Phân lập và đánh giá hoạt tính kháng sinh ở vi nấm liên kết trên hải miên ở vùng biển bắc bộ việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG SINH Ở VI NẤM LIÊN KẾT TRÊN HẢI MIÊN Ở VÙNG BIỂN BẮC BỘ VIỆT NAM ” Hà Nội 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG SINH Ở VI NẤM LIÊN KẾT TRÊN HẢI MIÊN Ở VÙNG BIỂN BẮC BỘ VIỆT NAM ” Giảng viên hƣớng dẫn: ThS Nguyễn Đình Luyện TS Nguyễn Thanh Hảo Sinh viên thực hiện: Vũ Thị Thanh An Mã sinh viên: 637101 Lớp: K63CNSHB Hà Nội 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả, hình ảnh, số liệu nghiên cứu đƣợc sử dụng luận văn trung thực, chƣa đƣợc sử dụng báo cáo Tất thơng tin đƣợc trích dẫn khóa luận đƣợc rõ nguồn gốc giúp đỡ đƣợc cảm ơn Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trƣớc Học viện Hội đồng Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Vũ Thị Thanh An i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn trân trọng đến ThS Nguyễn Đình Luyện, Viện Hóa học hợp chất Thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS Nguyễn Thanh Hảo, Khoa Công Nghệ Sinh học-Học viện Nông Nghiệp Việt Nam, người thầy tận tình giúp đỡ, hướng dẫn khoa học định hướng nghiên cứu suốt q trình em thực hồn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp Đề tài khóa luận tốt nghiệp thực hoàn thành Viện Hóa học hợp chất Thiên nhiên Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa học hợp chất Thiên nhiên, thầy cô anh chị, bạn sinh viên phòng Sinh học thực nghiệm ủng hộ tạo điều kiện thuận lợi để tơi tập trung nghiên cứu hồn thành nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy, Cô Trường Học viện Nông Nghiệp Việt Nam giảng dạy, cung cấp kiến thức để hoàn thành học phần chuyên đề chương trình đào tạo Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè ln quan tâm, hỗ trợ động viên suốt thời gian qua để tơi hồn thành tốt nhiệm vụ học tập trình nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn! Sinh viên Vũ Thị Thanh An ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT viii TÓM TẮT ix LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sự đa dạng vi sinh vật biển Việt Nam 1.2 Lý chọn Hải miên làm đối tƣợng nghiên cứu? 1.3 Giới thiệu Hải Miên 1.3.1 Cấu tạo 1.3.2 Hình dạng 1.3.3 Phân bố 1.4 Đánh giá hệ vi sinh vật bọt biển 1.5 Các nghiên cứu khoa học Hải miên 10 1.5.1 Các nghiên cứu khoa học giới tách chiết Hải miên để tìm hợp chất thứ cấp 10 1.5.2 Các hợp chất sinh học đƣợc sinh tổng hợp từ vi sinh vật liên kết Hải miên Việt Nam 11 1.6 Vi sinh vật liên kết với Hải Miên 14 1.6.1 Vi khuẩn 14 1.6.2 Vi nấm 17 1.6.3 Xạ khuẩn 18 1.7 Mục tiêu 20 iii 1.8 Nội dung thực đề tài 20 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Vật liệu môi trƣờng nghiên cứu 21 2.1.1 Thu thập mẫu vi sinh vật kiểm định 21 2.1.2 Môi trƣờng nghiên cứu 21 2.1.3 Hoá chất dụng cụ nghiên cứu 22 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 23 2.2.2 Phƣơng pháp phân lập chủng vi nấm liên kết Hải Miên 23 2.2.3 Phƣơng pháp sàng lọc chủng nấm có hoạt tính kháng VSVKĐ, phƣơng