Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lí nitrit trong nước nuôi trồng thủy sản

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT XỬ LÍ NITRIT TRONG NƯỚC NI TRỒNG THỦY SẢN” Người thực : Phạm Anh Hoàng Mã sinh viên : 621876 Lớp : K62 KHMTA Khóa : 62 Giảng viên hướng dẫn : TS Đinh Hồng Duyên Địa điểm thực tập : Bộ môn Vi Sinh Vật Hà Nội - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT XỬ LÍ NITRIT TRONG NƯỚC NI TRỒNG THỦY SẢN” Người thực : Phạm Anh Hoàng Mã sinh viên : 621876 Lớp : K62 KHMTA Khóa : 62 Giảng viên hướng dẫn : TS Đinh Hồng Duyên Địa điểm thực tập : Bộ môn Vi Sinh Vật Hà Nội - 2022 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Ngày 29 tháng 03 năm 2022 BẢN GIẢI TRÌNH SỬA CHỮA KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Kính gửi: - Ban Chủ nhiệm khoa Tài nguyên Môi trường - Bộ môn: Vi Sinh Vật Tên tơi là: Phạm Anh Hồng Mã sinh viên: 621876 Lớp: K62KHMTA Sinh viên ngành: Khoa Tài nguyên Môi trường Đã bảo vệ khóa luận tốt nghiệp Tiểu ban số ngày 25 tháng năm 2022 Tên đề tài: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lí nitrit nước ni trồng thủy sản Người hướng dẫn: TS Đinh Hồng Duyên Tiểu ban chấm luận tốt nghiệp yêu cầu chỉnh sửa trước nộp khóa luận tốt nghiệp nội dung sau: STT Nội dung yêu cầu chỉnh sửa Nội dung giải Tại trình (*) trang Bổ sung, làm rõ mơi trường phân lập tuyển Bổ sung môi 20 chọn VSV xử lí nitrit từ nước NTTS trường phân lập Bổ sung thêm phương pháp kết xác Bổ sung phương 20 định hình thái khuẩn lạc hình dạng tế pháp nhuộm bào chủng phân lập gram Tôi chỉnh sửa hồn thiện khóa luận tốt nghiệp theo u cầu Tiểu ban Vậy tơi kính mong thầy/cơ hướng dẫn xác nhận cho tơi để tơi có sở nộp khóa luận tốt nghiệp theo quy định Học viện Tôi xin chân trọng cảm ơn! NGƯỜI HƯỚNG DẪN SINH VIÊN TS Đinh Hồng Duyên Phạm Anh Hồng i KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Phạm Anh Hoàng Tel: 0375882270 Mail: pah06051999@gmail.com Chun ngành: Khoa học Mơi Trường Lớp: K62-KHMT Khố: 62 Giảng viên hướng dẫn: TS Đinh Hồng Duyên Tel: 0943300888 Mail: dhduyen@vnua.edu.vn Tên đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lí Nitrit nuôi trồng thủy sản” Loại đề tài: Đề tài khoa học thực nghiệm Địa điểm thực hiện: Hoài Đức - Hà Nội Người thực (Ký ghi rõ họ tên) Phạm Anh Hoàng ii LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan kết trình nghiên cứu khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lí Nitrit nước nuôi trồng thủy sản” em thực hiện, số liệu trích dẫn có nguồn gốc rõ ràng, kết trình bày khóa luận thu thập từ trình thực nghiên cứu chưa cơng bố nghiên cứu trước Các số liệu trích dẫn khóa luận đảm bảo tính xác, tin cậy trung thực Em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nội dung trình bày khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 11 tháng 10 năm 2022 Sinh viên thực Phạm Anh Hoàng i LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực khóa luận tốt nghiệp, ngồi nỗ lực thân, em nhận nhiều giúp đỡ để em hồn thành đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lí Nitrit nước ni trồng thủy sản” Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất thầy giáo, cô giáo khoa Môi trường – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đặc biệt em muốn nói lời cảm ơn sâu sắc tới cô giáo TS Đinh Hồng Duyên – Giảng viên môn VSV người trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ em suốt thời gian thực khoá luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo nhân viên cơng ty TNHH B.KITA Hồi Đức – Hà Nội bảo tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa luận Cuối em xin bày tỏ lịng biết đến gia đình, bạn bè người thân động viên, giúp đỡ em suốt thời gian học tập nghiên cứu trường Trong q trình nghiên cứu cịn hạn chế kiến thức, tài liệu thời gian nên không tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận góp ý thầy để nội dung khóa luận em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 11 tháng 10 năm 2022 Sinh viên thực Phạm Anh Hoàng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT KHÓA LUẬN viii PHẦN PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Lý chọn đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan ngành nuôi trồng thủy sản 2.2 Các yếu tố ô nhiễm môi trường nước ao nuôi trồng thủy sản 2.2.1 Đặc tính mơi trường nước ao ni trồng thủy sản 2.2.2 Nguồn phát sinh 12 2.2.3 Cơ chế gây ô nhiễm từ hoạt động nuôi trồng thủy sản 12 2.3 Vi khuẩn có khả xử lí Nitrit ứng dụng nuôi trồng thủy sản 13 2.3.1 Vi khuẩn Nitrosomonas Nitrobacter 13 2.3.2 Ứng dụng vi sinh vật có khả xử lí Nitrit ni trồng thủy sản 15 2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn xử lí nitrit Việt Nam giới 15 2.4.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn xử lí Nitrit giới 15 2.4.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn xử lí Nitrit Việt Nam 17 PHẦN ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Đối tượng nghiên cứu 19 3.2 Phạm vi nghiên cứu 19 3.3 Nội dung nghiên cứu 19 - Phân lập tuyển chọn vi sinh vật có khả xử lí nitrit nước nuôi 19 iii 3.4 Phương pháp nghiên cứu 19 3.4.1 Phương pháp thu thập số liệu 19 3.4.2 Phương pháp lấy mẫu 19 3.4.3 Phương pháp phân lập (phương pháp Koch) 20 3.4.4 Phương pháp pháp quan sát: Mơ tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc sau 48h nuôi cấy 30°C môi trường phân lập Quan sát hình thái tế bào phương pháp nhuộm gram quan sát kính hiển vi 20 3.4.5 Đánh giá hoạt tính khử Nitrit chủng vi khuẩn phương pháp quan trắc quang 4500 NO -B 21 3.4.6 Đánh giá đặc tính sinh học VSV tuyển chọn 21 3.4.7 Sản xuất chế phẩm vi sinh vật đánh giá chất lượng chế phẩm sinh học 22 3.4.8 Thử nghiệm với quy mơ phịng thí nghiệm 22 3.4.9 Phương pháp phân tích số tiêu nước 23 3.4.10 Phương pháp xử lí số liệu 23 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 4.1 Kết phân lập vi khuẩn 24 4.2 Kết đánh giá hoạt tính sinh học chủng 25 4.2.1 Hoạt tính khử nitrit chủng vi sinh vật 25 4.2.2 Đánh giá khả thích ứng pH chủng vi khuẩn 94 26 4.2.3 Đánh giá khả chịu nhiệt chủng vi sinh vật 94 27 4.3 Sản xuất chế phẩm vi sinh vật 28 4.3.1 Đặc điểm chủng vi sinh vật 94 dùng cho mục đích sản xuất chế phẩm 28 4.3.2 Chất lượng chế phẩm vi sinh vật 28 4.4 Thử nghiệm hiệu xử lí nitrit chế phẩm vi sinh vật 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 Kết luận 32 Kiến nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Khoảng nhiệt độ thích hợp với phát triển đối tượng nuôi Bảng 2.2 Ảnh hưởng pH cá 10 Bảng 3.1 Phương pháp đánh giá số tiêu nước 23 Bảng 4.