Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn lactobacillus sinh bacteriocin từ thủy sản

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS SINH BACTERIOCIN TỪ THỦY SẢN HÀ NỘI-2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS SINH BACTERIOCIN TỪ THỦY SẢN Sinh viên thực : NGUYỄN HOÀNG THẢO MINH Lớp : K63CNSHA Mã sinh viên : 637051 Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN THÙY DƯƠNG PGS.TS NGUYỄN XN CẢNH Bộ mơn : CƠNG NGHỆ VI SINH HÀ NỘI-2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học tơi thực thời gian từ tháng 03/2022-09/2022 hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Các số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa cơng bố nghiên cứu khác Các tài liệu trích dẫn khoá luận nêu mục tài liệu tham khảo Hà Nội, ngày 08 tháng 09 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Hoàng Thảo Minh i LỜI CẢM ƠN Lời cho cảm ơn đến ban Giám đốc Học viện, đội ngũ giảng viên, cán giảng dạy công tác Học viện Tôi vô biết ơn đến thầy cô khoa Công nghệ sinh học giảng dạy, hướng dẫn tạo điều kiện để tơi hồn thành chương trình học, thực tập nghề nghiệp khố luận tốt nghiệp Đặc biệt hơn, tơi xin bày tỏ kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh TS Nguyễn Thùy Dương định hướng nghiên cứu hướng dẫn tận tình tơi thời gian thực khố luận Tơi xin cảm ơn đến thầy cô môn Công nghệ vi sinh thầy PGS.TS Nguyễn Văn Giang, cô Th.S Trần Thị Hồng Hạnh, cô Th.S Nguyễn Thanh Huyền, cô Th.S Trần Thị Đào anh, chị nghiên cứu viên Dương Văn Hồn, Nguyễn Thị Thu giúp đỡ tơi thời gian thực khố luận Cuối tơi xin cảm ơn đến bạn bè thực khoá luận mơn Cơng nghệ vi sinh gia đình khuyến khích, động viên giúp đỡ để tơi hồn thành khố luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 08 tháng 09 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Hoàng Thảo Minh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii TÓM TẮT ix PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nội dụng nghiên cứu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Đối tượng nghiên cứu 1.2.3 Nội dung nghiên cứu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát vi khuẩn Lactobacillus 2.1.1 Khái niệm Lactobacillus 2.1.2 Vai trò vi khuẩn Lactobacillus 2.2 Định nghĩa Bacteriocin 2.3 Lịch sử nghiên cứu Bacteriocin 2.4 Phân loại bacteriocin 2.4.1 Bacteriocin lớp I 2.4.2 Bacteriocin lớp II 2.4.3 Bacteriocin lớp III 2.4.4 Bacteriocin lớp IV 2.5 Đặc tính sinh hóa bacteriocin 2.5.1 Tính chất vật lí iii 2.5.2 Tính chất hóa học 2.6 Bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus 2.7 Cơ chế hoạt động Bacteriocin 2.8 Ứng dụng Bacteriocin 10 2.8.1 Ứng dụng bảo quản thực phẩm 11 2.8.2 Ứng dụng hoạt động kháng khuẩn bao bì cơng nghệ nano 12 2.8.3 Ứng dụng thú y 13 2.8.4 Ứng dụng thực vật 13 2.9 Tình hình nghiên cứu bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus 13 2.9.1 Các nghiên cứu nước 13 2.9.2 Các nghiên cứu giới 14 PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 16 3.1.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 16 3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 16 3.1.3 Thiết bị hóa chất 16 3.1.4 Môi trường sử dụng nghiên cứu 16 3.2 Phương pháp nghiên cứu 17 3.2.1 Phương pháp thu thập mẫu 17 3.2.2 Phương pháp phân lập 17 3.2.3 Khảo sát khả kháng khuẩn 17 3.2.4 Khảo sát khả sinh bacteriocin 18 3.3.5 Định danh chủng vi khuẩn 19 3.3.6 Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu 21 3.3.7 Khảo sát khả chịu muối mật 21 3.3.8 Khảo sát khả chịu acid dày 21 PHẦN IV KẾT QUẢ 22 4.1 Phân lập vi khuẩn Lactic 22 4.2 Khảo sát khả kháng khuẩn 23 iv 4.3 Khảo sát khả sinh bacteriocin 25 4.3.1 Xử lí nhiệt 25 4.3.2 Xử lí enzyme phân giải proteinase-K 26 4.4 Đặc điểm sinh học 28 4.5 Định danh