Đánh giá và tuyển chọn các chủng vi sinh vật phân giải phosphate, kẽm khó tan từ đất trồng cam cao phong, hòa bình

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN GIẢI PHOSPHATE, KẼM KHĨ TAN TỪ ĐẤT TRỒNG CAM CAO PHONG, HỊA BÌNH Hà Nội-2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN GIẢI PHOSPHATE, KẼM KHÓ TAN TỪ ĐẤT TRỒNG CAM CAO PHONG, HỊA BÌNH Sinh viên thực : Nguyễn Thị Ngọc Mai Mã sinh viên : 637246 Lớp : K63CNSHC Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Trường Sơn PGS.TS Nguyễn Văn Giang Hà Nội-2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, đề tài “Đánh giá tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả phân giải phosphate, kẽm khó tan từ đất trồng cam Cao Phong, Hịa Bình” tiến hành nghiên cứu thực Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam hướng dẫn TS Nguyễn Trường Sơn PGS.TS Nguyễn Văn Giang Số liệu kết nghiên cứu trung thực chưa công bố cơng trình khoa học Tơi cam đoan giúp đỡ việc tiến hành khóa luận cảm ơn tài liệu tham khảo trích dẫn chỉ, rõ nguồn gốc Tơi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc Mai i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành khố luận tốt nghiệp Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, nhận hướng dẫn, bảo tận tình q thầy/cơ giáo ngồi mơn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Khoa Cơng nghệ Sinh học, tồn thầy/cơ giáo, cán giảng viên khoa tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành tốt khố luận Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc chân thành đến PGS TS Nguyễn Văn Giang, TS Nguyễn Trường Sơn tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian, công sức dạy bảo, truyền cho tơi nguồn tri thức q giá để tơi hồn thành tốt khố luận Tơi xin cảm ơn anh chị, bạn bè thực nghiên cứu khoa học Bộ môn Công nghệ Vi sinh ln động viên, hỗ trợ tơi hồn thành tốt khố luận Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bố mẹ tơi luôn ủng hộ tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Một lần nữa, tơi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc Mai ii TÓM TẮT Từ mẫu đất trồng cam thu thập Cao Phong, Hịa Bình sử dụng để phân lập vi khuẩn phân giải phosphate khó tan mơi trường NBRIP Khả phân giải phosphate dòng vi khuẩn phân lập đánh giá phương pháp so màu định lượng lượng PO43- môi trường nuôi cấy lỏng Tiến hành khảo sát khả phân giải kẽm với chủng vi khuẩn phân lập Chọn chủng vi khuẩn tuyển chọn tiến hành khảo sát IAA, ảnh hưởng thời gian (5 ngày, ngày, ngày, 11 ngày, 14 ngày), pH (5, 6, 7, 8, 9, 10), nguồn carbon (lactose, glucose, fructose, dextrin, xylose), nitơ ((NH4)2SO)4, NH4Cl, NaNO3, KNO3, pepton) đến khả phân giải phosphate, kẽm Kết cho thấy có 11 chủng vi khuẩn có khả phân giải phosphate khó tan, cúa chủng vi khuẩn có khả vừa phân giải phosphate, vừa phân giải kẽm khó tan, chọn chủng có khả phân giải phosphate kẽm khó tan cao Hai chủng vi khuẩn tuyển chọn có khả sinh IAA Với mơi trường phân giải phosphate chúng sinh trưởng phát triển tốt pH từ 6-8, ngày nuôi cấy chúng sử dụng tốt nguồn carbon glucose, nguồn nitơ pepton Với môi trường phân giải kẽm chúng sinh trưởng phát triển tốt pH 7, từ 9-14 ngày nuôi cấy, chúng sử dụng tốt nguồn carbon glucose, nguồn nitơ (NH4)2SO4 iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ẢNH ix PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan phosphate 2.1.1 Vai trò phosphate 2.1.2 Quá trình cố định phosphate đất 2.1.3 Vi khuẩn phân giải phosphate 2.2 Tổng quan kẽm 2.2.1 Vai trò kẽm 2.2.2 Vi khuẩn phân giải kẽm khó tan 2.3 Sơ lược cam 2.4 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật có khả phân giải phosphate, kẽm khó tan đất 2.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 2.3.2 Tình hình nghiên Việt Nam PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………………………………………………………………………… 11 3.1 Thời gian địa điểm thí nghiệm 11 iv 3.2 Đối tượng thí nghiệm 11 3.3 Vật liệu thí nghiệm 11 3.3.1 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 11 3.3.2 Hóa chất 11 3.4 Nội dung nghiên cứu 12 3.4.