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn 24 Bảng 4.2 Kết xác định hoạt tính khử Nitrit 25 Bảng 4.3 Kết khả thích ứng pH chủng 94 26 Bảng 4.4 Khả chịu nhiệt chủng 94 27 Bảng 4.5 Đặc điểm sinh học chủng 94 tuyển chọn 28 Bảng Chất lượng chế phẩm vi sinh vật 28 Bảng 4.7 Kết xử lí nước chế phẩm sau ngày 29 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Biểu đồ sản lượng nuôi trồng thủy sản Việt Nam Hình 2.2 Biểu đồ xuất thủy sản Việt Nam, 1997 - 2020 Hình 2.3 Biểu đồ sản lượng thủy sản Việt Nam, 1995 – 2020 Hình Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng 94 28 Hình Bố trí thí nghiệm 31 Hình Thí nghiệm sau ngày xử lí 31 vi HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT XỬ LÍ NITRIT TRONG NƯỚC NUÔI TRỒNG THỦY SẢN” Người thực : Phạm Anh Hoàng Mã sinh viên : 621876 Lớp : K62 KHMTA Khóa : 62 Giảng viên hướng dẫn : TS Đinh Hồng Duyên Địa điểm thực tập : Bộ môn Vi Sinh Vật Hà Nội - 2021 ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Phạm Anh Hoàng Tel: 0375882270 Mail: pah06051999@gmail.com Chuyên ngành: Khoa học Mơi Trường Lớp: K62-KHMT Khố: 62 Giảng viên hướng dẫn: TS Đinh Hồng Duyên Tel: 0943300888 Mail: dhduyen@vnua.edu.vn Tên đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lí Nitrit nước ni trồng thủy sản” Loại đề tài: Đề tài khoa học thực nghiệm Địa điểm thực hiện: Hoài Đức- Hà Nội Người thực (Ký ghi rõ họ tên) Phạm Anh Hoàng XÁC NHẬN CỦA CƠ SỞ THỰC TẬP PHẦN MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Ngành thủy sản phát triển mạnh Việt Nam Việt Nam sở hữu đường bờ biển dài 3.260 km khu đặc quyền kinh tế với diện tích triệu km2 Theo Tổng cục Thủy sản tổng sản lượng thủy sản năm 2020 nước ước đạt 8,4 triệu tấn, tăng 1,9% so với năm 2019; đó, sản lượng khai thác ước đạt 3,84 triệu tấn, tăng 2,5%, sản lượng nuôi trồng đạt khoảng 4,56 triệu tấn, tăng 1,4% Với phát triển đó, ngành thủy sản dần chiếm lĩnh trở thành ngành kinh tế quan trọng nước ta thời điểm đặc biệt tương lai Bên cạnh phát triển tình trạng nhiễm nitrit nuôi trồng thủy sản nghiêm trọng Nitrit sinh từ oxy hóa sinh học ammonium điều kiện hiếu khí Ammonium diện ao ni thủy sản có nguồn gốc từ thức ăn thừa từ chất thải tôm, cá vi khuẩn nước chuyển hóa thành nitrit Bệnh máu nâu xảy cá nước có nồng độ nitrit cao, khí độc xâm nhập vào máu thơng qua mang biến máu thành màu nâu giống sô-cô-la Hemoglobin vận chuyển oxy máu, kết hợp với nitrit để tạo thành Methemoglobin khơng có khả vận chuyển oxy Khi máu vận chuyển oxy, cá bị ngạt thở nồng độ oxy nước đảm bảo (Neospark, 2018) Điều được nói rõ “khi cá hấp thụ Nitrit bị bệnh máu nâu dẫn đến bị ngạt thiếu oxy máu” (Nguyễn Thị Kim Hà, 2017) Với tình trạng ô nhiễm nitrit nước ao nuôi trồng thủy sản vậy, thị trường có nhiều cách khắc phục tình trạng Mặc dù biện pháp sử dụng chế phẩm sinh học coi công cụ hữu hiệu để giải vấn đề ô