá trị thống kê bootstrap vùng gen r16S Ba3 với chủng chuẩn NR_043403 lên đến 93%, chứng tỏ clade (cụm nhánh) có độ tin cậy cao Đồng thời, mơ tả hình thái khuẩn lạc, tế bào, kết xác định tinh thể độc kết nhuộm gram chủng Ba3 tương đồng với mơ tả lồi Bacillus thuringiensis công bố Sau định danh đến cấp loài, chủng Ba3 tiếp tục nghiên cứu thí nghiệm để nhằm mục đích tạo chế phẩm vi sinh nhằm phòng trừ sâu hại Ngồi ra, mở rộng nghiên cứu nhằm đánh giá hoạt tính phịng trừ đối tượng trùng gây hại khác Có thể tiến hành giải trình tự vùng gen khác nhằm định danh cấp phân loài, hướng tới tạo sưu tập nguồn gen loài, phân loài Bacillus thuringiensis Việt Nam 31 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Quá trình thực đề tài: “Phân lập, tuyển chọn chủng Bacillus thuringiensis có khả trừ sâu hại rau” đưa kết luận sau: Đã phân lập thành công 04 chủng Bacillus thuringiensis từ mẫu đất mẫu sâu chết xã Thanh Hải, tỉnh Hà Nam có hoạt tính diệt sâu hại rau Đánh giá số hoạt tính sinh học 04 chủng Bacillus thuringiensis cho thấy: Các chủng Bacillus thuringiensis có khả sinh trưởng, phát triển tối ưu môi trường KingB khoảng nhiệt độ từ 35oC đến 40oC ngưỡng pH Chủng Ba1; Ba2; Ba3 có khả sinh tinh thể độc, chủng Ba4 không xác định tinh thể độc Cả 04 chủng Bacillus thuringiensis có khả diệt sâu hại rau tốt với hiệu lực trung bình đạt gần 60% Đặc biệt chủng Ba3 có hiệu lực đạt gần 90% Chủng Ba3 có khả phân giải chitin mạnh Ba chủng Ba1; Ba2; Ba3 có khả phân giải chitine mạnh, chủng Ba4 có khả phân giải trung bình Định danh kỹ thuật PCR giải trình tự gen, xác nhận chủng Ba3 thuộc chi Bacillus thuộc loài Bacillus thuringiensis 5.2 Kiến nghị Khảo sát khả diệt trừ sâu hại chủng Bt đối tượng sâu hại trồng khác; khảo sát khả đối kháng chủng Bt nấm bệnh; nghiên cứu kỹ thuật nhân sinh khối chủng Ba3 nhằm mục đích tạo chế phẩm vi sinh để ứng dụng cơng tác phịng trừ sâu hại rau mở rộng lên đối tượng sâu hại trồng khác 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Thị Hương, Đỗ Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Tuấn, Nguyễn Thuỳ Châu, Đinh Duy Kháng (2005), “Phân lập chủng B thuringiensis var.kurstaki Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, Hà Nội Bùi Thị Hương, Đỗ Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Tuấn, Nguyễn Thùy Châu, Đinh Duy Kháng (2003), “Phân lập chủng Btk Việt Nam”, Tạp chí di truyền học ứng dụng, số 3 Bùi Thị Hương, Đỗ Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Tuấn, Nguyễn Thùy Châu, Đinh Duy Kháng (2003), “Tạo dòng xác định trình tự DNA đặc điệu gen cry 1Ab từ chủng Btk phân lập Việt Nam”, Tạp chí di truyền học ứng dụng, số 4 Lã Thành Nam (2009), Xây dựng quy trình sản xuất thuốc trừ sâu B thuringiensis từ nguồn nước thải chế biến thủy sản, Luận văn Thạc sỹ Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa TP.HCM Lê Thị Thu Hiền, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình, Nơng Văn Hải (1998), “Gen kháng côn trùng ứng dụng công nghệ chuyển gen thực vật”, Kỷ yếu Viện Công nghệ sinh học Mai Thị Hằng, Trần Thị Mỹ Hạnh, Võ Thị Hường (2005), “Nghiên cứu số đặc điểm chủng Bacillus thuringiensis phân lập từ RNM Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Ngơ Đình Bính (2005), Thuốc trừ sâu vi