pháp khuếch tán thạch 24 2.2.4 Phƣơng pháp lên men thu cao chiết chủng vi nấm lựa chọn 25 2.2.5 Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng VSVKĐ cặn chiết Ethylacetate chủng 25 2.2.6 Xác định đặc điểm hình thái phân loại vi nấm biển 26 2.2.7 Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh vi nấm 27 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Kết phân lập chủng nấm liên kết Hải miên 30 3.2 Kết sàng lọc chủng nấm có hoạt tính kháng VSVKĐ, phƣơng pháp khuếch tán thạch 33 3.2.1 Kết sàng lọc chủng nấm có hoạt tính kháng VSVKĐ 33 3.2.2 Đặc điểm hình thái chủng nấm tuyển chọn đƣợc 35 3.3 Kết xác định hoạt tính kháng VSVKĐ từ cặn chiết ethylacetate chủng nấm 37 3.4 Kết điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh vi nấm 38 3.4.1 Thời gian lên men 38 iv 3.4.2 Nồng độ muối 42 3.4.3 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng 45 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 52 v DANH MỤC BẢNG Bảng Đặc điểm hệ sợi 54 chủng vi nấm liên kết Hải miên 32 Bảng Kết lựa chọn chủng nấm qua sàng lọc 35 Bảng Hoạt tính kháng VSVKĐ cặn chiết ethylacetate từ chủng nấm phân lập lựa chọn đƣợc 38 Bảng Thời gian lên men chủng nấm NH1 (ngày) 39 Bảng Thời gian lên men chủng nấm NH2 41 Bảng Ảnh hƣởng nồng độ muối cho sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng NH1 43 Bảng Ảnh hƣởng nồng độ muối cho sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng NH2 44 Bảng 8: Ảnh hƣởng pH môi trƣờng đến hình thành hoạt tính kháng sinh chủng nấm NH1 46 Bảng Ảnh hƣởng pH môi trƣờng đến hình thành hoạt tính kháng sinh chủng nấm NH2 47 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1: Sơ đồ nghiên cứu 23 Hình Các nhóm màu sắc từ 54 chủng nấm liên kết phân lập từ Hải miên 30 Hình Hình ảnh phân lập nội sinh ngoại sinh chủng vi nấm liên kết hải miên 32 Hình Tỉ lệ phần trăm chủng biểu hoạt tính kháng VSVKĐ 34 Hình Đĩa nấm ni cấy ngày (a) bào tử soi 100x (b) chủng NH1 36 Hình Đĩa nấm nuôi cấy ngày (a) bào tử soi 100x (b) chủng NH2 37 Hình Biểu đồ thể thời gian lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng NH1 40 Hình Biểu đồ thể thời gian lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng NH2 42 Hình Nồng độ muối thích hợp thể thu đƣợc hàm lƣợng cao chiết lớn chủng NH1 43 Hình 10 Nồng độ muối thích hợp thể thu đƣợc hàm lƣợng cao chiết lớn chủng NH2 45 Hình 11 Ảnh hƣởng pH mơi trƣờng đến hình thành hoạt tính kháng sinh chủng nấm NH1 46 Hình 12 Ảnh hƣởng pH mơi trƣờng đến hình thành hoạt tính kháng sinh chủng nấm NH2 47 vii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu VSVKĐ Tiếng Anh Diễn giải Standard control Vi sinh vật kiểm định microorganisms DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic ITS Internal transcribed spacer Vùng đƣợc phiên mã nội MIC Minimum inhibitory concentration rDNA Ribosomal DNA RYE Rice yeast extract medium Nồng độ ức chế tối thiểu AND ribosom viii Môi trƣờng gạo dịch chiết nấm men 23 Sibero et al., 2018 24 Anteneh et al., 2019 25 Xi et al., 2012 26 Liu et al., 2019 