chủng vi khuẩn 28 4.5.1 Khuếch đại trình tự DNA phản ứng PCR 28 4.5.2 Định danh phân tích phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA 29 4.6 Nồng độ ức chế tối thiểu 31 4.7 Khảo sát khả chịu muối mật 32 4.8 Khảo sát khả chịu acid dày 34 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC 45 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT LB : Luria Bertani MRS : De Man, Rogosa and Sharpe Cs : Cộng DNA : Deoxyribonucleic acid RNA : Ribonucleic acid µl : Microlit ml : Mililit GRAS : Generally Recognized As Safe FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nation FDA : Food and Drug Administration kDa : Kilodalton LAB : Lactic acide bacteria vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Độ bền nhiệt, pH enzyme thủy phân số bacteriocin sinh tổng hợp vi khuẩn Lactic Bảng 4.1: Kết phân lập chủng vi khuẩn 22 Bảng 4.2: Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn vi khuẩn L18 28 Phụ lục 4: Khảo sát khả chịu muối mật chủng L fermentum L18 47 Phụ lục 5: Khảo sát khả chịu acid dày chủng L fermentum L18 47 vii DANH MỤC HÌNH Hình4.1: Hình ảnh số khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập 23 Hình 4.2: Khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn phân lập 23 Hình 4.3: Khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn phân lập 24 Hình 4.4: Khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn phân lập sau 26 xử lí nhiệt 26 Hình 4.5 Khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn sau xử lí proteinase-K 27 Hình 4.6: Kết PCR đoạn gen 16s rRNA chủng vi khuẩn L18 29 Hình 4.7: Cây phân loại dựa trình tự 16S rRNA 29 chủng vi khuẩn L18 29 Hình 4.8: Nồng độ ức chế tối thiểu chủng vi khuẩn L fermentum L18 31 Hình 4.9: Nồng độ ức chế tối thiểu chủng chủng vi khuẩn L fermentum L18 32 Hình 4.10: Khảo sát khả chịu muối mật chủng vi khuẩn L fermentum L18 33 Hình 4.11: Khả chịu acid chủng vi khuẩn L fermentum L18 34 Phụ lục 1: Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn L18 (nhuộm gram, di động, nitrate) 45 Phụ lục 2: Khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn sau xử lí nhiệt độ 46 viii Hình 4.10: Khảo sát khả chịu muối mật chủng vi khuẩn L fermentum L18 Kết thí nghiệm cho thấy chủng vi khuẩn L fermentum L18 có khả chịu muối mật dải nồng độ từ 0% - 0,4% Trong cao nồng độ 0% 24 - 48 Tại 12 - 48 nuôi cấy, khả chịu muối mật chủng L fermentum L18 tăng dần từ dải nồng độ 0,1% - 0,3% Tại nồng độ 0,5% có dấu hiệu phát triển từ 12 - 24 thời điểm 48 có dấu hiệu giảm Ngồi chủng vi khuẩn L fermentum L18 có khả chịu muối mật từ dải nồng độ 0,6% - 0,8% Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả Kumar cs (2017) khảo sát khả chịu muối chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum strain RS-2 dải từ 0.1% - 0.75% Kết cho thấy khả chịu muối mật chủng vi khuẩn phát triển mạnh nồng độ 0.5% - 0.75% sau Nghiên cứu tác giả Bao cs (2010) khảo sát khả chịu muối mật chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum phân lập từ sản phẩm sữa khảo sát khả chịu muối mật từ 0.3% - 1.8% Kết cho thấy khả chịu muối mật chủa chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum phát triển mạnh nồng độ 0.3% 24 33 4.8 Khảo sát khả chịu acid dày Dịch vị dày coi thách thức mà chủng vi khuẩn probiotic phải đối mặt pH thấp tác dụng kháng khuẩn pepsin (Charteris & cs., 1998; Rupa & Mine, 2012) Do đó, khả chịu acid tiêu chí quan trọng dịng probiotic tiềm Chủng vi khuẩn probiotics phải tồn qua đường tiêu hóa pH ruột từ 2,5 đến 3,5 chúng tồn dày từ - trước chuyển đến đường ruột Chủng vi khuẩn L fermentum L18 nuôi môi trường MRS lỏng 24 30˚C ly tâm 5000 vòng/phút phút Rửa cặn tế bào nước cất cho vào môi trường MRS lỏng có dải pH từ - Và theo dõi kết sau