sinh, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 10 – 43 Ngơ Đình Quang Đính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Hoài Trâm, Trịnh Thế Cường (2000), “Nghiên cứu phân bố đa dạng sinh học Bacillus thuringiensis phân lập số tỉnh Việt Nam”, Những vấn đề nghiên cứu Công nghệ sinh học, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 484 – 488 Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học – tập 2, Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB ĐHQG TP HCM 33 10 Nguyễn Hữu Phúc cộng (1985), Nghiên cứu công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh Bt, Báo cáo tổng kết nghiệm thu đề tài quốc gia ngày 30/6/1986 11 Nguyễn Hữu Phúc, Ngô Kế Sương (1995), “Hiện trạng triển vọng việc nghiên cứu sản xuất sử dụng chế phẩm vi sinh BVTV TP HCM”, Hội thảo Công nghệ sinh học, tr.16 - 24/04/1995 12 Nguyễn Hữu Phúc, Trần Thị Cẩm Nhung, Nguyễn Thị Ngọc Tú, Lê Thị Khánh Vân, Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, Lâm Thanh Thúy (1982), “Nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu Bt phân viện khoa học VN 1976 – 1982”, Báo cáo khoa học phân viện Khoa học Việt Nam, tr.76 – 82 13 Nguyễn Lân Dũng (1981), Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại trồng, NXB Khoa học kỹ thuật 14 Nguyễn Lân Dũng (1999), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục 15 Nguyễn Thị Chính, Nguyễn Đình Quyến (1998), Nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu Bt ứng dụng phòng trừ sâu hại, Báo cáo nghiệm thu nhánh đề tài thuộc dự án hợp tác Việt Nam – CHLB Đức, VNM 9510-017 16 Nguyễn Thị Hồi Hà, Ngơ Giang Liên (2003), “Tuyển chọn chủng B thuringiensis có khả diệt sâu tơ sâu xanh”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp, 1(4), tr.260 – 263 17 Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Lê Thị Minh Thành, Ngơ Đình Bính, Dương Văn Hợp (2008), “Nghiên cứu phân bố số đặc điểm sinh học chủng B thuringiensis 18 Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Quỳnh Châu, Phạm Minh Hương, Nguyễn Anh Nguyệt, Ngô Đình Quang Bính, Nguyễn Văn Tuất (2003), “Nghiên cứu sản xuất ứng dụng thuốc trừ sâu Bt Việt Nam”, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc Hà Nội, tr.179 – 183 19 Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2007), Giáo trình Cơng nghệ sinh học – tập 5, NXB Giáo dục 20 Phan Nguyên Hồng (1999), Rừng ngập mặn Việt Nam, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 205 tr 21 Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật, NXB Giáo dục 22 Trần Văn Hai (2009), Giáo trình hóa bảo vệ thực vật, Đại học Cần Thơ 34 23 Võ Minh Phát (2010), Sản xuất thuốc trừ sâu B thuringiensis bùn thải, Luận văn Thạc sỹ Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa TP.HCM 24 Võ Thị Thứ, Nguyễn Kim Thoa (2000), “Đặc điểm phân loại chủng B.thuringiensis var israelensis phân lập Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, 22(4), tr.53 - 58 Tiếng Anh 25 Navon(1993), “Control of Lepidopteran pets with Bacillus thuringiensis", Bacillus thuringiensis an environment biopestiside theory and practide,pp 126 – 146 26 Black K.G and Snyman S.J (1991), “Biomass yield and insecticidal activity of a local Bt isolate in six fermentermedia”, Proceedings of the Annual