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả phân giải phosphate khó tan 12 3.4.2 Phương pháp khảo sát khả phân giải phosphate khó tan 12 3.4.3 Phương pháp xác định hoạt tính phân giải kẽm 14 3.4.4 khảo sát khả sinh IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn 15 3.4.5 Khảo sát ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy đến khả phân giải phosphate, kẽm chủng vi khuẩn tuyển chọn 16 3.4.6 Khảo sát ảnh hưởng số nguồn Carbon Nitơ đến khả phân giải phosphate- kẽm chủng vi khuẩn tuyển chọn 17 3.4.7 Nghiên cứu số đặc điểm sinh hóa dịng vi khuẩn tuyển chọn 18 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả phân giải phosphate khó tan 22 4.2 Khảo sát khả phân giải phosphate khó tan 23 4.3 Khảo sát khả phân giải kẽm khó tan 24 4.4 Khảo sát khả tổng hợp IAA 27 4.5 Ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy đến khả phân giải phosphate- kẽm chủng vi khuẩn tuyển chọn 28 4.5.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy chủng vi khuẩn 28 4.5.2 Ảnh hưởng pH 30 4.6 Ảnh hưởng nguồn chất khác đến khả phân giải phosphate, kẽm chủng vi khuẩn tuyển chọn 32 4.6.1 Ảnh hưởng nguồn Carbon 32 4.6.2 Ảnh hưởng nguồn Nitơ 33 4.7 Một số đặc điểm hình thái đặc tính sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn 34 v PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC 45 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ Tên đầy đủ viết tắt Zn : Kẽm cm : Centimeter g mg : Gam : Miligam l : Liter µl : Microliter MR : Methyl Red VP : Voges Proskauer LB : Luria Bertani NBRIP : National Botanical Research Institute’s Phosphate medium & : cs ; Cộng vii DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Các đặc điểm hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn tuyển chọn 35 Bảng 4.2 Một số đặc điểm sinh lý, hoá sinh chủng vi khuẩn tuyển chọn 36 viii OM4900 trồng chậu Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 10 Phạm hà, nguyễn thị (1999) Ảnh hưởng nguồn nitơ lên khả phân giải photphat khó tan chủng nấm sợi mn1 đt1, hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc, nxb khoa học kỹ thuật, hà nội, tr 434 – 440 11 Phạm Văn Toản , Phạm Bích Hiên Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật phân giải lân Việt Nam Truy cập từ: http://iasvn.org/upload/files/S63W5SP9H4su%20dung%20vi%20sinh%20vat %20phan%20giai.pdf ngày 24/03/2022 12 Tiêu chuẩn Việt Nam (2006) Phần I: Hướng dẫn lập chương trình lấy mẫu TCVN 7538-1: 2006 ISO 10381-1: 2002 13 Trần Thi Phương Thu Nguyễn Khởi Nghĩa (2018) Phân lập tuyển chọn số dòng nấm hòa tan lân từ đất trồng lúa khô ngập xen kẽ kết hợp bón phân hữu Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 54(9B): 23-33 14 Trần Văn Chính (2010) Giáo trình thổ nhưỡng học NXB Đại học Nông nghiệp Hà Nội Tài liệu tiếng anh Adesemoye A., Torbert H., Kloepper J., 2009 “Plant growth-promoting Rhizobacteria allow reduced application rates of chemical fertilizers” Microbial Ecology, 58 (Suppl 4): 921-929 Alagawadi, a.r., and a.c gaur (1992) Inoculation of azospirillum brasilense and phosphate solubilizing bacteria on yield of {sorghum bicolor (l.) Moench} in dry land Trop Agric 69:00:00 347-350 Alloway B.J (2004) Zinc in soils and crop nutrition International Zinc Association Communications Brussels: IZA Publications Alloway Brian J (2008) Znic in soils and crop nutrition Brussels, Belgium and Paris, France 39 Azhar Hussain (2015) Efficacy of bio-activated Zn for improving yield and quality of maize, University of Agriculture, Faisalabad-Pakistan, Pakistan Azhar Hussain, Muhammad Arshad, Zahir Ahmad Zahir & Muhammad Asghar (2015) Prospects of Zinc solubilizing bacteria for enhancing growth of maize Pak J Agri Sci., Vol 52(4): 915-922 Azhar Hussain, Zahir Ahmad Zahir, Allah Ditta, Muhammad Usman Tahir, Maqshoof Ahmad, Muhammad Zahid Mumtaz, Khizar Hayat & Shahzad Hussain (2019) Production and Implication of Bio-Activated Organic Fertilizer Enriched with Zinc-Solubilizing Bacteria to Boost up Maize (Zea mays L.) Production and Biofortification under Two Cropping Seasons Agronomy 10(1): 39 B.N Ames (1966), “Assay of inorganic