giờ, giờ, giờ, Hình 4.11: Khả chịu acid chủng vi khuẩn L fermentum L18 Kết thí nghiệm cho thấy chủng vi khuẩn L fermentum L18 tăng dải pH từ - qua từ - Ở pH=4 chủng L fermentum L18 phát triển nhanh cao Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả García & cs (2017) khảo sát khả chịu acid chủng vi khuẩn L fermentum UCO-979C dải pH từ - Kết cho thấy chủng vi khuẩn L 34 fermentum UCO-979C có khả phát triển pH=3 sau - Nghiên cứu Allameh & cs (2013) khảo sát khả chịu pH chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum phân lập từ dày cá lóc có dải pH từ Kết cho thấy chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum phát triển dải pH từ - Balcázar cộng (2008) khảo sát khả chịu pH từ - 6.5 chủng Lactobacillus fermentum CLFP 242 phân lập từ ruột cá, cho thấy chủng vi khuẩn L fermentum CLFP 242 phát triển độ pH từ 2.5 - 6.5 1,5 Từ kết cho thấy chủng vi khuẩn L fermentum L18 qua khảo sát khả chịu acid dày có khả chịu acid cao cho thấy khả sống sót dày tốt qua 35 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Từ mẫu ruột cá phân lập 95 chủng vi khuẩn lactic Trong đó, có 20 chủng vi khuẩn phân lập có khả đối kháng với chủng vi sinh vật kiểm định Staphylococcus aureus - Từ 20 chủng vi khuẩn lactic có khả đối kháng với Staphylococcus aureus qua kiểm tra tuyển chọn chủng vi khuẩn L18 có khả sinh bacteriocin, có độ bền nhiệt 60˚C - 100˚C 30 phút - Chủng vi khuẩn L18 có đặc điểm sinh học giống chủng vi khuẩn Lactobacillus sp (trực khuẩn gram dương, có khả phân giải CaCO3, khả sinh acid, catalase âm tính, di động…) - Kết giải trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn L18 Cho thấy chủng L18 có quan hệ họ hàng gần gũi với chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum strain IMAU32653 Do chủng vi khuẩn đặt tên Lactobacillus fermentum L18 Chủng L fermentum L18 tích ức chế tối thiểu 40µl Có khả chịu muối mật nồng độ từ 0,0% - 0,4% có khả chịu acid dày có độ pH từ - 5.2 Kiến nghị Khảo sát điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp để chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum L18 sinh bacteriocin tối ưu 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Đồng Thị Hoàng Anh, Nguyễn Quang Huy & Nguyễn Quỳnh Uyển (2017) Khảo sát số đặc điểm bacteriocin chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL487 phân lập từ mẫu chao Huế Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 33(1S): 1-6 Nguyễn Văn Thành & Nguyễn Ngọc Trai (2012) Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ đốm đỏ cá tra Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ (23a): 224-234 Nguyễn Lân Dũng (2010) Vi sinh vật học NXB Giáo dục Việt Nam TIẾNG ANH Allameh S K., Yusoff F M., Daud H M., Ringø E., Ideris A & Saad C R (2013) Characterization of a probiotic Lactobacillus fermentum isolated from snakehead, Channa striatus, stomach Journal of the World Aquaculture Society 44(6): 835-844 Aznar A., Fernández P S., Periago P M & Palop A (2015) Antimicrobial activity of nisin, thymol, carvacrol and cymene against growth of Candida lusitaniae Food Science and Technology International 21(1): 72-79 Badina A I (2013) Probiotics use in intensive fish farming African journal of Microbiology research 7(22): 2701-2711 Bali V., Panesar P S & Bera M B (2014) Potential of immobilization technology in bacteriocin production and antimicrobial packaging Food Reviews International 30(3): 244-263 Balouiri M., Sadiki M & Ibnsouda S K (2016) Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review Journal of pharmaceutical analysis 6(2): 71-79 Balcázar, J L., Vendrell, D., de Blas, I., Ruiz-Zarzuela, I., Muzquiz, J L., & Girones, O (2008) Characterization of probiotic properties of lactic acid bacteria isolated from