Congress – South Africa Sugar Technologist’Association 27 Chilcot C.N and P J Wigley (1994), “Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crystal protein", Proceeding of the 2nd Canberra meeting on Bacillus thurigiensis, pp 43 – 52 28 Choma C T W K surewicz, P R Carey, M Pozsgay, T Raynor and H Kaplan (1990), “Unusual proteolysis of the protoxin and toxin Bacillus thuringiensis”, Eur.J Biochem, vol 189, pp 523 – 527.75 29 Deluca A.J, Simonson J.G and larson A D(1981), “Bacillus thuringiensis distribution on soil of the United States”, Microbiol, vol 27,pp 865 – 870 30 Fisher R., Rosner L., 1959, “Toxicology of the Microbial Insecticide, Thuricide”, Journal of agricultural and food chemistry, vol 7, pp 686 – 688 31 Hofte H and H R Whitelog (1989) “Insecticidal crystal protein of Bacillus thuringiensis", Microbiol, Rev 53, pp 242 – 255 32 Iizuka T,Eds Yuzinin, Sun Ming, Liu Ziduo(1999), “Historical review on Bacillus thuringiensis", Biotechnology of Bacillus thuringiensis, Vol 3, tr 3-5 33 Imre S Otvos, Holly Armstrong, Nicolas Conder (2005), Safety of Btk Applications for Insect Control to Humans and Large Mammals 34 Keshavarzi M., Salimi H and Mirzanamadi F (2005), “Biochemical and physical requirements of Bt subsp kurstaki for high biomassyeild production”, J Agric Sci Technol, vol 7, pp 41 – 47 35 35 Kumar PA, Sharma RP, Malik VS (1996) "The insecticidal proteins of Bacillus thuringiensis" Advances in Applied Microbiology 36 Lachhaba K., Dtyagia R.,Valéro J.R (2001), “Production of Bt biopesticides using wastewater sludge as a raw material: effect of inoculums and sludge solids concertration”, Process biochemistry, vol 37, pp 197 – 208 37 Laurent P H, Ripauteau H, Dumamoir V.C, Frachon E, Lecadet M-M (1996), “A micromethod for serotyring Bacillus thuringiensis”, Microbiol, vol 22, pp 259-261 38 Meadows M.P., Entwistle P.F., Cory J.S., Bailey M J and Higgs S ED., (1993), “Bacillus thuringiensis in the enviroment: Ecology and risk assement”,Bacillus thuringiensis, an environmental biopesticide: Theory and practice, Wiley and Sons, pp 193 – 220 39 Pedersen J.C., Damgaard P H., Eilenberg E and Hansen B M (1995), “Dispersal of Bacillus thuringiensis var kurstaki in an experimental cabbage field”,Can J Microbiol, vol 41,pp 118 – 125 40 Powel, C.A Charlto, T Yanamoto(1994), “Recent advences in structure and fuction reseach on Bacillus thuringiensis crystal protein”, Bacillus thuringiensis biotechnology and environmental benefits, Vol 1, pp 1-20.76 41 Pries F G(1992), “Biological control of Mosquitoes and other bitting flies by Bacillus thuringiensis and B sphaericus”, Journal of Applied Bacteriology, vol 72, pp 357- 369 42 Shahram Aramideh, Mohammad Hassan Saferalizadeh, Ali Asghar Pourmirza, Mahmuod Rezazadeh Bari, Mansureh Keshavarzi, Mahdi Mohseniazar (2010), “Isolation and identification native Bacillus thuringiensis in different habitat from west Azerbaijan and evaluate effects on Indian moth plodia interpunctella (hubner) (Lepidoptera: pyralidae)”, Mun Ent Zool,Vol 5, pp 1034 – 1039 43 Travers RS, Martin PAW, Reichelderfer CF (1987) Selective process for efficient isolation of soil Bacillus spp., Appl Environ Microbial., 53: 12631266 44 Vimala Devi