nhiễm môi trường này, tạo tảng vững cho phần lớn hoạt động nuôi trồng thủy sản giới Xuất phát từ vấn đề trên, kiến nghị thực đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lí nitrit nước ni trồng thủy sản” Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật để phục vụ sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lí Nitrit nước nuôi trồng thủy sản - Thử nghiệm xử lí Nitrit nước ni trồng thủy sản chế phẩm vi sinh vật PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan ngành nuôi trồng thủy sản Từ 1995-2020: Sản lượng nuôi trồng thủy sản Việt Nam tăng gấp 11 lần, tăng trưởng trung bình hàng năm 10% từ 415 nghìn lên gần 4,6 triệu Nuôi trồng thủy sản phục vụ cho xuất tập trung chủ yếu đồng Sông Cửu Long(chiếm 95% tổng sản lượng cá tra 80% sản lượng tơm) Năm 2020: diện tích ni thủy sản nước 1,3 triệu 10.000.000 m3 nuôi lồng (7.500.000 m3 lồng nuôi mặn lợ 2.500.000 m3 nuôi ngọt) Sản lượng ni 4,56 triệu Trong đó, tơm ni 950.000 (tơm sú đạt 267,7 nghìn tấn, tơm chân trắng 632,3 nghìn tấn, tơm khác 50.000 tấn), cá tra 1.560.000 Cả nước có 2.362 sở sản xuất giống tôm nước lợ (1.750 sở giống tôm sú 612 sở giống tôm chân trắng) Sản xuất 79,3 triệu tôm giống (tôm sú 15,8 triệu con; tôm chân trắng 64,1 triệu 2.2 Các yếu tố ô nhiễm môi trường nước ao ni trồng thủy sản Nguồn nước có khắp nơi, sinh vật sống nước, cư trú, di chuyển, tìm kiếm thức ăn Nước vỏ bọc bảo vệ an toàn, tránh thay đổi đột ngột thời tiết cạn nóng cháy bỏng mặt trời Nước hoà tan nhiều chất vơ hữu Do thuỷ vực chịu ảnh hưởng lớn đất, chất đất ngấm khuếch tán vào nước Vùng trung du núi đồi thường thuộc loại đất vàng đỏ nâu (gọi đất đá ong hoá đất Feralit, Laterit), có nhiều oxit sắt, nên nước ao hồ vùng trung du miền núi thường bị nhiễm sắt Vùng ven biển thường bị ảnh hưởng đất phèn (vùng cửa sông ven biển rừng ngập mặn sú, vẹt ) có Sulfat sắt sulfat nhơm, khơng bị chua mà cịn bị nhiễm sắt sulfua độc hại 2.2.2 Nguồn phát sinh Tình trạng nhiễm mơi trường xảy nghiêm trọng nuôi trồng thủy sản phần lớn chất hữu dư thừa từ thức ăn, phân rác thải khác đọng lại đáy ao ni Ngồi ra, cịn hóa chất, kháng sinh sử dụng q trình ni trồng dư đọng lại mà khơng xử lý Việc hình thành lớp bùn đáy tích tụ lâu ngày chất hữu cơ, cặn bã nơi sinh sống vi sinh vật gây thối, vi sinh vật sinh khí độc NH , NO -, H , H S, CH Các vi sinh vật gây bệnh như: Vibrio, Aeromonas, Ecoli, Pseudomonas, Proteus, Staphylococcus nhiều loại nấm nguyên sinh động vật 2.2.3 Cơ chế gây ô nhiễm từ hoạt động ni trồng thủy sản Nhìn chung chế gây ô nhiễm thường diễn biến theo đường sau: Do nuôi cá người ta thường sử dụng dạng thức ăn chính: *Thức ăn xanh(cỏ, lá): Nếu nguồn thức ăn khơng kiểm sốt phần dư thừa bị lắng đọng bị phân hủy vi sinh vật yếm khí, tạo chất hữu độc hại CH , làm giảm lượng oxi hòa tan *Thức ăn tinh dạng cám công nghiệp hay cám tự nhiên, dạng thức ăn thường bổ sung nguồn đạm tinh bột xuống môi trường nước phần dư thừa bị phân giải thành chất vô theo chuỗi sau: Đạm => NH (NH4+) => NO => NO - (Nếu mơi trường acid mơi trường có NH +, mơi trường bazo có NH ) 2.3 Vi khuẩn có khả xử lí Nitrit ứng dụng nuôi trồng