intestinal microbiota of fish Aquaculture 278(1-4): 188-191 37 10 Bao, Y., Zhang, Y., Zhang, Y., Liu, Y., Wang, S., Dong, X & Zhang, H (2010) Screening of potential probiotic properties of Lactobacillus fermentum isolated from traditional dairy products Food control 21(5): 695-701 11 Brand A., Smith C & Dicks L (2013) The effects of continuous in vivo administration of nisin on Staphylococcus aureus infection and immune response in mice Probiotics and antimicrobial proteins 5(4): 279-286 12 Cintas L., Casaus M., Herranz C., Nes I & Hernández P (2001) Bacteriocins of lactic acid bacteria Food Science and Technology International 7(4): 281-305 13 Cotter P D., Hill C & Ross R P (2005) Bacteriocins: developing innate immunity for food Nature Reviews Microbiology 3(10): 777-788 14 Charteris W., Kelly P., Morelli L & Collins J (1998) Development and application of an in vitro methodology to determine the transit tolerance of potentially probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium species in the upper human gastrointestinal tract Journal of Applied Microbiology 84(5): 759-768 15 Daba G., Ishibashi N., Zendo T & Sonomoto K (2017) Functional analysis of the biosynthetic gene cluster required for immunity and secretion of a novel Lactococcus-specific bacteriocin, lactococcin Z Journal of Applied Microbiology 123(5): 1124-1132 16 Daba G M., Ishibashi N., Gong X., Taki H., Yamashiro K., Lim Y Y., Zendo T & Sonomoto K (2018) Characterisation of the action mechanism of a Lactococcus-specific bacteriocin, lactococcin Z Journal of bioscience and bioengineering 126(5): 603-610 17 De Mello M B., Da Silva Malheiros P., Brandelli A., Pesce Da Silveira N., Jantzen M M & De Souza Da Motta A (2013) Characterization and antilisterial effect of phosphatidylcholine nanovesicles containing the antimicrobial peptide pediocin Probiotics and antimicrobial proteins 5(1): 43-50 18 De Vos W M & Hugenholtz J (2004) Engineering metabolic highways in Lactococci and other lactic acid bacteria Trends in biotechnology 22(2): 72-79 19 Deegan L H., Cotter P D., Hill C & Ross P (2006) Bacteriocins: biological tools for bio-preservation and shelf-life extension International dairy journal 16(9): 1058-1071 38 20 Defoirdt T., Sorgeloos P & Bossier P (2011) Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture Current opinion in microbiology 14(3): 251-258 21 Drider D & Rebuffat S (2011) Prokaryotic antimicrobial peptides: from genes to applications Springer Science & Business Media trang trang 22 Fredericq P (1963) On the nature of colicinogenic factors: a review Journal of Theoretical Biology 4(2): 159-165 23 García, A., Navarro, K., Sanhueza, E., Pineda, S., Pastene, E., Quezada, M & González, C (2017) Characterization of Lactobacillus fermentum UCO-979C, a probiotic strain with a potent anti-Helicobacter pylori activity Electronic Journal of Biotechnology 25: 75-83 24 Gratia A (1925) Sur un remarquable exemple d'antagonisme entre deux souches de coilbacille CR Seances Soc Biol Fil 93: 1040-1041 25 Guo M., Jin T Z., Wang L., Scullen O J & Sommers C H (2014) Antimicrobial films and coatings for inactivation of Listeria innocua on ready-to-eat deli turkey meat Food control 40: 64-70 26 Ha T Q & Hoa T M T (2016) Selection of lactic acid bacteria producing bacteriocin Journal of Vietnammese Environment 8(5): 271-276 27 Hassan M U., Nayab H., Rehman T U., Williamson M P., Haq K U., Shafi N & Shafique F (2020) Characterisation of bacteriocins produced by Lactobacillus spp isolated from the traditional Pakistani yoghurt and their antimicrobial activity against common foodborne pathogens BioMed research international 2020 28 Hernandez D., Cardell E & Zarate V (2005) Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from Tenerife cheese: initial characterization of plantaricin TF711, a bacteriocin-like substance produced by Lactobacillus plantarum TF711 Journal of Applied Microbiology 99(1): 77-84 29 Jacob F., Lwoff A., Siminovitch A & Wollman E (1953) Définition de quelques termes relatifs la lysogénie ANNALES DE L INSTITUT PASTEUR MASSON EDITEUR 120 BLVD SAINT-GERMAIN, 75280 PARIS 06, FRANCE 222-224 39 30 Jaya Chitra J & Siva Kumar K (2018) Antimicrobial activity of bacteriocin from lactic acid bacteria against food borne bacterial pathogens International Journal of Current Research in Life Sciences 7(04): 1528-1532 31 Jozefiak D., Rutkowski A., Kaczmarek S., Jensen B., Engberg R & Højberg O (2010) Effect of β-glucanase and xylanase supplementation of barley-and ryebased diets on caecal microbiota of broiler chickens British Poultry Science 51(4): 546-557 32 Karthikeyan V & Santosh S (2009) Isolation and partial characterization of bacteriocin produced from Lactobacillus plantarum African journal of Microbiology research 3(5): 233-239 33 Kirkup B C & Riley M A (2004) Antibiotic-mediated antagonism leads to a bacterial game of rock–paper–scissors in vivo Nature 428(6981): 412-414 34 Kitazaki K., Baba T., Koga Y., Kuwano G., Fukuda H., Kawada E., Takasu Y., Takehana H., Koga S & Nagatoshi K (2010) The use of nisin A in preventing bovine mastitis infection Food and Food Ingredient J Japan 215: 449-456 35 Kumar, N., Tomar, S K., Thakur, K., & Singh, A K (2017) The ameliorative effects of probiotic Lactobacillus fermentum strain RS-2 on alloxan induced diabetic rats Journal of Functional Foods, 28, 275-284 36 Koohestani M., Moradi M., Tajik H & Badali A (2018) Effects of cell-free supernatant of Lactobacillus acidophilus LA5 and Lactobacillus casei 431 against planktonic form and biofilm of Staphylococcus aureus Veterinary Research Forum Faculty of Veterinary Medicine, Urmia University, Urmia, Iran 301 37 Li P., Gu Q., Yang L., Yu Y & Wang Y (2017) Characterization of extracellular vitamin B12 producing Lactobacillus plantarum strains and assessment of the probiotic potentials Food chemistry 234: 494-501 38 Lindgren S E & Dobrogosz W J (1990) Antagonistic activities of lactic acid bacteria in food and feed fermentations FEMS microbiology reviews 7(1-2): 149-163 39 Ma J., Yu W., Hou J., Han X., Shao H & Liu Y (2020) Characterization and production optimization of a broad-spectrum bacteriocin produced by 40 Lactobacillus casei KLDS 1.0338 and its application in soybean milk biopreservation International Journal of Food Properties 23(1): 677-692 40 Maeda M., Shibata A., Biswas G., Korenaga H., Kono T., Itami T & Sakai M (2014) Isolation of lactic acid bacteria from kuruma shrimp (Marsupenaeus japonicus) intestine and assessment of immunomodulatory role of a selected strain as probiotic Marine biotechnology 16(2): 181-192 41 Matsuura Y., Takehira M., Joti Y., Ogasahara K., Tanaka T., Ono N., Kunishima N & Yutani K (2015) Thermodynamics of protein denaturation at temperatures over 100 C: CutA1 mutant proteins substituted with hydrophobic and charged residues Scientific reports 5(1): 1-9 42 Messaoudi S., Manai M., Kergourlay G., Prévost H., Connil N., Chobert J.