phosphate, total phosphate and phosphate”, Methods in Enzymology, 8, pp.115-118 Broadley, M., Brown, P., Cakmak, I Rengel, Z., and Zhao, F., 2011 Funtion of nutrients: micronutrients In Marschner, P (ed), Marschner’s Mineral Nutrition of Higher Plants (3rd ed) Academic Press, San Diego, 212223 10 Bunt JS & AD Rovira (1955) Microbiological studies of some subantarctic soils Journal of Soil Science 6(1): 119-128 11 Chabot r., h Antoun and m P Cescas (1993) Grotwh stimulation of corn and romiane lettuce by microorganisms solubilizing inorganic phosphorous Can J Microbiol 39, 941-947 12 Claudia Schubert, Karina Guttek, Annegret Reinhold, Kurt Gruengreiff & Dirk Reinhold (2015) The influence of the trace element zinc on the immune system LaboratoriumsMedizin 39(s1) 13 Dinesh, R., Anandaraj, M., Kumar, A., Bini, YK, Subila, KP, Aravind, R., 2015 Isolation, characterization, and evaluation of multi-trait plant growth promoting rhizobacteria for their growth promoting and disease suppressing effects on ginger Microbiol Res 173, 34–43 40 14 Fatemeh Hashemnejad, Mohsen Barin, Maryam Khezri, Youbert Ghoosta & Edith C Hammer (2021) Isolation and Identification of Insoluble ZincSolubilising Bacteria and Evaluation of Their Ability to Solubilise Various Zinc Minerals Journal of Soil Science and Plant Nutrition 21(3): 2501-2509 15 Glick, B.R., Y Bashan (1997) Genetic manipulation of plant growth- promoting bacteria to enhance biocontrol of phytophatogens Biotechnol Adv 15, 353–378 16 Glickmann, E and Y Dessaux 1995 “A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria” Appl Environ Microbiol, 61(2):793-796 17 H Chung, et al (2005), “Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacteria from the rhizosphere of crop plants of Korea”, Soil Biol Biochem., 37(10), pp.1970-1974 18 Husna Siddiqui, Priyanka Singh, Yamshi Arif, Fareen Sami, Romana Naaz & Shamsul Hayat (2022) Role of Micronutrients in Providing Abiotic Stress Tolerance In: Microbial Biofertilizers and Micronutrient Availability Springer: 115-136 pages 19 Igual, J M., Valverde Portal, Á., Cervantes, E., and Velázquez, E (2001) Phosphate-solubilizing bacteria as inoculants for agriculture: use of updated molecular techniques in their study 20 Iti Gontia-Mishra, Swapnil Sapre & Sharad Tiwari (2017) Zinc solubilizing bacteria from the rhizosphere of rice as prospective modulator of zinc biofortification in rice Rhizosphere 3: 185-190 21 Jason W Kelsey & Martin Alexander (1997) Declining bioavailability and inappropriate estimation of risk of persistent compounds Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal 16(3): 582-585 22 Jog, R., Pandya, M., Nareshkumar, G., & Rajkumar, S J M (2014) Mechanism of phosphate solubilization and antifungal activity of 41 Streptomyces spp isolated from wheat roots and rhizosphere and their application in improving plant growth 160(4), 778-788 23 Kathleen Hefferon (2019) Biotechnological approaches for generating zinc-enriched crops to combat malnutrition Nutrients 11(2): 253 24 Katznelson H and B Bose (1959) Metabolic activity and phosphate lving capability of bacterial isolates from wheat roots, rhizosphere and nonrhizosphere soil Can J.Microbiol 5, 79–85 25 Khanghahi M.Y., P Ricciuti, I Allegretta, R Terzano & C Crecchio (2018) Solubilization of insoluble zinc compounds by zinc solubilizing bacteria (ZSB) and optimization of their growth conditions Environ Sci Pollut Res Int 25(26): 25862-25868 26 Kloepper j W., k Lifshitz, m N Schroth (1988) Pseudomonas inoculants to benefit plant production Isi atlas sci anim plant sci Pp 60–4 27 Lemanceau, P (1992): Effects benefiques de rhizobacteries sur les plantes: exemple des Pseudomonasspp fluorescent Agronomie 12, 413–437 28 MEP, (2010) Ministry of Environmental Protection, Bulletin of National Environmental Statistics 2009 MEP, Beijing 29 Mohite, B J J o s s., & nutrition, p (2013) “Isolation and characterization of Indole acetic acid (IAA) producing bacteria from rhizospheric soil and its effect on plant growth” 13(3), 638-649 30 Mózner, Z., Tabi, A., and