thủy sản 2.3.1 Vi khuẩn Nitrobacter Nitrosomonas Vi khuẩn Nitrosomonas chi vi khuẩn Chemoautotrophic hình que Gram âm Là số vi khuẩn thực q trình nitrat hóa – bước quan trọng để khởi động chu trình chuyển hóa Nitơ giúp loại bỏ Nitơ Amoniac nước thải Nitrosomonas thường phân bố rộng rãi đất, bùn nước nước lợ Phần lớn loài thuộc giống Nitrosomonas khơng có khả di động nên cần phải bám vào bề mặt giá thể đá, cát, giá thể sinh học, giúp chúng phát triển thuận lợi Tất loài thuộc giống Nitrosomonas sử dụng NH nguồn lượng cho chuyển hóa thành NO - Ammonia bị khử hydro thành amine (NH ) sau bị oxy hóa thành NO - Q trình chuyển hóa cho phép Nitrosomonas sử dụng số hợp chất amine Tên Nitrobacter có nguồn gốc từ danh từ giới tính tiếng Latin nitrum, nitri, alkalis Những lồi thuộc giống Nitrobacter vi khuẩn Gram (-), có hình que ngắn hay hình lê (0,5 – 0,8 x 1,0 – 2,0 µm) (Wikipedia) Nitrobacter chứng minh có nhiều đất bùn (Degrange, 1997), chúng giữ vai trò quan trọng bước thứ hai q trình nitrate hóa Nitrobacter khơng có khả di động cần phải bám vào bề mặt giá thể đá, cát hay giá thể sinh học để chúng phát triển thuận lợi nhờ tiết chất nhầy từ màng bao bên Các hợp chất gây độc cho đối tượng thủy sản NH NO - chuyển sang dạng không độc NO - nhờ vào trình nitrate hóa thực vi khuẩn nitrate hóa Nitrate hóa q trình mà ammonia oxy hóa thành nitrate (NO -) qua giai đoạn thực nhóm vi khuẩn khác Ở giai đoạn thứ nhất, vi khuẩn Nitrosomonas oxy hóa ammonium thành nitrite (NO -), nitrite cuối chuyển thành nitrate nhờ hoạt động vi khuẩn Nitrobacter 2.3.2 Ứng dụng nuôi trồng thủy sản Trong nuôi trồng thủy sản, nhóm vi khuẩn nitrate hóa sử dụng phổ biến lãnh vực sản xuất giống thủy sản ni thủy sản thâm canh Quy trình sản xuất thực thông qua hệ thống lọc sinh học tuần hoàn, nước thải từ bể ương nuôi tôm cá chứa hàm lượng NH (do tôm cá tiết ra) đưa vào bể lọc sinh học để xử lý Trong bể lọc sinh học, vi khuẩn Nitrosomonas chuyển hóa NH4+ thành NO2- (giai đoạn nitrite hóa), vi khuẩn Nitrobacter chuyển hóa NO2- thành NO3- (giai đoạn nitrate hóa) 2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn xử lí Nitrit Việt Nam giới 2.4.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn xử lí Nitrit giới TA Hovanec EF DeLong (2021), Phân tích so sánh vi khuẩn nitrat hóa có liên quan đến nước hồ cá biển Dữ liệu thu trình oxy hóa amoniac tự dưỡng hóa học bể ni nước chủng vi khuẩn beta-proteobacteria liên quan đến thành viên chi Nitrosomonas họ hàng gần chúng, sinh vật thường liên quan đến q trình nitrat hóa nước Có khả q trình nitrat hóa mơi trường tự nhiên chí cịn phức tạp q trình nitrat hóa hệ thống đơn giản đặc trưng vi sinh vật chịu trách nhiệm Camilla Grunditz Gunnel Dalhammar (2001) phát triển thử nghiệm ức chế q trình nitrat hóa cách sử dụng mẫu cấy tinh khiết Nitrosomonas Nitrobacter Các mẫu cấy tinh khiết Nitrosomonas Nitrobacter phân lập từ bùn hoạt tính sử dụng Các thử nghiệm thực ống nghiệm nơi vi khuẩn ủ với hợp chất nước thải cần thử nghiệm Tốc độ nitrat hóa đo so sánh với mẫu đối chứng Các sinh vật thử nghiệm đặc trưng nhiệt độ, độ pH hoạt động tế bào Nhiệt độ tối ưu 35°C Nitrosomonas 38°C Nitrobacter; pH tối ưu 8,1 Nitrosomonas 7,9 Nitrobacter 2.4.