-M & Dousset X (2013) Lactobacillus salivarius: bacteriocin and probiotic activity Food microbiology 36(2): 296-304 43 Michel-Briand Y & Baysse C (2002) The pyocins of Pseudomonas aeruginosa Biochimie 84(5-6): 499-510 44 Mills S., Serrano L., Griffin C., O'connor P M., Schaad G., Bruining C., Hill C., Ross R & Meijer W C (2011) Inhibitory activity of Lactobacillus plantarum LMG P-26358 against Listeria innocua when used as an adjunct starter in the manufacture of cheese Microbial cell factories BioMed Central 1-11 44 Muriel-Galet V., López-Carballo G., Gavara R & Hernández-Muñoz P (2012) Antimicrobial food packaging film based on the release of LAE from EVOH International journal of food microbiology 157(2): 239-244 45 Ndoti-Nembe A., Vu K D., Doucet N & Lacroix M (2013) Effect of combination of essential oils and bacteriocins on the efficacy of gamma radiation against Salmonella Typhimurium and Listeria monocytogenes International Journal of Radiation Biology 89(10): 794-800 46 Negash A W & Tsehai B A (2020) Current applications of bacteriocin International Journal of Microbiology 2020 47 Oscáriz J C & Pisabarro A G (2001) Classification and mode of action of membrane-active bacteriocins produced by gram-positive bacteria International Microbiology 4(1): 13-19 41 48 Perez R H., Zendo T & Sonomoto K (2014) Novel bacteriocins from lactic acid bacteria (LAB): various structures and applications Microbial cell factories 13(1): 1-13 49 Prabhakar K V., Lingala V., Peelei A., Mikkili I., Venkateswarulu T & Dulla J (2013) Biosynthesis and potential application of bacteriocins Journal of Pure and Applied Microbiology 7(4): 2-13 50 Ramos C L., Thorsen L., Schwan R F & Jespersen L (2013) Strain-specific probiotics properties of Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus brevis isolates from Brazilian food products Food microbiology 36(1): 22-29 51 Rasheed H A., Tuoheti T., Zhang Y., Azi F., Tekliye M & Dong M (2020) Purification and partial characterization of a novel bacteriocin produced by bacteriocinogenic Lactobacillus fermentum BZ532 isolated from Chinese fermented cereal beverage (Bozai) LWT 124: 109113 52 Reeves P (1965) The bacteriocins Bacteriological reviews 29(1): 24-45 53 Resende J A., Silva V L., Fontes C O., Souza-Filho J A., De Oliveira T L R., Coelho C M., César D E & Diniz C G (2012) Multidrug-resistance and toxic metal tolerance of medically important bacteria isolated from an aquaculture system Microbes and environments ME12049 54 Riley M A & Wertz J E (2002) Bacteriocins: evolution, ecology, and application Annual Reviews in Microbiology 56(1): 117-137 55 Rupa P & Mine Y (2012) Recent advances in the role of probiotics in human inflammation and gut health Journal of agricultural and food chemistry 60(34): 8249-8256 56 Saad M A., Abdelsamei H M., Ibrahim E., Abdou A M & El Sohaimy S A (2015) Effect of pH, heat treatments and proteinase K enzyme on the activity of Lactobacillus acidophilus bacteriocin Benha veterinary medical journal 28(1): 210-215 57 Sahoo T K., Jena P K., Nagar N., Patel A K & Seshadri S (2015) In vitro evaluation of probiotic properties of lactic acid bacteria from the gut of Labeo rohita and Catla catla Probiotics and antimicrobial proteins 7(2): 126-136 42 58 Sanders M E (2000) Considerations for use of probiotic bacteria to modulate human health The Journal of nutrition 130(2): 384S-390S 59 Sankar N R., Priyanka V D., Reddy P S., Rajanikanth P., Kumar V K & Indira M (2012) Purification and characterization of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum isolated from cow milk Int J Microbiol Res 3(2): 133-137 60 Schlegel R & Slade H D (1972) Bacteriocin production by transformable group H streptococci Journal of Bacteriology 112(2): 824-829 61 Seegers J F (2002) Lactobacilli as live vaccine delivery vectors: progress and prospects Trends in biotechnology 20(12): 508-515 62 Sharma N., Kapoor G & Neopaney B (2006) Characterization of a new bacteriocin produced from a novel isolated strain of Bacillus lentus NG121 Antonie Van Leeuwenhoek 89(3): 337-343 63 Smith D., Lee K D., Gray E., Souleimanov A & Zhou X 2008 Use of bacteriocins for promoting plant growth and disease resistance Google Patents 64 Sugita H., Shibuya K., Shimooka H & Deguchi Y (1996) Antibacterial abilities of intestinal bacteria in freshwater cultured fish Aquaculture 145(1-4): 195203 65 Todorov S D., Furtado D N., Saad S M I., Tome E & Franco B D G d M (2011) Potential beneficial properties of bacteriocin - producing lactic acid bacteria isolated from smoked salmon Journal of Applied Microbiology 110(4): 971-986 66 Turpin W., Humblot C., Thomas M & Guyot J.