51 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hình ảnh 07 mẫu Hải miên thu thập vùng vịnh Hải Phòng, Bắc bộ, Việt Nam 52 53 Phụ lục 2: Danh sách đặc điểm hình thái 54 chủng nấm phân lập đƣợc Bảng Đặc điểm chủng nấm phân lập từ 08 mẫu Hải miên STT Tên chủng HM01 Kí hiệu mẫu NSHM01.1 Đặc điểm Trịn, màu xanh rêu, viền ngồi xanh nhạt, bề mặt có sợi NSHM01.2 Trịn, màu xanh rêu, viền ngồi xanh nhạt, bề mặt nhiều sợi HM01 NSHM01.3 Tròn, màu hồng, bề mặt dạng sợi mọc toả, viền ngồi trắng NSHM01.1(2) Hình trịn, hệ sợi dày, bơng xốp, có màu trắng sữa, nhạt dần ngồi viền HM01.1 Tròn, nhân màu xanh lam, lớp màu hồng phấn, viền xanh lam, bề mặt dạng hạt, sần HM01HT1.1 Tròn, màu xanh xám, bề mặt lồi, bơng xốp, có viền ngồi màu trắng HM01HT1.2 Trịn ,màu xanh rêu, bề mặt lồi, bơng sợi, viền xung quanh nhạt hơn, lõm xuống HM01HT.1 HM01HT1.3 Trịn, xanh rêu, lồi, bơng sợi, viền xung quanh nhạt hơn, bề mặt nhăn nhúm tạo múi HM01HT1.4 Tròn, màu nâu nhạt, viền trắng, bề mặt nhăn nhúm, tạo múi cân xứng từ đồng tâm, sợi 10 HM01HT1.5 Tròn, màu hồng nhạt, lớp tiếp màu xám, viền ngồi màu trắng xanh, bề mặt có nếp nhăn sần 54 HM01HT.-1.1 Hình trịn, màu cam, bề mặt có nốt sần 11 12 HM01HT.-1 HM01HT.-1.2 Bề mặt xốp, kết cấu dạng sợi, màu xanh xám HM01HT.-1.3 Trịn, có lớp màu trắng đục xám đan xen 13 nhau, bề mặt sần HM01HT.-2.1 Tròn, màu nâu, viền trắng, tâm lồi màu 14 trắng, bề mặt bơng sợi HM01HT.-2.2 Trịn, màu vàng đen, bề mặt lồi, sợi, 15 viền màu vàng tƣơi 16 HM01HT.-2 HM01HT.-2.3 Màu trắng xám, nhân lồi màu trắng đục, viền ngồi tua tủa, bơng sợi 17 HM01HT.-2.4 Trịn, trắng tinh, bề mặt bơng 18 HM01HT.-2.5 Trịn, xanh dƣơng, viền nhân trắng, bề mặt lồi, sợi HM01HT.-2.6 Nấm men, tròn, trắng sữa, bề mặt trơn 19 lồi NSHM01HT1 Mọc lan, màu trắng tinh, sợi 20 21 HM01HT NSHM01HT2 Tròn, xanh rêu, viền mờ, bề mặt bơng sợi, lồi NSHM01HT3 Xanh rêu, trịn, sợi, viền xanh đậm, bề 22 mặt lồi, mặt dƣới đĩa thạch thấy tạo đƣờng chia múi từ tâm 23 HM01.-1 HM01.-1.1 Tròn, xanh rêu, lồi lên màu trắng, bề mặt sợi 24 HM01.-2 HM01.-2.1 Tròn, màu trắng ngà, lớp tiếp màu xanh dƣơng, viền ngồi trắng, bề mặt bơng sợi 55 25 HM01.-3 HM01.-3.1 Trịn, màu xanh đen, bề mặt lồi, bơng sợi trắng 26 HM01.-3.2 Mọc lan bề mặt, dạng sợi trùm, màu trắng đục 27 Rb01.1 28 Rb01.1.1 Hình trịn, màu đen, bề mặt có sợi, lồi Rb02IS2.-2.1 Hình trịn, màu vàng, bề mặt có nhân lồi, có sợi lơng 29 Rb02IS2.-2 Rb02IS2.-2.2 Trịn, nhân màu hồng cam, viền màu xanh lam, bơng sợi NSRb02IS2.1 Hình trịn, viền trắng tinh, có màu 30 nâu nhạt, bề mặt bơng sợi 31 Rb02IS2 NSRb02IS2.2 Hình trịn, màu xanh rêu, bề mặt bơng sợi, viền ngồi trắng tinh 32 SHC013.1.1 Hình trịn, bề mặt lồi, màu trắng, lớp màu cam, viền trắng, bề mặt sợi 33 SHC013.1 SHC013.1.2 Hình trịn, màu vàng xanh, có nhân, bề mặt sợi 34 MXSHM1.1 Mọc lan, nhiều lớp màu xanh, vàng hồng mọc lẫn lộn, bề mặt có lớp màng trắng, bơng hạt 35 MXSHM1 MXSHM1.2 Hình trịn, màu vàng, màu xanh lá, bề mặt hạt 36 MXSHM NSMXSHM.1 Hình trịn, màu vàng sẫm, có nhân giữa, bề mặt có sợi toả 