P.S., Ravinder T and Jaidev C (2005), “Barley-based medium for the cost – effective production of Bt”, World Journal of Microbiology and Biotechnology, vol 21, pp 173 – 178 36 45 World Health Organization, Geneva (1999), Microbial Pest Control Agent Bacillus thuringiensis 46 Xavier R., NagarathinamP., Gopalakrishnan, Murugan V and JayaramanK (2007), “Isolation of Lepidopteran Active Native Bt strains through PCR panning”,Asia Pacific Journal of molecular Biology and Biotechnology, vol 15 (2), pp 61 – 67 47 Zhang X., Liang., Siddiqui Z A., Gong Y., Yu Z., Chen S., 2009, “Efficient screening and breeding of Bt subsp k for high toxicity against Spodoptera exigua and Heliothis armigera”,J Ind microboil Biotechnol, vol 36, pp 815 – 820 Trang web 48 http://mabvietnam.net/Vn/MERD1-vn.htm 49 http://tusach.thuvienkhoahoc.com/ 50 http://www.agbiotech.com.vn 51 http://www.ebook.edu.vn 52 http://www.thiennhien.com 53 http://www.vietbao.vn/Khoa-hoc/Dung-vi-khuan-lam-thuoc-tru-sau 54 http://www.vietscience.free.fr 55 http://www.wattpad.com/855399-vk-gay-benh 56 https://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_thuringiensis 57 www.ctu.edu.vn/guidelines/scientific 37 PHỤ LỤC Khả kí sinh diệt trừ sâu hại rau chủng Bt phân lập BALANCED ANOVA FOR VARIATE NGàY FILE SLSRBI 21/ 4/22 15:15 :PAGE Hieu luc diet sau rau cua cac chung vi khuan Bt VARIATE V003 NGàY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 933333 233333 1.27 0.357 NL?I 533333 266667 1.45 0.289 * RESIDUAL 1.46667 183333 * TOTAL (CORRECTED) 14 2.93333 209524 BALANCED ANOVA FOR VARIATE NGàY FILE SLSRBI 21/ 4/22 15:15 :PAGE Hieu luc diet sau rau cua cac chung vi khuan Bt VARIATE V004 NGàY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 13.7333 3.43333 8.96 0.005 NL?I 1.60000 800000 2.09 0.186 * RESIDUAL 3.06667 383333 * TOTAL (CORRECTED) 14 18.4000 1.31429 BALANCED ANOVA FOR VARIATE NGàY FILE SLSRBI 21/ 4/22 15:15 :PAGE Hieu luc diet sau rau cua cac chung vi khuan Bt VARIATE V005 NGàY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 63.6000 15.9000 28.91 0.000 NL?I 933333 466667 0.85 0.466 * RESIDUAL 4.40000 550001 * TOTAL (CORRECTED) 14 68.9333 4.92381 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SLSRBI 21/ 4/22 15:15 :PAGE Hieu luc diet sau rau cua cac chung vi khuan Bt MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ ĐC Ba1 Ba2 Ba3 Ba4 NOS 3 3 NGàY 10.0000 10.0000 9.33333 9.66667 9.66667 NGàY 9.66667 7.33333 8.66667 7.00000 8.33333 NGàY 7.66667 4.33333 4.66667 1.33333 5.66667 SE(N= 3) 0.247207 0.357460 0.428175 5%LSD 8DF 0.806116 1.16564 1.39623 MEANS FOR EFFECT NL?I NL?I NOS NGàY 10.0000 NGàY 8.60000 38 NGàY 5.00000 5 9.60000 9.60000 7.80000 8.20000 4.40000 4.80000 SE(N= 5) 0.191485 0.276887 0.331663 5%LSD 8DF 0.624415 0.902902 1.08152 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SLSRBI 21/ 4/22 15:15 :PAGE Hieu luc diet sau rau cua cac chung vi khuan Bt F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE NGàY NGàY NGàY GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 9.7333 15 8.2000 15 4.7333 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.45774 0.42817 4.4 0.3566 1.1464 0.61914 7.6 0.0051 2.2190 0.74162 5.7 0.0001 39 |NL?I | | | 0.2894 0.1857 0.4659 | | | |