-P (2010) Lactobacilli as multifaceted probiotics with poorly disclosed molecular mechanisms International journal of food microbiology 143(3): 87-102 67 Therdtatha P., Tandumrongpong C., Pilasombut K., Matsusaki H., Keawsompong S & Nitisinprasert S (2016) Characterization of antimicrobial substance from Lactobacillus salivarius KL-D4 and its application as biopreservative for creamy filling SpringerPlus 5(1): 1-21 68 Walsh C J., Guinane C M., Hill C., Ross R P., O’toole P W & Cotter P D (2015) In silico identification of bacteriocin gene clusters in the gastrointestinal 43 tract, based on the Human Microbiome Project’s reference genome database BMC microbiology 15(1): 1-11 69 Wang Y., Qin Y., Xie Q., Zhang Y., Hu J & Li P (2018) Purification and characterization of plantaricin LPL-1, a novel class IIa bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum LPL-1 isolated from fermented fish Frontiers in microbiology 9: 2276 70 Wells J M & Mercenier A (2008) Mucosal delivery of therapeutic and prophylactic molecules using lactic acid bacteria Nature Reviews Microbiology 6(5): 349-362 71 Zacharof M & Lovitt R (2012) Bacteriocins produced by lactic acid bacteria a review article Apcbee Procedia 2: 50-56 72 Zhang J., Yang Y., Yang H., Bu Y., Yi H., Zhang L., Han X & Ai L (2018) Purification and partial characterization of bacteriocin Lac-B23, a novel bacteriocin production by Lactobacillus plantarum J23, isolated from Chinese traditional fermented milk Frontiers in microbiology 9: 2165 73 Zhang Z., Vriesekoop F., Yuan Q & Liang H (2014) Effects of nisin on the antimicrobial activity of D-limonene and its nanoemulsion Food chemistry 150: 307-312 44 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn L18 (nhuộm gram, di động, nitrate) 45 Phụ lục 2: Khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn sau xử lí nhiệt độ 60˚C L13 L4 L28 L1 L14 ĐC L5 L95 L19 L18 ĐC L10 ĐC L80 L94 L15 L6 L9 L83 L17 L8 L81 L16 80˚C L13 L1 L28 L10 L4 L19 L14 ĐC L5 L9 ĐC L15 L95 L80 ĐC L18 L94 L81 L6 L17 L16 L8 L83 100˚C L13 L1 L10 L4 L28 L19 L95 L14 L9 ĐC ĐC L15 L18 L80 ĐC L94 L5 L81 L8 L6 L16 L17 L83 121˚C L13 L4 L5 L28 L19 L14 ĐC ĐC ĐC L10 L95 L80 L1 L6 L15 L18 L81 L94 L8 L16 L17 L9 46 L83 Phụ lục 4: Khảo sát khả chịu muối mật chủng vi khuẩn L fermentum L18 Thời gian 0,0% 0,1% 0,2% 0,3% 0,4% 0h 0,235 ± 0,003 0,272 ± 0,003 0,309 ± 0,013 0,295 ± 0,008 0,269 ± 0,004 12h 1,359 ± 0,009 1,348 ± 0,011 1,355 ± 0,017 1,318 ± 0,015 1,111 ± 0,013 24h 2,076 ± 0,016 2,014 ± 0,007 1,990 ±0,018 1,597 ± 0,049 1,124 ± 0,010 48h 2,060 ± 0,006 2,015 ±0,004 1,906 ± 0,006 1,043 ± 0,027 2,038 ±0,005 Thời gian 0,5% 0,6% 0,7% 0,8% 0h 0,313 ± 0,010 0,284 ± 0,002 0,274 ± 0,005 0,304 ± 0,004 12h 0,401 ± 0,056 0,282 ± 0,021 0,267 ±0,016 0,251 ± 0,005 24h 0,341 ± 0,020 0,300 ± 0,012 0,293 ± 0,012 0,257 ± 0,011 48h 0,298 ± 0,002 0,291 ± 0,002 0,280 ± 0,009 0,285 ± 0,012 Phụ lục 5: Khảo sát khả chịu acid dày chủng vi khuẩn L fermentum L18 Thời gian pH1 pH2 pH3 pH4 0h 0,132 ± 0,025 0,276 ± 0,276 0,230 ± 0,040 0,275 ± 0,010 3h 0,286 ±0,009 0,346 ± 0,346 0,548 ± 0,040 0,639 ± 0,034 6h 0,437 ±0,008 0,473 ± 0,473 0,683 ± 0,015 0,890 ± 0,007 9h 0,522 ±0,011 0,573 ± 0,573 0,771 ± 0,011 1,071 ± 0,038 47