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn xử li nitrit Việt Nam Hoàng Phương Hà, Trần Văn Nhị, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Kim Cúc (2008), Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn nitrat hóa phân lập từ nước lợ ni tơm Quảng Bình Hà Tĩnh., Nông nghiệp phát triển nông thôn Nguyễn Văn Minh (2012) Phân lập tuyển chọn chủng nitrat hóa có tiềm ứng dụng xử lý nước nuôi trồng thủy sản Nguyễn Thị Phi Oanh (2019) phân lập từ mẫu nước ao nuôi tôm tuyển chọn ba dòng vi khuẩn BLS1.3, BLW2.2 BLW2.4 có khả chuyển hóa Nitrit đạt 56,3% say ngày nuôi cấy PHẦN ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu Môi trường nước nuôi trồng thủy sản Vi khuẩn nitrat hóa 3.2 Phạm vi nghiên cứu - Phạm vi thời gian: Năm 2021 - Phạm vi khơng gian: Phịng thí nghiệm cơng ty B.kita, Hồi Đức – Hà Nội 3.3 Nội dung nghiên cứu - Phân lập tuyển chọn vi sinh vật có khả xử lí Nitrit nước ni trồng thủy sản - Sản xuất chế phẩm vi sinh vật phục vụ xử lí Nitrit nước ni trồng thủy sản - Thử nghiệm đánh giá hiệu chế phẩm vi sinh vật 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Phương pháp thu thập số liệu - Thu thập số liệu thứ cấp (sách, báo chí, internet, ) - Kế thừa có chọn lọc tài liệu điều tra tài liệu nghiên cứu nhà khoa học có liên quan đến xử lý NO - nuôi trồng thủy sản 3.4.2 Phương pháp lấy mẫu Mẫu nước lấy từ ao cá Thơn Minh Hịa, Xã Minh Khai, Huyện Hoài Đức, Thành phố Hà Nội Tiến hành lấy mẫu vị trí ao nuôi (bao gồm đầu ao, ao, cuối ao) Mỗi vị trí lấy 500ml nước vào chai thu mẫu Mẫu thu tiến hành làm thí nghiệm bảo quản điều kiện nhiệt độ thấp (3-5oC) thời gian không tuần 3.4.3 Phương pháp phân lập (phương pháp Koch) Pha loãng mẫu đến nồng độ 10-6 Tại nồng độ dùng pipet 1ml khử trùng Hút 0,02 ml nhỏ vào mơi trường chun tính bán rắn chang đều, đem nuôi 28oC Các chủng vi sinh vật phân lập đem cấy phương pháp cấy ria mơi trường chun tính bán rắn Sau chủng vi sinh vật cấy vào ống thạch nghiêng để giữ giống (James Natalie, 2002) 3.4.4 Đánh giá hoạt tính khử Nitrit chủng vi khuẩn phương pháp quan trắc quang 4500 NO2-B Các chủng sau phân lập nuôi cấy môi trường chun tính đạt mật độ 107 CFU/ml tiến hành thí nghiệm đánh giá khả xử lí nitrit cách hút 1ml dịch khuẩn (107 CFU/ml) cho vào ống falcon chứa 50ml môi trường định lượng nitrit với hàm lượng NO - 5mg/l, chủng vi khuẩn nuôi cấy qua đêm nhiệt độ 30oC máy lắc 150 vòng/phút Sau ngày mẫu thu đem phân tích hàm lượng nitrit theo phương pháp trắc quang 4500 NO -B Sau kết định lượng NO - đưa hiệu xuất xử lí theo cơng thức sau: H= 𝑎𝑎−𝑏𝑏 𝑎𝑎 × 100% Trong đó: H hiệu xuất xử lí (%), a hàm lượng chất ban đầu (mg/l), b hàm lượng chất sau khoảng thời gian ngày xử lí (mg/l) 3.4.5 Đánh giá đặc tính sinh học VSV tuyển chọn 3.4.5.1 Đánh giá khả thích ứng pH Cấy chủng VSV phân lập môi trường chuyên tính có bổ sung dung dịch đệm, điều chỉnh pH HCl NaOH theo giá trị pH: 4, 5, 6, 7, Sau xác định mật độ VK sau khoảng 24h nuôi máy lắc phương pháp đo độ đục (OD) 10 3.4.5.2 Đánh giá khả chịu nhiệt độ vi sinh vật