37 MSXHM NSMXSHM.2 Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt nhám 38 NSMXSHM.3 Màu trắng đục, bề mặt nhăn, lồi, gồ ghề 39 BLVHM02.1 Hình trịn, bề mặt lồi, màu xanh vàng, bơng 56 sợi giữa, viền xanh ngồi màu trắng 40 BLVHM02 BLVHM02.2 Hình trịn, bề mặt lồi màu xanh vàng, bơng sợi, mặt sau có sợi toả 41 BLVHM02.3 Hình trịn, lồi, màu xanh rêu, bề mặt sần, viền ngồi trắng đục 42 HM01Hg.1 HM01Hg1.1 Hình trịn, có nhân màu vàng, viền tiếp màu xanh dƣơng, viền ngồi màu trắng tinh, bề mặt bơng sợi 43 HM01Hg.-2 HM01Hg.-2.1 Hình trịn, màu vàng, bề mặt bơng sợi, viền ngồi trắng tinh 44 HM01Hg.-3 HM01Hg.-3.1 Hình trịn, có nhân màu hồng, lớp màu xanh dƣơng, bề mặt bơng sợi 45 HM01Hg NSHM01Hg1 Hình trịn, nhân lồi, màu xanh vàng, có viền lõm ngăn cách lớp màu vàng nhạt 46 SHM05.-3 SHM05.-3.1 Hình trịn, màu xám, bề mặt nhăn có nếp gấp, có sợi bơng, viền ngồi trắng đục 47 NSSHM05.1 Trịn, trắng tinh, bề mặt lồi, nhăn nhúm, chia múi từ đồng tâm, sợi 48 NSSHM05.2 Màu trắng đục, mọc lan bề mặt, sợi 49 NSSHM05.3 Màu trắng đục, viền nhấp nhơ khơng trịn, từ tâm có đƣờng thẳng chia rãnh bề mặt có bơng sợi lƣa thƣa 50 SHM05 NSSHM05.4 Trịn, trắng đục, bề mặt bơng ít, từ đồng tâm có đƣờng thẳng kéo dài viền tạo rãnh 51 NSSHM05.5 Hình trịn, trắng đục, bề mặt bơng sợi 57 52 53 54 SHM05.-1 NSSHM05.6 Trắng sữa, mọc sợi, nấm trùm SHM05.-1.1 Hình trịn, màu xanh xám, bơng xốp SHM05.-1.2 Hình trịn, màu trắng sữa, dạng sợi, nhân lồi 58 Phụ lục 3: Bảng đánh giá hoạt tính kháng VSVKĐ 54 chủng vi nấm liên kết Hải miên STT Tên chủng có hoạt tính 1HMO1HT1.1 Hoạt tính kháng Vi sinh vật kiểm định (D,mm) Vi khuẩn Gram (-) E.coli P.aeru ginosa + ++ Vi khuẩn Gram Nấm mốc Nấm men (+) B.subti S.aure A.niger F.oxyspo C.albica S.cerevi lis us rum ns sie + +++ + - HMO1HT1.2 + ++ + - - - +++ + 1HMO1HT1.3 - ++ - - - - ++ + 1HMO1HT1.4 + +++ +++ - - - +++ + HMO1HT-1.2 + +++ + - - - +++ + HMO1HT-2.2 ++ +++ ++ - - - +++ + HMO1HT-2.3 + ++ ++ - - - +++ + 1SHCO13.1.1 + ++ + - - - - - 1SHCO13.1.2 + - + - - - +++ + 1SHCO13.-1.1 + + + - - - - - 2SHMO5.-3.1 + ++ + - - - + - 2MXSHM1.1 + ++ + - - - - - 2HMO1.-3.1 + ++ + - - - - - 2NSHM01.1 (2) 2NSSHM05.1 + ++ + - - - +++ + + + + - - - + - 2NSSHM05.5 + ++ + - - - - - 10 11 12 13 14 15 16 59 2NSSHM05.6 + ++ + - - - - - 2NSHM01.1 + - - - - - - - 2NSHM01.2 - ++ + - - - - - 2NSHMO1.3 + ++ ++ - - - - - 3NSHMO1HT 3NSHMO1HT + ++ + - - - - - + +++ + - - - + - 17 18 19 20 21 22 Chú thích: (-) khơng kháng VSVKĐ (+) kháng VSVKĐ vịng trịn có đường kính 0.5cm (++) kháng VSVKĐ vịng trịn có đường kính 1-2cm (+++) kháng VSVKĐ vịng trịn có đường kính >2cm  Chủng NSHM01.1 đƣợc gọi tắt chủng NH1  Chủng NSHM01.1(2) đƣợc gọi tắt chủng NH2 60 Phụ lục 4: Hình ảnh chủng vi nấm kháng lại VSVKĐ 61 Phụ lục Hình ảnh lên men mơi trƣờng rắn RYE Hình ảnh chủng NH2 lên men 62 Hình ảnh chủng NH1 lên men 63 Phụ lục Hình ảnh bổ sung dung mơi ethylacetat chiết dịch Hình ảnh chủng nấm NH1 NH2 bổ sung dung môi ethylacetat 64 Hình ảnh thu dịch chiết chủng NH1 (màu đen đục) chủng NH2 (màu cam) 65