Csutora, M (2012) Modifying the yield factor based on more efficient use of fertilizer—The environmental impacts of intensive and extensive agricultural practices Ecological Indicators, 16, 5866 31 Murphy Munees A., Mohammad S K., 2009 Effects of Quizalafop-p- Ethyl and Clodinafop on Plant Growth Promoting activities of Rhizobacteria from Mustard Rhizosphere Annals of Plant Protection Sciences, 17 (Suppl 1): 175-180 42 32 Nautiyal, C.S., 1999 “An efficient microbiological growth medium for screening phosphorus solubilizing microorganisms”, FEMS Microbiology Letter, 170(1): 2017-2021 33 Norse, D (2005) Non-point pollution from crop production: Global, regional and national issues Pedosphere, 15(4), 499-508 34 Perez e., m Sulbarán, m M Ball and l A Yarzabál (2007) Isolation and characterization of mineral phosphate-solubilizing bacteria naturally colonizing a limonitic crust in the southeastern venezuelan region Soil biol Biochem 39:2905-2914 35 Rodri;guez, h., & fraga, r (1999) Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion Biotechnology advances, 17(4), 319-339 36 S Alam, et al (2002), “In vitro solubilization of inorganic phosphate by phosphate solubilizing microorganisms (PSM) from maize rhizosphere”, Int J Agri Biol., 4(4), pp.454-458 37 Saravanan, VS, Subramoniam, SR, Raj, SA, 2003 Assessing in vitro solubilization potential of different zinc solubilizing bacterial (ZSB) isolates Braz J Microbiol 34, 121–125 38 Sharma, S B., Sayyed, R Z., Trivedi, M H., & Gobi, T A J S (2013) Phosphate solubilizing microbes: sustainable approach for managing phosphorus deficiency in agricultural soils 2(1), 1-14 39 Sharma, Sushil K.*, Mahaveer P Sharma, Aketi Ramesh, and Om P Joshi (2011) Characterization of Zinc-Solubilizing Bacillus Isolates and their Fotential to Influence Zinc Assimilation in Soybean Seeds J Microbiol Biotechnol (2012), 22(3), 352–359 40 Subba Rao, N S (1982) Advances in agricultural microbiology Butterworth Scientific, 295-303 41 T Baliah, et al (2016), “Isolation, identification and characterization of phosphate solubilizing bacteria from different crop soils of Srivilliputtur Taluk, Virudhunagar District, Tamil Nadu”, Tropical Ecology , 57(3), pp.465- 474 43 42 Wani, P., Khan, M., and Zaidi, A (2007) Co-inoculation of nitrogen- fixing and phosphate-solubilizing bacteria to promote growth, yield and nutrient uptake in chickpea Acta Agronomica Hungarica, 55(3), 315-323 43 Yadav, B.K & J.C Tarafdar (2010) Studies on Phosphatase Activity and Clusterbean Production as Influenced by the P Mobilizing Organism Emericella Rugulosa Legume Research, Vol 33, No 2, (June 2010), pp.118220, ISSN 0250-5371 44 Zaheer A., A Malik, A Sher, M Mansoor Qaisrani, A Mehmood, S Ullah Khan, M Ashraf, Z Mirza, S Karim & M Rasool (2019) Isolation, characterization, and effect of phosphate-zinc-solubilizing bacterial strains on chickpea (Cicer arietinum L.) growth Saudi J Biol Sci 26(5): 1061-1067 45 Zastrow M.L & V L Pecoraro (2014) Designing hydrolytic zinc metalloenzymes Biochemistry 53(6): 957-78 44 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hai chủng vi khuẩn tuyển chọn Phụ lục 2: Phương trình đường chuẩn PO43Bảng 1: Giá trị OD đường chuẩn PO43Nồng độ PO43Giá trị OD820 0 0.5 0.177 0.301 1.5 0.447 0.614 2.5 0.712 45 Phụ lục 3: Khả phân giải phosphate chủng vi khuẩn phân lập Phụ lục 4: Phương trình đường chuẩn IAA Bảng 2: Bảng giá trị đường chuẩn IAA Nồng độ Trp 10 20 30 40 50 60 70 Giá trị OD530 0.221 0.403 0.546 0.723 0.885 1.05 1.25 46 Phụ lục 6: Ảnh hưởng thời gian đến khả phân giải phosphate khó tan chủng tuyển chọn 47 Phụ lục 7: Ảnh hưởng pH đến khả phân giải phosphat Chủng CP03 Chủng CP04 48 Phụ lục 8: Ảnh hưởng nguồn C đến khả phân giải phosphate khó tan Chủng CP04 Phụ lục 9: Ảnh hưởng nguồn N đến khả phân giải phosphate khó tan Chủng CP04 49 Phụ lục 10: Ảnh hưởng thời gian đến khả phân giải kẽm 50 Phụ lục 11: Ảnh hưởng pH đến khả phân giải kẽm 51 Phụ lục 12: Ảnh hưởng nguồn C đến khả phân giải kẽm 52 Phụ lục 13: Ảnh hưởng nguồn N đến khả phân giải kẽm 53