Lấy vịng que cấy VSV pha lỗng đến nồng độ 10-1, tiến hành cấy VSV pha loãng theo tỷ lệ 10% vào môi trường dịch thể, đem nuôi lắc 150 vòng/phút nhiệt độ khác 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, sau khoảng thời gian tương ứng thời gian hình thành khuẩn lạc VSV 24h tiến hành đo OD xác định mật độ VSV 3.4.5.4 Đánh giá tính đối kháng chủng VSV Các chủng VSV tuyển chọn, nuôi cấy môi trường (môi trường VK tổng số) theo phương pháp cấy đường giao nhau, tiến hành nuôi nhiệt độ 300C sau thời gian 24h kiểm tra tính đối kháng 3.4.6 Sản xuất chế phẩm vi sinh vật đánh giá chất lượng chế phẩm sinh học 3.4.6.1 Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học Các chủng vi sinh vật sau tuyển chọn đem nhân sinh khối riêng rẽ môi trường thạch đĩa, nuôi cấy 28oC 48h Chuyển toàn lượng vi sinh vật vào 50ml môi trường dịch thể hấp tiệt trùng để nguội, đem lắc tốc độ 125 vòng/phút 48h, giống cấp Tiếp đến đem giống cấp nhân tiếp vào 500ml dịch thể máy lắc 125 vòng/phút 72h 3.4.6.2 Đánh giá chất lượng chế phẩm sinh học Chế phẩm sau sản xuất đánh giá theo quy chuẩn QCVN 02-32-1: 2019/BNNPTNT Quy chuẩn quy định rõ: Đối với chế phẩm vi sinh vật có nhiều lồi, lồi số lượng trung bình lồi vi sinh vật sống ≥ 106 CFU/g (hoặc ml) 3.4.7 Thử nghiệm với quy mơ phịng thí nghiệm Thử nghiệm xử lí nước ni trồng thủy sản Hồi Đức chế phẩm phẩm với công thức lặp lại lần 11 Công thức 1(CT1) : Sử dụng chế phẩm thị trường Yucca Zeo ( tỷ lệ 0.5%) Công thức (CT2): Sử dụng chế phẩm thí nghiệm ( tỷ lệ 0.5%) Công thức đối chứng (CT3): Không bổ sung thêm Chuẩn bị nước thải, để lắng (1h) sau tiến hành phân tích tiêu NO -, pH, BOD, COD, DO, nhiệt độ Sau cho nước thải vào bình, bình lít nước thải Tiến hành bổ sung chế phẩm công thức nêu theo dõi vòng ngày Hết ngày đem phân tích tiêu NO - , pH, BOD, COD, DO, nhiệt độ 3.6.2 Phương pháp phân tích số tiêu nước Phương pháp đánh giá số tiêu nước STT Thơng số Phương pháp phân tích Sử dụng máy đo pH Tiêu chuẩn pH TCVN 6492:2011 BOD (200C) Phương pháp pha loãng cấy TCVN 6001-1:2008 bổ sung allythiourea COD SMEWW 5220C:2017 TCVN 6491:1999 DO Sử dụng máy đo DO TCVN 7325:2004 NO - SMEWW 4500-NO - B:2017 TCVN 6137: 2009 3.4.9 Phương pháp xử lí số liệu Các số liệu thu thập tính tốn giá trị trung bình, độ lệch chuẩn biến thiên chúng vẽ phần mềm Excel 12 PHẦN DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Kết phân lập vi khuẩn 4.2 Kết đánh giá hoạt tính sinh học chủng 4.3 Kết tuyển chọn chủng VSV 4.4 Kết thử nghiệm KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 13 PHẦN KẾ HOẠCH THỰC HIỆN STT Nội dung Thời gian thực Lập đề cương khoá luận Tháng 10 Bảo vệ đề cương Tháng 10 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật Tháng 11 Đánh giá đặc tính sinh học chủng vi sinh vật tuyển chọn Sản xuất chế phẩm vi sinh vật Tháng 11 Tháng 12 Thử nghiệm đánh giá hiệu xử lí chế phẩm Tháng Viết khố luận tốt nghiệp Tháng Hồn thiện khố luận Tháng Bảo vệ khoá luận Tháng Giảng viên hướng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) Sinh viên thực đề tài (Ký ghi rõ họ tên) BỘ MÔN QUẢN LÝ SINH VIÊN Trưởng môn (Ký ghi rõ họ tên) 14